Amebas de vida livre (AVL) do gênero Acanthamoeba estão amplamente distribuídas no ambiente e podem tornar-se amebas patogênicas ao homem. O objetivo deste trabalho foi isolar em de água de torneira amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba, identificá-las e classificá-las. Um total de 132 amostras de água de torneira foi coletado de escolas estaduais e municipais entre os meses de março a novembro de 2009. As amostras passaram pelo processo de filtração e as membranas foram semeadas em ágar não-nutriente 1,5% coberto por uma suspensão de E. coli inativadas pelo calor. Todas as amostras positivas para AVL foram submetidas à clonagem celular e identificadas como pertencentes ao gênero Acanthamoeba, através da morfologia dos cistos e trofozoitos e pela PCR utilizando oligonucleotídeos gênero-específicos que amplificam a região ASA.S1 do gene 18S rDNA. Ensaios fisiológicos de termo e osmotolerância foram utilizados para avaliar a patogenicidade dos isolados. Vinte sete isolados foram positivos para AVL e 10 foram identificados como pertencentes ao gênero Acanthamoeba tanto pelas características morfológicas quanto pela análise molecular. Destes, nove isolados apresentaram características do grupo II e um do grupo III, segundo Pussard e Pons (1977). A análise do sequenciamento através da comparação das sequências dispostas no GenBank, demonstrou a distribuição no grupo genotípicos T2 (40%), T2/T6 (40%), T6 (10%) e T4 (10%). Nos ensaios de termotolerância e osmotolerância 50% dos isolados obtiveram um baixo potencial patogênico. Os resultados indicaram a presença do gênero Acanthamoeba em água tratada no estado do RS, revelando sua importância epidemiológica e a necessidade de mais estudos para determinar sua distribuição no ambiente e seu potencial patogênico. / Free-living amoebae (FLA) of Acanthamoeba genus are widely distributed in the environment and can become human pathogenic amoebae. The aim of this study was to isolate from tap water in free-living amoebae of Acanthamoeba, identify them and then classify them. A total of 132 samples of tap water was collected from state and municipal schools between march and november 2009. The samples passed through the filtration process and the membranes were seeded in non-nutrient 1.5% covered by a suspension of E. coli heatinactivated. All samples of AVL were cloned and identified as belonging to the genus Acanthamoeba by the morphology of cysts and trophozoites by PCR using primers and genus-specific primers that amplify the ASA.S1 region of 18S rDNA gene. Tests of physiological thermotolerance and osmotolerance were used to evaluate the pathogenicity of the isolates. Twenty seven isolates of AVL and 10 were identified as belonging to the genus Acanthamoeba through the morphological and molecular analysis. Nine of the isolates showed characteristics of group II and one isolate showed characteristics of group III, according Pussard and Pons (1977). The sequencing analysis by comparing the sequences submitted to GenBank, showed that genotype distribution in group T2 (40%), T2/T6 (40%), T6 (10%) and T4 (10%). In tests of thermotolerance and osmotolerance 50% of isolates had a low pathogenic potential. The results indicated the presence of Acanthamoeba in tap water in the RS, revealing its importance and the need for more epidemiological studies to determine their distribution in the environment and its pathogenic potential.

