Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_juliana_alcoforado_diniz.pdf: 1026827 bytes, checksum: f7e6dae0a1eabce2f815ea02d01d8e6a (MD5) Previous issue date: 2012-09-12 / Leptospirosis is a zoonosis caused by bacteria of the Leptospira genus. In recent years, efforts to identify immunogenic components of leptospires have resulted in the characterization of several outer membrane lipoproteins that are expressed during infection. Previously, our group had produced polyclonal IgY antibodies against whole-cell leptospires strain Fiocruz L1-130, which were used in different forms of capture ELISAs. In this study we produced and characterized IgY antibodies against LipL32 in recombinant form (rLipL32), the most abundant lipoprotein in the proteome of pathogenic leptospires, in order to use they in diagnostic assays and prophylaxis of leptospirosis. For this, two 22-week-old hens were immunized on day 0 with rLipL32 and oil adjuvant by intramuscular route. Three booster immunizations on days 14, 28 and 42 were held, and the eggs were collected daily from day 45. The yolks were processed and the antibodies purified with polyethylene glycol, and monitored by SDS-PAGE. Specificity of purified antibodies was assessed through indirect ELISA and Western blot (WB) using both rLipL32 and whole-cell Fiocruz L1-130. After standardization of the first batch of IgY, antibodies were conjugated with horseradish peroxidase and fluorescein (FITC). In addition, we conducted a passive immunoprotection assay in hamster model, using homologous and heterologous challenge. SDS-PAGE confirmed the successful purification of IgY and a batch with a concentration of 13μg.μL-1 was stored at -20ºC until use. Both IgY and IgY conjugated with horseradish peroxidase recognized the recombinant and native protein in ELISA and WB. In this study we produced and characterized successfully IgY against rLipL32. Although these antibodies have not been tested with clinical samples from humans or animals, they have antigen detecting potential for use in the diagnosis of leptospirosis. / A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Leptospira. Nos últimos anos, esforços para a identificação de componentes imunogênicos nas leptospiras resultaram na caracterização de várias lipoproteínas de membrana externa que são expressas durante a infecção. Anteriormente, nosso grupo havia produzido IgY contra Leptospira interrogans cepa Fiocruz L1-130 inteira, a qual foi usada em diferentes formatos de ELISA de captura. No presente estudo, objetivamos produzir e caracterizar anticorpos IgY contra a proteína LipL32 na forma recombinante (rLipL32), a lipoproteína mais abundante no proteoma das leptospiras patogênicas, com intuito de utilizá-los posteriormente, no diagnóstico e na imunoprofilaxia da leptospirose. Para isso, duas galinhas com 22 semanas de idade foram imunizadas no dia 0 com rLipL32 e adjuvante oleoso, através da via intramuscular. Três outras imunizações foram realizadas nos dias 14, 28 e 42 e os ovos coletados diariamente a partir do dia 45. Os anticorpos foram obitidos através do processamento das gemas, purificados com polietilenoglicol e monitorados por SDS-PAGE. A especificidade dos anticorpos foi avaliada através de ELISA indireto e Western blot (WB), ambos utilizando rLipL32 e Fiocruz L1-130 inteira. Após a padronização do primeiro lote de IgY, os anticorpos foram conjugados com peroxidase e fluoresceína (FITC), e avaliados em um ensaio de imunização passiva em hamsters, com desafio homólogo e heterólogo. O SDS-PAGE confirmou o sucesso de purificação, e um lote de IgY com a concentração de 13μg.μL-1 foi estocado a -20ºC até o uso. A IgY pura e conjugada com peroxidase reagiram com as proteínas recombinante e nativa no ELISA e no WB. Nesse estudo, produzimos e caracterizamos com sucesso IgY contra rLipL32. Embora esses anticorpos não tenham sido testados com amostras clínicas de humanos e animais, eles possuem potencial para compor ensaios que visem a detecção do antígeno no diagnóstico da leptospirose.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCLSP.pdf: 1835751 bytes, checksum: 94d92e1d4b14f4f8befcd6cb0b350de1 (MD5) Previous issue date: 2006-11-23 / Universidade Federal de Sao Carlos / Disintegrins are snake venom protein, of low molecular weight, rich in cysteines and RGDcontaining peptides that bind specifically to integrins αIIbβ3, α5β1, and αvβ3 expressed on platelets, endothelial and tumor cells. The biological effects of these peptides are related with biological process of cellular adhesion where receptors called integrins are presents. This dissertation describes the optimization of purification and additional characterization of a recombinant RGD-disintegrin of Bothrops alternatus, DisBa-01.. The DisBa-01 is a recombinant RGD-disintegrin, which interacts with αIIbβ3 integrin, inhibiting platelet aggregation and proliferation of endothelial and some tumor cells. In this work, a new protocol of purification was proposed for most efficient purification of the DisBa-01. The recombinant disintegrin, DisBa-01, was expressed in an optimizedbacterial system (Escherichia coli BL21(DE3) pET28a+DisBa-01) and purified by affinity chromatography. In this new protocol, the product of the purification in nickel column is submitted ion exchange chromatography. The use of the ion exchange chromatography as second step for purification increased the purity degree and the protein yield. The