Os nefelina sienitos miasquíticos a intermediários do Maciço Alcalino Poços de Caldas (MAPC), em especial o tipo da Pedreira, possuem enclaves microgranulares félsicos e máficoultramáficos intrigantes. O nefelina sienito da Pedreira (NeS) pode ser divido em duas fácies texturais: uma de granulação média-grossa a grossa (NeS-g), outra de granulação média-fina a fina (NeS-f). O NeSg possui, mais comumente, enclaves microgranulares félsicos (EMF), de composição fonolítica. Estes enclaves podem envolver enclaves menores, máfico-ultramáficos, gerando enclaves duplos. O NeSf apresenta mais tipicamente enclaves microgranulares máfico-ultramáficos (EMM), ora com feições de rompimento em estado plástico, ora com bordas angulosas e lineares. Diques de composição fonolítica cortam o NeS-g. As rochas estudadas neste trabalho são constituídas por nefelina, feldspato alcalino e clinopiroxênio. Como fase acessória, têm-se titanita, magnetita e biotita-flogopita. Apatita ocorre também como mineral acessório, com exceção para o NeS-g. No NeS-g, no NeS-f e nos EMF, o clinopiroxênio possui duas fases texturais: uma prismática, verde (egirina-augita) que também pode ter núcleo róseo/incolor (diopsídio, mais comum no NeS-f e no EMF); outra fibrosa, também verde, porém fortemente pleocroica (egirina). Os EMM são constituídos essencialmente por diopsídio, com M(médio)~80. Quando porfirítico, o enclave possui macrocristais de diopsídio róseo/incolor (#mg~0,9) imersos numa matriz de diopsídio verde (#mg~0,8), ambos prismáticos. Magnetita dos NeS possui pouca variação, com teores baixos de Ti, diferente da magnetita dos enclaves. A assinatura química da nefelina dos EMM é equivalente à do NeS-f, com mais Fe3+ e menos K em relação ao NeS-g. Feldspato alcalino tende a ser mais potássico nos EMF e apresenta maior variação composicional nos EMM (Ab10-33Or72-80). Biotita está presente somente nos EMF e flogopita somente nos EMM. O padrão de elementos terras raras (ETR) do clinopiroxênio róseo/incolor do NeS-f é semelhante ao do EMM. Egirina-augita e egirina possuem enriquecimento em ETR pesados. Os enclaves máfico-ultramáficos são ultrabásicos, classificados como tefritos/basanitos (Le Bas et al., 1986) ou nefelinitos/ankaratritos (De La Roche et al., 1980), enquanto as rochas félsicas são intermediárias, correspondentes a fonolitos ou nefelina sienitos, dependendo da granulometria. Os diques e o NeS-f são peralcalinos, enquanto o EMF, o NeS-g e os EMM são peralcalinos/metaluminosos. As rochas ultramáficas/ultrabásicas, aflorantes na porção noroeste do Maciço Alcalino Poços de Caldas (Ulbrich et al., 2002), possuem padrões de ETR que indicam que estas rochas podem estar geneticamente ligadas aos enclaves máfico-ultramáficos. De uma forma geral, as características estruturais, texturais e químicas das rochas estudadas corroboram com a hipótese de coexistência de pelo menos dois magmas distintos: um félsico sienítico insaturado outro ultramáfico/ultrabásico, que teriam interagido e formado os os EMM e o NeSf, principalmente. Enquanto num estágio posterior de cristalização do magma, porém ainda em estado plástico, o dique teria se colocado, com parcial absorção da rocha pelos nefelina sienitos, formando os EMF. / The miaskitic to intermediate nepheline syenites of Poços de Caldas Alkaline Massif, especially the Pedreira type, have intriguing felsic and mafic-ultramafic microgranular enclaves. The Pedreiras nepheline syenite type (NeS) can be divided into two textural facies: one that is medium-coarse to coarse grained (NeS-c) and the other that varies between medium-fine to fine grained (NeS-f). It is common among the NeS-c microgranular felsic enclaves (MFE) with phonolitic composition. These enclaves may develop smaller ones maficultramafic, generating double enclaves. The NeS-f usually presents mafic-ultramafic enclaves (MME), sometimes showing disrupted features in plastic stage and sometimes angular and linear edges. Phonolitic dykes cut the NeS-c. The rocks studied in this work are formed by nepheline, alkali-feldspar and clinopyroxene. The accessory phase is characterized by titanite, magnetite and biotite-phlogopite. In exception to the NeS-c, apatite also occurs as an accessory mineral. In the NeS-c, NeS-f and MFE, the clinopyroxene presents two textural phases: a green prismatic one (aegirine-augite), which also may have a pinkish/colourless core (diopsyde, which is common in the NeS-f and MFE); the other one is fibrous, also green, however with strongly pleocroism (aegirine). Essencially, the MME are formed by diopsyde, with M(medium)~80. When porphyritic, the enclave has macrocrystals of pinkish/colourless diopsyde (with mg#~0,9) in a green diopsyde (mg#~0,8) matrix, both prismatic. In the NeS, the magnetite varies little: with low levels of Ti, differently from the enclaves magnetite. The chemical signature of the nepheline in the MME equals to the one present in the NeS-f and has more Fe3+ and less K when compared to the NeS-c. The alkaline feldspar in the MFE has more potassium in its structure and presents a higher compositional variation in the MME (Ab10-33Or72-80). It is also noticeable that biotite is a component only to the MFE, while the phlogopite occurs in the MME. The rare earth elements (REE) pattern in the pinkish/colourless clinopyroxene of the NeS-f is similar to the MME. Both aegirine-augite and aegirine present an enrichment regarding the heavy REE. The MME are ultrabasic, classified as tephrite/basanite (Le Bas et al., 1986) or nephelinite/ankaratrites (De La Roche et al., 1980), while the felsic rocks are intermediate, corresponding to phonolite and nepheline syenite, depending on the grain size. The dykes and the NeS-f are peralkaline, while the MFE, NeS-c and the MME are peralkaline/metaluminous. The ultrabasic/ultrapotassic rocks, outcropping in the northwestern portion of the PCAM (Ulbrich et al., 2002), have REE patterns wich indicate that these rocks may be genetically related to mafic-ultramafic enclaves. Generally, the structural, textural and chemical signatures of the rocks studied in this work confirm the hypothesis of the coexistence of at least two different magmas: a syenitic undersaturated felsic one and a ultramafic/ultrabasic one, and their interaction resulted in the MME and, above all, the NeS-f. While in a late stage of magma cristalization, but still in the plastic state, the dike would be placed, with partial absorption of the rock by the nepheline syenite, resulting in the EMF.