Amebas de vida livre (AVL) do gênero Acanthamoeba estão distribuídas mundialmente e habitam uma ampla variedade de nichos ambientais. Acanthamoeba pode ser considerada um importante veículo de patógenos humanos por abrigar inúmeras bactérias endossimbiontes. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o potencial patogênico de 12 isolados de Acanthamoeba previamente isoladas de estojos de lentes de contato e ductos de ar condicionado usando testes de osmotolerância e termotolerância, bem como caracterizar e identificar a comunidade de endossimbiontes presentes, utilizando duas técnicas de biologia molecular, a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e DGGE (Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante). Dentre os isolados estudados ¼ destes, foram considerados potencialmente patogênicos a partir dos testes de osmotolerância e termotolerância. Todos os isolados quando submetidos à PCR demonstraram a presença de endossimbiontes, sendo que todos continham bactéria do gênero Pseudomonas spp. Não foi possível confirmar a presença de microorganismos da família Legionellaceae bem como da ordem Chlamydiales. A DGGE possibilitou caracterizar a diversidade bacteriana nos isolados de Acanthamoeba, entretanto a identificação de bactérias através desta metodologia apresentou-se comprometida, sendo que apenas 2 espécies bacterianas, Paenibacillus glucanolyticus e Candidatus Protochlamydia amoebophila, foram identificadas, nos isolados A2 e A12 respectivamente. As demais bandas sequenciadas apresentaram similaridade para bactérias incultiváveis, sem que espécie ou gênero pudessem ser identificados. Os resultados deste primeiro estudo de identificação e caracterização de endossimbiontes em isolados de Acanthamoeba oriundas da cidade de Porto Alegre/RS confirmam a presença de isolados de Acanthamoeba carreadoras de endossimbiontes e demonstram que diferentes populações bacterianas estão internalizadas nessas amebas. / Free-living amoebae (AVL) of the genus Acanthamoeba are distributed worldwide and inhabit a wide variety of environmental niches. Acanthamoeba can be considered an important vehicle for human pathogens harbor numerous bacteria endosymbionts. This study aimed to characterize the pathogenic potential of Acanthamoeba isolates from 12 previously isolated from contact lens cases and air conditioning ducts using assessed by osmotolerance and temperature tolerance as well as identify and characterize the community of endosymbionts present, using two techniques molecular biology, PCR (Polymerase Chain Reaction) and DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Among the isolates studied ¼ these were considered potentially pathogenic from tests osmotolerance and temperature tolerance. All strains when subjected to PCR demonstrated the presence of endosymbionts, all of which contained bacteria of the genus Pseudomonas spp. It was not possible to confirm the presence of microorganisms of family Legionellaceae and order Chlamydiales. The DGGE enabled characterization of bacterial diversity in the strains of Acanthamoeba, however the identification of bacteria using this methodology appeared compromised, with only two bacterial species, Paenibacillus glucanolyticus and Candidatus Protochlamydia amoebophila were identified in isolates A2 and A12 respectively. The other bands showed similarity to sequenced uncultivable bacteria, without which species or genus could be identified. The results of this first study of identification and characterization of endosymbionts in Acanthamoeba isolates deriving from the city of Porto Alegre / RS confirm the presence of strains of Acanthamoeba endosymbionts of carrier and show that different bacterial populations are internalized these amoebae.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_ricardo_luiz_ricci_falchi.pdf: 1452866 bytes, checksum: 5f2efbe078fb811eeea2b4e998a1ef48 (MD5) Previous issue date: 2006-06-22 / In countries in development, one of the main causes of diseases is the contamination of the water due to the deficiency of the sanitary sewerage system. Rio Grande city, situated in the South of Rio Grande do Sul, as the majority of the Brazilian cities also presents limitations in the collection and treatment of the cloacal sewer. This deficiency makes that part of the residues of the population be eliminated directly in the Patos Lagoon, which acquits a important role in the fishing activity, besides being used as local for washing, in the summer months, by the population which lives around. This study had as objectives to investigate the presence of pathogenic parasites to the man and parasites that are indicator of fecal contamination water samples gathered in different parts of the Patos Lagoon, Rio Grande, RS. In the period between January and December of 2005, it was gathered, monthly, samples of 500mL of water in 12 different parts of the Lagoon. The samples were filtered through a membrane of acetate of cellulose (0,45), under a negative pressure for the material retention. After the material elution, through the Tween 80 solution to 0, 1%, the material was concentrated by centrifugation in 1500 rpm, during 15 minutes. For the initial research of protozoa, it was achieved the direct exam in breezy of the material, as well as the