purified protein had its N-Terminal portion sequenced in 20 amino acids residues and its molecular mass determined by mass spectrometry. The mass spectrometry assay confirmed the mass of the DisBa-01 as 11.658 Da. The RGD-disintegrin pure had the tag of polihistidinas removed with thrombin. The cleavage of the tag of histidinas with thrombin was efficient. Polyclonal antibodies against DisBa-01 have also been produced in mice. The reactivity of these antibodies was observed through imunoblotting. These results provided one better form of obtain the pure protein as well as significant additional information for a better characterization of recombinant RGDdisintegrin, DisBa-01, which could be useful for the study of RGD-disintegrin, recombinant or native, and integrin. / Desintegrinas são proteínas de veneno de serpentes, de baixo peso molecular, ricas em cisteína e em geral um peptídeo contendo o motivo RGD que liga especificamente a integrinas αIIbβ3, α5β1, e αvβ3 de plaquetas, células endoteliais e células tumorais. Os efeitos biológicos desses peptídeos estão relacionados com processos biológicos de adesão celular onde receptores denominados integrinas estão presentes. Esta dissertação descreve a otimização da purificação de uma desintegrina-RGD recombinante de Bothrops alternatus, DisBa-01, e a caracterização adicional desta proteína. A DisBa-01 é uma desintegrina-RGD recombinante que interage com a integrina αIIbβ3 inibindo agregação plaquetária e proliferação de células endoteliais e algumas células tumorais. Neste trabalho, um novo protocolo de purificação foi proposto para a purificação mais eficiente da DisBa-01. A desintegrina, DisBa-01, foi expressa em um sistema bacteriano otimizado (Escherichia coli BL21(DE3)pET28a+DisBa-01) e purificada em coluna de afinidade. Neste novo protocolo, o produto da purificação na coluna de níquel é submetido à cromatografia de troca-iônica. O uso da cromatografia de troca-iônica aumentou o grau de pureza e o produto protéico final. A proteína purificada teve o N-terminal seqüenciado em 20 resíduos de aminoácidos. A massa molecular foi determinada por espectrometria de massa que confirmou como 11.658 Da a massa da proteína. A desintegrina-RGD pura teve a cauda de polihistidinas eficientemente removida com proteólise com trombina. Anticorpos policlonais contra DisBa-01 foram produzidos em camundongos. A reatividade desses anticorpos foi observada através de imunoblotting. Estes resultados estabelecem uma nova forma de obtenção da proteína pura, assim como informações adicionais significativas de uma melhor caracterização da desintegrina-RGD recombinante, DisBa-01, que pode ser útil para o estudo de desintegrinas- RGD, recombinantes ou nativas, e interações com integrinas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-07Bitstream added on 2014-06-13T21:06:29Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_e_dr_botfmvz.pdf: 757118 bytes, checksum: 8b4ac338061cf6ba7fd00cd910adc25d (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da alimentação de bovinos da raça Nelore com dietas de alto concentrado com preparado anticorpo policlonal (PAP), leveduras vivas - Saccharomyces cerevisae (LEV), monensina sódica (MON), associação entre PAP e LEV (MIX) e sem aditivos - controle (CTL) no desempenho, características de carcaça e custo do quilograma de peso vivo ganho em confinamento. Foram utilizados 95 bovinos Nelore, não castrados, com 20 meses de idade, oriundos de recria a pasto, terminados em confinamento por 112 dias com dietas de alto concentrado iso-protéicas e iso-energéticas. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON sobre ingestão de matéria seca durante o período de confinamento, porém a MON exerceu efeito (P<0,05) reduzindo a ingestão de matéria seca em percentagem do peso vivo nos primeiros 28 dias de confinamento em relação aos demais aditivos alimentares. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON em relação ao ganho de peso médio diário ao longo do confinamento, mais houve efeito negativo (P<0,05) do aditivo LEV, que diminuiu o ganho de peso dos animais ao longo do período de confinamento, consequentemente apresentou uma pior (P>0,05) conversão alimentar e um maior (P>0,05) custo para o quilo ganho em confinamento. O fornecimento de leveduras vivas também propiciou menor (P<0,05) peso de carcaça quente e peso de carcaça em arrobas. Os animais que receberam os aditivos alimentares PAP e LEV apresentaram (P<0,05) menor quantidade de gordura visceral na carcaça em relação aos animais que receberam MON. A utilização de PAP e LEV não alteram (P>0,05) as medidas de área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e espessura de gordura subcutânea do músculo Biceps femoris (EGG) em relação à MON e CTL / The objective of this study was to evaluate the effects of feeding Nellore bullocks with high concentrate diets containing: polyclonal antibody preparation (PAP), live yeast - Saccharomyces cerevisae (LEV), sodic monensin (MON), the association of PAP e LEV (MIX) and a control group on performance, carcass traits, and cost of gain. The diets were iso-energetic and iso-proteic and the feeding period was 112 days. There was no effect (P>0.05) of feeding ionophores on dry matter intake during total feeding period, however MON reduced (P<0.05) dry matter intake as body weight percentage in the first 28 days, compared to the others feed additives. There was no effect (P>0.05) of feeding MON in averaged daily gain, but on the other hand, there was found a negative effect (P<0.05) of feeding LEV, which decreased averaged daily gain, increased feed conversion and cost of gain. The addition of LEV in the diets also decreased (P<0.05) hot carcass weight. Animals that received PAP and LEV presented (P<0.05) less visceral fat than MON. The inclusion of PAP and LEV did not altered (P>0.05) ultrasound measurements compared to MON and CTL

