Cetoconazol é um agente antifúngico que possui ação tópica e sistêmica, podendo ser incorporado em diferentes formas farmacêuticas. Como exemplo, pode-se citar o xampu de cetoconazol, que é efetivo no tratamento da dermatite seborréica e pitiríase versicolor. É reconhecido que o cetoconazol, nas formas farmacêuticas xampu e solução, rapidamente altera a coloração se tornando avermelhado. A exposição de fármacos à radiação pode influenciar a estabilidade da formulação, levando a modificações nas propriedades físico-químicas do produto. O objetivo deste trabalho foi avaliar a fotoestabilidade do cetoconazol em xampu e solução. As formulações foram expostas à radiação UV-A (352 nm), UV-C (254 nm) e luz diurna. Métodos foram desenvolvidos e validados para a determinação quantitativa do cetoconazol: cromatografia líquida de alta eficiência e ensaio microbiológico utilizando o método de cilindros em placa. Estudos comparativos entre xampu de cetoconazol e xampu de cetoconazol contendo produtos de degradação foram feitos para avaliar a atividade antifúngica e a segurança biológica in vivo (teste de Draize) e in vitro (teste de citotoxicidade). Os resultados demonstraram diminuição na atividade antifúngica, mas não demonstraram alteração na segurança biológica. Os métodos utilizados para análise do cetoconazol (ensaio microbiológico e CLAE) demonstraram ser lineares, precisos e exatos, sendo úteis no controle de qualidade do fármaco. Os resultados indicam alteração do cetoconazol em presença da luz. Dois produtos de degradação foram isolados e identificados: 1-acetil-4-{4-[2-(2-clorofenil)-2-(1H-imidazolil-1- metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina e 1-acetil-4-{4-[2-(4-clorofenil)-2- (1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina. Conseqüentemente, adequada proteção da luz deve ser adotada durante armazenamento das duas formas farmacêuticas contendo o fármaco. / Ketoconazole is an antifungal agent with topic and systemic action and can be incorporated into several dosage forms. As an example, it could be mentioned ketoconazole shampoo, which is effective against seborrhoeic dermatitis and pityriasis versicolor. It is remarkable that ketoconazole is rapidly altered in shampoo and solution dosage forms, since its colour turns into red. Exposure of a drug to radiation can influence the stability of the formulation, leading to changes in the physicochemical properties of the product. The aim of this work was to assess the photostability of ketoconazole in shampoo and solution. The formulations were exposed to UV-A (352 nm) and UV-C (254 nm) radiations and daylight. Methods were developed and validated for the quantitative determination of ketoconazole: high performance liquid chromatography and microbiological assay using the cylinder-plate method. Comparative studies between ketoconazole shampoo and ketoconazole shampoo containing degradation products were conducted to evaluated the antifungal activity and biological reactivity in vivo (Draize test) and in vitro (cytotoxity test). The results showed a decrease in antifungal activity but not an alteration on the biological reactivity. The methods used for ketoconazole analysis (microbiological assay and HPLC) were linear, precise and accurate, providing valuable methods for the quality control of this drug. The results indicate alteration in ketoconazole in presence of light. Two photodegradation products were isolated and identified: 1-acetyl-4-{4-[2-(2-chlorophenyl)-2-(1H-imidazol- 1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-ylmethoxy]phenyl}piperazine and 1-acetyl-4-{4-[2- (4-chlorophenyl)-2-(1H-imidazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-ylmethoxy]phenyl} piperazine. Consequently, adequate light protection should be adopted for storage of these two dosage forms containing the drug.

O objetivo desta tese foi desenvolver um modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) aplicável a avaliação de esquemas posológicos de antifúngicos sistêmicos no tratamento de infecções cerebrais associadas ao Cryptococcus neorformans. Inicialmente um modelo de infecção cerebral em ratos Wistar machos imunocompetentes foi estabelecido. Os animais foram inoculados a partir da administração iv de 1.106 UFC/mL na veia lateral caudal, de uma cepa de Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957). A presença da levedura em cérebro, pulmão, fígado, rins e coração foi avaliada após 7, 10 e 14 dias. Paralelamente foram investigados os parâmetros bioquímicos (contagem de leucócitos, TGO, TGP, uréia, creatinina, albumina e CK) e a permeabilidade vascular cerebral com azul de Evans. Após 10 dias de inoculação foi produzida uma infecção com características semelhantes a doença em humanos. C. neoformans esteve presente em todos os tecidos investigados pelas análises histológicas e microbiológicas e diferenças nos níveis de albumina, ureia, TGP e CK, alteração no número de leucócitos (monócitos e neutrófilos) e elevação da permeabilidade cerebral ao azul de Evans foram observadas nos animais infectados. Após estabelecida e caracterizada a infecção, foi avaliada a farmacocinética plasmática e tecidual cerebral através da técnica de microdiálise, do fluconazol (FLU) (20 mg/kg, i.v. bolus) e do voriconazol (VRC) (5 mg/kg, i.v. bolus) em ratos Wistar sadios (n = 13) e infectados (n = 13). De posse dos dados das concentrações plasmáticas e teciduais vs tempo dos grupos sadios e infectados construiu-se um modelo farmacocinético populacional (PopPK) para cada fármaco investigado. A penetração cerebral do VRC demonstrou-se elevada nos animais infectados (fTsadios = 0,85 vs fTinfectados = 1,86). O modelo PopPK de dois compartimentos e eliminação por Michaelis Menten descreveu o perfil de concentrações versus tempo de VRC em plasma e tecido, simultaneamente. A covariável infecção foi incluída em V2 e VM. Observou-se o grande potencial do VRC para tratar meningite associada a C. neoformans, pois os níveis alcançados em tecidos infectados foram superiores aos valores descritos para CIM de VRC contra C. neoformans (0,03 - 0,5 μg/mL). A farmacocinética do FLC foi descrita através de um modelo PopPK de dois compartimentos com eliminação linear incluindo dados de concentrações plasmáticas e livres cerebrais para ambos os grupos investigados. Nesse modelo a covariável infecção foi atribuída ao parâmetro k21 e covariável peso foi atribuída aos parâmetros V1 e V2. De posse desse modelo popPK, foram investigados os desfechos farmacodinâmicos