material concentrated by the centrifugal-flotation technique in solution of sulfate of zinc. For the research of oocysts of Cryptosporidium spp., they were achieved concurrently the techniques of concentration centrifugal-flotation of Sheather and centrifugal-sedimentation by formol ether, with the posterior coloration with the Kinyoun technique. For the research of free-living amoebas, it was made the culture of one aliquot of each water sample in non-nutrient agar inoculated with inactive Escherichia coli . Aliquots originated of the eluted material from the membrane and of the culture were ruddy by trichrome, for the diagnosis of protozoa cysts. In the gathering places of the samples it was sized pH, saltiness and water temperature. The research of total coliforms and Escherichia coli was achieved by the technique of multiple tubes. In the analysis of the 12 parts, during the 12 months of water gathering, it was observed that 91,7% were infected with protozoa that can infect human beings; Cryptosporidium spp. (16,7%), Acanthamoeba spp. (91,7%), Naegleria spp. (25%) and Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar (8,3). Total coliforms (more than 5.000/100mL) and Escherichia coli (more than 1.000/100mL) were secluded in all the harvested samples, showing water contamination by cloacal sewer. The temperature, the saltiness and water pH, do not influenced in the detection do protozoa, except for Acanthamoeba spp. That presented bigger frequency when the water saltiness was under or equal 0,6% (p < 0,05). The presence of organic substance in the closeness of the places of samples gathering influenced in the detection of protozoa in general, as well as the creation of animals for the detection of Naegleria spp. (p < 0.05). The observation of water contamination for pathogenic parasites to man and the indications of fecal contamination, suggest better action of sanitary planning, as well as preventive and educative steps in order to avoid the human infection. / Nos países em desenvolvimento uma das principais causas de doenças é a contaminação da água devido às deficiências dos serviços de esgotamento sanitário. A cidade de Rio Grande, localizada ao sul do Rio Grande do Sul, assim como a maioria dos municípios brasileiros, também apresenta limitações na colheita e tratamento do esgoto cloacal. Esta deficiência faz com que parte dos dejetos da população seja eliminada diretamente na Laguna dos Patos, a qual desempenha importante papel na atividade pesqueira, além de ser usada como local para banho, nos meses de verão, pela população residente nos seus arredores. Este estudo teve como objetivos investigar a presença de parasitos patogênicos ao homem e de parasitos que são indicadores de contaminação fecal em amostras de água colhidas em diferentes pontos da Laguna dos Patos, Rio Grande, RS. No período de janeiro a dezembro de 2005, foram colhidas, mensalmente, amostras de 500 mL de água em 12 pontos da Laguna. As amostras foram filtradas através de membrana de acetato de celulose (0,45 µm), sob pressão negativa para a retenção do material. Após eluição do material, através da solução de Tween 80 a 0,1%, o material foi concentrado por centrifugação a 1500 rpm, por 15 minutos. Para a pesquisa inicial de protozoários, foi realizado o exame direto a fresco do material, bem como do material concentrado pela técnica de centrífugo-flutuação em solução de sulfato de zinco. Para a pesquisa de oocistos de Cryptosporidium spp., foram realizadas simultaneamente as técnicas de concentração de centrífugo-flutuação de Sheather e de centrífugo-sedimentação pelo formol-éter, com posterior coloração com a técnica de Kinyoun. Para a pesquisa de amebas de vida livre, foi feito o cultivo de uma alíquota de cada amostra de água em meio de ágar não nutriente com Escherichia coli inativada. Alíquotas provenientes do material eluído da membrana e do cultivo foram coradas pelo tricrômio, para diagnóstico de cistos de protozoários. Nos locais de colheita das amostras foram medidos pH, salinidade e temperatura da água. A pesquisa de coliformes totais e Escherichia coli foi realizada pela técnica dos tubos mú ltiplos. Na análise dos 12 pontos, durante os 12 meses de colheita de água, foi observado que 91,7% (11/12) estavam contaminados com protozoários que podem infectar seres humanos; Cryptosporidium spp. (16,7%), Acanthamoeba spp. (91,7%), Naegleria spp. (25%) e Entamoeba histolytica/ Entamoeba dispar (8,3%). Coliformes totais (superior a 5.000/100mL) e Escherichia coli (superior a 1.000/100mL) foram isolados em todas as amostras colhidas, demonstrando contaminação da água por esgoto cloacal. A temperatura, salinidade e pH da água, não influenciaram na detecção dos protozoários, exceto para Acanthamoeba spp. que apresentou maior freqüência quando a salinidade da água estava menor ou igual a 0,6% (p<0,05). A presença de matéria orgânica nas proximidades dos locais de colheita das amostras influenciou na detecção de protozoários em geral, bem como a criação de animais para a detecção de Naegleria spp. (p<0,05). A observação da contaminação da água por parasitos patogênicos ao homem e a indicação de contaminação fecal, sugerem melhores ações de planejamento sanitário, assim como medidas preventivas e educativas a fim de evitar a infecção humana.

