Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:18:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327688.pdf: 1457038 bytes, checksum: 2aa37a38003e3b6e579ae614ab6e60cb (MD5) Previous issue date: 2014 / As quinonas são uma classe de substâncias químicas de interesse na terapêutica do câncer, visto que algumas delas apresentam potencial antitumoral. Pesquisas sugerem que o efeito antitumoral destes compostos pode ser potenciado por substituições estratégicas dos substituintes ligados ao núcleo quinóide. Desta forma, este trabalho teve como objetivo caracterizar o potencial citotóxico, antiproliferativo e antitumoral bem como o mecanismo molecular de ação de 1,4-naftoquinonas substituídas. Dentre os compostos avaliados, os que apresentaram maior atividade citotóxica para linhagem tumoral MCF7 (câncer de mama humano), avaliada pelo método do MTT, foram DPB1, DPB2, DPB4 e DPB5 (CI50 < 25 µM). Sugerindo-se que o efeito citotóxico é influenciado principalmente por seus substituintes onde grupos doadores e aceptores de elétrons modulam as propriedades eletrônicas do átomo de nitrogênio presente nas moléculas, facilitando ou dificultando a ocorrência do ciclo redox. Além disso, estes mesmos quatro compostos inibiram a formação de colônias celulares, promovendo um efeito citostático. Através do ensaio de fragmentação do DNA plasmidial e ensaio cometa constatou-se que as 1,4-naftoquinonas substituídas promoveram dano direto ao DNA e que a fotoativação pela luz UV-A (365 nm) potencializou este dano. Para verificar se as mesmas possuíam interação direta com o DNA, foi utilizada a técnica de varredura por espectrometria, utilizando-se o CT-DNA. Foi observado que os compostos interagem com o DNA, promovendo um efeito hipocrômico, indicando que a interação seja por intercalação, o que foi confirmado pelo ensaio de fluorescência, utilizando o brometo de etídeo como agente intercalante. O dano ao DNA induzido pelos compostos foi também confirmado por imunoeletroforese, as naftoquinonas substituídas aumentaram a fosforilação da histona gH2Ax. Por outro lado, a citometria de fluxo demonstrou que os compostos avaliados promoveram a parada do ciclo celular na fase G2, o que foi também confirmada pelo ensaio de imunoeletroforese, onde não se observou inibição na expressão da proteína cdk2, o que poderia ser devido ao fato desta cinase dependente de ciclina estar particularmente envolvida na regulação do ciclo celular na fase G1. Além disso, também foi observado que os compostos promoveram a morte celular predominantemente por apoptose independente de caspase e/ou necrose programada tanto in vivo quanto in vitro. Considerando que estes compostos aumentaram a expressão da p53 e não promoveram a clivagem da PARP. Diante desses resultados, sugere-se que os compostos possam ter promovido a morte celular por necrose programada ou necrosis like/ apoptose independete de caspase. Sugere-se ainda que os efeitos citotóxicos, genotóxicos e citostático promovido pelos compostos se devam a geração de EROS, que foi observado pelo ensaio com DCFH-A, onde os compostos DPB1, DPB2, DPB4 e DPB5 apresentaram um aumento significativo de geração de EROs (7874,22; 6056,37; 10547,47 e 3833,33 unidades de fluorescência/mg de proteína) em relação ao controle negativo (1493,10 unidades de fluorescência/mg de proteína). Os ensaios in vivo, demonstraram que DPB1, DPB2, DPB4 e DPB5 apresentaram efeito antitumoral, se destacando o composto DPB4. Em relação ao tipo de morte celular in vivo foi observado que os compostos aumentaram o percentual de células apoptóticas iniciais e principalmente tardias e/ou necróticas, confirmando os resultados visualizados in vitro. Além disso, foi investigado se os compostos poderiam também ter uma atividade antiangiogênica, sendo este efeito observado para todos os compostos avaliados (DPB1, DPB2, DPB4 e DPB5), destacando-se o composto DPB2 que em concentrações de 5, 10 e 20 µM/ml reduziram o percentual de vasos em 67,69; 53,84 e 76,92%. Por fim, sugere-se que os efeitos mediados pelas 1,4-naftoquinonassubstituídas em estudo se devam ao sinergismo de três mecanismos: ciclo redox, pelo aumento da geração de EROs, intercalação ao DNA e/ou inibição da topoisomerase II, que consequentemente induz a morte das células tumorais.<br> / Abstract : Quinones are a class of chemicals of interest in cancer therapy, since some of them have antitumor potential. Research suggests that the antitumor effect of these compounds can be potentiated by strategic substitutions quinoid substituents attached to the core. Thus, this study aimed to characterize the cytotoxic, antiproliferative and antitumor potential as well as the molecular mechanism of action of substituted 1,4- naphthoquinones. Among the compounds evaluated, showed the highest cytotoxic activity to tumor cell line MCF7 (human breast cancer), as evaluated by the MTT method were DPB1, DPB2, DPB4 and DPB5 (IC50 < 25 mM) having substituents attached directly to the naphthoquinone nucleus. Suggesting that the cytotoxic effect is mainly influenced by their substituents groups where donors and electron acceptors modulate the electronic properties of this nitrogen atom in molecules, facilitating or hindering the occurrence of the redox cycle. Furthermore, these same four compounds inhibited the formation of cell colonies by promoting a cytostatic effect. Through the fragmentation test and the plasmid DNA comet assay was found that 1,4- naphthoquinones substituted promoted direct DNA damage and that the photoactivation by UV-A light (365 nm) potentiated this damage. To verify whether they had direct interaction with DNA, the technique