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-07Bitstream added on 2014-06-13T20:17:03Z : No. of bitstreams: 1 bastos_jpst_me_botfmvz.pdf: 410858 bytes, checksum: 65d4c4f6f1d9565cc9e57b146657bfd7 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos de diferentes doses do preparado de anticorpos policlonais (PAP) produzido contra diferentes cepas de bactérias ruminais sobre parâmetros de fermentação ruminal (pH, AGCC, nitrogênio amoniacal e lactato) em bovinos recebendo dieta de alto concentrado. Foram utilizadas oito fêmeas bovinas, canuladas no rúmen, alimentadas (ad libitum) duas vezes ao dia com dieta de alto concentrado. O delineamento experimental utilizado foi o quadrado latino 4 x 4, replicado duas vezes. Os quatro tratamentos foram estruturados de acordo com as diferentes doses do produto (T1: 0,0 g/animal/dia, “controle”; T2: 1,5 g/animal/dia; T3: 3,0 g/animal/dia e T4: 4,5 g/animal/dia) e em diferentes períodos experimentais. Cada período experimental foi constituído de 21 dias, sendo que as colheitas de líquido ruminal foram realizadas a cada duas horas nos tempos de 0 a 12 horas, após a alimentação, no último dia de cada período e posteriormente analisadas. Não foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento (p > 0,05) para os dados de pH. Independentemente do tempo de amostragem, não foi observado efeito linear ou quadrático dos níveis de administração do PAP sobre o pH ruminal. Não foram observados efeitos significativos (p > 0,05) sobre a concentração de AGCC total, nitrogênio amoniacal ou proporções molares dos ácidos acético, propiônico e butírico e lactato. Também não foram observados efeitos nos parâmetros de degradabilidade in situ para as três diferentes fontes alimentares utilizadas e para os valores de digestibilidade in vivo. Com isso, pode-se concluir que as diferentes doses do PAP não foram suficientes para alterar o ambiente ruminal sendo necessária à realização de mais testes que refutem ou não essa resposta. / Due the prohibition of antibiotics in ruminants diets arouse the necessity to find new alternatives for ionophores utilization without hazard to human health. The objective of the present study was to evaluate the effects of different doses of polyclonal antibody preparation (PAP) on ruminal fermentation parameters (pH, short chain fatty acids, ammonia nitrogen and lactate) in cattle fed high concentrate diets. Eight rumen cannulated cows were used in a latin square 4x4, twice replicated. The treatments were T1: 0.0 g/animal/day, “control”; T2: 1.5 g/animal/day; T3: 3.0 g/animal/day; T4: 4.5 g/animal/day with four experimental periods with 21 days each. Sample collection was carried out at the last day of each period with two hours of interval between each collection. There was no interaction between time and treatment (p > 0.05) for pH data. Independently from time of sampling there was no linear or quadratic effect on total short chain fatty acids (tSCFA), ammonia nitrogen (NH3-N) or molar proportion of acetate, propionate and butirate. There were no significant differences to degradability and digestibility values in this trial. Thus, it can be concluded that different levels of PAP were not sufficient to alter rumen environment with the necessity of more studies to validate or not this observation.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-10-05T18:40:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2695208 bytes, checksum: 64ee45ce4e18a3b829acab0ecd84536a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-05T18:40:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2695208 bytes, checksum: 64ee45ce4e18a3b829acab0ecd84536a (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Seca de ponteiros, causada por Erwinia psidii é atualmente uma das doenças emergentes mais severas na cultura do eucalipto. Apesar de sua importância econômica, em virtude dos riscos que pode causar na eucaliptocultura, pouco se sabe sobre este patossistema. Assim, neste trabalho, a partir de cortes histológicos, estudou-se o processo de colonização em plantas de eucalipto usando um isolado de E. psidii transformado com gfp, estimou-se a variabilidade genética das populações do patógeno por meio de marcadores moleculares rep– PCR (ERIC, REP e BOX) e desenvolveu-se um imunoteste para detecção rápida de E. psidii usando colônias puras isoladas de plantas sintomáticas e assintomáticas. Neste estudo, conseguiu-se transformar E. psidii com pGreen-TIR e demonstrar que o plasmídeo é estável na ausência de seleção com antibióticos in vitro e in vivo. Usando microscopia de fluorescência, demonstrou-se que a colonização de E. psidii nos tecidos não está restrita ao ponto de inoculação (axila foliar). E. psidii coloniza os vasos do xilema, esclerênquima e parênquima das folhas e caule do eucalipto. Aos 35 dias após a inoculação (dai), a bactéria encontrava-se a 5 cm acima do ponto de inoculação, indicando que foi capaz de colonizar a planta acropetalmente, acompanhando o fluxo da água