Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2018-08-06T18:07:50Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-06T18:12:47Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-08-06T18:12:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-30 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Por análises in silico, um domínio B conservado e antigênico foi previamente identificado em nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases (NTPDases) de plantas e parasitos. O r-potDomB, um recombinante derivado do domínio B (r78-117) da apirase de batata, foi obtido por expressão heteróloga, e a sua reatividade com anticorpos policlonaisanti-apirase de batata confirmaram a existência de epitopos indutores de resposta imune humoral em mamíferos. A clonagem do gene da NTPDase1 de Leishmania amazonensis (LamNTPDase1; NCBI: AFJ22627.1) e as análises in silico reforçaram a hipótese de conservação do domínio B de NTPDases. O r-potDomB, os peptídeos sintéticos LbB1LJ e LbB2LJ derivados do domínio B de NTPDase1 de Leishmania, e os anticorpos produzidos contra estas biomoléculas, foram usados como ferramentas moleculares para estudos específicos da NTPDase1 de L. amazonensis e da leishmaniose. Por “Western blots”, a NTPDase1 foi identificada como bandas de 48 e 63 kDa em frações de membrana, microssomal e flagelo de promastigotas. Por análise imunocitoquímicaultraestrutural, os anticorpos localizaram a NTPDase1 na superfície de membrana plasmática, núcleo, mitocôndria e cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo, confirmando sua ampla distribuição neste parasito. Análises in silico sugeriram as possíveis modificações pós-traducionais da NTPDase1, incluindo a sua conjugação com proteína SUMO. Os polipeptídeos de 48 e 63 kDa e um co-migrante de 12 kDa foram isolados de promastigotas por eletroforese em gel não-desnaturante. Por “Western blots” e espectrometria de massas, a identidade da NTPDase1 foi confirmada nospolipeptídeos de 48 e 63 kDa. Por espectrometria de massas, o polipeptídeo de 12 kDa foi identificado como pertencente à família de proteínas SUMO e, também, adicionado aopolipeptídeo de 63 kDa. Os polipeptídeos de 63 kDa e 12 kDa, mas não o de 48 kDa, foram reconhecidos em “Western blots” pelo soro imune anti- SUMO1, sugerindo a ligação entre NTPDase1 e SUMO, uma modificação descrita pela primeira vez entre os membros da família das NTPDases. Camundongos BALB/c foram infectados com promastigotas, e os anticorpos destes animais reconheceram a NTPDase1 pura, mas não SUMO, confirmando sua antigenicidade. Durante a progressão da doença, alta reatividade entre r-potDomB, LbB1LJ ou LbB2LJ e anticorpos IgG2a dos camundongos infectados foi observada aos 40 dias pós-infecção, revelando a antigenicidade do domínio B e a sua habilidade de induzir a produção deste subtipo nos estágios iniciais da doença. A reatividade de IgG1 foi significativamente maior aos 90-120 dias pós-infecção, coincidindo com o estágio mais ativo da doença, sugerindo participação do domínio em eventos imunoregulatórios. O r-potDomB induziu reação de hipersensibilidade tardia em camundongos Suíços, uma resposta imune celular, com elevação concomitante dos níveis de IgG2a e IFN-y. O r-potDomB, na ausência de adjuvante, usado na préimunização de camungondos Suíços infectados com amastigotas, estimulou a produção de IgG2a e IFN-y, e promoveu proteção parcial contra a progressão da leishmaniose como observado por medida de edema de patas e análises histopatológicas.Os resultados estimulam o