of scanning spectrometer was used, using the CT-DNA. It was observed that the compounds interact with the DNA, providing a hypochromic effect, indicating that the interaction is by intercalation, which was confirmed by fluorescence assay using ethidium bromide as the intercalating agent. The DNA damage induced by the compounds was also confirmed by immunoblot, substituted naphthoquinones increased phosphorylation of histone ?H2Ax. Furthermore, flow cytometry showed that the compounds evaluated promoted cell cycle arrest in the G2 phase, which was also confirmed by immunoelectrophoresis assay where no inhibition was observed in the expression of the cdk2 protein, which could be due to the fact this cyclin dependent kinase to be particularly involved in the regulation of the cell cycle in the G1 phase. Moreover, it was observed that the compounds promoted cell death predominantly by caspase -independent apoptosis and / or programmed necrosis both in vivo and in vitro. Whereas these compounds increased the expression of p53 and did not promote the cleavage of PARP. From these results, it is suggested that the compounds may have promoted cell death by necrosis or programmed like necrosis. It is also suggested that the cytotoxic, genotoxic and cytostatic effects promoted by the compounds are due to generation of ROS, which was observed by DCFH-A assay, where DPB1 , DPB2 , DPB4 and DPB5 compounds showed a significant increase in ROS generation (7874.22, 6056.37, 3833.33 and 10547.47 fluorescence units / mg protein ) compared to negative control (1493.10 fluorescence units/mg protein). In vivo assays showed that DPB1, DPB2, DPB4 and DPB5 showed antitumor effect, highlighting the compound DPB4. Regarding the type of cell death was observed that compounds increased the percentage of early apoptotic cells and mostly late and/or necrotic, confirming the results shown in vitro. Furthermore, we investigated whether the compounds could also have a antiangiogenic activity, this effect being observed for all compounds evaluated (DPB1, DPB2, DPB4 and DPB5), highlighting the compound DPB2 that at concentrations of 5, 10 and 20µM /ml reduced the percentage of vessels in 67.69, 53.84 and 76.92 %. Finally, it is suggested that the effects mediated by substituted 1,4- naphthoquinones study are due to the synergism of three mechanisms: redox cycle by the increased generation of ROS, and DNA intercalating / or inhibition of topoisomerase II, which consequently leads to tumor cell death.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:45:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 329217.pdf: 1998132 bytes, checksum: e00638349c5bf4365456b99f47193051 (MD5) Previous issue date: 2014 / Nas últimas décadas a cadeia produtiva de alimentos foi alvo de inovações principalmente sob dois aspectos: a problemática do uso excessivo de aditivos incorporados diretamente aos alimentos, e quanto ao aumento do consumo de materiais plásticos tradicionais para a fabricação de embalagens que, por sua vez, impactam em questões ambientais. Neste contexto, foram elaborados filmes biodegradáveis multifuncionais com polímero natural (amido de milho) e polímero sintético (polietileno linear de baixa densidade - PELBD), nas concentrações de amido 10, 20, 30, 40, 50 %, denominados de F10, F20, F30, F40 e F50, respectivamente, aditivados com ácido cítrico como agente antioxidante, antimicrobiano e compatibilizante. Também foi produzido um filme controle (FC) somente de PELBD. A microscopia eletrônica de varredura demonstrou que a incorporação do amido provocou alterações na superfície devido a uma distribuição não uniforme e existência de cristais, principalmente nos filmes com maior proporção mássica de amido. Estas caraterísticas influenciaram as propriedades mecânicas, com uma diminuição da Resistência máxima à Tração dos filmes com concentrações superiores a 10% da mistura de amido. Efeito semelhante foi percebido no Alongamento até a ruptura e Módulo de elasticidade. A solubilidade e o grau de intumescimento dos filmes em água aumentaram de forma diretamente proporcional à concentração de amido dos filmes. Em relação aos parâmetros de cor dos filmes foi observado um aumento na Luminosidade e na intensidade da cor vermelha (a*) principalmente para os filmes com maior adição de amido (F40 e F50). A cor amarela (b*) foi intensificada significativamente nos filmes F30, F40 e F50. Na análise termogravimétrica das blendas foi demonstrado que a degradação ocorre em três estágios, com mudanças relativas à proporção de amido, diferentemente do FC que degradou em apenas um estágio. Os espectros FT-IR para os diferentes filmes apresentaram bandas de absorção típicas dos grupos funcionais do PELBD com um aumento gradativo na intensidade dos picos característicos do amido de acordo com sua incorporação. Referente à condutividade elétrica dos filmes, esta aumentou com a adição da mistura de amido. Após caracterização, o filme foi avaliado quanto à atividade antioxidante/antimicrobiana na conservação de amostras de carne armazenadas em refrigeração. O filme F30 apresentou uma redução significativa dos índices de TBARs e no último dia de armazenamento nos valores de pH e na contagem bacteriana total da carne quando comparadas ao FC (não ativo). Foidetectada uma melhora em relação à cor da carne embalada, com aumento significativo de a* e Chroma, característicos da cor vermelha desejável de carnes bovinas. Na avaliação da migração do ácido cítrico em meio simulante, foi detectada migração a partir do segundo dia de armazenamento. A biodegradabilidade dos filmes foi confirmada pela inoculação em meio com Aspergillus niger, pela ação direta da enzima amilase e em solo. O filme ativo biodegradável se apresenta como uma boa alternativa para o armazenamento de carne bovina, tanto sob os aspectos de qualidade da carne, oxidação de gorduras, degradação microbiana e coloração, quanto pela necessária redução do uso de materiais plásticos convencionais na cadeia produtiva cárnea.