O presente trabalho tem como objetivo estudar as modificações ocorridas na cana-de-açúcar, com diferentes composições químicas e estruturais, pelo pré-tratamento sulfito alcalino. A remoção de lignina e hemicelulose, bem como a introdução de grupos sulfônicos em cana-de-açúcar que ocorrem durante o pré-tratamento sulfito alcalino tornam mais fácil a hidrólise da celulose. A compreensão das modificações químicas e físicas em materiais lignocelulósicos que ocorrem durante este pré-tratamento é fundamental para a geração de processos mais eficazes. Neste trabalho, bagaço e entrenós de cana-de-açúcar, selecionados de plantas híbridas com composição química variada, foram pré-tratados em condições brandas com 10% de sulfito e 5% de hidróxido de sódio por diferentes tempos. No início do pré-tratamento, a deslignificação aumentou rapidamente, o mesmo não aconteceu com a hemicelulose. Nos primeiros 30 min de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar houve remoção de 50% da lignina inicial e 30% da hemicelulose, o que ocasionou uma melhora significativa na conversão de celulose, atingindo 64%. Mesmo sem remoção adicional de lignina e hemicelulose, o processo continuou a introduzir os grupos ácidos, o que contribuiu para o inchamento da fibra. A largura da fibra do bagaço não tratado aumentou de 10,4 ?m para 30 ?m no material pré-tratado com 120 min. Estas modificações na fibra foram responsáveis pelo aumento na eficiência da hidrólise enzimática da celulose, a qual atingiu 92%. Híbridos experimentais com teores reduzidos de lignina apresentaram taxas iniciais de hidrólise mais elevadas e um menor tempo de pré-tratamento para alcançar a conversão total de celulose do que a cana de referência. Diferentes regiões (medula, interface, córtex e fração externa) dos entrenós das canas foram hidrolisadas por celulases. O pré-tratamento da interface, córtex e fração externa com sulfito-alcalino produziu substratos menos recalcitrantes com o aumento do tempo de reação e resultou na melhora da hidrólise enzimática. Foram utilizadas várias técnicas para avaliar as mudanças que ocorreram durante o pré-tratamento, as quais foram capazes de estudar a morfologia da superfície e as características químicas das amostras. O tratamento químico ocasionou uma intensa deslignificação e alterações morfológicas nas superfícies das fibras da cana-de-açúcar. A redução na absorção a 285 nm e 315 nm das paredes celulares das fibras, parênquima e dos vasos aumentou substancialmente os valores de conversão enzimática da celulose e da hemicelulose. Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (FE-SEM) revelou que as fibras da região do córtex e, especialmente, da interface mostrou paredes celulares colapsadas após a parcial deslignificação. Após o tratamento sulfito alcalino, os dados de espectroscopia fotoelétrica de raio-X (XPS) e espectrometria de massa de íons secundários por tempo de vôo (TOF-SIMS) apresentaram um aumento das intensidades dos sinais nas superfícies das fibras, os quais foram atribuídos à presença de carboidratos em algumas amostras. Em conformidade, os sinais de lignina diminuíram nas superfícies das fibras das mesmas amostras. / The present work aims to study the changes occurring in sugar cane, with different in structure and chemical compositions, by sulfite-alkaline pre-treatment. Removing lignin and hemicellulose as well as introducing sulfonic groups in sugar cane pretreated with alkaline sulfite made cellulose hydrolysis easier. Understanding the chemical and physical alterations occurring during this pretreatment of lignocellulosic materials is fundamental for the generation of effective pretreatment methods. In the present work, sugarcane bagasse and also sugar cane internodes, selected from experimental hybrid plants, were pretreated with the alkaline-sulfite process under mild conditions with varied cooking times. The first 30 min of pretreatment of sugar cane bagasse, which removed approximately half of the initial lignin and 30% of hemicellulose seemed responsible for a significant enhancement of the cellulose conversion level, which reached 64%. After the first 30 min of pretreatment, delignification increased slightly and hemicellulose removal was not enhanced. However, the process continued to introduce acid groups into the residual lignin that enhanced the fiber swelling up to 120 min of cooking. The fiber widths increased from 10,4 ?m in the untreated bagasse to 30 ?m in the 120 min-pretreated material. These changes were responsible for an additional increase in the efficiency of enzymatic hydrolysis of the cellulose, which reached 92%. Experimental hybrids with less original lignin presented higher initial hydrolysis rates than reference sugar cane and required lower time of pretreatment to achieve the total cellulose conversion. Different regions (pith, interface, rind and outermost fraction) of the internodes of types of sugarcanes were hydrolyzed by cellulases. The pretreatment of the interface, rind and outermost fraction with alkaline sulfite produced less recalcitrant substrates with increasing reaction time and resulted in improvement enzymatic hydrolysis. Several techniques enabling the study of surface morphological and chemical characteristics were used to evaluate the changes occurring during the pretreatment step. The chemical treatment caused intense delignification and morphological changes on the sugar cane fiber surfaces. The reduction in the absorption at 285 nm and 315 nm of the cell walls of the fibers, parenchyma and vessel, substantially increased the values of enzymatic conversion of cellulose and hemicellulose. Field emission scanning electron microscopy (FE-SEM) indicated that the fibers from rind regions and especially from the interface showed collapsed cell walls after partial delignification. After the alkaline sulfite treatment, X-ray photoelectrom spectroscopy (XPS) and time-of-flight-secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) data showed increased signal intensities on the fibers surfaces assigned to carbohydrates of some samples. In accordance, the lignin signals diminished on the fiber surfaces of the same samples.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-05-07T22:56:27Z No. of bitstreams: 1 126110041.pdf: 1662239 bytes, checksum: 4c1751ff15692d571713c45fca07289c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-07T22:56:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 126110041.pdf: 1662239 bytes, checksum: 4c1751ff15692d571713c45fca07289c (MD5) Previous issue date: 2014-03-24 / Células tronco são células indiferenciadas e multipotentes, capazes de se diferenciar nos mais diversos tipos celulares. São definidas por duas características principais, a autorrenovação e o potencial de diferenciação. Devido ao seu potencial de diferenciação, facilidade de isolamento e expansão em cultura, as células tronco mesenquimais (Mesenchymal Stem Cell – MSCs) são largamente utilizadas em testes para o tratamento de inúmeras doenças, como doenças cardíacas, mieloma e osteoartrite. O corticosteroide dexametasona é amplamente utilizado como indutor de diferenciação óssea em células tronco e está envolvido no aumento da atividade da enzima fosfatase alcalina (ALP). Há quatro genes que codificam a ALP: ALPL, ALPP, ALPPL2 e ALPI. A ALPL é um dos principais marcadores de diferenciação óssea promovida pelo tratamento com dexametasona, esse gene possui três diferentes variantes que são geradas por splicing alternativo. Porém, até hoje não se tem conhecimento