e nutrientes. Análises por microscopia confocal de amostras de plantas inoculadas via sistema raicular revelaram que E. psidii penetra e coloniza raízes primárias e secundárias e atinge os vasos do xilema. No entanto, nos tempos após inoculação avaliados neste estudo, a bactéria ficou restrita nas raízes e não atingiou o caule da planta. Estudos adicionais avaliando tempos após inoculação maiores devem ser realizados para confirmar esses resultados. Acredita-se que E. psidii seja disseminada a partir de mudas infectadas assintomáticas. Análises moleculares (rep-PCR) de 101 isolados de E. psidii obtidos de Eucalyptus spp. e cinco isolados de goiabeira (Psidium guajava) indicam que as populações de E. psidii do Brasil apresentam baixa variabilidade genética. Observou-se, contudo, o agrupamento dos isolados por espécie hospedeira, embora dois isolados de goiaba (LPF681 e LPF682) agruparam-se com os de eucalipto (LPF609). Testes de Wilcoxon e ANOVA dos dados de severidade e AACPD para diferentes isolados da bactéria inoculados em dois clones de eucalipto indicaram que há interação isolado × clone. A AACPD e a severidade da doença variaram significativamente entre isolados e nos dois clones testados. A variabilidade em agressividade entre isolados de E. psidii demonstraram a importância do emprego de isolados mais agressivos para a seleção de genótipos de eucalipto resistentes para plantio em escala comercial. O anti-soro contra o isolado LPF534 de E. psidii (Anti-Ep), obtido neste estudo, reagiu positivamente contra todos os isolados de E. psidii testados, incluindo alguns isolados de goiaba. O teste de aglutinação desenvolvido com este anti-soro é importante para o diagnóstico de E. psidii, por representar uma alternativa rápida e de baixo custo, em comparação com métodos baseados em PCR para a detecção do patógeno em plantas assintomáticas. / Dieback, caused by Erwinia psidii is currently one of the most severe emerging diseases in eucalypt plantations. Despite its economic importance, due to the risks posed to eucalypt production, little is known about this pathosystem. In this work, we studied the plant colonization by a gfp-transformed E. psidii isolate using histological sections, estimated the genetic variability of pathogen populations using molecular rep–PCR markers (ERIC, REP and BOX) and developed an immunoassay for the rapid detection of E. psidii in symptomatic and asymptomatic plants. In this study, we were able to transform E. psidii with pGreen-TIR and to demonstrate that the plasmid is stable in the absence of antibiotic selection both in vitro and in vivo. Using fluorescence microscopy, it was possible to demonstrate that tissue colonization by E. psidii is not restricted to the inoculation point (leaf axil) and that it colonizes the xylem vessels, sclerenchyma and parenchyma of the leaves and stem of eucalypt. At 35 days after inoculation (dai), the bacterium was found at 5 cm above the inoculation point, indicating that it was able to colonize the plant acropetally, following the water flow. Confocal microscopy analysis of plant samples inoculated via radicular system revealed that E. psidii penetrates and colonizes primary and secondary roots and reaches the xylem vessels. However, at the times after inoculation evaluated in this study, the bacterium was restricted to the roots and did not reach the stem of the plant. Further studies with longer times after inoculation must be performed to confirm these results. It is believed that E. psidii is disseminated from infected asymptomatic cuttings. Molecular analyzes (rep-PCR) of 101 E. psidii isolates obtained from eucalypt (Eucalyptus spp.) and five guava (Psidium guajava) demonstrated that the populations in Brazil have low genetic variability. Nonetheless, grouping of isolates by host plant was observed, although two guava isolates (LPF681 and LPF682) grouped with eucalypt isolates (LPF609). The Wilcoxon and ANOVA tests on disease severity and AUDPC data indicated an isolate × clone interaction. AUDPC and disease severity varied significantly among isolates and between the two clones tested. The variability in aggressiveness among isolates of E. psidii demonstrated the importance of using the most aggressive isolates in the selection of resistant eucalypt genotypes for commercial scale planting. An antiserum against E. psidii isolate LPF534 (Anti-Ep) obtained in this study reacted positively against all strains of E. psidii tested, including some isolated from guava. The agglutination test designed using this antiserum can be considered important for the diagnosis of E. psidii, as it represents a rapid and low-cost alternative compared to PCR-based methods for detecting the pathogen in asymptomatic plants.