A incidência de ceratite infecciosa relacionada a lentes de contato ocasionada por espécies de Acanthamoeba e Fusarium tem aumentado nos últimos anos. Esses organimos compartilham vários ambientes e casos de coinfecção foram relatados. Interações entre amebas e outros micro-organismos podem resultar em mudanças significativas para ambos, como o aumento da virulência em hospedeiros mamíferos. Neste estudo, foi avaliada a interação das cepas Neff, T4 e T4 pulmão de Acanthamoeba castellanii com Fusarium solani, bem como as possíveis implicações no desenvolvimento de ceratite. A. castellanii foi capaz de fagocitar F. solani e os conídios foram capazes de germinar dentro da ameba. A cocultura com ameba viva, bem como o sobrenadante da cultura e o lisado amebiano aumentaram significativamente o crescimento do fungo. Além disso, F. solani vivo e o seu sobrenadante de cultura aumentaram a sobrevivência da ameba, mas de forma diferente em cada cepa amebiana. A presença do fungo resultou em aumento de encistamento das cepas amebianas T4 pulmão e T4, bem como aumentou a resistência da cepa Neff à clorexidina. Curiosamente, a passagem pela ameba aumentou o efeito citopático de F. solani em células de mamíferos. Esses resultados mostram que A. castellanii e F. solani têm uma relação de protocooperação, com benefícios para ambos, e especialmente, indicam um possível efeito sobre as características de virulência de ambos os organismos. Assim a interação entre A. castellanii e F. solani pode resultar em impactos graves nos casos de ceratite. / The incidence of Acanthamoeba and Fusarium species has increased in contact lens-related infectious keratitis. They share several environments and cases of co-infection have been reported. The interaction between the amoeba and other microorganisms may result in significant changes for both, like increased virulence in mammalian hosts. In this study, we evaluated the interaction of Neff, T4 and T4 lung strains of Acanthamoeba castellanii with Fusarium solani and the implications in keratitis. A. castellanii phagocyted the fungi, and conidia were able to germinate inside the amoeba. The co-culture with live amoeba as well as the amebic culture supernatant and lysate significantly increased fungal growth. Moreover, live F. solani and the its culture supernatant enhanced the survival of amoeba, but differently in each A. castellanii strain. The presence of fungi resulted in increased amoebal encystment of T4 and T4 lung strains, end increased the resistence of Neff strain to chlorhexidine. The encystment of T4 and T4 lung strains was increased by the fungi. Interestingly, the passage by Neff amoeba increased the cytophatic effect of F. solani on mammalian cells linage. These results show that A. castellanii and F. solani have a protocooperation relationship, with benefits for both, and especially indicate a possible effect on virulence characteristics of both organisms. These data suggest that the A. castellanii-F. solani interaction may cause severe impacts in keratitis.