<br> / Abstract : In recent decades the food chain was the target of innovations mainly in two aspects: the problem of excessive use of additives incorporated directly to food, and about of increased consumption of traditional plastics for the manufacture of packaging which, in turn, impact on environmental issues. In this context, biodegradable films with natural polymer (corn starch) and synthetic polymer (linear low density polyethylene - LLDPE) were prepared at concentrations of starch 10, 20, 30, 40, 50%, called F10, F20, F30, F40 and F50, respectively, with additives citric acid as antioxidant, antimicrobial and coupling agent. Also produced a film control (FC) only of LLDPE. The Scanning Electron Microscopy showed that the incorporation of starch caused changes on the surface of the films. These characteristics influence the mechanical properties of the films, with a decrease of Tensile Strength in concentrations higher than 10% of the starch. A similar effect was observed in Elongation at Break and Modulus of Elasticity. The water vapor permeability of the films was affected by the incorporation of starch, but was framed as moderate. The solubility and degree of swelling of the films in water increased in direct proportion to the concentration of starch films. Regarding the color parameters of the films was observed an increase in brightness and intensity of redness (a*) mainly for F40 and F50. The yellow color (b*) was significantly enhanced in F30, F40 and F50. In Thermogravimetric analysis of blends was shown deterioration in three stages, with changes on the proportion of starch, unlike FC has degraded in just one stage. The FT-IR spectra for the different films presented the typical absorption bands of the functional groups of LLDPE with a gradual increase in the intensity of the characteristic peaks of starch according to their incorporation. In relation the electrical conductivity of the films, was observed a increased with the addition of the mixture of starch. After characterization, the film was evaluated for antioxidant/antimicrobial activity in the conservation of meat samples stored under refrigeration. The film F30 showed a significant reduction of oxidation (TBARS), pH and total bacterial count of meat when compared with samples from FC (not active). An improvement was detected in relation to the color of packaged meat, with significant increase in a* and Chroma, the desirable characteristic red color of beef. The migration of citric acid in simulating media was detected from the second day of storage. The biodegradability of the films was confirmed by inoculation in medium with Aspergillus niger by the direct action of the enzyme amylase andsoil. The biodegradable active film was presented as a good alternative for storage of beef, due to preserve aspects of meat quality like: lipid oxidation, microbial degradation and staining, and by reducing the use of conventional plastic materials in the meat production chain.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:45:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327071.pdf: 10727675 bytes, checksum: 7885ff7ed16785edf9c7164f271b1a5b (MD5) / A 1a,25-diidroxivitamina D3 (1,25-D3) é o metabólito ativo da vitaminaD3. A 1,25-D3 é crítica para a manutenção da reprodução, já que aredução da fertilidade foi observada em ratos machos deficientes devitamina D. Este hormônio exerce ações via receptor nuclear (VDRn) eatravés de vias de respostas rápidas associadas a um receptor presente namembrana plasmática (VDRmem). As células de Sertoli são o principalcomponente estrutural do túbulo seminífero, e são responsáveis pelaregulação do fluxo de nutrientes para as células germinativas emdesenvolvimento. Dois fatores importantes no metabolismo das célulasde Sertoli são a atividade da enzima gama-glutamil transpeptidase(GGT) e a secreção de lactato para a nutrição das células germinativas.O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito e o mecanismo de ação da1,25-D3 na atividade da enzima GGT e no metabolismo energéticoatravés da secreção de lactato e captação de glicose em células de Sertolide ratos de 30 dias de idade. Neste trabalho foi demonstrado que a 1,25-D3 aumentou a atividade da GGT em 6 h através da interação com oreceptor VDRmem e possível ativação da proteína cinase A (PKA), eem tempos mais prolongados o bloqueio da síntese proteica inibiu oefeito do hormônio, sugerindo que a regulação da atividade da GGT pela1,25-D3 também esteja relacionada à expressão da enzima. Como a GGTparticipa na regeneração da glutationa (GSH), os níveis de GSH foramestudados nas células de Sertoli, porém não houve alteração destesníveis no tratamento com a 1,25-D3. O lactato é o substrato energéticopreferencial das células germinativas, e foi verificado que o tratamentodas células de Sertoli com a 1,25-D3 estimulou a liberação de lactato,além de aumentar a captação de [14-C]-2-Deoxi-d-glicose (14C-DG) e aatividade intracelular da enzima lactato desidrogenase (LDH). Afosforilação oxidativa foi verificada nas células de Sertoli através derespirometria de alta resolução, e foi observado que a respiraçãomitocondrial não foi alterada nas células tratadas com a 1,25-D3corroborando com o aumento da produção de lactato pelas células deSertoli. Neste ensaio também foi observada uma diminuiçãosignificativa na produção de espécies reativas de oxigênio. Foi medida aatividade da enzima LDH extracelular, onde foi demonstrado que a1,25-D3 não possui capacidade citotóxica. Como conclusão destetrabalho, a 1,25-D3 aumenta a atividade da GGT e secreção de lactato,parâmetros importantes da função das células de Sertoli, o que sugereque este hormônio representa um dos fatores importantes na regulaçãodo metabolismo das células de Sertoli, destinado a aumentar ofornecimento de nutrientes e melhorar os mecanismos de defesaantioxidantes para o desenvolvimento normal e completo da ondaespermatogênica.