de qual dessas variantes atua na deposição de matriz óssea. O objetivo do trabalho foi analisar, por PCR quantitativo (qPCR), a atividade das variantes de ALPL durante a diferenciação de MSCs tratadas com dexametasona. Os primers das três variantes do gene ALPL foram desenhados pelo nosso grupo de pesquisa. Para o experimento, aproximadamente 3x10 4 células por mL foram semeadas em placa de cultura. Para o tratamento utilizou-se dexametasona 10 -7 M, tendo como período de tratamento 0, 3 e 7 dias. Os resultados da qPCR mostraram que os primers desenhados possuem uma eficiência superior a 90% e R 2 = 1, sendo os primers da variante 2 mais eficiente que os primers da variante 1, e os primers de ambas as variantes mais eficientes que os primers de ALP atualmente utilizados. Os primers da ALPL/v3 não apresentaram amplificação. Nossa análise estatística indica que a diferença de expressão entre as células tratadas e os controles se mostrou relevante, apontando para um grande aumento de ALPL/v1 nas células tratadas. A expressão de ALPL/v2, apesar de significativa entre os controles e tratados, é baixa quando comparada à ALPL/v1. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a dexametasona, além de aumentar a atividade do promotor de ALPL, também dá preferência ao splicing alternativo que origina o mRNA da variante 1 do gene. / Stem cells are undifferentiated and pluripotent cells that are able to differentiate into several cell types. Stem cells are distinguished from other cell types by two important characteristics: self-renewal and differentiation potential. Due to their differentiation potential and easiness for isolate and growth in vitro, mesenchymal stem cells (MSCs) are widely used in trials for the treatment of numerous diseases such as heart disease, myeloma and osteoarthritis. The corticosteroid dexamethasone is broadly used to induce bone differentiation in stem cells and is involved in the increased activity of alkaline phosphatase (ALPL). There are four genes coding ALP: ALPL, ALPP, ALPPL2 and ALPI. The ALPL is one of the main markers for bone differentiation stimulated by dexamethasone. This gene has three different variants which are generated by alternative splicing. However, to date it is not known which of these variants act in the bone matrix deposition. In this context, the aim of this work was to analyze the activity of ALPL variants during the differentiation of MSCs treated with dexamethasone. Primers for the three ALPL variants were designed by our group. For the experiment, approximately 3x10 4 cells per ml were seeded in culture plate. For treatment, we used 10 -7 M dexamethasone for 0, 3 and 7 days. The qPCR results showed that the primers designed had an amplification efficiency higher than 90% and R 2 = 1; variant 2 (V2) primers was more efficient than the variant 1 (V1) primers and primers of both variants are more efficient than the currently used ALP primers. The primers of ALPL/v3 showed no amplification. Our statistical data showed that the differences in expression between treated and control cells were significant, indicating an expressive increase of ALPL/v1 in treated cells. The expression of ALPL/v2, although significant between controls and treated cells, was low when compared to ALPL/v1. The results of this study indicate that dexamethasone, besides increasing the activity of the ALPL promoter, gives preference to alternative splicing that originates the variant1 mRNA.

Os efeitos de preparações de plasma rico em plaquetas (PRP) sobre a atividade osteogênica in vitro e in vivo em contato com biomateriais são divergentes na literatura. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão e/ou atividade de marcadores iniciais da diferenciação osteoblástica em culturas de células osteogênicas crescidas sobre titânio (Ti) e expostas a coquetel de fatores de crescimento e proteínas PRP-símile (coquetel de FCs). Células osteoblásticas primárias derivadas de calvárias de ratos recém-nascidos foram cultivadas em meio osteogênico e expostas, nos 7 primeiros dias, a coquetel de FCs nas diluições 1:1 (FCs), 1:10 (FCs/10), 1:100 (FCs/100) e 1:1000 (FCs/1000). Foram avaliados, nos tempos de 7, 10 e 14 dias: 1) os aspectos morfológicos e a imunomarcação de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN), por epifluorescência; 2) a proliferação celular, por ensaio de MTT; 3) a expressão de RNAm para o fator de transcrição Runx2, BSP e fosfatase alcalina (ALP), por PCR em tempo real; 4) a atividade de ALP, clivada da fração de membrana; 5) quantificação da mineralização, por extração do vermelho de Alizarina. Os resultados mostraram inibição da formação dos nódulos de matriz mineralizada em culturas FCs e atraso em seu desenvolvimento em FCs/10 e FCs/100, em comparação a FCs/1000 e controle. A expressão de Runx2, BSP e ALP era menor em todas as culturas expostas ao coquetel de FCs em 7 dias, sendo que para Runx2 e BSP notava-se o efeito concentração-dependente em 10 dias. Menores valores de atividade de ALP foram observados nas culturas FCs e FCs/10, com efeito concentração-dependente e correlação positiva com a mineralização em 7 dias, mas não em 10 e 14. Os resultados permitem concluir que a exposição ao coquetel de FCs inibe e/ou atrasa a diferenciação osteogênica de culturas primárias sobre Ti. Adicionalmente, a atividade de ALP de membrana pode ser considerada também um marcador inicial de diferenciação osteoblástica, indicativo do potencial osteogênico no modelo in vitro utilizado. / The effects of platelet-rich plasma (PRP) preparations on the in vitro and in vivo osteogenic activity in contact with biomaterials have been subject of debate and controversy in the literature. The aim of the present study was to evaluate the expression and/or activity of early markers of osteoblast differentiation in cultured osteogenic cells grown on titanium (Ti) and exposed to a PRP-like cocktail of growth factors and proteins (GFs cocktail). Primary osteoblastic cells derived from newborn rat calvarial bone were cultured in an osteogenic medium (control group) and exposed during the first 7 days of culture to the following dilutions of GFs cocktail: 1:1 (GFs), 1:10 (GFs/10), 1:100 (GFs/100) and 1:1000 (GFs/1000). At days 7, 10 and 14 of culture, the following parameters were assessed: 1) morphology and immunolabeling for bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN) by epifluorescence microscopy; 2) cell proliferation by MTT assay; 3) mRNA expression for the osteoblast markers Runx2, BSP and alkaline phosphatase (ALP) by real time PCR; 4) ALP activity following ALP cleavage from cell membrane; 5) mineralization by Alizarin red extraction. The results showed no mineralized nodules for the GFs group and a delayed nodule formation for GFs/10 and GFs/100 compared with GFs/1000 and control. Whereas Runx2, BSP and ALP mRNA levels were lower for all cultures exposed to the GFs cocktail at day 7, a concentration-dependent effect was noticed only for Runx2 and BSP at day 10. The GFs cocktail showed a concentration-dependent effect on ALP activity, with the lowest values for GFs and GFs/10 cultures and a positive correlation with mineralization at day 7 but not at day 10 or 14. In conclusion, inhibited and/or delayed osteogenic differentiation take place in primary cultures grown on Ti and exposed to the GFs cocktail. In addition, membrane ALP activity can also be considered an early marker of osteoblast differentiation, indicative of the in vitro osteogenic potential in the model used.