A imunidade passiva surge como uma alternativa para a manipulação da fermentação ruminal e anticorpos de origem aviária contra bactérias específicas começam a ser pesquisados. Objetivou-se com este trabalho avaliar um preparado de anticorpos policlonais contra Streptococus bovis, Fusobacterium necrophorum e algumas cepas de bactérias proteolíticas (Peptostreptococcus anacrobius, Clostridium aminophilum e Clostridium sticklandii) sobre a diversidade microbiana ruminal e degradabilidade in situ de alguns alimentos. Foram utilizadas nove vacas mestiças portadoras de cânula ruminal. O delineamento experimental foi o quadrado latino 3 x 3 replicado 3 vezes, com arranjo fatorial de tratamentos 3 x 3 referente a 2 modificadores ruminais representados pela monensina (MON) e pelo preparado de anticorpos policlonais (PAP) mais o grupo controle e 3 fontes energéticas suplementadas na dieta, representadas pelo milho seco moído (MSM), silagem de grão úmido de milho (SGUM) e polpa cítrica (PC). Cada subperíodo experimental foi composto de 21 dias, sendo 16 dias para adaptação aos tratamentos e 5 para coleta de dados. A degradabilidade in situ dos alimentos testados foi mensurada através da técnica de saco de náilon. A coleta de amostras para a análise quantitativa de protozoários ocorreu no 21° dia de cada período, às 0 e 4 horas pós-alimentação, sendo estas coletadas por varredura do assoalho ruminal. O conteúdo ruminal foi coletado no 21° dia de cada período, às 4 h pós-alimentação, para análise da diversidade microbiana através de técnica de eletroforese em gel com gradiente de desnaturação. Observou-se que dietas contendo PC apresentaram aumento de 80,6%; 75,4% e 66,8% da degradabilidade efetiva da FDN da cana-de-açúcar para as taxas de passagem de 2, 5, 8%/h, respectivamente, em relação ao grupo tratado com SGUM, mas não em relação ao grupo com MSM. O tratamento com PAP demonstrou efeito sobre a fração solúvel (a) do amido do MSM, diminuindo esta em 45,26% e 45,37% em relação ao grupo CON e grupo MON, respectivamente. Observou-se que o tratamento com MON diminuiu em 16,14% o valor da fração potencialmente degradável (b) da MS da SGUM em relação ao grupo CON, mas não em relação ao grupo tratado com PAP. Já sobre a taxa de degradação (c), a MON aumentou o valor desta em 63,18% e 60,65% em relação ao grupo CON e PAP, respectivamente. Também a MON diminuiu a degradabilidade potencial (Dp) da MS da SGUM em 3,40% em relação ao grupo CON, mas não em relação ao grupo tratado com PAP. Observou-se que o PAP aumentou em 93,65% a contagem relativa de Isotricha em relação ao grupo CON, mas não em relação ao grupo MON. Já a PC aumentou em 334,42% (0h) e 399,75% (4h) a contagem relativa de protozoários do gênero Isotricha em relação às dietas de MSM e SGUM. Observou-se que o tratamento com PC aumentou em 52% a contagem do número de bandas em DGGE para a comunidade Archaea, em relação ao grupo MSM, sem diferir do grupo SGUM. Em linhas gerais, no presente experimento, não foi possível atribuir um padrão na estrutura de amplificação das comunidades Bacteria ou Archaea do conteúdo ruminal de animais tratados com dois diferentes modificadores ruminais ou 3 fontes energéticas distintas. / Passive immunity arises as an alternative for ruminal fermentation manipulation and aviary antibodies against specific bacteria starts to be studied. The objective of the present study was to evaluate a polyclonal antibody preparation (PAP) against Streptococus bovis, Fusobacterium necrophorum and some proteolytic bacteria (Peptostreptococcus anacrobius, Clostridium aminophilum and Clostridium sticklandii) on ruminal microbial community diversity and in situ degradability of some feedstuffs. Nine ruminally fistulated cows were used in a latin square 3 x 3 replicated 3 times with factorial arrangement of treatments 3 x 3 regarding to two rumen modifiers [monensin (MON) and (PAP) plus a control group (CON)] and three energetic sources supplemented in the diet represented by the dry-grounded corn grain (CG), high moisture corn silage (HMCS) and citrus pulp (CiPu). Each trial lasted 21 days where 16 days were for treatments adaptation and 5 for data collection. In situ degradability of the experimental diets was measured by nylon bag in situ technique. The collection of samples for quantitative protozoa analysis occurred on day 21 of each trial at 0 and 4 h after feeding by scanning the ruminal floor. The ruminal content was collected in the day 21 of each trial at 0 and 4 h after feeding for the analysis of microbial ruminal diversity by the denaturing gradient gel electrophoresis. Diets with CiPu presented an increase of 80.6%; 75.4% and 66.8% in effective degradability of NDF of sugar cane for outflow rates of 0.02, 0.05, 0.08/h, respectively, in relation to group treated with HMCS but not to the group CG. The group treated with PAP showed effect on soluble fraction (a) of starch of CG decreasing it in 45.26% and 45.37% in relation to CON and MON group respectively. It was observed that the treatment with MON decreased in 16.14% the value of potentially soluble fraction (b) of DM from HMCS in relation to CON group but not in relation to PAP. For the degradation rate (c) the MON increased it values in 63.18% and 60.65% in relation to CON and PAP group respectively. Also, MON treatment decreased potential degradability (Pd) of DM of HMCS in 3.40% in relation to CON group but not to PAP. It was observed that PAP treatment increased in 93.65% the relative counting of Isotricha in relation to CON group but not in relation to MON group. It was observed that CiPu diet increased in 334.42% (0h) and 399.75% (4h) the relative counting of Isotricha in relation to CG and HMCS. It was observed that CiPu increased in 52% the counting of the numbers of bands in DGGE for Archaea community in relation to CG without difference to HMCS group. In general lines, in the present experiment, it was not possible to assign that there was a pattern in the structures of amplification by Bacteria and Archaea communities of the ruminal content of animals treated with two different rumen modifiers or three distinct energetic sources.

