O presente estudo foi realizado com 258 mulheres, com e sem sintomas de candidíase vulvovaginal, atendidas no Centro de Saúde Geraldo Paula Souza, da Faculdade de Saúde Pública da USP. Leveduras foram isoladas em 162 mulheres, sendo que 34% foram de mulheres assintomáticas, 34% com sintomas de candidíase vulvovaginal primária (CVV) e 32% com candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR). As espécies mais isoladas foram C . albicans, C. parapsilosis, C. glabrata e C. tropicalis. Espécies como C. metapsilosis e C. haemulonii também foram encontradas. A produção de proteinase foi vista em 88% das amostras e de fosfolipase foi de 39%. A sensibilidade in vitro aos antifúngicos foi realizada pelo Etest e, nos isolados resistentes a anfotericina B, fluconazol e itraconazol foram realizados ensaios de microdiluição (CLSIM27S3) e EUCAST EDef7.1, que confirmaram a diminuição da sensibilidade ao itraconazol em isolados de C. parapsilosis (1); C. guilliermondii (1), C. glabrata (3) e Trichosporon spp (1). A diminuição da sensibilidade ao fluconazol foi observada em isolados de C. parapsilosis (1), C. glabrata (3), C. krusei e Rhodotorula spp (1). As leveduras do grupo das CVVRs foram as que apresentaram menor sensibilidade. Em 61 isolados de várias espécies foi realizada a cariotipagem em campo pulsado (PFGE) e não foram observadas similaridade entre elas. Os dados obtidos reforçam a importância da realização de exames laboratoriais que permitam identificar as espécies presentes no conteúdo vaginal, de modo a nortear a escolha terapêutica. / This study was conducted with 258 women, with and without symptoms of vulvovaginal candidiasis, seen at the Health Center \"Geraldo Paula Souza\", School of Public Health of USP. Yeasts were isolated in 162 women, 34% of women were asymptomatic, 34% with primary symptoms of vulvovaginal candidiasis (VVC) and 32% with recurrent vulvovaginal candidiasis (CVVR). The species were more isolated C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata and C. tropicalis. Species such as C. metapsilosis and C. haemulonii were also found. The production of proteinase was seen in 88% of the samples and phospholipase was 39%. Sensitivity \"in vitro\" Antifungal was by the \"Etest\" and in isolates resistant to amphotericin B, fluconazole and itraconazole microdilution tests were performed (CLSIM27S3) and EUCAST EDef7.1, which confirmed the decreased sensitivity to itraconazole in isolates C. parapsilosis (1), C. guilliermondii (1), C. glabrata (3) and Trichosporon spp (1). The decreased sensitivity to fluconazole was observed in isolates of C. parapsilosis (1), C. glabrata (3), C. krusei and Rhodotorula spp (1). Yeasts of the group CVVRs were those who had lowest sensitivity. In 61 isolated from various species karyotyping was performed pulsed field (PFGE) and there were no similarity between them. The data emphasize the importance of laboratory tests to identify the species present in the vaginal content in order to guide the therapeutic choice.

Os efeitos da administração de anfotericina B a camundongos suscetíveis ao P. brasiliensis foram avaliados. A L-AmB reverte o padrão de suscetibilidade para o de resistência de forma mais eficiente do que a c-AmB, como observado na quantificação de UFC, NO e IgG2b. Porém, os níveis de TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, IgG total, IgM, IgG1, IgG2a e IgA não são significativamente alterados. Neutrófilos e macrófagos peritoneais co-cultivados com Pb e L-AmB tendem a apresentar maior capacidade fungicida, mas não maior síntese de mediadores. O melhor desempenho de L-AmB poderia se dever a sua interação com TLR4. Em TLR4-deficientes ou não, a progressão da doença é similar. A eficácia da terapia, porém, é menor nos deficientes, como observado na quantificação de UFC; os perfis leucocitários e as concentrações de NO, TNF-a, IL-12 e GM-CSF não são significativamente alterados. Logo, a droga é capaz de reverter os parâmetros micológicos, mas não os imunológicos. A interação entre TLR4, P. brasiliensis e L-AmB não parece ser importante para o estabelecimento da imunidade. / Amphotericin B effects in mice susceptible to P. brasiliensis were evaluated. L-AmB reverts the susceptibility pattern to the resistant one with more efficiency than c-AmB, as confirmed by the CFU, NO e IgG2b quantifications. However, TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, total IgG, IgM, IgG1, IgG2a and IgA levels are not significantly altered. Neutrophils and macrophages cocultivated with Pb e L-AmB tend to present higher fungicidal ability, but not enhanced synthesis of mediators. The better performance of L-AmB could be due to its interaction with TLR4. In TLR4-deficient or sufficient mice, progression of the disease is similar. The efficiency of the therapy, however, is lower in deficient animals, as seen on CFU; leukocyte profiles and NO, TNF-a, IL-12 and GM-CSF levels are not significantly altered by L-AmB-TLR4 interaction. Therefore, the drug administration is capable of reverting mycological parameters, but not the immunological ones. Interaction between TLR4, P. brasiliensis and L-AmB does not seem to play a special role in the establishment of immunity.