considerando o nível de exposição cerebral nas doses de 125 e 250 mg/kg para ratos e 400-2000 mg para humanos observado em tecido sadio e infectado através da probabilidade de atingir o alvo terapêutico (PTA - fASC/CIM = 389) do FLC usando simulações de Monte Carlo. Essas simulações demonstraram um uso limitado de fluconazol em monoterapia para o tratamento de meningite por C. neoformans. Após a etapa farmacocinética procederam-se os estudos farmacodinâmicos através da metologia de curvas de morte em função do tempo do fluconazol e voriconazol frente a C. neoformans. Os dados da curva de morte foram modelados adequadamente com o modelo PK-PD de Emax modificado incluindo um termo de atraso de crescimento. A CIM foi determinada para ambos os fármacos por microdiluição e os valores foram de 0,03 μg/mL para voriconazol e 0,5 μg/mL para fluconazol, indicando que esta cepa ATCC 28957 é sensível a ambos os fármacos. Os valores de k, EC50 e kmax foram determinados para vários múltiplos das CIM de cada fármaco (0,03×, 0,06×, 0,25×, 0,5×, 1× 4×, 16×, 32× e 64×). O valor médio de k foi de 0,38 h-1, EC50 foi de 1,26 ± 0,18 μg/mL e 0,32 ± 0,06 μg/mL e kmax foi de 0,95 ± 0,21 h-1 e 0,64 ± 0,12 h-1 para FLC e VRC, respectivamente. Por fim, de posse dos parâmetros calculados através do modelo PK-PD foram realizadas simulações dos desfechos de tratamento para meningite criptocócica no cenário clínico para ambos os fármacos após administração das doses 200 e 400 mg de voriconazol e 800 e 2000 mg de fluconazol por dez semanas. Através das simulações conclui-se que para fluconazol há 25% de insucesso na dose de 800 mg e 10% na dose de 2000 mg com um tempo médio de 3 semanas para erradicação da levedura. Para o voriconazol, o EC50 teve pouco impacto sobre a erradicação do fungo e, em todos os cenários foi observada uma erradicação completa do fungo em curto espaço de tempo (1 - 2 semanas). Os resultados incentivam o uso de voriconazol nos pacientes com meningite criptocócica e uma reavaliação do uso de fluconazol. / The aim of this thesis was to develop a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model for the evaluation of systemic antifungal dosing regimens for the treatment of brain infections associated with Cryptococcus neorformans. Firstly a model of brain infection in immunocompetent male Wistar rats was established. The animals were inoculated by intravenously administration of 1. 106 CFU/mL of Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957) into the tail lateral vein. The presence of yeasts in the brain, lung, the liver, kidneys and the heart was evaluated after 7, 10 and 14 days. The biochemical parameters (leucocytes counting, GOT, GPT, urea, creatinine, albumin and CK) and cerebral vascular permeability with Evans blue were investigated. After 10 days post inoculation an infection with characteristics similar in humans was produced. C. neoformans was present in all tissues investigated by histological and microbiological analyzes and differences in albumin, urea, GPT and CK levels, alterations in the number of leukocytes (monocytes and neutrophils), and elevation of cerebral permeability to Evans blue were observed in infected animals. After establishing and characterizing the infection, the plasma and cerebral tissue pharmacokinetics were evaluated by microdialysis after administration of fluconazole (FLU) (20 mg/kg, iv bolus) and voriconazole (VRC) (5 mg/kg, iv bolus) in healthy (n = 13) and infected Wistar rats (n = 13). A population pharmacokinetic model (PopPK) was build for each drug, based on data from plasma and tissue concentrations vs. time of healthy and infected groups. The brain penetration of voriconazole was shown to be high in infected animals (fThealthy = 0.85 vs fTinfected = 1.86) than in healthy ones. The two-compartment model with Michaelis Menten elimination best described the concentration of VRC in plasma and tissue. The covariate infection was included in V2 and VM. The great potential of voriconazole to treat meningitis associated with C. neoformans was observed, as the levels reached in infected tissues were higher than the values described for MIC against C. neoformans (0.03 - 0.5 μg/mL). The pharmacokinetics of FLC was described using a two-compartment model with linear elimination including data from plasma and brain free concentrations for both groups investigated. In this model the covariate infection was attributed to parameter k21 and covariate weight was assigned to parameters V1 and V2. With this popPK model, the pharmacodynamic outcomes were investigated considering the level of brain exposure at doses of 125 and 250 mg/kg for rats and 400 - 2000 mg for humans observed in healthy and infected tissue through the probability of attaining the target (PTA - fAUC/MIC = 389) of fluconazole using Monte Carlo simulations. These simulations demonstrated limited use of fluconazole in monotherapy for the treatment of C. neoformans meningitis. After the pharmacokinetics modeling, the pharmacodynamic studies were carried out using the methodology of time-kill curves of fluconazole and voriconazole versus C. neoformans. The kill curves data were suitably modeled with the modified Emax PK-PD model including a growth delay term. MIC was determined for both drugs by microdilution and values were 0.03 μg.mL-1 for voriconazole and 0.5 μg.mL-1 for fluconazole, indicating that this ATCC 28957 strain is sensitive to both drugs. The values of k, EC50 and kmax were determined for several MIC multiples of each drug (0.03 ×, 0.06 ×, 0.25 ×, 0,5×, 1 × 4 ×, 16 ×, 32 × and 64 ×). The mean value of k was 0.38 h-1, EC50 was 1.26 ± 0.18 μg.mL-1 and 0.32 ± 0.06 μg.mL-1 and kmax was 0.95 ± 0.21 h -1 and 0.64 ± 0.12 h-1 for FLC and VRC, respectively. Finally, the parameters obtained using the PK-PD model were used to simulate treatment outcomes for cryptococcal meningitis in the clinical setting for both drugs after administration of 200 and 400 mg of voriconazole and 800 and 2000 mg of fluconazole for 10 weeks. By the simulations it is concluded that for fluconazole there is a 25% rate of failure at the dose of 800 mg and 10% at the dose of 2000 mg with an average time of 3 weeks for eradication of the yeast. For voriconazole, the EC50 had little impact on fungus eradication and, in all scenarios complete eradication of the fungus was observed in a short time (1 - 2 weeks). The results encourage the use of voriconazole in patients with cryptococcal meningitis and a reassessment of fluconazole use.