<br> / Abstract: 1a,25-diidroxivitamin D3 (1,25-D3) is the biologically active metaboliteof vitamin D3. 1,25-D3 is critical for the maintenance of normalreproduction since reduced fertility is observed in vitamin D-deficientmale rats. This hormone acts through a nuclear receptor (VDRn) and viarapid response pathways associated to a putative membrane receptor(VDRmem). Sertoli cells are the most important structural component ofseminiferous tubules, and they are responsible for regulating the nutrientinflux for germ cells development. Two important factors in Sertoli cellmetabolism regulation are the gamma-glutamyl transpeptidase (GGT)enzime activity and lactate secretion for germ cell nutrition. The aim ofthe present work was to study the effect and mechanism of action of1,25-D3 on GGT activity and on metabolic activity through lactatesecretion and glucose uptake in 30-day-old rat Sertoli cells. The resultsshow that 1,25-D3 increased GGT activity in 6 h through interactionwith VDRmem and possibly with protein kinase A (PKA) activation,and in longer incubations the protein synthesis inibition prevented thehormone effect, suggesting that the GGT activity regulation by the 1,25-D3 is also related to enzyme synthesis. As GGT is also related togluthatione (GSH) regeneration, the GSH levels in Sertoli cells wereverified, but no alteration was observed in cells incubated with 1,25-D3.Lactate is the preferred energetic substract of germ cells, and it wasobserved that Sertoli cells treatment with 1,25-D3 increased the lactaterelease, and also [14-C]-2-Deoxy-d-glucose (14C-DG) uptake and lactatedehydrogenase (LDH) intracellular activity. The oxidativephosphorylation in Sertoli cells was verified through high resolutionrespirometry, and it was observed that mitochondrial respiration was notaltered in cells treated with 1,25-D3, although the increased lactaterelease in these cells. In this essay it was also observed a decrease inoxygen reactive species production. The extracellular LDH activity wasmeasured and it was demonstrated that 1,25-D3 doesn?t have citotoxiccapacity. From this work, it is concluded that 1,25-D3 regulates GGTactivity and lactate release, significant parameters of Sertoli cellfunction, suggesting that this hormone represents an important factor inthe regulation of Sertoli cell metabolism. Also, 1,25-D3 improvescellular antioxidant defenses to the ongoing spermatogenesis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:58:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327702.pdf: 2174850 bytes, checksum: d91a97be57c43c41d3fa9c447b791113 (MD5) Previous issue date: 2014 / A ansiedade é vista pela ciência moderna como um conjunto de comportamentos, com respostas endócrinas e fisiológicas, que objetivam proteger o indivíduo de possíveis ameaças. Um teste amplamente utilizado na pesquisa da ansiedade é o labirinto em cruz elevado (LCE), por ser simples, não requerer procedimentos estressantes e com sensibilidade bidirecional. Recentemente constatou-se que uma única injeção sistêmica de pilocarpina (PILO) - agonista não seletivo muscarínico - em doses não-convulsivantes induz um perfil ansiogênico em ratos avaliados 24h, 1 mês e até 6 meses após o tratamento. A fim de melhor entender os mecanismos que levam a esta alteração comportamental persistente, o presente trabalho buscou investigar o papel dos receptores NMDA, através do pré-tratamento e tratamento com MK-801, na modulação dos comportamentos relacionados à ansiedade. Ratos Wistar adultos machos foram tratados com PILO (150 mg/Kg i.p) e MK-801 (0,03 e 0,06 mg/Kg i.p.), e avaliados 24 h ou 30 dias após no LCE. A injeção de PILO promoveu efeitos ansiogênicos nos animais avaliados no teste do LCE, com uma diminuição do tempo gasto e número de entradas nos braços abertos do labirinto em comparação aos animais controle. O pré-tratamento, bem como o tratamento com antagonista, nas duas doses utilizadas, foram capazes de prevenir e bloquear, respectivamente, os efeitos ansiogênicos observados nos animais tratados com PILO 24h e 30 dias após o tratamento, havendo aumento no tempo e número de entradas nos braços abertos do labirinto e na incidência de comportamentos relacionados à avaliação de risco. Buscando melhor esclarecer o envolvimento dos receptores NMDA no modelo de ansiedade induzida pela pilocarpina, assim como as prováveis vias de ativação envolvidas, avaliou-se a participação do óxido nítrico (NO) por meio expressão das proteínas PSD-95 e nNOS. Os resultados obtidos mostram que os animais tratados com pilocarpina apresentaram diminuição da expressão de nNOS, efeito revertido pelo tratamento com antagonista. Os resultados demonstrados no presente estudo sugerem um papel importante dos receptores glutamatérgicos-NMDA numa interação sinérgica com os receptores muscarínicos, mostrando que a modulação interativa entre esses dois sistemas neurotransmissores constitui um mecanismo importante no perfil ansiogênico desencadeado pela pilocarpina, bem como um provável envolvimento do NO na regulação da função dos receptores de NMDA na modulação dos estados ansiosos.