Orientador: Mário de Beni Arrigoni / Banca: André Mendes Jorge / Banca: Rafael da Costa Cervieri / Banca: Cristiana Andrighetto / Banca: Alexandre Amstalden Moraes Sampaio / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da alimentação de bovinos da raça Nelore com dietas de alto concentrado com preparado anticorpo policlonal (PAP), leveduras vivas - Saccharomyces cerevisae (LEV), monensina sódica (MON), associação entre PAP e LEV (MIX) e sem aditivos - controle (CTL) no desempenho, características de carcaça e custo do quilograma de peso vivo ganho em confinamento. Foram utilizados 95 bovinos Nelore, não castrados, com 20 meses de idade, oriundos de recria a pasto, terminados em confinamento por 112 dias com dietas de alto concentrado iso-protéicas e iso-energéticas. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON sobre ingestão de matéria seca durante o período de confinamento, porém a MON exerceu efeito (P<0,05) reduzindo a ingestão de matéria seca em percentagem do peso vivo nos primeiros 28 dias de confinamento em relação aos demais aditivos alimentares. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON em relação ao ganho de peso médio diário ao longo do confinamento, mais houve efeito negativo (P<0,05) do aditivo LEV, que diminuiu o ganho de peso dos animais ao longo do período de confinamento, consequentemente apresentou uma pior (P>0,05) conversão alimentar e um maior (P>0,05) custo para o quilo ganho em confinamento. O fornecimento de leveduras vivas também propiciou menor (P<0,05) peso de carcaça quente e peso de carcaça em arrobas. Os animais que receberam os aditivos alimentares PAP e LEV apresentaram (P<0,05) menor quantidade de gordura visceral na carcaça em relação aos animais que receberam MON. A utilização de PAP e LEV não alteram (P>0,05) as medidas de área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e espessura de gordura subcutânea do músculo Biceps femoris (EGG) em relação à MON e CTL / Abstract: The objective of this study was to evaluate the effects of feeding Nellore bullocks with high concentrate diets containing: polyclonal antibody preparation (PAP), live yeast - Saccharomyces cerevisae (LEV), sodic monensin (MON), the association of PAP e LEV (MIX) and a control group on performance, carcass traits, and cost of gain. The diets were iso-energetic and iso-proteic and the feeding period was 112 days. There was no effect (P>0.05) of feeding ionophores on dry matter intake during total feeding period, however MON reduced (P<0.05) dry matter intake as body weight percentage in the first 28 days, compared to the others feed additives. There was no effect (P>0.05) of feeding MON in averaged daily gain, but on the other hand, there was found a negative effect (P<0.05) of feeding LEV, which decreased averaged daily gain, increased feed conversion and cost of gain. The addition of LEV in the diets also decreased (P<0.05) hot carcass weight. Animals that received PAP and LEV presented (P<0.05) less visceral fat than MON. The inclusion of PAP and LEV did not altered (P>0.05) ultrasound measurements compared to MON and CTL / Doutor

A imunidade passiva surge como uma alternativa para a manipulação da fermentação ruminal e anticorpos de origem aviária contra bactérias específicas começam a ser pesquisados. Objetivou-se com este trabalho avaliar um preparado de anticorpos policlonais contra Streptococus bovis, Fusobacterium necrophorum e algumas cepas de bactérias proteolíticas (Peptostreptococcus anacrobius, Clostridium aminophilum e Clostridium sticklandii) sobre a diversidade microbiana ruminal e degradabilidade in situ de alguns alimentos. Foram utilizadas nove vacas mestiças portadoras de cânula ruminal. O delineamento experimental foi o quadrado latino 3 x 3 replicado 3 vezes, com arranjo fatorial de tratamentos 3 x 3 referente a 2 modificadores ruminais representados pela monensina (MON) e pelo preparado de anticorpos policlonais (PAP) mais o grupo controle e 3 fontes energéticas suplementadas na dieta, representadas pelo milho seco moído (MSM), silagem de grão úmido de milho (SGUM) e polpa cítrica (PC). Cada subperíodo experimental foi composto de 21 dias, sendo 16 dias para adaptação aos tratamentos e 5 para coleta de dados. A degradabilidade in situ dos alimentos testados foi mensurada através da técnica de saco de náilon. A coleta de amostras para a análise quantitativa de protozoários ocorreu no 21° dia de cada período, às 0 e 4 horas pós-alimentação, sendo estas coletadas por varredura do assoalho ruminal. O conteúdo ruminal foi coletado no 21° dia de cada período, às 4 h pós-alimentação, para análise da diversidade microbiana através de técnica de eletroforese em gel com gradiente de desnaturação. Observou-se que dietas contendo PC apresentaram aumento de 80,6%; 75,4% e 66,8% da degradabilidade efetiva da FDN da cana-de-açúcar para as taxas de passagem de 2, 5, 8%/h, respectivamente, em relação ao grupo tratado com SGUM, mas não em relação ao grupo com MSM. O tratamento com PAP demonstrou efeito sobre a fração solúvel (a) do amido do MSM, diminuindo esta em 45,26% e 45,37% em relação ao grupo CON e grupo MON, respectivamente. Observou-se que o tratamento com MON diminuiu em 16,14% o valor da fração potencialmente degradável (b) da MS da SGUM em relação ao grupo CON, mas não em relação ao grupo tratado com PAP. Já sobre a taxa de degradação (c), a MON aumentou o valor desta em 63,18% e 60,65% em relação ao grupo CON e PAP, respectivamente. Também a MON diminuiu a degradabilidade potencial (Dp) da MS da SGUM em 3,40% em relação ao grupo CON, mas não em relação ao grupo tratado com PAP. Observou-se que o PAP aumentou em 93,65% a contagem relativa de Isotricha em relação ao grupo CON, mas não em relação ao grupo MON. Já a PC aumentou em 334,42% (0h) e 399,75% (4h) a contagem relativa de protozoários do gênero Isotricha em relação às dietas de MSM e SGUM. Observou-se que o tratamento com PC aumentou em 52% a contagem do número de bandas em DGGE para a comunidade Archaea, em relação ao grupo MSM, sem diferir do grupo SGUM. Em linhas gerais, no presente experimento, não foi possível atribuir um padrão na estrutura de amplificação das comunidades Bacteria ou Archaea do conteúdo ruminal de animais tratados com dois diferentes modificadores ruminais ou 3 fontes energéticas distintas. / Passive immunity arises as an alternative for ruminal fermentation manipulation and aviary antibodies against specific bacteria starts to be studied. The objective of the present study was to evaluate a polyclonal antibody preparation (PAP) against Streptococus bovis, Fusobacterium necrophorum and some proteolytic bacteria (Peptostreptococcus anacrobius, Clostridium aminophilum and Clostridium sticklandii) on ruminal microbial community diversity and in situ degradability of some feedstuffs. Nine ruminally fistulated