Objetivos: O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito antifúngico voriconazol (VRC) contra espécies de Candida. Método: Para alcançar este objetivo as seguintes etapas foram realizadas: i) foi adaptado e padronizado modelo de candidíase disseminada em ratos Wistar imunocompetentes e imunocomprometidos com Candida sp.; ii) foram validados métodos analíticos de LC-MS/MS e LC-UV para o doseamento do VRC em amostras de plasma e microdialisado de tecido; iii) foram estabelecidas as condições para microdiálise do VRC e as taxas de recuperação in vitro, por perda e ganho, e em tecido renal in vivo, por retrodiálise, foram determinadas; iv) foi avaliada a PK não-linear do VRC após administração i.v. bolus das doses de 2,5, 5 e 10 mg/kg e a biodisponibilidade oral foi determinada em roedores; v) a penetração renal do VRC após administração oral das doses de 40 e 60 mg/kg foi determinada em ratos Wistar sadios e infectados com C. albicans ou C. krusei; e (vi) o perfil fungistático do VRC contra C. albicans e C. krusei foi determinado utilizando modelo de infecção experimental in vitro onde foram simuladas as concentrações livres renais do VRC esperadas em humanos após administração oral e i.v. de diferentes posologias. Os dados de cinética e dinâmica obtidos foram modelados com equação de Emax modificada, com auxílio do Scientist®. Resultados e Conclusões: i) O modelo de candidíase disseminada foi adaptado com sucesso para ratos Wistar. C. albicans apresentou maior virulência com Log UFC/g de tecido renal de 5,51 ± 0,56 e 7,29 ± 0,26, após 2 e 7 dias de infecção em animais imunocompetentes, respectivamente. Em animais imunocomprometidos a contagem foi de 6,43 ± 0,59 Log UFC/g após 2 dias de infecção, com morte de todo o grupo dentro de 4 dias. As espécies não-albicans (C. krusei e C. glabrata) apresentaram um perfil de infecção semelhante em animais imunocompetentes (Log UFC/g = 2,98 ± 0,27 para C. krusei e 2,48 ± 0,46 para C. glabrata). Entretanto, nos animais imunocomprometidos, C. krusei promoveu morte de todo o grupo em até 7 dias, enquanto C. glabrata causou apenas um aumento no grau de infecção (Log UFC/g = 6,98 ± 0,48). ii) Os métodos analíticos por LC-UV e LCMS/ MS para quantificação do VRC foram validados. As curvas de calibração foram lineares na faixa de 50 a 2500 ng/mL (r > 0,98) para ambos os métodos. Os ensaios de precisão intra e inter-dia foram > 94,9 e 95,8 %, para microdialisado por HPLC-UV e > 87,5 e 92,3 % para LC-MS/MS em plasma, respectivamente. A exatidão foi > 89,1 % para HPLC-UV e > 88,4 % para LC-MS/MS. iii) A avaliação do VRC por microdiálise mostrou que a recuperação é concentração independente (0,1–2,0 μg/mL). O VRC entretanto, devido a sua moderada lipofilia, liga-se às tubulações do sistema de microdiálise, gerando diferenças entre a recuperação determinada pelo método de perda (retrodiálise) e de ganho (diálise) in vitro, as quais puderam ser corrigidas após o cálculo do coeficiente de ligação do fármaco ao sistema. A recuperação in vivo após correção da ligação ao sistema foi de 24,5 ± 2,8 % iv) A análise dos perfis de plasmáticos do VRC obtidos em ratos Wistar após administração oral mostrou comportamento não-linear, compatível com saturação de eliminação. A avaliação compartimental dos perfis i.v. de diferentes doses, utilizando modelo de três compartimentos com eliminação de Michaelis-Menten, permitiu a determinação da constante de Michaelis (KM) de 0,58 μg/mL e da velocidade máxima da eliminação (VM) de 2,63 μg/h, em média. A modelagem simultânea dos dados plasmáticos (40 mg/kg) e i.v. (10 mg/kg) permitiu a determinação da biodisponibilidade oral do VRC em ratos, que foi de 82,8%. v) A fração de penetração renal do VRC, determinada por microdiálise em ratos sadios e infectados, foi de 0,34 ± 0,01, similar a fração livre do fármaco no plasma (0,34), indicando que as concentrações livres renais de VRC são semelhantes às concentrações livres plasmáticas e que as mesmas não se modificam devido a infecções causadas por Candida sp. vi) Os parâmetros da modelagem PK/PD do efeito do VRC contra espécies de Candida em modelo de infecção experimental in vitro obtidos foram: CE50 de 2,96 μg/mL e Kmax = 0,26 h-1 para C. albicans e CE50 de 3,47 μg/mL e Kmax = 0,51 h-1 para C. krusei. Houve diferença estatística apenas no Kmax para as duas espécies (α = 0,05) indicando uma maior suscetibilidade da C. krusei ao VRC. O modelo PK/PD de Emax modificado utilizado foi capaz de descrever adequadamente os perfis de inibição do crescimento de Candida sp em função do tempo, para todos os regimes terapêuticos do VRC avaliados, podendo ser usado para otimização da terapia com esse fármaco. / Objectives: The aim of this work was the development of a pharmacokineticpharmacodynamic model (PK/PD) to describe the fungistatic effect of voriconazole (VRC) against Candida species. Method: To reach this objective, the following steps were done: i) a disseminated candidiasis model to immunocompetent and immunocompromised Wistar rats with Candida sp was adapted and standardized; ii) analytical methods of LC-MS/MS and LC-UV for measurement of VRC in plasma and microdialysate tissue samples were validated; iii) microdialysis conditions of VRC and the recoveries rate in vitro, by loss and gain, in renal tissue in vivo, by retrodialysis, were determined; iv) the non-linear PK of VRC after i.v. bolus administration of 2.5, 5 e 10 mg/kg doses were evaluated and the oral bioavailability in rodents was estimated; v) tissue penetration of VRC after oral administration of 40 and 60 mg/kg was determined in healthy and infected by C. albicans or C. krusei Wistar male rats; vi) the fungistatic profile of VRC against C. albicans and C. krusei was determined using a experimental infection model in vitro, where the free renal concentrations of VRC expected in humans after oral and iv administration of different dosing regimens were simulated. The kinetic and dynamic data obtained were modeled using an Emax modified model, with aid of Scientist®. Results and Conclusions: i) The disseminated candidiasis model was successfully adapted to Wistar rats. C. albicans showing high virulence with Log CFU/g of renal tissue of 5.51 ± 0.56 and 7.29 ± 0.26, after 2 and 7 days of infection in immunocompetent animals, respectively. In immunocompromised animals, the counting was 6.43 ± 0.59 Log CFU/g after 2 days of infection, with whole group death within 4 days. Non-albicans especies (C. krusei e C. glabrata) showed a similar infection profile in immunocompetent and immunocompromised animals (Log CFU/g = 2.98 ± 0.27 to C. krusei e 2.48 ± 0.46 to C. glabrata). However, in immunocompromised animals, C. krusei causes death in the whole group up to 7 days, instead, C. glabrata causes only a low increase in the infection degree (Log CFU/g = 6.98 ± 0.48). ii) The analytical methods of HPLC-UV and LC-MS/MS to VRC quantification were validated. Linearity was between 50 - 2500 range ng/mL (r > 0.98) for both methods. The intra and inter-day precision assays were > 94.9 e 95.8 %, for microdialysate using LC-UV and > 87.5 e 92.3 % using LCxx MS/MS for plasma, respectively. The accuracy was > 89.1 % for HPLC-UV and > 88.4 % for LC-MS/MS. iii) The evaluation of VRC by microdialysis showed that recovery is concentration independent (0.1–2 μg/mL). VRC, however, due to its moderate lipophilic characteristic, binds to the microdialysis system tubing’s, generating differences between recoveries determined by loss (retrodialysis) and gain (dialysis) in vitro methods, which could be corrected after determination of drug’s binding coefficient to the system. The in vivo recovery determined after correction of system binding was 24.5 ± 2.8 %. iv) VRC plasma profiles analysis obtained from Wistar rats after oral administration showed a nonlinear behavior, compatible with saturable elimination. The compartmental evaluation of i.v. profiles in different doses, employing the a compartment model with Michaelis-Menten elimination, allowed to determine the Michaelis-Menten constant (KM) of 0.58 μg/mL and the maximum velocity (VM) of 2.63 μg/h, in average. The simultaneous modeling of oral (40 mg/kg) and iv (10 mg/kg) plasma data allowed the determination of the oral bioavailability of VRC in rats, equal to 82.8%. v) The VRC renal penetration fraction, determined by microdialysis in healthy and infected rats, was 0.34 ± 0.01, similar to the free unbound fraction in plasma (0.34), showing that VRC free renal concentration levels are similar to the unbound plasma concentrations and that did not change due the infection associated to Candida sp. vi) The parameters of PK-PD modeling of VRC effect against Candida species in the in vitro experimental infection model obtained were: EC50 de 2.97 μg/mL and Kmax = 0.203 h−1 to C. albicans and EC50 of 3.47 μg/mL and Kmax = 0.51 h−1 to C. krusei. There is a statistical difference only in Kmax value for the two species (α = 0.05), showing a higher susceptibility of C. krusei to VRC. The PK/PD Emax modified model employed was able to describe adequately the growth inhibition profiles of Candida sp in function of time, for all VRC dosing regimens evaluated, and can be used for therapy optimization with this drug.