A especiação de isolados clínicos de Aspergillus ganhou relevância nos últimos anos devido à descrição de espécies crípticas resistentes aos derivados azólicos. A identificação morfológica convencional não é capaz de discriminar as espécies de Aspergillus e o sequenciamento de DNA é uma técnica pouco adaptada a laboratórios clínicos. A espectrometria de massas por ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz tempo-devoo (EM MALDI-TOF) é uma metodologia emergente que vem sendo explorada com intuito de fornecer identificação rápida e acurada de microrganismos, incluindo os fungos filamentosos de importância clínica. Entretanto, há poucos estudos avaliando a plataforma VITEK MS® para a identificação de espécies de Aspergillus. O presente estudo teve como objetivo fornecer dados adicionais sobre a performance dos sistemas do VITEK MS® e suas bibliotecas de espectros de referências (ER) In Vitro Diagnostics (IVD) e Research Use Only (RUO) para identificar as espécies de Aspergillus de relevância clínica. Uma biblioteca de ER in-house também foi construída e avaliada. Um total de 106 organismos foram avaliados por EM, incluindo 47 cepas provenientes das coleções de fungos do Westerdijk Fungal Biodiversity Institute (Holanda) e do LEMIUNIFESP, seis isolados ambientais (IMT-USP) e 53 isolados cínicos do HC-FMUSP. Foram utilizados dois protocolos de extração proteica, um recomendado pelo fabricante e outro empregando meio de cultura líquido para os isolados/cepas com baixa esporulação. Trinta e cinco organismos foram selecionadas para construir os ERs, e os 71 restantes foram usados para avaliação de desempenho das bibliotecas IVD, RUO e RUO+in-house. Entre os 71 organismos analisados, 91,5%, 84,5% e 100% tiveram identificação correta de gênero pelos bibliotecas IVD, RUO e RUO+in-house, respectivamente. Enquanto para identificação de espécie, as bibliotecas IVD, RUO e RUO+in-house mostraram 83,1%, 77,4% e 90,1% de identificações de espécie, respectivamente. Para as 16 espécies crípticas de Aspergillus analisadas, a identificação foi correta em 31,2%, 18,7% e 62,5%, pelos sistemas IVD, RUO e RUO+in-house, respectivamente. Entre as espécies crípticas resistentes aos derivados azólicos, o sistema IVD forneceu identificação correta para as espécies Aspergillus lentulus, Aspergillus calidoustus e Aspergillus sydowii. Entretanto, Aspergillus fumigatiaffinis e Neosartorya pseudofischeri foram erroneamente identificadas como Aspergillus fumigatus pelo sistema IVD. A biblioteca in-house demonstrou melhor performance, mas espécies filogeneticamente próximas como A. fumigatiaffinis e A. lentulus tiveram identificações cruzadas. Concluímos que o VITEK® MS demonstrou boa performance para a identificação das espécies de Aspergillus, porém para algumas espécies crípticas, há necessidade de melhoria das bibliotecas de espectro de referência comercializadas. Algumas espécies crípticas filogeneticamente relacionadas apresentaram espectros similares e são de difícil diferenciação por EM MALDI, mesmo com a construção de uma biblioteca de ER in-house com vários representantes de cada espécie / Aspergillus spp. identification has become more relevant in clinical practice since azoleresistant cryptic species have emerged in the last years. Conventional morphologic identification is not able to discriminate Aspergillus species and DNA sequencing is not feasible for clinical laboratories. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) is an emergent technology that has been explored to provide fast and accurate identification of microorganisms, including clinically relevant molds. However, only a few studies have explored the platform VITEK MS® for the identification of Aspergillus species. The present study aimed to provide additional data regarding the performance of the In Vitro Diagnostics (IVD) and Research Use Only (RUO) systems for the identification of Aspergillus species, including azoleresistant ones, and also to construct and to evaluate an in-house reference spectrum library. A total of 106 organisms were evaluated by MS, including 47 Aspergillus strains (Westerdijk Fungal Biodiversity Institute and LEMI-UNIFESP collections), six environmental (IMT-USP) and 53 clinical isolates (HC-FMUSP). Two protein extraction protocols were used, one recommended by the manufacturer and another with liquid broth for the organisms with poor sporulation. Thirty-five organisms were selected to construct the in-house reference spectrum library and the remaining 71 were used for the performance evaluation. Correct genus identification was provided in 91.5%, 84.5% and 100% by the IVD, RUO, and RUO+in-house reference spectrum libraries, respectively. Correct species