aproveitamento biotecnológico do rpotDomB, ou derivados desta biomolécula, em formulações e em protocolos experimentais de imunoterapia e/ou vacinação contra leishmanioses. / By in silico analysis, an antigenic conserved B domain was previously identified within nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) of plants and parasites. The r-potDomB, a recombinant belonging to the conserved B domain (r78- 117) from the potato apyrase, was obtained by heterologous expression, and its reactivity with polyclonal anti-potato apyrase antibodies confirmed the existence of epitopes which induce humoral immune response in mammalian. The cloning of the gene from the Leishmania amazonensisNTPDase 1 (LamNTPDase1; NCBI AFJ22627.1) and in silico analysis reinforced the hypothesis of B-domain conservation within NTPDases. The r-potDomB, synthetic peptides LbB1LJ and LbB2LJ derived from the B-domain from LeishmaniaNTPDase 1, and the antibodies raised against these biomolecules, were used as molecular tools for specific studies of the L. amazonensisNTPDase 1 and leishmaniasis. By Western blots, theNTPDase 1 was identified as bands of 48 and 63 kDa in membrane, microsomal and flagellar fractions of promastigotes. By ultrastructural immunocytochemical, the antibodies localized the NTPDase 1 at the surface of plasma membrane, nucleus, mitochondria and kinetoplast, at flagellar pocket and flagellum, confirming its widespread distribution in this parasite. In silico analysis suggested possible post-translational modifications of the NTPDase 1, including its conjugation with SUMO protein. The polypeptides of 48 and 63 kDa and one co-migrant of 12 kDa were isolated of promastigotes by non-denaturing gel electrophoresis. By Western blots and mass spectrometry, the identity of NTPDase1 in the polypeptides of 48 e 63 kDa was confirmed. By mass spectrometry, the polypeptide of 12 kDa was identified belonging to the SUMO protein family and, also, added to the polypeptide of 63 kDa. The polypeptides of 63 and 12 kDa, but not 48 kDa, were recognized in Western blots by immune serum anti-SUMO1, suggesting binding between NTPDase 1 and SUMO, a modification described for the first time among members of the NTPDase family. BALB/c mice were infected with promastigotes, and the antibodies from these animals recognized the pure NTPDase, but not SUMO, confirming its antigenicity. During disease progression, high reactivity between r-potDomB, LbB1LJ or LbB2LJ and IgG2a antibodies of the promastigote-infected mice was observed at 40 days post-infection, revealing both the B-domain antigenicity and its ability for induce the production of this subtype in early disease stages. The IgG1 reactivity was significantly higher at 90-120 days post-infection, coinciding with the most active stage of the disease, suggesting participation of the domain in immuneregulatory events. The r-potDomB induced delayed type-hypersensitivity reaction in Swiss mice, a cellular immune response, with a concomitant increase in the levels of IgG2a and IFN-y. The r-potDomB, in the absence of adjuvant, used in pre-immunization of amastigotes-infected Swiss mice, stimulated the production of IgG2a and IFN-y, and promoted partial protection against leishmaniasis progression, as observed by measuring of footpad swelling and histopathological analysis. The results stimulate biotechnological use of the r-potDomB, or derivatives of this biomolecule, in formulations and experimental protocols of immunotherapy and/or vaccination against leishmaniasis.