Made available in DSpace on 2015-02-04T21:42:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lais Helena Teixeira.pdf: 556132 bytes, checksum: 2153838bf056154d32211284850ce417 (MD5) Previous issue date: 2008-06-26 / Amebas de vida-livre, particularmente as pertencentes aos gêneros Acanthamoeba e Naegleria, são amplamente distribuídas no mundo todo e têm sido consideradas como parasitas oportunísticos de humanos. Elas são resistentes a extremas condições de temperatura e de pH, bem como ao cloro e a outros tipos de desinfetantes. Cistos desidratados podem sobreviver por vários anos numa variedade de hábitats, incluindo solo, poeiras domésticas, esgoto, água fresca, água de torneira, lagos naturais e artificiais e piscinas inadequadamente (ou adequadamente) cloradas, onde as amebas podem se alimentar de bactérias contaminantes. O gênero Acanthamoeba pode ocorrer comensalmente na região nasofaríngea de indivíduos saudáveis, mas pode ser considerada uma infecção oportunista, ocorrendo principalmente em indivíduos debilitados, alcoólatras, doentes crônicos, pessoas submetidas a tratamento com drogas imunossupressoras e pacientes imunocomprometidos. No Brasil, já foram descritos casos de ceratites e encefalites amebianas, mas poucos são os relatos da presença delas no ambiente. O objetivo do trabalho é o de avaliar a ocorrência de amebas de vida-livre, dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria, em ambientes fechados, e para tal foi escolhido a Universidade Católica de Santos, com a finalidade de se conhecer o universo desses organismos, em lugares com alta densidade circulante de indivíduos aparentemente saudáveis. Foram coletadas 200 amostras de poeira dos pisos, no período de 5 meses, com auxílio de swab esterilizado, e transferidas para tubos de ensaio com 5ml de solução salina de Page, usada como transporte. Essa solução foi semeada em ágar não nutriente com 50&#956;l de caldo BHI ou solução de Page enriquecida com E. coli ATCC 25922, viva, com crescimento de 18 a 24h. Os tubos foram incubados a 37ºC e a leitura foi realizada a cada 48h por até 20 dias, em microscópio óptico comum, com aumento de 400X. As amostras positivas foram repicadas para novos tubos com ágar não nutriente da mesma forma. A identificação foi feita pela observação de cistos e trofozoítas baseando-se no tipo de movimento e nos critérios morfológicos. Nas amostras analisadas, observou-se 28% de positividade com cistos e trofozoítas sugestivos para os gêneros Acanthamoeba e Naegleria. As amebas de vida-livre mais encontradas foram as do gênero Acanthamoeba provavelmente por serem organismos comensais e ubiquitários, e por apresentarem maior resistência à ação dos desinfetantes utilizados na limpeza da universidade. Já o gênero Naegleria foi encontrado menos frequentemente talvez por estarem associados a locais úmidos, e as amostras terem sido, em sua grande maioria, coletadas de locais secos.

O tratamento da ceratite por Acanthamoeba é longo, inespecífico e de baixa adesão do paciente. Assim, a busca por novas estratégias de tratamento é necessária. Extratos não aquosos de algumas espécies de Pterocaulon exibem efeito antimicótico e antiparasitário, sendo esta atividade correntemente relacionada à presença de cumarinas. Neste contexto, o presente estudo teve por objetivo o desenvolvimento de nanoemulsões contendo extrato hexânico de Pterocaulon balansae Chodat (rico em cumarinas) visando à obtenção de um produto de uso ocular com atividade amebicida. Em uma primeira etapa, o extrato hexânico foi caracterizado por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos, detectando-se a presença de quatro cumarinas majoritárias, entre elas, a 5-metoxi-6,7-metileno dioxicumarina (5MMDC), selecionada como marcador químico do extrato vegetal. O extrato foi na sequência incorporado em nanoemulsões constituídas de um núcleo de triglicerídeos de cadeia média estabilizado por lecitina de gema de ovo, preparadas por emulsificação espontânea. Tal procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões monodispersas com diâmetro médio de gotícula de aproximadamente 200-300 nm, independente da quantidade de extrato adicionado à formulação (1,0 a 5,0 mg/mL). A atividade amebicida das formulções contra Acanthamoeba castellanii foi dependente da dose e do tempo de incubação, sendo 24 horas e a concentração de 1,25 mg/mL de extrato considerada como ótima (~5% de viabilidade), com efeito similar ao controle clorexidina. Enfim, os estudos de citotoxicidade in vitro demonstraram que as células de epitélio de córnea humana (HCE) não foram afetadas com a incubação com as nanoemulsões através do ensaio de MTT. Esses