identification was provided in 83.1%, 77.4% and 90.1% by the IVD, RUO, and RUO+in-house reference spectrum libraries, respectively. Among the 16 Aspergillus cryptic species, correct identification was provided in 31.5%, 18.7% and 62.5% by the IVD, RUO, and RUO+in-house reference spectrum libraries, respectively. Among the azole-resistant cryptic species, the IVD system provided correct identification for Aspergillus lentulus, Aspergillus calidoustus and Aspergillus sydowii. However, Aspergillus fumigatiaffinis and Neosartorya pseudofischeri were misidentified as Aspergillus fumigatus by the IVD system. The in-house library had better performance for the identification of Aspergillus cryptic species, but closely related taxa may be difficult to have correct differentiation by MALDI-TOF MS. In conclusion, VITEK® MS showed good performance for the identification of Aspergillus species and some azoleresistant species. However, a more robust reference spectrum library including more representatives of azole-resistant cryptic species may be necessary to achieve better identification performance of closely related taxa

A prospecção e síntese de novos derivados de 8-hidroxiquinolina está em ascensão devido às suas diversas atividades biológicas. Neste trabalho é relatada a síntese e avaliação da atividade antimicrobiana de novos derivados contendo uma sulfonamida substituída na posição 5 da 8-hidroxiquinolina ou um grupamento aminossubstituído na posição 7 da 5-cloro-8-hidroxiquinolina ou 5-cloro-8-metoxiquinolina. Os derivados 5-sulfonamidas foram preparados por clorossulfonação seguida da reação com a amina apropriada. Os derivados 7-aminossubstituído foram sintetizados através da metilação da hidroxila da posição 8, seguida da reação de cross-coupling catalisada por paládio e desmetilação. A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada através do método de microdiluição em caldo. Dentre os compostos sintetizados, 5a (da série 5-sulfonamidas) foi o mais potente, sendo ativo contra todas as espécies fúngicas testadas, além de apresentar importante atividade contra cepas de Staphylococcus aureus, e baixa toxicidade contra células VERO. Isso sugere que a introdução de um grupamento retirador de elétrons em para no substituinte arila da posição 5 é importante para a atividade antimicrobiana. Ainda, a nanoemulsão preparada contendo 5a manteve a atividade antifúngica da substância contra espécies de Candida spp. A série 7-aminossubstituído também apresentou resultados muito interessantes. Desta série, o composto 5i foi o mais potente. Isso sugere que grupamentos heterocíclicos hidrofílicos na posição 7 podem favorecer a atividade antifúngica. A presença da hidroxila livre na posição 8 parece ser essencial para a atividade antifúngica, pois os derivados protegidos por uma metila foram pouco ativos. Os derivados de 8-hidroxiquinolina 5a e 5i podem ser considerados para estudos posteriores na busca de novos agentes antimicrobianos. / The synthesis and screening of new 8-hydroxyquinoline derivatives is growing, due to their various biological activities. In this work, the synthesis and antimicrobial evaluation of new derivatives containing a substituted 5-sulfonamide in the 8-hydroxyquinoline or a substituted amino group at the 7-position of the 5-chloro-8-hydroxyquinoline or 5-chloro-8-methoxyquinoline is reported. The 5-sulfonamide derivatives were prepared by chlorosulfonation followed by the reaction with the appropriate amine. The 7-amino derivatives were synthesized by methylation of the 8-hydroxyquinoline, followed by palladium-catalyzed cross-coupling reaction and demethylation. The antimicrobial evaluation was tested by the broth microdilution method. Among all the prepared compounds, 5a (from the 5-sulfonamide series) was the most potent, being active against all the fungal species tested, while also showing important activity against Staphylococcus aureus strains, and low toxicity against VERO cells. This suggests that the introduction of an electron-withdrawing group at para-position of the N-aryl substituent is important for the activity. In addition, the prepared 5a nanoemulsion maintained the antifungal activity of the compound against Candida spp. The 7-amino series has also presented interesting results. In this series, 5i was the most potent compound. This suggests that the hydrophilic heterocyclic substituent at the 7-position was favorable to antifungal activity. The presence of the free hydroxyl at the 8-position is important for the antifungal activity, since the methyl-protected derivatives were poorly active. The 8-hydroxyquinoline derivatives 5a and 5i may be considered for further studies in the search for novel antimicrobial agents.