Nos últimos anos, várias espécies de fungos, até então conhecidos como saprófitas do ambiente, têm emergido como importantes patógenos na prática clínica, associados muitas vezes com a resistência aos antimicrobianos disponíveis comercialmente. Dessa forma, o conhecimento de aspectos relacionados à patogenicidade desses micro-organismos, como a formação de biofilme, assim como o perfil de susceptibilidade aos antifúngicos e a novas alternativas terapêuticas faz-se necessário. Uma importante tecnologia neste contexto é a utilização de sistemas nanoestruturados a partir de polímeros biodegradáveis para a veiculação de fármacos. Este trabalho visa verificar em isolados fúngicos emergentes a expressão fenotípica de biofilme através do teste em microplaca de poliestireno e o perfil de susceptibilidade frente a antifúngicos na forma livre e incorporados em sistemas nanoestruturados, através da técnica de microdiluição em caldo. Foram selecionados para o estudo 82 isolados fúngicos potencialmente patogênicos, sendo 26 oriundos do ambiente e 56 procedentes de espécimes clínicos. Quanto à capacidade de formação de biofilme verificou-se que 68 (82,9%) isolados produziram biofilme pelo teste da microplaca, sendo 38 classificados como fortes, 17 como moderados e 13 como fracos produtores. Além disso, observou-se que os isolados clínicos apresentaram maior capacidade de formação de biofilme do que os isolados ambientais. Não houve correlação entre a produção de biofilme e a susceptibilidade aos antifúngicos testados nas células planctônicas. De um modo geral, os fungos foram sensíveis à maioria dos antifúngicos testados neste trabalho. Entretanto, o fluconazol apresentou baixa atividade (CIM≥64μg/mL) para 45% dos isolados avaliados. Com o intuito de investigar o efeito de cetoconazol e de fluconazol associados a nanoestruturas sobre os diferentes fungos apresentados no estudo, também foram desenvolvidas nanocápsulas de poli-ɛ-caprolactona contendo estes fármacos. Análises físico-químicas das nanoestruturas revelaram tamanho médio de partícula variando de 206 nm para as nanocápsulas de cetoconazol (CN) e de 211 nm para as nanocápsulas de fluconazol (FN). Ambas as formulações apresentaram características homogêneas e demonstraram estruturas monodispersas. A eficiência de encapsulação do cetoconazol e do fluconazol nas formulações foi de 86,35 e de 80,5%, respectivamente. Os diversos gêneros investigados parecem se comportar de maneira diferente quando expostos às nanoestruturas dos dois fármacos em estudo, sugerindo que as espécies de Candida poderiam apresentar uma maior susceptibilidade in vitro frente a estas nanoestruturas quando comparadas à forma livre dos antifúngicos em questão. Os resultados obtidos demonstram a potencialidade destas formulações para a veiculação de cetoconazol e fluconazol. Como perspectivas, sugere-se a realização de estudos adicionais para evidenciar o efeito in vitro das nanopartículas sobre os diferentes fungos de importância clínica e ambiental. / In recent years, several fungal species known as environmental saprophytes have emerged as important pathogens in clinical practice, often associated with antimicrobial resistance commercially available. Thus, the knowledge of aspects related to these pathogenic micro-organisms, such as biofilm formation, as well as the profile of susceptibility to antifungal agents and new therapeutic options is necessary. An important technology in this context is the use of nanostructured materials from biodegradable polymers for the placement of drugs. This work aims to examine the emerging fungal isolates in the phenotypic expression of biofilm through the test on polystyrene microplate and the susceptibility profile to antifungals front in the free trade and in the nanostructured systems by the broth microdilution method. In this study, 82 potentially pathogenic fungal isolates were selected, being the 26 from environment originating and the 56 from the clinical specimens. Regarding the ability of biofilm formation was found that 68 (82,9%) isolates produced biofilm by the microplate assay. The isolates were classified as 38 strong, 17 moderate and 13 weak biofilm producers. Moreover, it was noted that clinical isolates showed greater capability for the biofilm formation than the environmental isolates. There was no correlation between the biofilm production and the susceptibility to antifungal agents tested in planktonic cells. In general, the fungi were susceptible of the majority of the antifungal agents tested in this study. However, the fluconazole showed low activity (MIC≥64μg/mL) for 45% of the isolates. In order to investigate the effect of the ketoconazole and the fluconazole associated with nanostructures against different fungi contained in the study, polymeric nanocapsules have also been developed containing these drugs. Physicochemical analyzes showed an average size of nanostructures ranging from 206 nm for the nanocapsules of ketoconazole (CN), and 211 nm for the fluconazole (FN). The formulations showed homogeneous characteristics and demonstrated monodisperse structures. The encapsulation efficiency of ketoconazole and fluconazole in the formulations was 86,35 and 80,5%, respectively. The diverse genera investigated appear to behave differently when exposed to the nanostructures of the two drugs have being studied, suggesting that Candida species could exhibit a greater sensitivity to these nanostructures compared to the free form of antifungal concerned. The results demonstrate the potential of the formulations for the delivery of fluconazole and ketoconazole. As perspectives, we suggest further studies to demonstrate the in vitro effect of the nanoparticles against different fungi from the clinical and the environmental importance.