O maciço alcalino máfico-ultramáfico Ponte Nova (SP-MG) apresenta uma associação litológica eminentemente gabróide, gerada por sucessivos pulsos magmáticos, há aproximadamente 86 Ma. Constitui a única ocorrência de tendência alcalina do setor norte da província Serra do Mar com predomínio acentuado de rochas máficas e ultramáficas cumuláticas. Apresenta duas áreas de exposição: uma principal, maior (~5,5 km2), de forma elíptica e com grande variedade de litotipos, e uma menor (~1 km2), localizada a sul da primeira, estando ambas separadas por rochas do embasamento Pré-Cambriano. Na área principal, o pulso central é constituido de uma seqüência inferior, cumulática, caracterizada pela presença de cumulatos ultramáficos e melagábricos (e.g., olivina clinopiroxenitos e melagabros com olivina), e uma seqüência superior, com rochas gábricas e monzogábricas porfiríticas e equigranulares. Tais seqüências associadas a um mesmo pulso são confirmada pelas variações crípticas em minerais, pela composição geoquímica das rochas e pelas assinaturas isotópicas obtida. À região oeste e sul deste pulso central encontra-se, separada por falhas, uma seqüência inferior muito semelhante, cumulática porém com a seqüência superior caracterizada principalmente pela ocorrência de rochas bandadas e com maior concentração de nefelina em relação às rochas da área central. Estas ocorrências parecem estar relacionadas a um segundo pulso associado à esta área principal, conforme indicado pela evolução da seqüência superior, pelas assinaturas isotópicas e condições de fO2 calculadas e por variações crípticas encontradas em alguns minerais das rochas bandadas, como olivina. Já na área satélite a sul, predominam melamonzonitos com nefelina que, embora permitam algumas correlações com as rochas da seqüência superior do pulso central, o enriquecimento em diferentes traços bem como a assinatura isotópica apontam para um pulso magmático isolado. Esta área ainda apresenta litotipos mais evoluídos (e.g., monzonitos com nefelina) que, conforme as características isotópicas e também a distribuição dos traços, permite individualizá-lo como um pulso separado. Outros pulsos isolados e menores são caracterizados, predominando rochas melagábricas, variando entre olivina melamonzodioritos a melamonzodioritos com olivina no pulso satélite norte e rochas mais evoluídas, variando entre nefelina monzodioritos a monzodioritos com nefelina, no pulso satélite leste. Diferenciados félsicos finais ocorrem sob a forma de diques, vênulas e possivelmente bolsões, e variam de leucocráticos a mesocráticos, com rochas de composições monzoníticas a monzossieníticas, chegando a nefelina sienitos em alguns casos, e podem ser considerados representativas do líquido residual dos diferentes pulsos que sofreram migração para diferentes porções do maciço. Um corpo de brecha magmática ocorre confinado à região leste, posterior aos pulsos anteriormente descritos, com fragmentos líticos de todos os litotipos gabróides anteriormente descritos. Diques máficos (lamprófiros, tefritos e basanitos) e félsicos (tefrifonólitos a fonotefritos) intrudem as rochas do maciço, sendo estes representativos de diferentes fontes mantélicas e possivelmente ocorrendo em estágios distintos. As diferentes assinaturas isotópicas registradas para os diques, que abrangem o amplo espectro obtido para os diferentes pulsos do maciço, confirmam o caráter multi-intrusivo desta ocorrência. O caráter cumulático é bastante pronunciado nos principais pulsos do maciço Ponte Nova. Os altos índices de máficos (M), os baixos conteúdos de Na e K, o caráter ultrabásico e a composição de picrito e picrobasalto de parte das amostras evidenciam este caráter e apontam a cristalização fracionada como principal mecanismo atuante na evolução do maciço. A variação composicional das fases cumulus ao longo de todo maciço, especialmente relacionada aos índices envolvendo a razão Mg/(Mg+Fe2+) tanto na olivina quanto no clinopiroxênio, com a progressiva diminuição deste índice em direção às rochas da seqüência superior, indicam que mecanismos de fracionamento magmático dominam a variação vertical modal e geoquímica do maciço em seus principais pulsos. Variações crípticas obtidas também em fases intercumulus, compatíveis com o trend evolutivo dos minerais cumulus, favorecem a idéia de estas fases serem representativas principalmente de um líquido aprisionado (trapped liquid) no momento da acumulação, guardando portanto a composição do líquido em equilíbrio com o cumulato formado. Assim, infere-se que o processo de acumulação envolvido, com conseqüente aprisionamento de líquido, deve ter-se dado de maneira relativamente rápida. Tal consideração tende a indicar um processo gravitacional de acumulação para grande parte das rochas do maciço. Já os casos onde são encontradas estruturas bandadas, alternando-se bandas máficas e félsicas (associadas a regiões próximas ao contato com o embasamento), apontam para uma possível ação mais efetiva de correntes de convecção. Com relação aos parâmetros intensivos, as rochas do maciço Ponte Nova cristalizaram-se a uma profundidade relativamente rasa (entre 1 e 0,5 kbar), conforme indicado pela composição dos clinopiroxênios. A história de cristalização do maciço inicia-se algo acima de 1030ºC, que representa o início do equilíbrio olivinaclinopiroxênio, terminando em ±600º C, com o equilíbrio apatita-biotita (fases intersticiais finais). Conforme modelamentos geoquímicos evidenciam, os diques máficos junto ao Maciço Ponte Nova e os que são encaixados no embasamento adjacente a este, de composição principalmente basanito-tefrítica, podem ser considerados representativos do magma parental que levou à formação das rochas cumuláticas do maciço. Modelos de fusão indicam que os diques máficos que cortam o maciço e, conseqüentemente, o magma parental do Maciço Ponte Nova, podem ter como fonte mantélica tanto espinélio lherzolitos como granada lherzolitos. Em ambos os casos o manto deve estar previamente enriquecido em elementos traços. A este enriquecimento é atribuido como causa o metassomatismo mantélico. As assinaturas isotópicas encontradas para os diferentes litotipos do maciço Ponte Nova pressupõe uma fonte mantélica heterogênea, sendo representativas dos diferentes graus de enriquecimento do manto litosférico. As idades modelo (TDM) obtidas, que podem ser atribuídas aos períodos de enriquecimento metassomático do manto, são correlacionáveis com os eventos regionais de evolução crustal neoproterozóica, principalmente ligados a eventos de subducção. As evidências