O extrato bruto da planta inteira (Peperomia trineura) foi submetido à cromatografia de adsorção em sílica gel, cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) e CLAE semipreparativa, resultando no isolamento de cinco policetídeos inéditos em função do comprimento ou presença da insaturação na cadeia alquílica. A elucidação estrutural destes policetídeos foi realizada com base nas analises espectroscópicas de RMN 1D e 2D, infravermelho e espectrometria de massas de baixa e alta resolução. As frações provenientes do extrato bruto foram testadas frente a duas linhagens de células leucêmicas (K-562 e Nalm 6), apresentando atividades consideráveis. Já os policetídeos tiveram seu potencial antifúngico avaliado frente a duas espécies de fungos fitopatogênicas - Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum - e apresentaram atividade fraca e média variando de acordo com suas estruturas. / The crude extract of whole plant (Peperomia trineura) was subjected to adsorption chromatography on silica gel, preparative thin-layer chromatography (CCDP) and semi-preparative HPLC, resulting in the isolation of five novel polyketides with variable chain lenght or presence of unsaturation in the alkyl chain. The structural elucidation of these compounds was based on spectroscopic techniques for 1D and 2D NMR, infrared and low and high resolution mass spectrometry. The fractions from the crude extract were tested against the two leukemic cell lines (K-562 and Nalm 6), showing considerable activities. The polyketides were evaluated against the phytopathogenic fungi - Cladosporium cladosporioides and C. sphaerospermum - and displayed low and medium activity.

O estudo de dissolução in vitro é uma ferramenta importante utilizada para o controle de qualidade lote-a-Iote dos medicamentos, como guia no desenvolvimento de novas formulações e para assegurar a qualidade e performance do produto após certas alterações. O itraconazol é um fármaco com baixa solubilidade em meio aquoso (classe 11), dessa forma, alguns problemas de solubilidade podem ser detectados no ensaio de dissolução. A proposta deste trabalho foi a realização de uma avaliação biofarmacêutica in vitro de cápsulas contendo péletes de itraconazol comercializadas no mercado brasileiro por laboratórios farmacêuticos e farmácias magistrais. O medicamento de referência, registrado com o nome de Sporanox® (Janssen-Cilag), uma formulação genérica, duas formulações similares e quatro formulações magistrais, foram submetidas a ensaios de doseamento, perfil de dissolução, eficiência de dissolução, cinética de dissolução, fator de diferença (f1) e fator de semelhança (f2). Os resultados demonstraram diferenças de liberação entre as formulações sugerindo que as mesmas não são equivalentes ao medicamento de referência. / Dissolution testing is an important tool used as a quality control procedure in pharmaceutical production, as guide in the development of new formulations and to assure the quality and performance of the product after certain modifications. Itraconazol is a poorly water-solubility drug (class 11) and the dissolution studies are very important to detect solubility problems. The purpose of this work was the in vitro biopharmaceutical evaluation of capsules containing Itraconazole pellets manufactured by Brazilian pharmaceutical laboratories and compounding pharmacies. The reference product, registered as Sporanox® (Janssen-Cilag), a generic product, a similar formulation and four compounding formulations were submitted to assay, dissolution profile, dissolution efficiency, dissolution kinetics, difference factor (f1) and similarity factor (f2). The results demonstrated different releases among the formulations suggesting that they are not equivalent to the reference product.