Orientador: Flavia Maria Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T08:25:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franca_CeliadeJesus_M.pdf: 1711635 bytes, checksum: 8b68d7bd0f495d93e2c2949a9229045c (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Estudos indicam que cerca de 2,5% dos recém-nascidos sofrem reações de hipersensibilidade ao leite bovino. Os principais componentes alergênicos do soro do leite bovino são as proteínas ß-Lactoglobulina (ß-Lg) e a-Lactoalbumina (a-La). A enzima transglutaminase (TG) tem sido utilizada para modificar as proteínas do soro do leite, podendo reduzir o seu potencial antigênico. O objetivo desse trabalho foi estudar o efeito do pH e relação enzima substrato (E:S) na polimerização do Isolado proteico do soro do leite (IPS) com a TG em diferentes condições utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta, e avaliar a redução do potencial antigênico das proteínas pela suscetibilidade dos produtos obtidos à digestão com pepsina. O estudo da polimerização do IPS foi realizado por meio de experimentos fatoriais 22, nos quais as variáveis independentes foram a relação enzima:substrato (E:S) (15,7 ¿ 56,9 U TG /g de proteína) e pH (5,0 ¿ 8,4). A variável dependente foi a polimerização das amostras avaliada pela concentração relativa das proteínas ß-Lg ([ß-Lg]) e a-La ([a-La]) após a reação de polimerização, medida por densitometria do gel. Para o estudo da polimerização, foram realizados dois DCCR(Delineamento Composto Central Rotacional): DCCR 1 no qual foi utilizado o IPS sem qualquer tratamento e DCCR 2 no qual foi utilizado o IPS tratado termicamente. Para condição do DCCR 2, foi realizado um experimento preliminar afim de obter as melhores condições de tempo e temperatura de polimerização pela TG. A caracterização das amostras de IPS polimerizado foi realizada por eletroforese (SDS-PAGE). As amostras que apresentaram a menor [ß-Lg] foram empregadas para o estudo de resistência à pepsina, foram utilizados dois modelos de simulação da digestão gástrica: o adulto (182 U de pepsina/g de proteína, pH 2,0) e o infantil (23 U de pepsina/g de proteína, pH 4,0) seguida por caracterização por eletroforese (SDS-PAGE). A avaliação in vitro da antigenicidade dos digeridos gástricos foi realizada por ELISA, utilizando soro de camundongos BALB/c sensibilizados com ß-Lg na forma nativa. A polimerização do IPS pela TG foi mais eficiente quando a proteína foi previamente desnaturada por tratamento térmico. No DCCR 1 ocorreu maior polimerização da a-La do que da ß-Lg, indicando que esta proteína reage facilmente com a TG, mesmo sem tratamento térmico prévio. A digestão in vitro do IPS foi mais eficiente nas condições fisiológicas simulando o modelo adulto do que o infantil. Em ambos os modelos, a amostra tratada termicamente e polimerizada com TG (IPS/TT-TG) foi mais susceptível à pepsina e também foi a que apresentou a menor resposta frente IgE anti- ß-Lg. A diminuição moderada do potencial alergênico após os tratamentos realizados sugerem que houve modificação e ou ocultação de epítopos da estrutura da proteína / Abstract: Studies indicate that about 2.5% of newborns suffer from hypersensitivity reactions to cow¿s milk. The main allergenic components of bovine whey proteins are ß-lactoglobulin (ß-Lg) and a-lactalbumin (a-La). The enzyme transglutaminase (TG) has been used for modifying whey proteins, and may reduce their antigenic potential. The present work aimed at studying the effect of pH and enzyme substrate (E:S) on the polymerization of the IPS with TG under different conditions using Response Surface Methodology, and evaluate the reduction of potential of the antigenic proteins using the susceptibility of products to pepsin digestion. The study of the IPS polymerization was performed by factorial experiments 22, in which the independent variables were enzyme: substrate ratio (E: S) (15.7 to 56.9 U TG / g of protein (U g-1) ) and pH (5.0 - 8.4). The dependent variable was polymerization of the samples evaluated by the relative concentration of the ß-Lg ([ß-Lg]) and a-La ([La-a]) after the polymerization reaction, evaluated