cows were used in a latin square 3 x 3 replicated 3 times with factorial arrangement of treatments 3 x 3 regarding to two rumen modifiers [monensin (MON) and (PAP) plus a control group (CON)] and three energetic sources supplemented in the diet represented by the dry-grounded corn grain (CG), high moisture corn silage (HMCS) and citrus pulp (CiPu). Each trial lasted 21 days where 16 days were for treatments adaptation and 5 for data collection. In situ degradability of the experimental diets was measured by nylon bag in situ technique. The collection of samples for quantitative protozoa analysis occurred on day 21 of each trial at 0 and 4 h after feeding by scanning the ruminal floor. The ruminal content was collected in the day 21 of each trial at 0 and 4 h after feeding for the analysis of microbial ruminal diversity by the denaturing gradient gel electrophoresis. Diets with CiPu presented an increase of 80.6%; 75.4% and 66.8% in effective degradability of NDF of sugar cane for outflow rates of 0.02, 0.05, 0.08/h, respectively, in relation to group treated with HMCS but not to the group CG. The group treated with PAP showed effect on soluble fraction (a) of starch of CG decreasing it in 45.26% and 45.37% in relation to CON and MON group respectively. It was observed that the treatment with MON decreased in 16.14% the value of potentially soluble fraction (b) of DM from HMCS in relation to CON group but not in relation to PAP. For the degradation rate (c) the MON increased it values in 63.18% and 60.65% in relation to CON and PAP group respectively. Also, MON treatment decreased potential degradability (Pd) of DM of HMCS in 3.40% in relation to CON group but not to PAP. It was observed that PAP treatment increased in 93.65% the relative counting of Isotricha in relation to CON group but not in relation to MON group. It was observed that CiPu diet increased in 334.42% (0h) and 399.75% (4h) the relative counting of Isotricha in relation to CG and HMCS. It was observed that CiPu increased in 52% the counting of the numbers of bands in DGGE for Archaea community in relation to CG without difference to HMCS group. In general lines, in the present experiment, it was not possible to assign that there was a pattern in the structures of amplification by Bacteria and Archaea communities of the ruminal content of animals treated with two different rumen modifiers or three distinct energetic sources.

Globalmente ocorrem cerca de 800.000 mortes de crianças menores de cinco anos associadas à diarreia, principalmente na África subsaariana, sul da Ásia e América Latina. Dentre os patógenos causadores de diarreia, Escherichia coli diarreiogênica (DEC) é o agente etiológico bacteriano mais comum, incluindo E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli produtora da toxina de Shiga e seu subgrupo enterohemorrágica (STEC/EHEC). Os dados epidemiológicos indicam a importância do diagnóstico precoce e sua realização em locais com pouca infraestrutura. Desta forma o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um teste rápido, sensível e específico para o diagnóstico de EPEC e STEC/EHEC. Primeiramente, foram definidas diferentes condições do cultivo bacteriano: Dulbecco\'s modified Eagle\'s (DMEM), DMEM contendo 1% de triptona e DMEM pré-condicionado para o cultivo dos isolados de EPEC/EHEC e avaliação da produção/secreção das proteínas secretadas EspA e EspB, utilizando anticorpos monoclonais (MAb) e policlonais (PAb) anti-EspA ou anti-EspB por ELISA indireto. Para a avaliação da liberação das toxinas de Shiga para o sobrenadante do cultivo bacteriano de STEC/EHEC, foram testados diferentes condições de tratamento, o cultivo bacteriano foi tratado com Triton X-100 e o sedimento foi tratado com tampão de lise B-PER utilizando MAb e PAb anti-Stx1 ou anti-Stx2 por ELISA de captura. Subsequentemente, foi desenvolvido e avaliado o teste de aglutinação em látex para a detecção de EspB em isolados de EPEC/EHEC, e Stx1 e Stx2 em isolados de STEC/EHEC. EspB foi definida como biomarcador, o MAb anti-EspB como ferramenta para o diagnóstico de EPEC/EHEC, e a condição ideal para a produção/secreção de EspB foi o cultivo em DMEM. Para o diagnóstico de STEC/EHEC a condição ideal para liberação das toxinas Stx foi o tratamento do cultivo com Triton X-100. Tanto o ELISA, como a aglutinação em látex apresentaram sensibilidades e especificidades exigidas para testes diagnósticos de doenças negligenciadas em países em desenvolvimento e os testes de aglutinação em látex para a detecção destes patógenos foram precisos, rápidos e fáceis de executar, sendo portanto promissores para a utilização em laboratórios com mínima infraestrutura. / There are 800,000 deaths associated with diarrhea worldwide in children under five, and these are mainly in sub-Saharan Africa, Southeast Asia and Latin America. Among the causative pathogens of diarrhea, diarrheagenic Escherichia coli (DEC) is the most common bacterial etiological agent, including enteropathogenic E. coli (EPEC) and Shiga toxin-producing E. coli and its subgroup enterohemorrhagic E. coli (STEC/EHEC). Epidemiological data indicate the importance of early diagnosis and its realization in places with limited resources. Therefore, the objective of this work was to develop a rapid, sensitive and specific test for the diagnosis of EPEC and STEC/EHEC. First, different bacterial growth conditions were evaluated: Dulbecco\'s modified Eagle\'s medium (DMEM) or DMEM containing 1% tryptone, and DMEM pre-conditioned with EPEC/EHEC isolates. The production/secretion of the secreted proteins EspA and EspB was determined by indirect ELISA utilizing anti-EspA or anti-EspB monoclonal (MAb) and polyclonal (PAb) antibodies. Different treatments were tested for their effect on the release of Shiga toxins into the medium of STEC/EHEC bacterial cultures. The bacterial culture supernatant was treated with Triton X-100, and the sediment was treated with B-PER lysis buffer. The toxins release was determined by capture ELISA using anti-Stx1 or anti-Stx2 MAb and PAb. Subsequently, a latex agglutination test was developed and evaluated for the detection of EspB in EPEC/EHEC isolates and of Stx1 and Stx2 in STEC/EHEC isolates. EspB was defined as the biomarker and anti-EspB MAb as the tool for the diagnosis of EPEC/EHEC. The ideal conditions for the production/secretion of EspB were cultivation in DMEM. For the diagnosis of STEC/EHEC, the ideal conditions for the release of Stx were Triton X-100 treatment. ELISA as well as latex agglutination showed the sensitivities and specificities required for diagnostic tests of neglected diseases in developing countries. The latex agglutination test for the detection of these pathogens was precise, rapid and easy to perform, thereby being promising for their utilization in laboratories with limited resources.