<br> / Abstract : Modern science sees anxiety as a set of behaviors with endocrine and physiological responses that aim to protect the individual from possible threats. A test widely used in anxiety research is the elevated plus maze (EPM), for being simple and not require bidirectional sensitivity and stressful procedures. Recently it was found that a single systemic injection of pilocarpine (PILO) Â a non-selective muscarinic receptor agonist - at non-convulsant doses induces an anxiogenic profile in rats evaluated 24h, 1 month and up to 6 months after treatment. In order to better understand the mechanisms that lead to this persistent behavioral change, this study investigated the role of NMDA receptors, through the pre-treatment and treatment with MK-801, in the modulation of anxiety-related behaviors. Adult male Wistar rats were treated with PILO (150 mg/kg, i.p.) and MK-801 (0.03 and 0.06 mg/kg, i.p.) and evaluated 24 h or 30 days later in the EPM. The injection of PILO promoted anxiogenic-like effects in animals evaluated in the EPM test, with a decrease in the time spent and number of entries on the open arms of the maze in comparison to control animals. The pre-treatment and treatment with antagonist, at both doses used, were able to block and prevent, respectively, the anxiogenic-like effects observed in PILO-treated animals 24 h and 30 days after the treatment, increasing the time spent and number of entries on the open arms of the maze and risk-assessment behaviors incidence. Seeking to clarify the involvement of NMDA receptors in the pilocarpine-induced anxiety model, as well as the likely activation pathways involved, we evaluated the role of nitric oxide (NO) through expression of PSD-95 and nNOS proteins. The results show that PILO-treated animals showed decreased nNOS expression, and this effect was reversed by the antagonist treatment. The results reported in this study suggested a major role of NMDA-glutamate receptors in a synergistic interaction with muscarinic receptors, showing that interactive modulation between these two neurotransmitter systems is an important mechanism in the anxiogenic-like behavior induced by pilocarpine, as well as a possible involvement of NO in regulating the function of NMDA receptors in the modulation of anxious states.

Tese (doutorado)-Universidade Federal do Parana / Made available in DSpace on 2016-01-08T19:27:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1995

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-26T12:04:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 302042.pdf: 693987 bytes, checksum: 823b44b5d3f07e3feb6ab9f9b1c8df9d (MD5) / Glutamato, o principal neurotransmissor central excitatório, induz excitotoxicidade neuronal pela ativação de receptores NMDA e AMPA, promovendo o influxo de cálcio nos neurônios. Estudos recentes do nosso grupo demonstram que as frações e sub-frações isoladas da Croton celtidifolius possuem propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e antinociceptivas. Assim, utilizando um modelo in vitro de excitotoxicidade induzida por glutamato (Glu) e in vivo de neurotoxicidade decorrente da lesão da medula espinhal de ratos Wistar adultos, avaliou-se o possível efeito neuroprotetor da fração rica (FRP) em proantocianidinas isolada da Croton celtidifolius. Glu induziu morte de células do gânglio da raiz dorsal (GRD), de forma dependente da concentração e do tempo de exposição. O pós-tratamento com a FRP (1 - 100 µg/ml) inibiu em até 37% a morte celular induzida por Glu (1 mM). Já o co-tratamento, foi capaz de reduzir a morte celular em 27%. A exposição das células ao Glu (0,01, 0,1 e 1 mM) aumentou os níveis da enzima lactato desidrogenase de 6,5 % (células controle) para 37, 49 e 63 %, respectivamente, indicativo de alteração na permeabilidade da membrana celular. Esta alteração foi atenuada pelo tratamento das células com a FRP (100 µg/mL). Ademais, o insulto glutamatérgico induziu a geração de espécies reativas de oxigênio, a qual foi inibida pelo tratamento das células do GRD com FRP (100 µg/ml). Além disso, o efeito neuroprotetor desencadeado pela FRP parece ser mediado em parte pela inibição de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, mas não os metabotrópicos uma vez que a perda da viabilidade celular decorrentes da exposição das células ao agonista NMDA, mas não ao agonista metabotrópico, foi revertida pela FRP. Nos estudos in vivo, animais submetidos a lesão medular e tratados com a FRP na dose de 10 mg/kg por via intraperitoneal, durante 5 dias consecutivos, apresentaram uma melhora significante na performance locomotora e na força de preensão, quando comparado aos animais lesados tratados com veículo. Em conjunto, estes resultados fornecem a primeira evidência de que a FRP atenua a morte celular por necrose e por apoptose, bem como a produção de EROs induzida por Glu, inibe a morte celular induzida por peróxido de hidrogênio e pelo agonista NMDA. A FRP também foi capaz de promover uma melhora na atividade locomotora e na força de preensão de animais submetidos à lesão traumática da medula espinhal, reforçando a hipótese de que polifenóis podem ser ferramentas terapêuticas promissoras como agentes neuroprotetores. / Glutamate, the major central excitatory neurotransmitter, induces neuronal excitotoxicity by activation of NMDA and AMPA receptors and stimulating the influx of calcium into neurons. Recently, our group showed that fractions and subfractions isolated from Croton celtidifolius have