Submitted by JACIARA CRISTINA ALMEIDA DO AMARAL (jaciaramaral@ufpa.br) on 2018-09-24T18:34:39Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1_Dissertação_Final_AlineBarral.pdf: 935702 bytes, checksum: 0e13603e9f7137c77025d2055231cd3e (MD5) / Approved for entry into archive by JACIARA CRISTINA ALMEIDA DO AMARAL (jaciaramaral@ufpa.br) on 2018-09-24T18:35:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1_Dissertação_Final_AlineBarral.pdf: 935702 bytes, checksum: 0e13603e9f7137c77025d2055231cd3e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-24T18:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1_Dissertação_Final_AlineBarral.pdf: 935702 bytes, checksum: 0e13603e9f7137c77025d2055231cd3e (MD5) Previous issue date: 2018-08-14 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Chromoblastomycosis (CBM) is a fungal disease characterized by chronic cutaneous and subcutaneous lesions, due to the previous transcutaneous implantation of different black fungi, belonging to the family Herpotrichiellaceae, the main agent belonging to the genus Fonsecaea. The Amazon region is the main endemic area of Brazil and our state is the main endemic area in the country and second in the world. There is no standardization of treatment, drug therapy is used, with different regimens, mainly itraconazole. New azolics such as posaconazole and voriconazole began to be used, but with limitations due to the high cost, the use of physical methods such as cryosurgery, thermotherapy, laser therapy and both. The low cure rates and high rates of relapse of the disease may be related to the different treatment methods employed and the lack of a standardized regimen itself. The objective of this work was to evaluate the in vitro sensitivity of conidia and in vitro induced muriform cells of Fonsecaea spp. in the presence of different antifungal agents, to date there are no studies evaluating the action of drugs using the pathogenic form of the fungus, reinforcing the importance of this study, following the method established in the standard M38-A2, Clinical and Laboratory Standards Institute. The minimum inhibitory concentration for each drug was obtained after 5 days of interaction, posaconazole showed better in vitro inhibitory activity for conidia (CIMMG = 0.632μg / ml) and muriform cells (CIMMG = 1μg / ml). In the analysis of the fungicidal concentration, in both conidia and muriform cells, posaconazole presented lower value (CFMMG = 6.72μg / ml, in both). The fungus samples presented distinct times to differentiate their conidia in muriform cells, therefore we believe that although they belong to the same genus the fungi present physiological peculiarities still unknown. In the in vitro susceptibility tests PCZ had the lowest inhibitory and fungicidal concentrations in both conidia and muriform cells, thus investing in susceptibility testing was important to identify sensitive or resistant strains. / A cromoblastomicose (CBM) é uma doença fúngica caracterizada por lesões crônicas cutâneas e subcutâneas, decorrentes da implantação transcutânea prévia de diferentes fungos negros, pertencentes a família Herpotrichiellaceae, o principal agente pertencente ao gênero Fonsecaea. A região amazônica é a principal área endêmica do Brasil, o estado do Pará a principal área endêmica no país e segunda no mundo. Não há uma padronização de tratamento, é usado a terapia medicamentosa, com diferentes esquemas, principalmente itraconazol. Novos azólicos como posaconazol e voriconazol começaram a ser utilizados, mas com limitações devido ao alto custo, o uso de métodos físicos como a criocirurgia, termoterapia, terapia a laser e a combinação de ambos. As baixas taxas de cura e altas taxas de recidivas da doença pode estar relacionado aos diferentes métodos de tratamento empregados e a própria falta de um esquema padronizado. O objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade in vitro de conídios e células muriformes, induzidas in vitro, de Fonsecaea spp. frente a diferentes antifúngicos, até o momento não há estudos que avaliem a ação de fármacos usando a forma patogênica do fungo, reforçando a importância deste estudo, seguindo o método estabelecido na norma M38-A2, do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A concentração inibitória mínima para cada fármaco utilizado foi obtida após 5 dias de interação, o posaconazol apresentou melhor atividade inibitória in vitro para conídios (CIMMG=0.632μg/ml) e células muriformes (CIMMG=1μg/ml). Na análise da concentração fungicida, tanto em conídios quanto em células muriformes, o posaconazol apresentou menor valor (CFMMG=6.72μg/ml, em ambos). As amostras fúngicas apresentaram tempos distintos para diferenciar seus conídios em células muriformes, portanto acreditamos que apesar de pertencerem ao mesmo gênero os fungos apresentam particularidades fisiológicas ainda desconhecidas. Nos testes de suscetibilidade in vitro, o PCZ teve as menores concentrações inibitórias e fungicidas tanto em conídios quanto em células muriformes,com isso investir em testes de suscetibilidade foi impor importante para identificar cepas sensíveis ou resistente.