Globalmente ocorrem cerca de 800.000 mortes de crianças menores de cinco anos associadas à diarreia, principalmente na África subsaariana, sul da Ásia e América Latina. Dentre os patógenos causadores de diarreia, Escherichia coli diarreiogênica (DEC) é o agente etiológico bacteriano mais comum, incluindo E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli produtora da toxina de Shiga e seu subgrupo enterohemorrágica (STEC/EHEC). Os dados epidemiológicos indicam a importância do diagnóstico precoce e sua realização em locais com pouca infraestrutura. Desta forma o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um teste rápido, sensível e específico para o diagnóstico de EPEC e STEC/EHEC. Primeiramente, foram definidas diferentes condições do cultivo bacteriano: Dulbecco\'s modified Eagle\'s (DMEM), DMEM contendo 1% de triptona e DMEM pré-condicionado para o cultivo dos isolados de EPEC/EHEC e avaliação da produção/secreção das proteínas secretadas EspA e EspB, utilizando anticorpos monoclonais (MAb) e policlonais (PAb) anti-EspA ou anti-EspB por ELISA indireto. Para a avaliação da liberação das toxinas de Shiga para o sobrenadante do cultivo bacteriano de STEC/EHEC, foram testados diferentes condições de tratamento, o cultivo bacteriano foi tratado com Triton X-100 e o sedimento foi tratado com tampão de lise B-PER utilizando MAb e PAb anti-Stx1 ou anti-Stx2 por ELISA de captura. Subsequentemente, foi desenvolvido e avaliado o teste de aglutinação em látex para a detecção de EspB em isolados de EPEC/EHEC, e Stx1 e Stx2 em isolados de STEC/EHEC. EspB foi definida como biomarcador, o MAb anti-EspB como ferramenta para o diagnóstico de EPEC/EHEC, e a condição ideal para a produção/secreção de EspB foi o cultivo em DMEM. Para o diagnóstico de STEC/EHEC a condição ideal para liberação das toxinas Stx foi o tratamento do cultivo com Triton X-100. Tanto o ELISA, como a aglutinação em látex apresentaram sensibilidades e especificidades exigidas para testes diagnósticos de doenças negligenciadas em países em desenvolvimento e os testes de aglutinação em látex para a detecção destes patógenos foram precisos, rápidos e fáceis de executar, sendo portanto promissores para a utilização em laboratórios com mínima infraestrutura. / There are 800,000 deaths associated with diarrhea worldwide in children under five, and these are mainly in sub-Saharan Africa, Southeast Asia and Latin America. Among the causative pathogens of diarrhea, diarrheagenic Escherichia coli (DEC) is the most common bacterial etiological agent, including enteropathogenic E. coli (EPEC) and Shiga toxin-producing E. coli and its subgroup enterohemorrhagic E. coli (STEC/EHEC). Epidemiological data indicate the importance of early diagnosis and its realization in places with limited resources. Therefore, the objective of this work was to develop a rapid, sensitive and specific test for the diagnosis of EPEC and STEC/EHEC. First, different bacterial growth conditions were evaluated: Dulbecco\'s modified Eagle\'s medium (DMEM) or DMEM containing 1% tryptone, and DMEM pre-conditioned with EPEC/EHEC isolates. The production/secretion of the secreted proteins EspA and EspB was determined by indirect ELISA utilizing anti-EspA or anti-EspB monoclonal (MAb) and polyclonal (PAb) antibodies. Different treatments were tested for their effect on the release of Shiga toxins into the medium of STEC/EHEC bacterial cultures. The bacterial culture supernatant was treated with Triton X-100, and the sediment was treated with B-PER lysis buffer. The toxins release was determined by capture ELISA using anti-Stx1 or anti-Stx2 MAb and PAb. Subsequently, a latex agglutination test was developed and evaluated for the detection of EspB in EPEC/EHEC isolates and of Stx1 and Stx2 in STEC/EHEC isolates. EspB was defined as the biomarker and anti-EspB MAb as the tool for the diagnosis of EPEC/EHEC. The ideal conditions for the production/secretion of EspB were cultivation in DMEM. For the diagnosis of STEC/EHEC, the ideal conditions for the release of Stx were Triton X-100 treatment. ELISA as well as latex agglutination showed the sensitivities and specificities required for diagnostic tests of neglected diseases in developing countries. The latex agglutination test for the detection of these pathogens was precise, rapid and easy to perform, thereby being promising for their utilization in laboratories with limited resources.