resultados sugerem o potencial do extrato hexânico, rico em cumarinas de Pterocaulon balansae, associado a nanoemulsões como uma nova estratégia para o tratamento da ceratite ocular causada por Acanthamoeba. / Treatment for keratitis caused by Acanthamoeba is unspecific, long term and with low patient compliance, being the search of new treatment strategies a need. Non-aqueous extracts of some species of Pterocaulon exhibit antimycotic and anti-parasitic activity, usually attributed to the presence of coumarins. In this scenario, the aim of this work is the development of nanoemulsion to associate the coumarin-rich n-hexane extract of Pterocaulon balansae. Previously, the extract was prepared and characterized by high performance liquid chromatography with photodiode array detector. The presence of 4 major coumarins was detected, where 5-methoxy-6,7-methylene dioxycoumarin (5MMDC) was selected as chemical marker. This extract was associated to nanoemulsions composed of egg lecithin and medium chain triglycerides, prepared by spontaneous emulsification. The physicochemical characterization showed the formation of monodisperse nanoemulsions with 200-300 nm diameter, regardless the amount of extract incorporated (1.0-5.0 mg/mL). The amoebicidal activity of the formulations against Acanthamoeba castellanii was both dose-dependent and incubation time-dependent, being 24h of incubation and concentration of 1.25 mg/mL of the extract the optimal (~5% viability), with effect similar to chlorexidine control. Finally, in vitro cytotoxicity studies showed that human corneal epithelial cells were unaffected after incubation with nanoemulsions by MTT assay. These results suggest a potential of the coumarin-rich n-hexane extracts of Pterocaulon balansae associated to nanoemulsion as a new strategy for the treatment of ocular keratitis caused by Acanthamoeba.

Protozoários do gênero Acanthamoeba estão presentes nos mais variados ambientes, sendo esta a ameba mais isolada entre as amebas de vida livre (AVL). Acanthamoeba spp. pode causar encefalomielite e outras doenças graves em animais e seres humanos. Os fatores que contribuem para infecções por Acanthamoeba incluem biologia parasitária, diversidade genética, propagação no meio ambiente e suscetibilidade do hospedeiro. Acanthamoeba pode hospedar diversos microrganismos como: algas, bactérias, fungos, protozoários e vírus. Os estudos sobre as interações entre Acanthamoeba e microrganismos tem aumentado nos últimos anos, principalmente para entender como certas bactérias resistem à fagocitose de seus hospedeiros. Existem poucos estudos sobre adesão e a interação in vitro de Acanthamoeba com macrófagos, que são a primeira linha de defesa em doenças infecciosas. Neste trabalho foi proposto o isolamento de AVL do gênero Acanthamoeba de amostras clínicas de cães. Os resultados deste trabalho foram: 14 isolados de Acanthamoeba confirmados pela PCR, sendo o alvo o gene do 18S rDNA, de mucosa nasal e lesões cutâneas de 96 amostras coletadas de 48 cães. Destes, 13 isolados de Acanthamoeba foram sequenciados, o genótipo foi determinado e o potencial de patogenicidade em células VERO de 8 isolados foi avaliado. Os isolados eram pertencentes aos genótipos T3 (3 amostras), T4 (5 amostras), T5 (4 amostras) e T16 (1 amostra). Os 14 isolados de Acanthamoeba continham pelo menos uma espécie bacteriana internalizada e um isolado continha todas as espécies de endossimbiontes pesquisados. Observou-se que 79% dos isolados de Acanthamoeba hospedavam Legionella pneumophila, 50% Mycobacterium, 79% Pseudomonas e 57% Enterobacteriaceae. Os isolados de Acanthamoeba foram co-cultivados com macrófagos e observou-se à aderência em apenas 1h de contato, confirmando que Acanthamoeba é contato dependente. Este estudo descreveu os primeiros isolados de Acanthamoeba de amostras clínicas provenientes de cães. Também foi o primeiro relato da presença de endossimbiontes neste tipo de isolado realizado na América Latina. Neste estudo foi isolado pela primeira vez o genótipo T16 de amostra clínica. A importância deste estudo está no fato de verificar a presença de Acanthamoeba potencialmente patogênica em amostras clínicas de animais e pesquisar bactérias patogênicas internalizadas nestas amebas. Podendo estes microrganismos estar envolvidos em doenças infecciosas e futuras complicações como doenças graves em mamíferos. / Protozoa of the genus Acanthamoeba are present in diverse environments and are the most common free-living amoeba (FLA). Acanthamoeba spp. cause encephalitis and can cause severe illness in animals and humans. The factors that contribute to infections include Acanthamoeba parasite