significativas das heterogeneidades mantélicas (tanto em escala regional quanto numa escala local) com assinaturas isotópicas tipicamente litosféricas, do enriquecimento geoquímico da fonte (indicando um metassomatismo mantélico e uma fonte rica em voláteis) e do claro controle tectônico dos pulsos alcalinos (associados à reativação das principais zonas de fraqueza regionais), tendenciam uma interpretação favorável a modelos relacionados principalmente a fenômenos litosféricos, se comparadas aos modelos envolvendo plumas mantélicas. / The Ponte Nova alkaline mafic-ultramafic massif (~85 Ma) is mainly composed of a gabbroic association, generated by successive magmatic pulses. It is the single alkaline massif of the northern sector of Serra do Mar Province with predominance of mafic and ultramafic cumulitic rocks. The Ponte Nova massif crops out in two areas: the larger one (~5.5 km2), with elliptical shape and a wide variety of lithotypes, and the smaller satellite area (~1 km2), located south of the main area. These are separated by outcrops of Precambrian basement. The central pulse of the larger area is composed by a lower sequence, cumulitic, characterized by the presence of ultramafic and melagabbroic cumulates (e.g., olivine clinopyroxenites and olivine-bearing melagabbros), and an upper sequence, with porphyritic and equigranular gabbroic and monzogabbroic rocks. Such sequences are associated with the same magmatic pulse, as indicated by cryptic variations in minerals, whole-rock geochemistry and isotopic signatures. At the western and southern adjoining regions of this central pulse, separated by faults, a similar cumulitic lower sequence crops out. However, the upper sequence of these regions is characterized by the occurrence of banded rocks with higher concentration of nepheline than in the central area. These occurrences seem to be related to a second magmatic pulse, as indicated by evolution of its upper sequence, by isotopic signatures, calculated fO2 conditions and cryptic variations in some minerals of the banded rocks, such as olivine. In the southern satellite area, nepheline-bearing melamonzonites are the predominant rocks. Although correlations with rocks of central pulse upper sequence can be established, the enrichment in several trace elements as well as its isotopic signatures point to an isolated magmatic pulse. This area also presents more evolved lithotypes (e.g., nepheline-bearing monzonites) that, as indicated by isotopic characteristics and the distribution of the trace elements, could be interpreted as a distinct pulse. There are other isolated and smaller pulses in the larger area. Melagabbroic rocks varying between olivine melamonzodiorites to olivine-bearing melamonzodiorites are found in a northern satellite pulse. More evolved rocks varying between nepheline monzodiorites and nepheline-bearing monzodiorites are found in an eastern satellite body. Late-stage felsic rocks occur as dykes, venules and patches, and vary from leucocratic to mesocratic rocks, monzonitic to monzosyenitic in composition (nepheline syenites in some cases). These rocks are possibly representative of residual liquids that had suffered migration for different portions of the massif. A magmatic breccia occurs in the eastern region of the main area, subsequent to the described pulses, with the previously described lithic fragments of all gabbroic lithotypes. Mafic (lamprophyres, tephrites, basanites) and felsic (tephriphonolites to phonotephrites) dykes intrude the massif rocks. These are representative of different mantle sources and possibly occur in distinct magmatic stages. The wide-range isotopic signatures of these dykes, that comprise the wide range obtained for the different pulses of the massif, confirm the multi-intrusive character of this occurrence. The cumulitic character is strongly characterized in the main pulses of the Ponte Nova massif. The high mafic index (M), the low Na and K contents, the ultrabasic character and the composition of picrite and picribasalt of part of the samples evidence this character and point to fractional crystallization as the main operating mechanism in the evolution of the massif. The compositional variation of the cumulus phases throughout all the massif, particularly in terms of Mg/ (Mg+Fe2+) ratios, either in olivine or clinopyroxene, with the gradual reduction of this index towards the upper sequence, indicates that magmatic fractionation dominates the modal and geochemical vertical variation of the massif in its main pulses. Cryptic variations obtained also in intercumulus phases, compatible with evolutive trend of cumulus minerals, suggest that these phases represent a trapped liquid at the moment of the accumulation, and the composition of liquid and cumulate were in equilibrium. Thus, it may be inferred that the process of accumulation must have been relatively fast, indicating a gravitational process of accumulation for most rocks of the massif. The banded structures near the contact with the basement, alternating mafic and felsic banding, suggest a more effective action of convection currents. The Ponte Nova massif crystallized at relatively low depth (between 1 and 0,5 kbar), as indicated by clinopyroxene compositions. The massif crystallization sequence begins above 1030ºC, representing the beginning of the olivine-clinopyroxene equilibrium, and did proceed until ±600oC, with the apatite-biotite equilibrium (final interstitial phases). The mafic dykes intruding the Ponte Nova massif and those in the adjacent basement, mainly of basanitictephritic composition, possibly represent the parental magma of the cumulitic rocks of the massif, as indicated by geochemical models. The Ponte Nova massif isotopic signatures of the different lithotypes indicate a heterogeneous mantle source, with variable degrees of lithospheric mantle enrichment. Model ages (TDM) can be attributed to periods of mantle metassomatic enrichment and are correlated with the regional events of Neoproterozoic crustal evolution, mainly related to subduction events. The significative evidences of mantle heterogeneities (both at regional and local scale) with typically lithospheric isotopic signatures, of geochemical source enrichment (indicative of mantle metassomatism and a volatile-rich source) and of clearly tectonic control of the alkaline pulses (associated to the reactivation of the main regional zones of weakness), led to a favorable interpretation of models mainly related to lithospheric phenomena, if compared with models involving mantle plumes.