Para que um produto de aplicação tópica apresente o efeito terapêutico é necessário que o fármaco seja liberado de seu veículo e atravesse a barreira do estrato córneo, atingindo seus sítios de ação nas camadas da pele nas quais o efeito é esperado. Os estudos de penetração cutânea in vitro, utilizando células de difusão de Franz modificadas, podem fornecer resultados úteis quanto à eficácia do produto. As dermatofitoses são micoses superficiais. São manifestações crônicas e resistentes ao tratamento, fato que se explica não só em decorrência da própria natureza destas afecções como também devido à baixa penetração de fármacos antimicóticos na pele. Dentre os antifúngicos disponíveis na terapêutica, ciclopirox olamina é uma substância que tem demonstrado elevada eficácia no tratamento de dermatofitoses. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver formulações de uso tópico contendo 0,5% de ciclopirox olamina e avaliar a performance dessas formulações. Foi possível obter formulações estáveis fisicamente, contendo promotores de penetração cutânea. O sistema de amostragem automática utilizado para realização dos experimentos foi qualificado e apresentou-se em condições adequadas. / In order to present the pharmacological effect, a topical product must release the pharmaceutical active ingredient from its vehicle and this active must pass through the stratum corneum barrier, reaching the target layer of the skin, where its effect is desired. In vitro skin penetration studies, using modified diffusion Franz cells, can provide useful results regarding the product efficacy. Dermatophytosis is superficial mycosis resistant to treatment due to the disease nature and also to the low penetration profile of the antifungals into the skin. Among the antifungals available in the therapeutic arsenal, ciclopirox olamine has demonstrated a high efficacy in the treatment of dermatophytosis. The objectives of the present work were to develop topical formulations containing 0,5% of ciclopirox olamine and evaluate their performance. It was possible to obtain physically stable formulae, containing skin penetration enhancers. The automatic sampling system used in the experiments was qualified, showing adequate performance.

Submitted by Carvalho Dias João Paulo (joao.dias@famerp.br) on 2018-04-04T13:34:51Z No. of bitstreams: 1 lucianigaspardetoledo_dissert.pdf: 1518015 bytes, checksum: e7bd4f850932330d46b398509046745b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-04T13:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lucianigaspardetoledo_dissert.pdf: 1518015 bytes, checksum: e7bd4f850932330d46b398509046745b (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / Introduction: Candida spp are opportunistic pathogens isolated from human biota in the gastrointestinal tract, oral and vaginal mucosa, which can lead to the development of superficial lesions to disseminated infections, especially in immunosuppression. The high toxicity, the high cost of treatment and the emergence of resistant strains justify the search for new therapeutic agents. The plant biodiversity is rich in active ingredients that have contributed to the development of new and effective drugs, less expensive treatments and population access. Cymbopogon nardus (L.) Rendle is a plant popularly known as citronella and cultivated in subtropical and tropical areas of Asia, Africa and America, including Brazil. Essential oils present in the Cymbopogon genus plants have been widely studied, but there are few studies involving chemical analysis and microbiological ethanol extract of C. nardus. Objective: The objective of this study was to evaluate the antifungal potential, in vitro, of ethanol extract (EE) and essential oil (EO) from the leaves of Cymbopogon nardus (L.) Rendle (citronella) clinical isolates against of Candida spp. Material and Methods: In this study the species Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis sensu stricto and C. orthopsilosis were selected. EE was obtained by extraction ultrasonic bath and analyzed by ultra-performance liquid chromatography (UPLC-ESI-QTOF-MS). The EO was extracted by hydrodistillation and analyzed by gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS). The antifungal activity of EE and EO was performed by determination of the minimum inhibitory concentration (MIC), time-kill assay inhibition of hyphal growth of C. albicans and inhibit mature biofilm. Additionally, the cytotoxic evaluation (determination of IC50) was assessed in HepG-2 cell lines (hepatic) and MRC-5 (fibroblast). Results: The results of the chemical analysis of EE showed presence of glycosylated flavones and glycosylated phenylpropanoids. According to the EO chemical analysis, the main compounds observed were monoterpenes containing-oxygen: citronellal, geranial, geraniol, citronellol and neral. Biological assays showed effective antifungal activity of EE (MIC 1000 to 125 μg / ml) and of EO (MIC 1000 the 250 μg/ml). In the time-kill assay was observed inhibition of growth of the species tested for EE and EO. The hyphal growth of C. albicans was inhibited by EE (1000 to 31 μg/ml) and the EO (1000 to 15.8 μg/ml) for 12 and 24 hours. The EE and EO inhibit mature biofilm species C. albicans, C. krusei, and C. parapsilosis at concentrations of 50xCIM and 10xCIM, respectively. EE exhibited the lower IC50 values for HepG-2 (322 μg/ml) and MRC-5 (181.1 μg/ml) than essential oil that showed IC50 values for HepG-2 (96.6 μg/ml) and MRC-5 (33.1 μg/ml). Conclusions: The EE and EO from C. nardus present as a promising source of new molecules with antifungal activity especially to the inhibition of the main virulence factors such as formation of hyphae and biofilm. / Introdução: Leveduras do gênero Candida são patógenos oportunistas isolados da biota humana no trato gastrointestinal, mucosa oral e vaginal, que podem levar ao desenvolvimento de lesões superficiais até infecções disseminadas, especialmente em situações de imunossupressão. O alto custo para tratamento de infecções, a elevada toxicidade, e o surgimento de cepas resistentes justificam a busca de novos agentes terapêuticos. A biodiversidade vegetal é rica em princípios ativos que têm contribuído com o desenvolvimento de novos e efetivos medicamentos, mais econômicos e de fácil acesso populacional. Cymbopogon nardus (L.) Rendle, é uma planta popularmente conhecida como citronela e cultivada em áreas subtropicais e tropicais da Ásia, África e América, incluindo o Brasil. Os óleos essenciais presentes em plantas do gênero Cymbopogon têm sido amplamente estudados, porém, a analise química e microbiológica do extrato etanólico de C. Nardus,é pouco explorada Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial antifúngico, in vitro, do extrato etanólico (EE) e do óleo essencial (OE) das folhas de Cymbopogon nardus (L.) Rendle (citronela) frente isolados clínicos de Candida spp. Material e Métodos: Foram consideradas as espécies: Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis sensu stricto e C. orthopsilosis. O EE foi obtido por extração em banho ultrassônico e analisado por cromatografia liquida de ultra performance (UPLC-ESI-QTOF-MS). O OE foi extraído por hidrodestilação e analisado por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa (CG-EM). A atividade antifúngica do EE e do OE foi realizada através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM), ensaio time-kill, inibição do crescimento hifal de C. albicans e inibição de biofilme maduro. Adicionalmente, a avaliação citotóxica (determinação de IC50) foi estabelecida em linhagens celulares HepG-2 (hepática) e MRC-5 (fibroblasto). Resultados: Os resultados da análise química do EE evidenciaram presença de flavonas e fenilpropanoides glicosilados. De acordo com a análise química do OE, os principais compostos observados foram monoterpenos contendo oxigênio: citronelal, geranial, geraniol, citronelol e neral. Os ensaios biológicos mostraram importante atividade antifúngica para o EE (CIM de 1000 a 125 μg/mL) e, para o OE (CIM de 1000 a 250 μg/mL). A inibição do crescimento ocorreu para todas as espécies avaliadas frente aos produtos, EE e OE. O EE (1000 até 31 μg/mL) e OE (1000 até 15,8 μg/mL) inibiram o desenvolvimento da hifa de C. albicans, durante 12 e 24 horas, além de inibir o biofilme maduro das espécies de C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis, nas concentrações de 50xCIM e 10xCIM, respectivamente. O EE apresentou os menores valores de IC50 para HepG-2 (322 μg/mL) e MRC-5 (181,1 μg/mL) em comparação com o óleo essencial - IC50 para HepG-2 (96,6 μg/mL) e MRC-5 (33,1 μg/mL). Conclusões: O EE e OE de C. nardus apresentam-se como uma fonte promissora de novas moléculas com atividade antifúngica com destaque à inibição dos principais fatores de virulência: formação de hifa e biofilme.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Patricia Fernanda Zambuzzi Carvalho.pdf: 3971188 bytes, checksum: 969d3e1c4e16d34d3b2fea9e30b2cebc (MD5) Previous issue date: 2010-09-10 / The termodimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic human mycosis geographically distributed in Latin America, being the eighth most common cause of death among chronic infections. PCM is acquired by inhalation of fungal propagules, which reach the lungs and is disseminate through the bloodstream and/or lymph to all parts of the body. The treatment of PCM is long, starting with a dosage of aggressive antifungal agents, extending for months or years. Resistance to antimicrobial drugs may limit the ability of effective treatment of patients, interfering with therapeutic efficacy. Thus, it is necessary to discover and develop new antifungal agents. Plants compounds have a great structural diversity, many of which are models for the synthesis of a vast number of drugs. The action of the oenothein B compound, purified from leaves of Eugenia uniflora, a plant from the Brazilian Savannah, was evaluated on growth, viability and expression of P. brasiliensis genes. The compound interfered with cell morphology and inhibited the transcripts of β-1- 3-glucan synthase. The synergistic effect between oenothein B and drugs used to treat PCM (amphotericin B, itraconazole, Sulfamethoxazole and