Cetoconazol é um agente antifúngico que possui ação tópica e sistêmica, podendo ser incorporado em diferentes formas farmacêuticas. Como exemplo, pode-se citar o xampu de cetoconazol, que é efetivo no tratamento da dermatite seborréica e pitiríase versicolor. É reconhecido que o cetoconazol, nas formas farmacêuticas xampu e solução, rapidamente altera a coloração se tornando avermelhado. A exposição de fármacos à radiação pode influenciar a estabilidade da formulação, levando a modificações nas propriedades físico-químicas do produto. O objetivo deste trabalho foi avaliar a fotoestabilidade do cetoconazol em xampu e solução. As formulações foram expostas à radiação UV-A (352 nm), UV-C (254 nm) e luz diurna. Métodos foram desenvolvidos e validados para a determinação quantitativa do cetoconazol: cromatografia líquida de alta eficiência e ensaio microbiológico utilizando o método de cilindros em placa. Estudos comparativos entre xampu de cetoconazol e xampu de cetoconazol contendo produtos de degradação foram feitos para avaliar a atividade antifúngica e a segurança biológica in vivo (teste de Draize) e in vitro (teste de citotoxicidade). Os resultados demonstraram diminuição na atividade antifúngica, mas não demonstraram alteração na segurança biológica. Os métodos utilizados para análise do cetoconazol (ensaio microbiológico e CLAE) demonstraram ser lineares, precisos e exatos, sendo úteis no controle de qualidade do fármaco. Os resultados indicam alteração do cetoconazol em presença da luz. Dois produtos de degradação foram isolados e identificados: 1-acetil-4-{4-[2-(2-clorofenil)-2-(1H-imidazolil-1- metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina e 1-acetil-4-{4-[2-(4-clorofenil)-2- (1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina. Conseqüentemente, adequada proteção da luz deve ser adotada durante armazenamento das duas formas farmacêuticas contendo o fármaco. / Ketoconazole is an antifungal agent with topic and systemic action and can be incorporated into several dosage forms. As an example, it could be mentioned ketoconazole shampoo, which is effective against seborrhoeic dermatitis and pityriasis versicolor. It is remarkable that ketoconazole is rapidly altered in shampoo and solution dosage forms, since its colour turns into red. Exposure of a drug to radiation can influence the stability of the formulation, leading to changes in the physicochemical properties of the product. The aim of this work was to assess the photostability of ketoconazole in shampoo and solution. The formulations were exposed to UV-A (352 nm) and UV-C (254 nm) radiations and daylight. Methods were developed and validated for the quantitative determination of ketoconazole: high performance liquid chromatography and microbiological assay using the cylinder-plate method. Comparative studies between ketoconazole shampoo and ketoconazole shampoo containing degradation products were conducted to evaluated the antifungal activity and biological reactivity in vivo (Draize test) and in vitro (cytotoxity test). The results showed a decrease in antifungal activity but not an alteration on the biological reactivity. The methods used for ketoconazole analysis (microbiological assay and HPLC) were linear, precise and accurate, providing valuable methods for the quality control of this drug. The results indicate alteration in ketoconazole in presence of light. Two photodegradation products were isolated and identified: 1-acetyl-4-{4-[2-(2-chlorophenyl)-2-(1H-imidazol- 1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-ylmethoxy]phenyl}piperazine and 1-acetyl-4-{4-[2- (4-chlorophenyl)-2-(1H-imidazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-ylmethoxy]phenyl} piperazine. Consequently, adequate light protection should be adopted for storage of these two dosage forms containing the drug.

Orientadores: Maria Luiza Moretti, Rogerio de Jeus Pedro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T04:29:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Delgado_AnaCeciliaNastrini_D.pdf: 4216034 bytes, checksum: 9c8e2de690455b1af06e61e9e3ce2bd6 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: OBJETIVOS: Avaliar a incidência de colonização oral por Candida spp. em pacientes com HIV em uso de terapia anti-retroviral, comparando os resultados dos grupos de pacientes colonizados e não colonizados, assim como estudar os aspectos microbiológicos das cepas isoladas. PACIENTES E MÉTODOS: Foi realizado estudo transversal de pacientes assistidos no HC/Unicamp, de agosto de 2003 a abril de 2004, com coleta única por paciente de swab da cavidade oral. CHROMagar Candida® e ID32C® foram utilizados no cultivo, isolamento e identificação de Candida spp. e Candida Check® na determinação dos sorotipos de C. albicans. C. dubliniensis foi identificada por seqüenciamento no aparelho ABI PRISM 3100® GENETIC ANALYZER. O perfil genômico foi estudado por PFGE, usando o sistema CHEF e a sensibilidade aos azólicos, 5-fluocitosina, anfotericina B e nistatina, baseada na microdiluição em caldo (CLSI). Por meio da revisão dos prontuários foi avaliado: gênero, idade, raça, ano de diagnóstico da infecção pelo HIV, tipo de exposição ao HIV, carga viral, contagem de linfócito TCD4+, infecções oportunistas, classificação clínica da infecção pelo HIV, terapia anti-retroviral e terapia antifúngica. RESULTADOS: Foram identificados 140/324 pacientes colonizados e 184/324 não colonizados: gênero masculino (63% e 60%), exposição sexual (81,5% e 80,5%) e idade média de 38,9 anos. A presença de colonização/infecção foi significativamente maior em pacientes com carga viral detectável (p=0,002) e CD4+<200/mm3 (p=0,006). Foi evidenciada incidência de candidíase oral (31,2%), tuberculose (20,9%), herpes zoster (16,3%), pneumonia por Pneumocystis carinii (PCP) (15,7%) e toxoplasmose (11,7%), no total de pacientes estudados. Não foi observada diferença significativa de colonização por Candida entre os pacientes em uso de TARV com ou sem IP. O uso prévio de nistatina foi maior no grupo colonizado (p=0,014). Foram isoladas 115/154 C. albicans sorotipo A, 15/154 C. albicans sorotipo B e 24/154 Candida não albicans. Doze pacientes apresentaram colonização mista. O estudo genômico de C. albicans sorotipo A identificou 15 perfis diferentes, com predomínio do A1 (56,5%), que mostrou similaridade de 100% entre o perfil de C. albicans sorotipo B predominante B1 (86,6%). O perfil genômico de C. glabrata mostrou-se heterogêneo. C. albicans sorotipo A e B mostraram-se sensíveis a todos os antifúngicos avaliados. C. glabrata e C. krusei apresentaram S-DD para os azólicos. CONCLUSÃO: O trabalho contribuiu de forma significativa para traçar o perfil epidemiológico/clínico dos pacientes HIV em uso de TARV e verificou que o uso de IP não influenciou na presença ou ausência de colonização oral por Candida / Abstract: OBJECTIVES: Evaluating de incidence of oral colonization by Candida spp. in patients in use of antiretroviral therapy, comparing the results of the groups of patients colonized and non-colonized, as well as study the microbiological aspects of the isolated strains. PATIENTS AND METHODS: It was made a cross sectional study assisted at HC/UNICAMP, from August, 2003 to April, 2004, with unique collect of the oral cavity by patient using a swab. CHROMagar Candida® and ID32C® were used in growth, isolation and identification of Candida spp. and Candida Check® for determination of C. albicans sorotypes. C. dubliniensis was identified by sequencing in ABI PRISM 3100® GENETIC ANALYZER device. The genomic profile was studied by PFGE, using the system CHEF and azoles, 5-FC, amphotericin B and nistatine sensibility, based broth microdilution (CLSI). It was evaluated through the review of the prontuaries: genre, age, race, year of HIV infection diagnosis, type of exposition, viral load, TCD4+ linfocyte counting, opportunistic infections, antiretroviral therapy and antifungal therapy. RESULTS: It was identified 140/324 colonized patients and 184/324 non-colonized patients: male gender (63% and 60%), sexual exposition (81,5% and 80,5%) and average age of 39,8 years old. The presence of colonization was