Apesar de representarem apenas 1% das rochas expostas na superfície da Terra, as rochas alcalinas possuem um grande espectro composicional e são associadas a vários ambientes tectônicos terrestres. Além disso, seu estudo nos ajuda a compreender melhor a evolução térmica e geodinâmica do planeta. Potássio, sódio e cálcio são os principais elementos utilizados na classificação deste grupo de rochas, e as razões entre estes elementos nos dão pistas sobre sua origem. Este estudo experimental utilizou uma prensa hidráulica de 1000 tonf, com câmaras de perfil toroidal acopladas, para estudar o sistema kalsilita-nefelina-diopsídio-sílica anidro, a 4,0GPa (aprox. 120 km de profundidade) e temperaturas até 1400 °C, com foco nos planos lucita-nefelina-diopsídio (Lct-Nph-Di) e kalsilita-nefelina-diopsídio (Kls-Nph-Di). Os produtos dos experimentos foram analisados através de MEV-EDS e DRX Para o plano Lct-Nph-Di foram encontrados campos de estabilidade para os minerais kalsilita (Klsss), nefelina (Nphss), e clinopiroxênios (Cpxss) (ambos soluções sólidas), wollastonita e sanidina, além de três pontos invariantes: (A) Kls+Nph+Di+liquido (Lc62Ne29Di9) a 1000°C (pseudoeutético); (B) Kls+Sa+(Di+Wo)+liquido (Lct75Nph22Di2) a 1200°C (pseudoperitético), (C) Kls+Di+Wo+liquido (Lct74Nph17Di9) a 1000°C (pseudoeutético). O campo da kalsilita forma uma barreira termal entre os campos composicionais potássico/ultrapotássico e sódico do diagrama. No plano Kls-Nph-Di foram encontrados campos de estabilidade para Klsss, Nphss e Cpxss e duas fases aluminosas (espinélio e coríndon), além do ponto invariante Kls+Nph+Di(±Spl)+liquido (Kls47Nph43Di10) a 1100°C (pseudoeutético). Nossos dados sugerem que a 4,0 GPa a dissolução de K em Nphss é estendida para até 39% molar, e de Na em Klsss para até 27% molar, e que tal solução sólida parcial determina o quão ricos em K ou Na os líquidos gerados pelo sistema serão. Adicionalmente, nossos dados mostram correlaçãos entre concentrações álcalis e sílicas nos líquidos gerados: positiva para K2O, negativa para CaO, mas irregular para Na2O (este devendo depender de outros fatores). / The alkaline rocks represent only 1% of the exposed rocks on the Earth’s surface. Despite that, these rocks are a group with a wide compositional spectrum, associated to many tectonic contexts, and their study can help us to better understand the thermal and geodynamic evolution of our planet. Potassium, sodium and calcium are the main elements used in the classification of this group of rocks, and their concentration can give us insights about the origin of these rocks. We have experimentally investigated the Kalsilite–Nepheline–Diopside-Silica system at high pressure and temperature conditions (HPHT), with emphasis on silica-undersaturated volume (Leucite–Nepheline–Diopside and Kalsilite–Nepheline–Diopside planes), both at 4.0GPa (~120km deep) and dry conditions and temperatures up to 1400°C, aiming to better understand the influence of K2O, Na2O, and CaO in alkaline silica-undersaturated magmas. For the experiments, we used a 1000 tonf hydraulic press with toroidal chambers, and the run products were analyzed by XRD and SEM-EDS technique. In the Lct-Nph-Di plane we determined the stability fields for kalsilite (Klsss), nepheline (Nphss) and clinopyroxene solid solution (CPxss), wollastonite (Wo) and sanidine (Sa); and three piercing points: (A) Kls+Nph+Di+liquid (Lc62Ne29Di9) at 1000°C; (B) Kls+Sa+(Di+Wo)+liquid (Lct75Nph22Di2) at 1200°C, (C) Kls+Di+Wo+liquid (Lct74Nph17Di9) at 1000°C Kalsilite stability field represents a boundary between ultrapotassic/potassic vs. sodic compositions. In the plane Kls-Nph-Di, we found the stability fields for Klsss, Nphss and CPxss and two aluminous phases spinel (Spl) and corundum (Crn). This plane have a piercing point in Kls+Nph+Di(±Spl)+liquid (Kls47Nph43Di10) at 1100°C. Our data suggest that pressure extends K dissolution in Nph (up to 39%) and Na in Kls (up to 27%), and that these solid solutions determine eutectic positions in surrounding systems, or how much K-rich will be the generated magmas. Additionally, our data shows positive correlation between K2O and SiO2 concentration in magmas, negative correlation between CaO and SiO2 and no evident correlation with Na2O.

I arbetet för Vikan AB var uppgiften att undersöka två olika delningsmetoder för mikrofibrer. Vikan AB är ett företag som utvecklar och framställer textila rengöringsredskap i mikrofibrer och tror sig ha kommit på en ny delningsmetod som förhoppningsvis ger en rad fördelar mot den nuvarande metoden. Den nya framställningsmetoden går under arbetsnamnet Easy Split och har ännu inte introducerats på marknaden.Studien har gått ut på att i fyra olika avseenden utvärdera de olika metodernas för- och nackdelar. De olika aspekterna har således varit processgång, utseende, hållbarhet och funktion. Utvärderingen utfördes med hjälp av en rad undersökningar där bland annat tester i absorption, kvadratmetervikt och fläckreduktion ingick.Många av egenskaperna undersöktes med hjälp av befintliga standarder medan undersökningen av fläckreduktionen skedde med en egenutvecklad testmetod. Till denna metod användes en Martindale vars rörelsemönster och tryck är valdes utifrån att göra testmetoden så verklighetstrogen som möjligt. Resultaten visar att det finns en skillnad på de olika metoderna och att de önskvärda egenskaperna finns starkast representerade hos den Easy split- baserade mikrofiberdelningen. De besparingar Vikan kan göra i och med att byta delningsmetod kan ha inverkan på energi- och vattenförbrukningen vilket resulterar i tidsbesparingar och minskade kostnader. / <p>In collaboration with Vikan AB the task has been to examine the different splitting types for microfibers. The company Vikan AB develops and produces textile cleaning products in microfibers and they now seem to have come up with a new splitting method that hopefully will give a range of advantages compared to the present method. The new method goes under the name Easy split and has not yet been introduced to the market.The study consisted of an analysis of the pros and cons of the methods in four different aspects. The different points of view were processing, appearance, durability and function. The investigation was made with a variety of tests including absorption, weight per square meter and stain reduction. Many of the properties were examined with help of existing standard tests while the stain reduction was analyzed with a method developed for this specific purpose. To represent the real environment a Martindale was used because of its uniform moving pattern. The conclusion indicates that the new splitting method not only results in advantages in adsorption, weight and stain reduction but also in water and energy consumption as well as time and expenses.</p><p>Program: Textilingenjörsutbildningen</p>