Trimethoprim-Sulfamethoxazole Combination) was evaluated in this study by the method of sensitivity on plates. The highest inhibition of the fungal growth was observed in association of oenothein B with Trimethoprim-Sulfamethoxazole Combination, followed by amphotericin B, itraconazole and sulfamethoxazole, respectively. Representational Difference Analysis (RDA) was also performed to elucidate the mechanism of action of oenothein B in P. brasiliensis. We identified 463 ESTs up regulated and 121 ESTs down regulated after 90 min of incubation of P. brasiliensis yeast cells with the compound. After 180 min incubation 301 ESTs up regulated and 143 down regulated were identified. The ESTs were classified according to their functional categories using the program Blast2GO. The analysis indicated the presence of transcripts with functions related to cell wall and membrane, transcription factors and hypothetical proteins. In this study, we evaluated also the characteristics of the malate synthase (Pbmls) cDNA, regulation of Pbmls gene expression, and enzymatic activity of the MLS protein of P. brasiliensis (PbMLS), isolate Pb01. The cDNA contains 1617 bp, which encodes a protein of 539 amino acids. The protein has the signature of the MLSs, residues essential for catalytic activity and addressing signal for peroxisomes, PTS1. The high level of Pbmls transcript observed in the presence of 2C sources suggests that in P. brasiliensis, the primary regulation of carbon flux into glyoxylate cycle was at the level of the Pbmls transcript. Transcript analysis, protein levels and enzymatic activity in the presence of different carbon and nitrogen sources suggest that PbMLS acts in both pathways: in glyoxylate cycle, when 2C sources are used, and in alantoin degradation pathway, when proline is used as nitrogen source, or when oxalurate is used to induces genes from pathway. / O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica humana geograficamente distribuída na América Latina, sendo a oitava causa de morte mais comum entre as infecções crônicas recorrentes. A PCM é adquirida pela inalação de propágulos do fungo, os quais chegam ao pulmão, e é disseminado pela corrente sanguínea e/ou linfática para todas as partes do corpo. O tratamento da PCM é longo, iniciando com uma dosagem de agentes antifúngicos agressiva, se estendendo por meses ou anos. A resistência às drogas antimicrobianas pode limitar a capacidade do tratamento efetivo dos pacientes, interferindo na eficácia da terapêutica. Desta forma, torna-se necessário a descoberta e desenvolvimento de novos agentes antifúngicos. Compostos de plantas são produtos biológicos, com uma grande diversidade estrutural, muitas das quais são modelos para a síntese de um vasto número de fármacos. A atuação do composto oenoteína B, purificado das folhas de Eugenia uniflora, uma planta do Cerrado Brasileiro, foi avaliado no crescimento, viabilidade e expressão de genes de P. brasiliensis. O composto interferiu com a morfologia das células e inibiu os transcritos de β-1-3-glicana sintase. O efeito sinérgico entre oenoteína B e os fármacos utilizados no tratamento da PCM (anfotericina B, itraconazol, sulfametoxazol e a combinação trimetoprim-sulfametoxazol), foi avaliado no presente estudo, através do método de sensibilidade em placas. A maior inibição no crescimento das colônias do fungo foi observada na associação da oenoteína B com a combinação trimetoprimsulfametoxazol, seguido com anfotericina B, itraconazol e sulfametoxazol, respectivamente. A Análise Diferencial Representacional (RDA) também foi realizada visando elucidar o mecanismo de ação da oenoteína B em P. brasiliensis. Foram identificadas 463 ESTs induzidas e 121 ESTs reprimidas, após 90 min de incubação de células leveduriformes do fungo com o composto. Após 180 min de incubação foram identificadas 301 ESTs induzidas e 143 reprimidas. As ESTs foram classificadas de acordo com suas categorias funcionais utilizando o programa Blast2GO. As análises indicaram a presença de transcritos com funções relacionados à parede e membrana celular, fatores de transcrição e proteínas hipotéticas. No presente trabalho, foi avaliado ainda, as características do cDNA, a regulação da expressão gênica de Pbmls, e a atividade enzimática da proteína de P. brasiliensis (PbMLS), isolado Pb01. O cDNA contém 1617 pb, que codifica uma proteina de 539 aminoácidos. A proteína apresenta a assinatura das MLSs, resíduos catalíticos essenciais para a atividade e o sinal de endereçamento para os peroxissomos, PTS1. O maior nível do transcrito Pbmls observado na presença de fontes de 2C sugere que em P. brasiliensis, a regulação primária do fluxo de carbono no ciclo do glioxalato foi ao nível dos transcritos de Pbmls. As análises de transcritos, níveis de proteínas e atividades enzimáticas na presença de diferentes fontes de carbono e nitrogênio sugerem que PbMLS esteja atuando em ambas as vias: no ciclo do glioxalato, quando fontes de 2C são utilizadas, e na via da degradação da alantoína, quando prolina é utilizada como fonte de nitrogênio, ou quando oxalurato é utilizado para induzir os genes da via.