antiinflammatory, antioxidant and antinociceptive properties. Thus, using an in vitro model of excitotoxicity induced by glutamate (Glu) and in vivo neurotoxicity caused by spinal cord injury (SCI) in adult Wistar Rats, we evaluated the possible neuroprotective effect of a proanthocyanidin-rich fraction (PRF) isolated from the bark of Croton celtidifolius. Glu induced cell death of dorsal root ganglion (DRG) in a manner concentration-dependent and the exposure time. The post-treatment with FRP (from 1 to 100 ìg / mL) inhibited the cell death induced by Glu (1 mM) in 37%. Since co-treatment, was able to reduce cell death in 27%. The exposure of cells to glu (0.001, 0.1 and 1 mM) increased the levels of the enzyme lactate deydrogenase from 6.5% (control cells) to 37, 49 and 63% respectively, indicating changes in cell membrane permeability. This change was attenuated by treatment of cells with the PRF (100 ìg / mL). Moreover, the glutamatergic insult induced generation of reactive oxygen species, which was inhibited by treatment of cells with FRP (100 ìg / mL). Moreover, the neuroprotective effect triggered by FRP seems to be mediated in part by inhibition of NMDA-type glutamate receptors, but not metabotropic receptors, since the loss of cell viability after exposure of cells to NMDA agonist, but not a metabotropic agonist was reversed by FRP. The in vivo studies, animals subjected to SCI and treated with PRF at a dose of 10 mg / kg by i.p. route for 5 consecutive days showed a significant improvement in locomotor performance and grip force when compared to injured animals treated with vehicle. Taken together, these results provide the first evidence that PRF attenuated the cell death by apoptosis and the production of ROS induced by Glu, also inhibits cell death induced by hydrogen peroxide and the NMDA agonist receptors. The FRP was able to promote an improvement in locomotor activity and grip strength of animals subjected to traumatic spinal cord injury (SCI), reinforcing the hypothesis that polyphenols are promising therapeutic tools such as neuroprotective agents.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-03-04T20:08:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 309424.pdf: 8231566 bytes, checksum: 0f3205f2eef3d499b5f1b73d0e524bb7 (MD5) / Os transtornos de humor são doenças comuns, severas, crônicas e muitas vezes, ameaçadoras de vida. A depressão é uma doença heterogenia com manifestações fisiológicas, comportamentais e psicológicas. Os sistemas de neurotransmissores que têm recebido maior atenção nos estudos da neurobiologia da depressão são os sistemas monoaminérgicos, outros sistemas neuronais e processos bioquímicos, como o estresse oxidativo, a neurogênese e a morte celular, podem estar envolvidos na patogênese da depressão. O escitalopram é um inibidor seletivo da recaptação de serotonina (ISRS) e a duloxetina é um inibidor da recaptação de serotonina e noradrenalina (IRSN), ambos usados no tratamento da depressão. Este estudo investigou o efeito antidepressivo do escitalopram e da duloxetina no teste do nado forçado (TNF) e no teste da suspensão da cauda (TSC) em camundongos e o seu mecanismo de ação. O escitalopram nas doses de 0,1-10 mg/kg, i.p. e a duloxetina nas doses de 1-30 mg/kg, i.p., causaram uma redução no tempo de imobilidade no TNF e no TSC, sem alterar a atividade locomotora no campo aberto. A administração oral de escitalopram (0,3-10 mg/kg) e de duloxetina (1-30 mg/kg) também reduziu o tempo de imobilidade no TNF. Foi avaliado o envolvimento do sistema glutamatérgico, via L-arginina-óxido nítrico e as vias de sinalização celular no efeito antidepressivo do escitalopram e da duloxetina no TNF. A ação antidepressiva do escitalopram (3 mg/kg, p.o.) e da duloxetina (10 mg/kg, p.o.) foi prevenida pelo pré-tratamento com NMDA, L-arginina, SNAP, sildenafil, H-89, GF109203X, LY294002, U0126, mas não com KN-62. O efeito antidepressivo da duloxetina foi também prevenido pelo pré-tratamento com SNAP. Além disso, quando administrado em doses sub-ativas, o escitalopram (0,1 mg/kg, p.o.) e a duloxetina (0,3 mg/kg, p.o.) produziram um efeito sinérgico com 7-nitroindazol, azul de metileno e ODQ, sendo que o MK-801 produziu um efeito sinérgico com a duloxetina. O escitalopram (1 µM) e da duloxetina (10 µM) foram neuroprotetores contra a morte celular induzida pelo GLU (10 mM) em fatias hipocampais e este efeito foi bloqueado pelo LY294002 e SNAP. O escitalopram e a duloxetina diminuíram a liberação de GLU. Em conjunto os resultados sugerem que o efeito antidepressivo do escitalopram e da duloxetina é dependente do bloqueio dos receptores NMDA e da inibição da síntese de NO e GMPc. Nossos resultados sugerem que o efeito antidepressivo do escitalopram e da duloxetina é dependente da modulação das vias de sinalização como a PKA, PKC, PI3K e MAPK/ERK. O escitalopram e da duloxetina foram neuroprotetores contra a morte celular induzida pelo GLU por um mecanismo que envolve as vias NO e PI3K/AKT prevenindo a liberação de GLU. Estes antidepressivos podem ter um importante potencial neuroprotetor na depressão e nas doenças degenerativas do SNC.