Os efeitos de preparações de plasma rico em plaquetas (PRP) sobre a atividade osteogênica in vitro e in vivo em contato com biomateriais são divergentes na literatura. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão e/ou atividade de marcadores iniciais da diferenciação osteoblástica em culturas de células osteogênicas crescidas sobre titânio (Ti) e expostas a coquetel de fatores de crescimento e proteínas PRP-símile (coquetel de FCs). Células osteoblásticas primárias derivadas de calvárias de ratos recém-nascidos foram cultivadas em meio osteogênico e expostas, nos 7 primeiros dias, a coquetel de FCs nas diluições 1:1 (FCs), 1:10 (FCs/10), 1:100 (FCs/100) e 1:1000 (FCs/1000). Foram avaliados, nos tempos de 7, 10 e 14 dias: 1) os aspectos morfológicos e a imunomarcação de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN), por epifluorescência; 2) a proliferação celular, por ensaio de MTT; 3) a expressão de RNAm para o fator de transcrição Runx2, BSP e fosfatase alcalina (ALP), por PCR em tempo real; 4) a atividade de ALP, clivada da fração de membrana; 5) quantificação da mineralização, por extração do vermelho de Alizarina. Os resultados mostraram inibição da formação dos nódulos de matriz mineralizada em culturas FCs e atraso em seu desenvolvimento em FCs/10 e FCs/100, em comparação a FCs/1000 e controle. A expressão de Runx2, BSP e ALP era menor em todas as culturas expostas ao coquetel de FCs em 7 dias, sendo que para Runx2 e BSP notava-se o efeito concentração-dependente em 10 dias. Menores valores de atividade de ALP foram observados nas culturas FCs e FCs/10, com efeito concentração-dependente e correlação positiva com a mineralização em 7 dias, mas não em 10 e 14. Os resultados permitem concluir que a exposição ao coquetel de FCs inibe e/ou atrasa a diferenciação osteogênica de culturas primárias sobre Ti. Adicionalmente, a atividade de ALP de membrana pode ser considerada também um marcador inicial de diferenciação osteoblástica, indicativo do potencial osteogênico no modelo in vitro utilizado. / The effects of platelet-rich plasma (PRP) preparations on the in vitro and in vivo osteogenic activity in contact with biomaterials have been subject of debate and controversy in the literature. The aim of the present study was to evaluate the expression and/or activity of early markers of osteoblast differentiation in cultured osteogenic cells grown on titanium (Ti) and exposed to a PRP-like cocktail of growth factors and proteins (GFs cocktail). Primary osteoblastic cells derived from newborn rat calvarial bone were cultured in an osteogenic medium (control group) and exposed during the first 7 days of culture to the following dilutions of GFs cocktail: 1:1 (GFs), 1:10 (GFs/10), 1:100 (GFs/100) and 1:1000 (GFs/1000). At days 7, 10 and 14 of culture, the following parameters were assessed: 1) morphology and immunolabeling for bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN) by epifluorescence microscopy; 2) cell proliferation by MTT assay; 3) mRNA expression for the osteoblast markers Runx2, BSP and alkaline phosphatase (ALP) by real time PCR; 4) ALP activity following ALP cleavage from cell membrane; 5) mineralization by Alizarin red extraction. The results showed no mineralized nodules for the GFs group and a delayed nodule formation for GFs/10 and GFs/100 compared with GFs/1000 and control. Whereas Runx2, BSP and ALP mRNA levels were lower for all cultures exposed to the GFs cocktail at day 7, a concentration-dependent effect was noticed only for Runx2 and BSP at day 10. The GFs cocktail showed a concentration-dependent effect on ALP activity, with the lowest values for GFs and GFs/10 cultures and a positive correlation with mineralization at day 7 but not at day 10 or 14. In conclusion, inhibited and/or delayed osteogenic differentiation take place in primary cultures grown on Ti and exposed to the GFs cocktail. In addition, membrane ALP activity can also be considered an early marker of osteoblast differentiation, indicative of the in vitro osteogenic potential in the model used.

A biomineralização óssea é um processo complexo e multifatorial sendo um grande desafio para a ciência à compreensão dos seus mecanismos regulatórios. Este processo é mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs), as quais surgem das superfícies de osteoblastos e são secretadas no local específico do início da biomineralização. MVs têm a capacidade de acumular altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a duas proteínas: Anexina V (AnxA5) e Fosfatase Alcalina (TNAP). As anexinas são as proteínas mais abundantes detectadas nas MVs e responsáveis pela formação de canais de cálcio. TNAP apresenta atividade fosfomonohidrolítica, produzindo Pi a partir, principalmente, de pirofosfato (PPi) e ATP. O enfoque deste projeto foi produzir e caracterizar proteolipossomos com diferentes composições lipídicas de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) contendo TNAP e AnxA5, e manter a funcionalidade das proteínas após incorporação nos sistemas miméticos. Foi possível incorporar AnxA5 em DPPC-proteolipossomos (11,64 µg/mL), mas na presença de DPPS houve um aumento significativo de AnxA5 incorporada (25,79 µg/mL) a DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar). A presença das proteínas nos proteolipossomos compostos por DPPC e DPPC:DPPS 5, 10 e 15% (razão molar) foi confirmada por SDS-PAGE e Immunoblotting. Melhores rendimentos de incorporação das duas proteínas foram obtidos quando ambas foram incorporadas concomitantemente. DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteoliposomos revelaram conter 75% de AnxA5 e 25% de TNAP em concentração de proteína. A presença de DPPS não afetou significativamente as porcentagens de proteínas incorporadas. Os parâmetros cinéticos da TNAP na hidrólise de diferentes substratos fisiológicos (ATP, ADP e PPi) foram determinados na presença e ausência de AnxA5, em pH fisiológico, e para os diversos sistemas lipídicos. A melhor eficiência catalítica da enzima foi obtida para sistemas contendo 10% de DPPS (razão molar) (kcat/K0.5= 183,02; 776,06 e 657,08 M-1.s-1, respectivamente). A TNAP apresentou maior especificidade para a hidrólise de PPi quando comparado com ATP e ADP. Estudos utilizando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mostraram que o aumento da concentração de DPPS em DPPC-lipossomos proporcionou um progressivo alargamento no pico de transição de fase, diminuição na t1/2 e H. A pré-transição de fase só foi detectada até a concentração de 15% de DPPS em DPPC. Para 20% de DPPS e acima, observou-se uma segregação lateral de fase com a formação de possíveis microdomínios ricos em DPPS. A interação da AnxA5 com DPPC-lipossomos e DPPC:DPPS 10%-lipossomos resultou em uma redução nos valores de H (de 8,73 para 5,68 e 8,43 para 5,37 Kcal.mol-1, respectivamente). Quando a TNAP está presente nos proteolipossomos, este efeito é ainda maior. A AnxA5 incorporada em DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar) foi capazes de mediar o influxo de 45Ca2+ para dentro das vesículas (~ 800 nmol Ca2+) quando utilizados faixas de concentração de cálcio em níveis fisiológicos (~2 mM). A presença da TNAP nos proteolipossomos não afetou o influxo de Ca2+ mediado pela AnxA5. Entretanto, a presença da AnxA5 afetou significativamente os parâmetros cinéticos da TNAP para os diferentes substratos. Estudos com vesículas unilamelares gigantes (GUVs) também confirmaram a inserção funcional da AnxA5 em vesículas constituídos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e DOPC:DPPS 10% (razão molar). O principal efeito causado pela AnxA5 na morfologia das GUVs foi a perda de contraste óptico devido a formação de poros nas membranas das vesículas. Neste caso, a presença de DPPS não proporcionou mudanças significativas para a incorporação da AnxA5. TNAP quando inserida em GUVs provocou intensa flutuação e excesso de área das vesículas com formação de filamentos. A presença do DPPS provavelmente dificulta a inserção da TNAP à membrana das GUVs. Quando há microdomínios lipídicos heterogêneos na composição de GUVs compostas por DOPC:Colesterol:Esfingomielina (8:1:1) e DOPC:Colesterol:Esfingomielina:Gangliosídeo (7:1:1:1) (razão molar), a inserção da TNAP provocou uma maior segregação lateral de fase evidenciada por imagens com fluorescência. A presença da TNAP e AnxA5 em DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos proporcionou mudanças significativas nas propriedades mecânicas visco-elásticas