biology, genetic diversity, spreading in the environment and host susceptibility. Acanthamoeba may host various microorganisms such as algae, bacteria, fungi, protozoa and viruses. Studies regarding the interactions between Acanthamoeba and microorganisms have increased in recent years, mainly to understand how certain bacteria resist phagocytosis by their hosts. There are few studies on adherence and in vitro interaction of Acanthamoeba with macrophages, which are the first line of defense in infectious diseases. In this study, we proposed the isolation of the FLA Acanthamoeba from clinical samples from dogs. We found 14 Acanthamoeba isolates confirmed by PCR and by the 18S gene target rDNA in nasal mucosa and skin lesions out of 96 samples collected from 48 dogs. From this 14 isolates, 13 Acanthamoeba isolates were sequenced and the genotype was determined. Regarding the potential for pathogenicity in VERO cells, 8 isolates was assessed. The isolates belonged to genotype 3 (3 samples), T4 (5 samples), T5 (4 samples) and T16 (1 sample). The 14 isolates of Acanthamoeba contained at least one bacterial species internalized and one isolate contained all endosymbionts species studied. It was observed that 79% of isolates of Acanthamoeba carryng Legionella pneumophila, Mycobacterium 50%, 79% Pseudomonas and 57% Enterobacteriaceae. Acanthamoeba isolates were co-cultured with murine macrophages and adherence was observed in 1h of contact, confirming that Acanthamoeba interact with defense cells in a contact-dependent manner. This study describes the first clinical isolates of Acanthamoeba samples from dogs. It was also the first report of the presence of this type of endosymbionts isolated held in Latin America. As far as we know, this is the first study to isolate a T16 genotype amoeba from clinical sample. The importance of this study lies on the fact verify the presence of potentially pathogenic Acanthamoeba in samples from animals and search pathogenic bacteria internalized by these amoebae. These microorganisms may be involved in infectious diseases in mammals.

L. monocytogenes is ubiquitous in environment and can grow and survive in a wide range of environmental conditions. It contaminates foods via raw materials or food processing environments. However, the current knowledge of its ecology and in particular, the mode of environmental survival and transmission of L. monocytogenes remains limited. One important aspect of environmental survival of L. monocytogenes may be contact with other microorganisms, including amoebae, which naturally feed on bacteria as a source of nutrients. In this context, research has shown that several intra-cellular pathogens are able to survive or replicate within free-living amoebae. In view of the potential for amoebae to act as environmental reservoirs for bacteria, the interaction of L. monocytogenes with freeliving Acanthamoeba spp. and the impact of plasmid-associated genes on their interaction were investigated. Several strains of environmental and clinical isolates of L. monocytogenes were used for co-culture with amoebae. Axenic amoebae were isolated from environmental sources (water, soil) by cultivation in PYG supplemented with antibiotics. L. monocytogenes strains were co-cultured with amoebae on plates, in trays (as monolayers of amoeba cells) and in flasks to provide qualitative and quantitative assessments of the survival of bacteria and amoebae. Bacteriological methods and microscopy (fluorescence, TEM and phase contrast) were used to track the fate of internalized bacteria. A vector that allowed GFP expression under control of the prfA promoter was used to assess the expression of Listeria virulence genes within amoeba cells. The role plasmid encoded genes in interactions of L. monocytogenes with amoebae was assessed using plasmid-cured versus wild type in the co-cultures. Finally the mechanisms of bacterial uptake and killing by A. polyphaga were assessed using chemical inhibitors that affected actin polymerization (Cytochalasin D, Wortmannin), phagosome-lysosome fusion (Suramin) and phagosomal acidification (ammonium chloride, Bafilomycin A and Monensin). Sequence analysis of a section of the large plasmid from strain DRDC8 revealed a high level of similarity of gene organization and DNA sequences with plasmid-borne genes found in other Listeria spp. and Gram-positive bacteria. While the majority of environmental isolates of L. monocytogenes contained a large plasmid, it was absent in clinical isolates. Further, plasmid of DRDC8 was lost during serial passage in HeLa cells. This data indicated that the plasmid may be readily lost during isolation