by densitometry of the gel. To study the polymerization, two CRCD (Central Rotatable Composite Design) were performed: CRCD 1 in which untreated WPI was used and CRCD 2 in which WPI denatured by heat treatment was used. The characterization of the samples was performed by SDS-PAGE. The evaluation of the polymerization was achieved by the relative concentration of the proteins ß-Lg ([ß-Lg]) and a-La (([a-La]) after polymerization, determined by densitometry. The samples with the lowest [ß-Lg] were chosen for the study of resistance to pepsin using two simulation models of gastric digestion, the adult (182 U pepsin / g of protein and pH 2.0) and infant (23 U pepsin / g of protein, pH 4.0). The resistance of the proteins to the action of pepsin was evaluated by SDS-PAGE. Evaluation of the antigenicity of the samples before and after gastric digestion was performed by ELISA using sera from BALB/c mice sensitized with ß-Lg in its native form. Between the two designs carried out for the polymerization of WPI by TG, the one in which the WPI has previously been denatured by heat treatment was more effective. The in vitro digestion of WPI was more efficient under conditions simulating the physiological adult model than the infant model. In both models the sample which was heat treated and subsequently polymerized by TG was more susceptible to pepsin, and showed the lowest anti-IgE response against ß-Lg, indicating that the allergenic potential was decreased after treatment. These results suggested that there was a modified and/or hidden of the epitopes / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestra em Alimentos e Nutrição

A utilização de antígenos de Taenia crassiceps vem se mostrando como via alternativa no imunodiagnóstico da neurocisticercose (NC), sendo as frações de 18 e 14 kDa consideradas específicas. No presente trabalho, foram sintetizados seis peptídeos, com base nas seqüências de aminoácidos das proteínas de 10, 14 e 18 kDa de T. crassiceps e homólogas às seqüências de aminoácidos de T. solium. Os peptídeos foram divididos em \"a\" e \"b\", denominados como, P1a, P2a, P3a e P4a e P1b, P3b e P4b, sendo, as seqüências de aminoácidos dos peptídeos \"a\", uma seqüência interna dos peptídeos \"b\". Em estudo da antigenicidade dos peptídeos conduzido por teste ELISA, P1a e P4a isolados ou utilizados como múltiplos peptídeos antigênicos (MAP) contendo dois, três ou quatro peptídeos, apresentaram reatividade com soro hiperimune anti-líquido vesicular de T. crassiceps, enquanto que MAPs contendo apenas P2a e P3a não foram antigênicos. Anticorpos monoclonais (AcMos) anti-T. crassiceps (n=3) e anti-T. solium (n=19), reconheceram, em ordem decrescente, P1b (72,7%), P1a (45,5%) e P3a e P2a (9,1%), enquanto que P3b, P4a e P4b não apresentaram reatividade com os AcMos utilizados. Com soros humanos de pacientes com NC (NC) e de indivíduos supostamente saudáveis (ISS), P1b e P1a foram considerados potencialmente antigênicos, isolados ou em MAPs com três ou quatro peptídeos. A avaliação do teste ELISA com peptídeo sintético isolado ou MAP, respectivamente, P1b e MAP-a (P1a+P3a+P4a), foi realizada baseando-se em três diferentes cut off, a, b e TG-ROC. De acordo com os cut off utilizados, ELISA com P1b apresentou índices de positividade entre 59,0-79,5% com amostras de soros NC (n=39); 1,3-11,8% com ISS (n=76); 3,4-10,2% com amostras de soros de pacientes com hidatidose provindos do Rio Grande do Sul (H-R) (n=59); 0,0-50,0% com amostras de soros de pacientes com hidatidose provindos do Peru (H-P) (n=8) e 0,0-9,1% com amostras de soros de pacientes com outras parasitoses (OP) (n=33). ELISA com MAP-a apresentou índices de positividade entre 57,7-92,3% com NC (n=26); 1,4-9,6% com ISS (n=73); 0,0-13,3% com H-R (n=15) e 12,5-37,5% com H-P (n=8). Na tentativa de aumentar a positividade do teste ELISA com peptídeos sintéticos, antígeno de 18 e14 kDa de T. crassiceps foi adicionado, porém, não houve maior antigenicidade ao complexo antigênico. Os peptídeos sintéticos utilizados mostraram-se promissores para o diagnóstico sorológico da NC, porém, não foram representativos dos epítopos imunodominantes