dos proteolipossomos detectadas por imagens de Microscopia de Força Atômica. Assim, no presente trabalho foi possível obter uma inédita metodologia para a formação de proteolipossomos contendo TNAP e AnxA5 concomitantemente, os quais apresentaram uma reconstituição funcional das proteínas, apresentando capacidade de captar Ca2+ para dentro das vesículas e habilidade de hidrolisar fosfosubstratos em sua superfície. / Bone biomineralization is a multifactorial and complex process, being a challenge for the science the understanding of their regulatory mechanisms. This process is mediated by the release of matrix vesicles (MVs), structures which arise by budding from osteoblast and chondroblast surface and are secreted in the specific site where biomineralization begins. MVs have the ability of accumulating high concentrations of Ca2+ and Pi ions, providing an adequate microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. Two protein families present in MVs merit special attention: Annexins and Phosphatases. The annexins were the most abundant proteins detected in MVs and are responsible for the Ca2+-channels formation (especially AnxA5). Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) exhibits phosphomonohydrolytic activity, producing Pi mainly from PPi and ATP. Such proteins regulate the formation of calcium phosphate crystals, acting directly in the bone mineralization process. The goal of this project was to produce and characterize proteoliposomes with different lipid compositions of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS) harboring TNAP and AnxA5, keeping the functions of both proteins after their incorporation into the mimetic systems. AnxA5 was able to incorporate into DPPC-proteoliposomes (11.64 µg/mL), but the presence of DPPS increased significantly the AnxA5 incorporation (25.79 µg/mL) into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes. The presence of both proteins into DPPC and DPPC:DPPS 5, 10 and 15% (molar ratios) proteoliposomes was confirmed by SDS-PAGE and Immunoblotting analysis. Better yield of TNAP and AnxA5 incorporation was observed when both proteins were reconstituted simultaneously. DPPC-proteoliposomes and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) incorporated about 75% of AnxA5 and 25% of TNAP (protein concentration). DPPS presence did not affect significantly the yield of incorporation of both proteins. The kinetic parameters for the hydrolysis of different physiological substrates (ATP, ADP and PPi) by TNAP were determined in the presence and absence of AnxA5, at physiological pH, for the different systems. The best catalytic efficiencies were achieved with proteoliposomes containing DPPS 10% (molar ratio) (kcat/K0.5= 183.02; 776.06 and 657.08 M-1.s-1 for ATP, ADP and PPi, respectively), condition that also favored PPi hydrolysis by TNAP when compared to ATP and ADP hydrolysis. Studies by Differential Scanning Calorimetry (DSC) showed that the increasing DPPS concentrations in the DPPC-liposomes resulted in a progressive broadening of the phase transition peaks and decreased t1/2 and H values. The pre-transition was detected only in concentrations up to DPPS 15% in DPPC. Phase lateral segregation can be observed for DPPS 20% and above, suggesting the formation of DPPS-rich microdomains. The interaction of AnxA5 with DPPC and DPPC:DPPS 10%-liposomes resulted in a decrease of H values (from 8.73 to 5.68 and from 8.43 to 5.37 Kcal.mol-1, respectively). When TNAP was present in the proteoliposomes, this effect was even greater. AnxA5 incorporated into DPPC and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) was able to mediate 45Ca2+-influx (~ 800 nmol Ca2+) into the vesicles at physiological Ca2+-concentrations (~ 2 mM), and this process was not affected by the presence of TNAP in the systems. However, AnxA5 affected significantly the hydrolysis of substrates by TNAP. Studies with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) also confirmed the functional reconstitution of AnxA5 in dioleoylphosphocholine (DOPC) and DOPC:DPPS 10% (molar ratio) vesicles. The main effect caused by AnxA5 in the GUVs morphology was the formation of pores in the vesicles membrane. In this case, DPPS presence did not affect the AnxA5 incorporation. The presence of TNAP in GUVs caused a several fluctuation, indicating that the vesicles acquired an excess of area and undergoes sequential budding transitions. It is suggested that the presence of DPPS makes the TNAP insertion into the GUVs membrane difficult. With the presence of heterogeneous lipid microdomains in GUVs composed of DOPC, Cholesterol (Chol), Sphingomyelin (SM) and Ganglioside (GM1) in the proportions DOPC:Chol:SM 8:1:1 and DOPC:Chol:SM:GM1 7:1:1:1 (molar ratios), the TNAP insertion caused a greater phase lateral segregation, evidenced by fluorescence analysis. Atomic Force Microscopy (AFM) analysis indicated that the presence of both proteins into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) caused significant changes in the visco-elastic mechanical properties of the vesicles. In conclusion, the present work describes the synthesis of proteoliposomes harboring TNAP and AnxA5 concomitantly, with the functional reconstitution of both proteins, with the ability to transport Ca2+ into the vesicles and hydrolyze phosphosubstrates on their surface.

Doctor of Philosophy / Department of Chemistry / Paul Edward Smith / The activity and function of many macromolecules in cellular environments are coupled with the binding of ions such as alkaline earth metal ions and poly oxo anions. These ions are involved in the regulation of important processes such as protein crystallization, nucleic acid and protein stability, enzyme activity, and many others. The exact mechanism of ion specificity is still elusive. In principle, computer simulations can be used to help provide a molecular level understanding of the dynamics of hydrated ions and their interactions with the biomolecules. However, most of the force fields available today often fail to accurately reproduce the properties of ions in aqueous environments. Here we develop a classical non polarizable force field for aqueous alkaline earth metal halides (MX₂) where M = Mg²⁺, Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺ and X = Cl⁻, Br⁻, I⁻, and for some biologically important oxo anions which are NO₃⁻, ClO₄⁻, H₂PO₄⁻ and SO₄²⁻, for use in biomolecular simulations. The new force field parameters are developed to reproduce the experimental Kirkwood-Buff integrals. The Kirkwood-Buff integrals can be used to quantify the affinity between molecular species in solution. This helps to capture the fine balance between the interactions of ions and water. Since this new force field can reproduce the experimental Kirkwood-Buff integrals for most concentrations of the respective salts, they are capable of reproduce the experimental activity derivatives, partial molar volumes, and excess coordination numbers. Use of these new models in MD simulations also leads to reasonable diffusion constants and dielectric decrements. Attempts to develop force field parameters for CO₃²⁻, HPO₄²⁻ and PO₄³⁻ ions were unsuccessful due to an excessive aggregation behavior in the simulations. Therefore, in an effort to overcome this aggregation behavior in the simulations, we have investigated scaling the anion to water interaction strength, and also the possibility of using a high frequency permittivity in the simulations. The strategy of increasing relative permittivity of the system to mimic electronic screening effects are particularly promising for decreasing the excessive ion clustering observed in the MD simulations.