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Fisicas e Matematicas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T21:07:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2015-03-18T20:43:15Z : No. of bitstreams: 1 313699.pdf: 3446379 bytes, checksum: 507f85a2970ba1b5fcd885a888bdf743 (MD5) / A poli(etilenoimina) (PEI) foi modificada por meio da alquilação com grupos n-alquila (n = 4, 6, 8 e 12 carbonos). O espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS), tensão superficial, emissão de fluorescência do pireno, viscosidade e medidas de pH foram as técnicas usadas para investigar a conformação e agregação das PEIs hidrofobicamente modificadas em solução aquosa, na ausência e na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS). Medidas de SAXS mostraram que o raio de giro diminui com o aumento do comprimento da cadeia alquílica, enquanto que os dados de viscosidade indicaram uma diminuição na viscosidade intrínseca. A PEI não modificada não apresentou atividade na superfície, enquanto as PEIs modificadas mostraram atividade pronunciada na superfície e presença de domínios hidrofóbicos. Na presença de SDS, o início da formação do complexo polímero-surfactante foi determinado, indicando uma diminuição na concentração de agregação crítica (cac) com o aumento no comprimento da cadeia alquílica substituída na PEI. A PEI também foi decorada com o grupo uridina com dois graus de substituição (5% e 15%). A formação de complexos das PEIs, decoradas com uridina ou hidrofobicamente modificadas, com o DNA do timo de bezerro foi investigada através das técnicas de emissão de fluorescência do brometo de etídio, espectrofotometria de UV-Vis, dicroísmo circular (CD), potencial zeta, viscosidade, espalhamento de luz dinâmico (DLS) e SAXS, na ausência e na presença de SDS. Todas as PEIs apresentaram três etapas na formação de complexos com o DNA: a primeira, quando uma pequena quantidade de polieletrólito foi adicionada, as cadeias do DNA são parcialmente condensadas; a segunda, quando mais polieletrólito foi adicionado, apresenta complexos com densidade de carga nula, com tamanho micrométrico; a terceira, em concentrações mais altas da PEI, o DNA foi completamente condensado pelas cadeias das PEIs, formando complexos positivamente carregados com valores de RH,ap na faixa de 51 a 88 nm. Análises de viscosidade e SAXS sugerem que o a PEI não modificada teve a interação mais forte e que melhor condensa o DNA.<br> / Abstract : The polyethylene imine (PEI) was modified by means of the alkylation with n-alkyl groups (n = 4, 6, 8 and 12 carbons). Small-angle X-ray scattering (SAXS), viscosity, surface tension, and pyrene fluorescence emission were then used as techniques to examine the conformation and aggregation of the hydrophobically modified PEIs in aqueous solution, in the absence and presence of sodium dodecylsulfate (SDS). Analysis of the SAXS data showed that the radius of gyration decreases with an increase in the alkyl chain length of the polymer, while the viscosity data indicated a decrease in the intrinsic viscosity under the same conditions. The nonmodified PEI was not surface active, while the hydrophobically modified samples showed pronounced surface activity and the presence of hydrophobic domains. On addition of SDS, the onset of the formation of polymer#surfactant complexes was determined, indicating a decrease in the critical aggregate concentration (cac) with an increase in the alkyl chain length of the polymer backbone. The PEI also was decorated with uridine groups with two substitution degrees (5% and 15%). The complex formation of the decorated or hydrophobically modified PEI with calf thymus DNA was investigated through of the ethidium bromide fluorescence emission, UV-Vis spectrophotometry, circular dichroism (CD), potential zeta, viscosity, dynamic light scattering (DLS) and SAXS techniques, in the absence and presence of SDS. All versions of PEI showed three steps in complexes formation with DNA: first, when a small amount of polyelectrolyte was added, DNA chains were partially condensed; second, when more polyelectrolyte was added, the complexes had a null charge density and micrometric size; third, at higher concentration of PEI, the DNA was fully condensed by PEI chains, leading to positively charged complexes with RH,ap values in the range of 51-88 nm. Viscosity and SAXS analyses suggested that the unmodified PEI had the stronger interaction and promoted the best DNA condensation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-06-25T22:55:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 311468.pdf: 1744978 bytes, checksum: 2c50dfef14dbdb20f41ec7b7942aeb0d (MD5) / A excitotoxicidade induzida pela excessiva ativação da neurotransmissão glutamatérgica está envolvida em várias neuropatologias. Neste sentido, moléculas que impeçam a liberação de glutamato ou a ativação excessiva dos seus receptores, podem ser úteis para prevenir a morte neuronal em algumas doenças. As lectinas são proteínas capazes de ligação reversível a carboidratos e glicoconjugados, e algumas têm sido utilizadas no estudo e purificação de receptores ionotrópicos glutamatérgicos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a potencial atividade neuroprotetora de lectinas extraídas de plantas como a ConBr, BBL, VGL, CGL e FTL frente à excitotoxicidade glutamatérgica. Fatias de hipocampo foram isoladas a partir de camundongos machos adultos e incubadas durante 6 h em solução tampão salina/Krebs/DMEM, na presença de glutamato (10 mM) ou glutamato (10 mM) co-administrado com ConBr, BBL, VGL, CGL ou FTL (10 µg/mL). Além disso, a fosforilação de MAPKs (ERK1/2, p38MAPK e JNK1/2/3) e AKT foi avaliada por western blot na avaliação neuroprotetora de ConBr, VGL e CGL. Os resultados mostram que o glutamato foi capaz de reduzir a viabilidade hipocampal (~25%), diminuiu a fosforilação de AKT e aumentou a fosforilação de ERK1 e p38MAPK. Notavelmente, ConBr e VGL impediram a redução da viabilidade celular e reverteram a diminuição da fosforilação de AKT induzida pelo glutamato. Entretanto, somente VGL reverteu o aumento na fosforilação de