significantly greater in patients with detectable viral load (p=0,002) e CD4+<200/mm3 (p=0,006). The incidence of oral candidiasis (31,2%), tuberculosis (20,9%), herpes zoster (16,3%), Pneumocystis carinii pneumonia (PCP) (15,7%) and toxoplasmosis (11,7%) was seen among the total of studied patients. It was not observed a significant difference regarding colonization by Candida among the patients in use of ARVT with or without usage of PI. The early usage of nistatine was bigger in the colonized group (p=0,014). It was isolated 115/154 C. albicans sorotype A, 15/154 C. albicans sorotype B and 24/154 non albicans Candida . Twelve patients presented mixed colonization. The genomic study of C. albicans sorotype A, identified 15 different profiles, with dominance of A1 (56,5%), which shown 100 % similarity between C. albicans sorotype B and predominant B1 (86,6%). The genomic profile of C. glabrata showed heterogeneous. C. albicans serotype A and B showed sensible to all evaluated antifugicals. C. glabrata e C. krusei showed S-DD to azoles. CONCLUSION: This work contributed significantly to trace an epidemiological/clinical profile of the HIV patients in usage of ARV therapy and the lack of influence of IP in the presence or absence of colonization of oral Candida / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-07T18:57:29Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Karen Kelly Carvalho de Oliveira.pdf: 2064619 bytes, checksum: 99e96187d8cd6db44d7bb15b47d1bbe8 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-07T19:07:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Karen Kelly Carvalho de Oliveira.pdf: 2064619 bytes, checksum: 99e96187d8cd6db44d7bb15b47d1bbe8 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-07T19:11:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Karen Kelly Carvalho de Oliveira.pdf: 2064619 bytes, checksum: 99e96187d8cd6db44d7bb15b47d1bbe8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-07T19:11:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Karen Kelly Carvalho de Oliveira.pdf: 2064619 bytes, checksum: 99e96187d8cd6db44d7bb15b47d1bbe8 (MD5) Previous issue date: 2014-05-29 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The increase in microbial resistance to available antibiotics and the continuous decrease observed in the number of the new antimicrobial agents approved by Food and Drug Administration creates a constant search for new compounds. To do so, one of the strategies to be followed consists in exploring understudied natural sources, as often organisms obtained new ecosystems are associated with new chemical diversity. In this context are the basidiomycetes, which have been reported as promising sources of antimicrobial and, despite this potential and great biological diversity, the species found in the Amazon have been insufficiently studied. The objective of this study was to evaluate the antimicrobial activity of eight basidiomycetes isolated from Manaus and Boa Vista. The fungi were grown in two liquid media (malt and GLP) and malt-agar medium, in the latter case were held in two incubation conditions: absence and presence of light. The fungi were maintained at room temperature in all treatments. The tests used the filtered liquid from the growth medium for seven to 63 days, besides extracts with ethyl acetate from growing on solid media (ten days). The pathogens tested were Escherichia coli CBAM 001, Staphylococcus aureus CBAM 324, Candida albicans CFAM 1342, Aspergillus niger CFAM 161 and Penicillium sp. CFAM 059, by agar diffusion method. The filtered with positive activity, were submitted to microdilution test for identification of minimum inhibitory concentration. Molecular identification was performed by amplification and sequencing of the rDNA fragment, with subsequent comparison of the sequences obtained with those deposited in the National Center for Biotechnology Information database. Of filtered tested, seven inhibited the growth of C. albicans CFAM 1342, all of Oudemansiella canarii 1528 cultivation, as medium malt, as in GLP. At medium malt, this basidiomycete produced antifungal compounds at seven and 49 days of cultivation, while in the medium GLP produced from the 21 days of cultivation, until the 49th day. The minimum inhibitory concentration was found for the filtrate obtained after 28 days of GLP cultivation medium (2.5 mg/ml) and the filtrate obtained after 49 days malt medium (5 mg/ml). The extracts obtained with ethyl acetate inhibited C. albicans CFAM 1342, Penicillium sp. CFAM 059, E. coli CBAM 001 and S. aureus CBAM 324. This method was found more satisfactory results, as well as Oudemansiella canarii 1528, six other basidiomycetes (Basidiomycete 347, Pleurotus sp. 474, Gloeophyllum sp. 1153, Trametes sp. 1232, Trametes sp. 1540 e Earliella scabrosa 1552) showed antimicrobial activity. Thus, the results allow to observe the influence of culture conditions for the production of antimicrobial compounds, as well as choice of solvents, further studies are needed to determine the optimum conditions for production and extraction thereof. / O aumento da resistência microbiana aos antibióticos disponíveis e o decréscimo contínuo observado no número de novos antimicrobianos aprovados pela Food and Drug Administration gera uma constante busca por novos compostos. Para tanto, uma das estratégias a ser seguida consiste na exploração de fontes naturais pouco estudadas, pois frequentemente organismos obtidos de novos ecossistemas estão associados à nova diversidade química. Neste contexto destacam-se os basidiomicetos, que vêm sendo relatados como promissoras fontes de antimicrobianos e, apesar deste potencial e da grande diversidade biológica, as espécies ocorrentes na Amazônia têm sido pouco estudadas. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana de oito basidiomicetos isolados de Manaus e Boa Vista. Os fungos foram cultivados em dois meios líquidos (malte e GLP) e em meio ágar-malte, neste último caso foram mantidos em duas condições de incubação: ausência e presença de luz. Em todos os tratamentos os fungos foram mantidos em temperatura ambiente. Os testes utilizaram os filtrados provenientes do crescimento em meio líquido de sete a 63 dias, além de extratos obtidos com acetato de etila a partir do cultivo em meio sólido (dez dias). Os patógenos testados foram Escherichia coli CBAM 001, Staphylococcus aureus CBAM 324, Candida albicans CFAM 1342, Aspergillus niger CFAM 161 e Penicillium sp. CFAM 059, através do método de difusão em ágar. Os filtrados com atividade positiva foram submetidos a teste de microdiluição para identificação da concentração inibitória mínima. Foi realizada a identificação molecular através de amplificação e sequenciamento do fragmento do rDNA, com posterior comparação das sequências obtidas com as depositadas no banco de dados do National Center for Biotechnology Information. Dos filtrados testados, sete inibiram o crescimento de C. albicans CFAM 1342, todos provenientes do cultivo de Oudemansiella canarii 1528, tanto em meio malte, como em meio GLP. Em meio malte, este basidiomiceto produziu compostos antifúngicos aos sete e 49 dias de cultivo, enquanto em meio GLP produziu a partir dos 21 dias de cultivo, até o 49º dia. A concentração inibitória mínima foi identificada para o filtrado obtido aos 28 dias de cultivo em meio GLP (2,5 mg/mL) e o filtrado obtido aos 49 dias em meio malte (5 mg/mL). Os extratos obtidos com acetato de etila além de inibir C. albicans CFAM 1342, inibiram Penicillium sp. CFAM 059, E. coli CBAM 001 e S. aureus CBAM 324. Esta metodologia apresentou resultados mais satisfatórios, pois além de Oudemansiella canarii 1528, outros seis basidiomicetos (Basidiomycete 347, Pleurotus sp. 474, Gloeophyllum sp. 1153, Trametes sp. 1232, Trametes sp. 1540 e Earliella scabrosa 1552) apresentaram atividade antimicrobiana. Deste modo, os resultados obtidos permitiram observar a influência das condições de cultivo para a produção de compostos antimicrobianos, assim como a escolha de solventes, sendo necessários estudos posteriores para determinar a melhor condição para a produção e extração destes compostos.