procedures or during growth within host animals/cells and thus plasmid instability may explain the absence of plasmid in clinical isolates. Co-culture of L. monocytogenes with Acanthamoeba spp. showed these amoebae are able to actively phagocytose and kill bacteria within 2-5 h irrespective of temperature used. Amoebae killed both plasmid cured and LLO mutants with the same rate for the parental bacteria. Fluorescence microscopy and TEM of bacteria within trophozoites showed the bacteria become confined within tight vacuolar structures surrounded by lysosomes and mitochondria and degraded after 4 to 5 h post phagocytosis. This data indicated that although L. monocytogenes is an effective pathogen of mammalian cells, it could not escape from phagosomes and evade the killing mechanisms of amoeba trophozoites. Consequently, bacteria are killed within phagolysosome in trophozoites before they express their virulence genes to escape from phagosomes and get access to cytoplasm. This was confirmed by observing no GFP expression by bacteria carried prfA::gfp construct in co-culture with amoebae whereas it was observed during co-culture with HeLa cells. Using inhibitors, the mechanisms involved in phagocytosis, and killing of L. monocytogenes cells by A. polyphaga were assessed. The results showed that the uptake of bacterial cells is mediated by the trophozoites but not the bacteria and mannose binding protein is not involved in this process. Furthermore, pre-treatment of trophozoites with inhibitors indicated both phagosomal acidification and phagosome lysosome fusion are involved in killing of bacteria. These results suggest that compared to mammalian cells e.g. HeLa cells, amoeba trophozoites are better able to effectively inactivate and destroy internalized L. monocytogenes cells. In conclusion, Acanthamoeba spp. are able to uptake and kill L. monocytogenes cells in phagolysosome compartments. However, bacteria can saprophyticaly grow on materials released from amoeba trophozoites. Thus this group of amoebae is not able to harbour L. monocytogenes cells, or act as environmental reservoirs for this opportunistic pathogen under the laboratory conditions tested. / http://proxy.library.adelaide.edu.au/login?url= http://library.adelaide.edu.au/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?BBID=1292868 / Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, School of Molecular and Biomedical Science, 2007

Reproduction de : Mémoire du DES : Biologie médicale : Nantes : 2008. Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Acanthamoeba mannose-binding protein (AcMBP) is a virulence factor of the free-living amoeba, Acanthamoeba castellanii. It is crucial for the development of Acanthamoeba keratitis (AK), a corneal infection that often causes blindness. AK is associated with contact lens use and contaminated water sources. Therapeutic unresponsiveness is attributed to similarities in the biological processes that Acanthamoeba shares with humans and its ability to form drug-resistant cysts. I aimed to characterise AcMBP as a basis for developing future drugs against Acanthamoeba. To start with, I carried out morphological studies on the two well-known life stages of Acanthamoeba and characterised a third stage: the protocysts. Mature cysts and protocysts could not interconvert directly, but always excysted to trophozoites. This is important because Acanthamoeba can potentially be trapped as protocysts, which are likely to be more susceptible to drugs. I also studied Acanthamoeba adhesion towards various surfaces and cytopathic activities towards cells (including human corneal epithelial cells). Whilst AcMBP was important for adhesion, it is not the only receptor involved. To gain structure/function information, I expressed the extracellular portion of AcMBP and three truncated fragments. AcMBP is a Ca2+-dependent lectin (~100 kDa) that binds to mannose. Ca2+ is essential for lectin activity and stability. The extracellular fragment is monomeric, indicating that trimerisation, shown previously, depends on the membrane-spanning and/or intracellular regions. Bioinformatics revealed that lectin activity is almost certainly located in a DUF 4114 domain (~10 kDa, DUF: domain of unknown function). N-terminal fragments, including the DUF4114 domain did not bind to mannose-Sepharose, suggesting that part of the cysteine-rich domain is also important. AcMBP bound to a variety of mammalian glycans so may have more than one lectin activity. Although attempts to crystallise AcMBP were unsuccessful, future structural analysis will be useful for defining the domains and determining how it binds to mannose.