p38MAPK e ERK1 induzido por glutamato. Na presença do inibidor de PI3K, LY294002 (10 µM), ConBr não foi capaz de reverter a queda na viabilidade induzida pelo glutamato, sugerindo que o efeito neuroprotetor de ConBr é dependente da via PI3K/AKT. O mecanismo envolvido na modulação das vias de sinalização intracelular não foi elucidado. No entanto, considerando os receptores NMDA como uma proteína glicosilada no domínio N-terminal extracelular, é possível sugerir um bloqueio dos receptores de NMDA por meio da interação das lectinas ConBr e VGL com as cadeias de oligossacarídios. / The excitotoxicity induced by excessive activation of the glutamatergic neurotransmission is involved in several neuropathologies. In this sense, molecules that prevent the release of glutamate or excessive activation of its receptors can be useful to prevent neuronal death in these diseases. Lectins are proteins capable of reversible binding to carbohydrates on glycoconjugates, and some have been used in the study and purification of ionotropic glutamate receptors. The present study aimed to evaluate the potential neuroprotective activity of lectins extracted from plants such as ConBr, BBL, VGL, CGL and FTL to prevent glutamate-induced excitotoxicity. Hippocampal slices were isolated from adult male mice and incubated for 6 h in Krebs/saline/DMEM buffer in the presence of glutamate (10 mM) or glutamate (10 mM) plus ConBr, BBL, VGL, CGL or FTL (10 ìg/mL). Moreover, the phosphorylation of MAPKs (ERK1/2, p38MAPK and JNK1/2/3) and AKT was evaluated by western blotting in the study concerning the neuroprotective mechanism displayed by ConBr, VGL and CGL. The results show that glutamate was able to reduce hippocampal slice viability (-25%), diminish the phosphorylation of AKT and increase the phosphorylation of p38MAPK and ERK1. No changes were observed in the phosphorylation of JNK1/2/3 and ERK2. VGL prevented the increment of p38MAPK and ERK1 phosphorylation. Notably, ConBr and VGL prevented the reduction of cell viability and the decrease of AKT phosphorylation induced by glutamate. Furthermore, in the presence of PI3K inhibitor, LY294002 (10 ìM), ConBr was unable to reverse the loss in cell viability induced by glutamate. It suggests that ConBr exerts its neuroprotective effect in a manner dependent of PI3K/AKT pathway. The mechanism involved in the modulation of signaling pathways was not addressed in our study. However, considering NMDA receptors as glycosylated protein in the extracellular N-terminal domain it is possible to suggest a blockage of NMDA receptors via ConBr or VGL lectin interaction with oligosaccharide chains.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:35:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 224317.pdf: 734501 bytes, checksum: d726c56d487f25c927fdf04011fbe267 (MD5) / Os polihidroxialcanoatos (PHA's) são substâncias naturais acumulados no interior das células como forma de reserva de carbono e energia em condições particulares de crescimento. Há um significativo interesse no estudo dos PHA's devido a seu valor comercial como termoplástico biodegradável sendo uma potencial alternativa para substituição da utilização dos plásticos derivados do petróleo. O poli[3-hidroxibutirato] é o PHA mais bem caracterizado e diversas bactérias são capazes de sintetizá-lo, porém, este biopolímero não apresenta propriedades industriais interessantes (duro e quebradiço). A incorporação de monômeros de valerato e produção do copolímero poli[3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato] (P[3HB-co-3HV]), resulta na formação de um polímero com características industriais mais interessantes. O precursor das unidades de valerato mais empregado é o ácido propiônico e este é adicionado ao meio de cultivo a fim de se produzir o copolímero. Entretanto, grande parte do ácido propiônico não é incorporado na forma de valerato, visto que este é utilizado em outras vias metabólicas. Com a finalidade de aumentar a conversão de ácido propiônico em valerato, foi estudado o efeito da adição de suplementos (azeite de oliva e ácido acético) e de um inibidor enzimático (ácido itacônico) na incorporação de valerato no copolímero P[3HB-co-3HV]. Foi utilizada para produção de P[3HB-co-3HV] a bactéria Escherichia coli JM101, abrigando os genes de biossíntese de PHA's de Ralstonia eutropha (plasmídio pBHR68). Os cultivos foram realizados em agitador orbital por 48 horas a temperatura de 37ºC e agitação de 150 rpm em meio Luria Bertani contendo 20 g. L-1 de glicose, 100mg.L-1 de ampicilina com ou sem a adição de ácido propiônico, suplementos ou inibidor. Os resultados mostram que a E.coli JM101 recombinante, contendo os genes de biossíntese de PHA's de R. eutropha acumulou 61% de PHB. Na presença de ácido propiônico, foi acumulado 8,4% de PHA, com 20% de valerato incorporado no copolímero P[3HB-co-3HV]. Quando azeite de oliva foi utilizado como suplemento, a biomassa celular e o acúmulo de polímero aumentaram em 49% e 82% respectivamente, porém a porcentagem de valerato incorporada no polímero diminuiu. A adição de ácido acético no meio de cultivo diminuiu drasticamente a biomassa e o acúmulo de polímero não pode ser detectado. Nos cultivos onde se empregou o ácido itacônico como inibidor químico da enzima propionil-CoA carboxilase (PCC), principal enzima atuante no catabolismo do ácido propiônico, o crescimento bacteriano diminuiu e não se teve acúmulo de PHA. Os resultados sugerem que os ácidos: propiônico, acético e itacônico, são tóxicos para E. coli JM101. No entanto, o ácido propiônico ainda continua sendo o principal precursor das unidades de valerato no copolímero.