A paracoccidioidomicose (PCM), doença sistêmica de caráter granulomatoso, causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis. A PCM é endêmica na América Latina e atinge principalmente indivíduos do sexo masculino com atividades econômica ligada a agricultura. Os pacientes com PCM exigem tratamento a base de sulfametoxazol/trimetoprim, anfotericina B, e derivados azólicos por longos períodos. A gp43, possui 416 aminoácidos, onde um trecho específico de 15 aminoácidos (QTLIAIHTLAIRYAN) designado como (P10), é reconhecido pelos linfócitos T de camundongos e humanos. No presente estudo avaliamos o efeito aditivo da imunização do P10 com às drogas antifúngicas utilizadas no tratamento da PCM. Nossos resultados indicam um efeito aditivo entre a imunização com P10 e o tratamento medicamentoso em camundongos Balb/c infectados. Associado a redução significativa da carga fúngica no pulmão, baço e fígado desses animais, detectamos aumento dos níveis de IL-12 e IFN-? e diminuição de IL-4 e IL-10. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides brasiliensis, a thermal dimorphic fungus. PCM is endemic in Latin America affecting mainly rural workers. The patients with PCM demand treatment the base of sulfametoxazole/trimethoprim, amphotericin B and derivatives azolic. The gp43 has 416-mer and mice and human T lymphocytes are stimulated by a 15-mer peptide designated as P10 (QTLIAIHTLAIRYAN). In the present work we evaluated the additive effect of P10 immunization and antifungal drugs utilizing in PCM treatment. Ours results showed an additive protective effect between immunization with P10 and drugs treatment with infected Balb/c mice. Associated to the reduction of fungal burden in the lung, spleen and liver we observed increase of levels of IL-12 and IFN-? and reduction of IL-4 and IL-10.

O aumento da resistência aos antifúngicos convencionais e os possíveis efeitos colaterais destes fármacos têm estimulado pesquisas sobre produtos naturais com potencial antimicrobiano e baixa toxicidade. Assim, o objetivo desta pesquisa foi realizar uma avaliação clínica e laboratorial do tratamento da estomatite protética (EP) através de produtos naturais, por meio de cultura micológica quantitativa, de microscopia confocal e de análise das propriedades superficiais de uma resina acrílica. Em todas as avaliações, os grupos experimentais foram divididos de acordo com as seguintes substâncias: G1 - água destilada estéril; G2 - nistatina; G3 - extrato alcoólico de própolis a 20%; G4 - gel de Punica granatum Linné; G5 - gel de Uncaria tomentosa (Imuno-Max Gel). Para a cultura micológica quantitativa, 30 pacientes diagnosticados com EP utilizaram os seus respectivos medicamentos três vezes por dia, durante 14 dias, associados à escovação das próteses com dentifrício. Nas avaliações, foram coletados materiais das áreas eritematosas da mucosa palatina e das áreas correspondentes na prótese total superior. Este procedimento foi realizado antes do tratamento (T0), após 14 dias do início do tratamento (T1) e 30 dias após a suspensão do uso dos medicamentos (T2). Os dados obtidos foram submetidos ao teste não-paramétrico de Friedman para comparações intragrupos e ao teste de Kruskal-Wallis para comparações intergrupos. Para análise através de microscopia confocal, 30 espécimes de uma resina acrílica termopolimerizável foram inoculados com C. albicans para a formação do biofilme e, em seguida, imersos em sua respectiva droga. Os biofilmes remanescentes sobre os espécimes foram corados através de fluorocromos indicadores de viabilidade celular. Os dados obtidos foram analisados através do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e do pós-teste de comparação múltipla de Dunn. Para análise das propriedades superficiais, 50 espécimes de uma resina acrílica termopolimerizável foram fabricados, polidos e testados para a verificação inicial da rugosidade e da microdureza (T0). A seguir, cada espécime foi imerso na sua correspondente substância por 24 horas. Após 14 dias de imersão (T1), as propriedades superficiais dos espécimes foram novamente mensuradas. A variação intragrupos na rugosidade e na microdureza foi avaliada através do teste t pareado. A avaliação intergrupos, quanto ao efeito dos produtos testados na rugosidade e na microdureza, foi realizada através da análise de variância (ANOVA), seguida de teste de Tukey. Para todos os testes deste estudo foi considerado um nível de significância de 5% (p<0,05). De acordo com os resultados, foi possível concluir que o gel de P. granatum Linné exibiu propriedades superiores em relação aos produtos naturais testados. Esta substância apresentou um efeito mais completo, uma vez que, associada à escovação manual, proporcionou a maior redução da contaminação fúngica da mucosa palatina de pacientes com EP em longo prazo, além de promover, in vitro, a perda total da viabilidade celular e maior remoção das células fúngicas em biofilmes. Por fim, este produto não alterou significantemente, in vitro, a rugosidade e a microdureza da resina acrílica testada. / The increased resistance to conventional antifungal drugs and their possible side effects have stimulated research on natural products with antimicrobial activity and low toxicity. This study comprised a clinical and laboratory evaluation of the treatment of denture stomatitis (DS) using natural products by quantitative mycological culture, confocal microscopy and analysis of surface properties of an acrylic resin. In all evaluations, the experimental groups were divided according to the following substances: G1 - sterile distilled water; G2 - nystatin (Micostatin); G3 - 20% propolis alcoholic extract; G4 - P. granatum Linné gel; G5 - Uncaria tomentosa gel (Imuno-Max Gel). For quantitative mycological culture, 30 patients diagnosed with DS used their respective medicines three times a day for 14 days, associated with denture brushing with dentifrice. For the analysis, material was collected from erythematous areas of the palatal mucosa and from corresponding areas on the maxillary denture. This procedure was performed before treatment (T0), at 14 days after treatment onset (T1) and 30 days after interrupting the use of drugs (T2). Data were analyzed by the non-parametric Friedman test for intragroup comparisons and Kruskal-Wallis test for intergroup comparisons. For analysis by confocal microscopy, 30 specimens of a polymerized acrylic resin were inoculated with C. albicans for biofilm development and then immersed in the respective drugs. The remaining biofilms on the specimens were stained using fluorochrome indicators of cell viability. Data were analyzed by non-parametric Kruskal-Wallis test and Dunn\'s multiple comparison post-hoc test. For the analysis of surface properties, 50 specimens of polymerized acrylic resin were fabricated, polished and tested for initial verification of roughness and microhardness (T0). Then, the specimens were individually immersed in the respective drugs for 24 hours. After 14 days of immersion (T1), the surface properties of the specimens were measured again. The intragroup variation in roughness and microhardness was evaluated by the paired t-test. The intergroup evaluation as to the effect of tested products on roughness and microhardness was performed by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey test. All tests in this study considered a significance level of 5% (p<0.05). According to the results, it was concluded that P. granatum Linné gel exhibited superior properties compared to the natural products tested. This substance showed a more thorough effect, since it provided the greatest long-term reduction of fungal contamination of the palatal mucosa of patients with DS when associated with manual brushing, besides promoting total loss of cell viability and increased removal of fungal cells in biofilms in vitro. Finally, in vitro, this drug did not significantly change the roughness and hardness of the acrylic resin tested.

Desenvolveram-se métodos bioanalíticos para determinação de anfotericina B e fluconazol em apenas 200 L de plasma e líquor (LCR) através da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE UV-VIS). A anfotericina B foi determinada através de CLAE-VIS utilizando p-nitrofenol como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas com acetonitrila, seguida da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por tampão acetato 0,1M pH 5,0 e acetonitrila (50:50,v/v) 0,5mL/min em 385nm; o tempo de corrida foi 15 min. Através da validação o método mostrou-se robusto com 0,2-25,0 &#181;g/mL(linearidade, r2 0,9999), LD 0,1 &#181;g/mL, precisão (5,4% e 6,9%), exatidão expressa através do erro sistemático (3,3% e 2,2%): intra e interdias). Os estudos de estabilidade evidenciaram 1,0% para o erro sistemático e 3% de precisão na bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), e os ciclos de congelamento evidenciaram boa estabilidade uma vez que todos os ensaios foram realizados em Laboratório de luz amarela. O fluconazol foi determinado através de CLAE-UV utilizando carbamazepina como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas pela extração líquido-líquido com diclorometano em meio alcalino, seguido da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por água UP e acetonitrila (70:30,v/v) 0,5mL/min em 210nm; o tempo de corrida foi 15 min. O método mostrou-se robusto com 0,2-250 &#181;g/mL(linearidade, r2 0,9998), LD 0,1&#181;g/mL, com boa recuperação absoluta (98%) e relativa (100%), precisão 0,5%/1,3%, exatidão expressa através do erro sistemático (1,2%). Evidenciou-se ótima estabilidade para os extratos em bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), na longa duração (20&#176; C, 9 meses) e através dos ciclos de congelamento. Investigaram-se 21 pacientes adultos de ambos os sexos portadores de meningite criptocócica com AIDS após internação emergencial em terapia de alta dose com anfotericina B (1mg/Kg) e fluonazol (400 mg, 12/12 horas) durante 12 semanas. O monitoramento das concentrações de anfotericina B e fluconazol no plasma e no LCR forneceram as razões que permitiram estimar a penetração dos antifúngicos no SNC. Obtiveram-se concentrações de anfotericina B, médias (IC95%): 2,30 (0,02-5,08) &#181;g/mL no plasma e 0,30 (0,19-0,36) &#181;g/mL no LCR. As concentrações do fluconazol, médias (IC95%) foram: 31,7 (20,1-43,3) &#181;g/mL no plasma e 19,4 (11,1-27,7) &#181;g/mL no LCR. Com base nos resultados obtidos conclui-se que a penetração da anfotericina B foi insuficiente (10-27%), enquanto que a do fluconazol mostrou-se adequada com valores médios (IC95%) de 67 (47-87) %. / Analytical methods were developed to determine amphotericin B and fluconazole in only 200 L of plasma and in cerebrospinal fluid (CSF) by liquid chromatography (HPLC UVVIS). Amphotericin B was determined by HPLC - VIS using p-nitrophenol as internal standard, after the purification of biological matrices using acetonitrile, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of acetate buffer 0.1M pH 5.0 plus acetonitrile (50:50,v/v) 0.5mL/min at 385nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-25,0&#181;g/mL (linearity, r2 0.9999), DL 0.1&#181;g/mL, precision (5.4%/6.0%), accuracy expressed as systematic error (3.3%/2.2%). The stability was investigated, error systematic was 1% for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h). Thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. All procedures were performed under yellow light at room temperature. Fluconazole was determined by HPLC - UV using carbamazepine as internal standard, after the purification of biological matrices using liquid-liquid extraction in alkaline medium, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of purified water plus acetonitrile (70:30,v/v) 0.5mL/min at 210nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-250 &#181;g/mL(linearity, r2 0.9998), DL 0.1&#181;g/mL. Absolute recovery was 98% and relative recovery was 100%, intra/interday precision were 0,5/-1,3%; accuracy expressed as systematic error were 1.2%/1.2%.and relative recovery was 100%. Good stability for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h) and long term stability (at 20o C for 9 months) were demonstrated. Also thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. Twenty one adult patients of both sex were investigated. Inpatients with meningitis by Cryptococcus neoformans with AIDS were under high dose therapy with amphotericin B 1mg/Kg plus fluonazole 400 mg, every 12h during 12 weeks. Therapeutic monitoring of amphotericin B and fluconazole in plasma and in CSF showed ratios that indicate the penetration of antifungal drugs into CNS. Mean (CI95%) data were for amphotericin B 2.30 (0.02-5.08 ) &#181;g/mL in plasma and 0.30 (0.19-0.36) &#181;g/mL in CSF. Fluconazole showed 31.7 (20.1-43.3) &#181;g/mL in plasma and 19.4 (11.1-27.7) &#181;g/mL in CSF. Based on data obtained we conclude that the penetration of amphotericin B was poor (10-27%) while fluconazole was adequate 67% (47-87%), mean (CI95%).