presentes em cisticercos de T. solium. Outras seqüências de aminoácidos necessitam ser ensaiadas, a fim de obter um complexo antigênico sintético equivalente ao antígeno nativo, porém, o alto custo da síntese dos peptídeos ainda é uma barreira que limita a investigação de novos MAPs. / Taenia crassiceps antigens have been showed like one alternative rote to the immunodiagnosis of neurocysticercosis (NC), where 18- and 14-kDa fractions have been considered specific. In this study, six peptides were synthesized based on 10, 14 and 18 kDa fractions of amino acids sequence of proteins of the T.crassiceps and homologous to T. solium. Peptides were divided in \"a\" and \"b\", denominated P1a, P2a, P3a and P4a and P1b, P3b and P4b, being that amino acids sequences of the \"a\" peptides are one internal sequence of the \"b\" peptides. In antigenic study of the peptides conducted by ELISA, isolated P1a and P4a peptides or used like multiple antigenic peptides (MAP) with two, three or four peptides, cross-reacted with anti-vesicular fluid of the T. crassiceps hyperimmune serum, while that, MAPs with only P2a and P3a did not showed antigenicity. Monoclonal antibodies (Mabs) anti-T. crassiceps (n=3) and anti-T.solium (n=19) Mabs recognized in decreasing order, P1b (72,7%), P1a (45,5%) and P3a and P2a (9,1%), while, P3b, P4a and P4b did not showed reactivity with Mabs used. In human serum samples of the patients with neurocysticercosis (NC) and serum healthy individuals (HI), where P1b and P1a peptides were analyzed isolated or in MAPs with three or four peptides, both of them showed antigenic potential. The evaluation of the ELISA tests with synthetic peptides isolated or in MAPs, P1b and MAP-a (P1a+P3a+P4a), respectively, was analyzed in three differents cut off, a, b and TG-Roc. Based on its, ELISA assayed with P1b showed 59,0-79,5% positivity when NC serum samples where tested (n=39); 1,3-11,8% with HI serum samples (n=76); 3,4-10,2% with human serum samples of the patients with hydatidosis from Rio Grande do Sul (H-R) (n=59); 0,0-50,0% with human serum samples of the patients with hydatidosis from Peru (H-P) (n=8) and 0,0-9,1% with human serum samples of the patients with others parasitoses (OP) (n=33). By the way, ELISA assayed with MAP-a showed 57,7-92,3% positivity with NC (n=26); 1,4-9,6% with HI (n=73); 0,0-13,3% with H-R (n=15) and 12,5-37,5% with H-P (n=8). On the attempt of increase the positivity of the ELISA test using synthetic peptides, 18- and 14-kDa fractions of the T. crassiceps was added, but they did not promoted more antigenicity. Synthetic peptides used showed promising results on neurocysticercosis serumdiagnosis, but they were no representatives of dominants epitopes present in T. solium cysticercus. Others amino acids sequences need be used to have a synthetic antigenic complex similar to native antigens, however, the high cost of the peptide synthesis still is a problem that limit the study of the news MAPs.

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T13:49:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MicheleAugusto_M.pdf: 2050778 bytes, checksum: aedc46d9b78bf413f7e34cfbe46a36a6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A ß-Lactoglubulina (ß-Lg) é uma das proteínas mais antigênicas presente no leite bovino. Tratamentos físicos, químicos ou enzimáticos podem alterar a antigenicidade desta proteína. Em trabalho anterior, verificou-se que o potencial antigênico da ß-Lg é reduzido quando polimerizada pela enzima transglutaminase (TG) na presença de cisteína (Cys). No entanto, o efeito da polimerização sobre o valor nutricional da ß-Lg ainda não é conhecido. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da reação de polimerização catalisada pela TG na digestibilidade in vitro e atividade antigênica da ß-Lg antes e após a ação das enzimas gastrintestinais. A ß-Lg polimerizada pela TG (0, 10 ou 25 U g-1), após tratamento térmico ou na presença de agentes redutores Cys (0, 0,1 e 0,25 mol L- 1) ou ditiotreitol (DTT 0,02 mol -1), foi avaliada quanto à digestibilidade in vitro, utilizando as enzimas pepsina e pancreatina. As amostras, antes e após a digestão in vitro, foram caracterizadas pelos métodos SDS-PAGE, SDSPAGE/ tricina e cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (CLAE-FR). Posteriormente, as amostras foram avaliadas quanto à antigenicidade, exceto aquelas na presença de DTT, por meio do método de Imunoblote, utilizando soro de camundongos BALB/c sensibilizados com a ß-Lg na forma nativa (ß-Lg N) ou com ß-Lg polimerizada com 25 U de TG g-1, na presença de 0,25 mol L-1 de Cys (ß-Lg 0,25Cys 25TG). A adição de TG resultou na formação de polímeros com massa molar igual ou acima de 97,4 kDa, principalmente na presença de agentes redutores alcançando aproximadamente 96% de polimerização na presença de DTT e 91% na presença de Cys. A digestibilidade in vitro da ß-Lg N foi 53,6% e todos os tratamentos realizados aumentaram a digestibilidade da proteína em até 79%. Os maiores valores de digestibilidade foram obtidos quando a ß-Lg foi tratada com agentes redutores. O processo de polimerização também teve efeito positivo na digestibilidade, principalmente para as amostras polimerizadas na presença de Cys ou DTT, atingindo valores acima de 75%. A análise por Imunoblote mostrou que a polimerização da ß-Lg na presença de agente redutor Cys, na concentração de 0,25 mol L-1, reduziu o reconhecimento da ß-Lg pelas IgE específicas presente nos soros dos animais sensibilizados com ß-Lg N ou com ß- Lg 0,25Cys 25TG. Após a digestão com pepsina e pancreatina, as amostras polimerizadas pós-tratamento térmico ou na presença de Cys apresentaram redução da antigenicidade, como também os digeridos da ß-Lg tratada com Cys (não polimerizada com TG). A desnaturação pelo agente redutor Cys e a polimerização por TG em ambas as condições estudadas mostraram ser métodos efetivos no aumento da digestibilidade da ß-Lg. Por sua vez, a combinação destes métodos com a digestão por enzimas gastrintestinais levou à redução da antigenicidade da proteína, já que os peptídeos gerados apresentaram potencial antigênico baixo / Abstract: The ß-Lactoglubulin (ß-Lg) is one of the most antigenic proteins present in the bovine milk. Physical, chemical or enzymatic treatments can alter the antigenicity of this protein. In previous study, it was shown that the antigenic potential of ß-Lg is reduced when polymerized by transglutaminase (TG) in the presence of cysteine (Cys). However, the effect of polymerization on the nutritional properties of ß-Lg is still unknown. The present study aimed to evaluate the effect of the polymerization reaction catalyzed by TG on the in vitro digestibility and the antigenic activity of ß- Lg, before and after simulate digestion with gastrointestinal enzymes. The in vitro digestibility of the ß-Lg treated with TG (0, 10 or 25 U g-1), after heat treatment or in the presence of reducing agents Cys (0, 0.1 and 0.25 mol L-1) or dithiothreitol (DTT 0.02 mol L-1), was evaluated using the gastrointestinal enzymes, pepsin and pancreatin. The samples, before and after in vitro digestion, were characterized by SDS-PAGE, SDS-PAGE/tricine and reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Subsequently, the samples were evaluated for antigenicity, except those prepared in the presence of DTT, by immunochemical methods (Immnoblotting), using sera from BALB/c mice sensitized with native ß-Lg (ß-Lg N) or ß-Lg polymerized with 25 U of TG g-1 in the presence of 0.25 mol L-1 of Cys (ß-Lg 0.25Cys 25TG). The formation of polymers with molar mass equal to or above 97.4 kDa was observed with the addition of TG, especially in the presence of reducing agents, reaching approximately 96% of polymerization in the presence of DTT and 91% in the presence of Cys. The in vitro digestibility of native ß-Lg was 53.6% and the all treatments performed increased the digestibility of protein up to 79%. The highest values of digestibility were obtained in the presence of reducing agents. The polymerization also had a positive effect on the digestibility, especially for those samples polymerized in the presence of Cys or DTT, with values above 75%. Analysis by immunoblotting showed that the polymerization of ß-Lg in the presence of 0.25 mol L-1 Cys, reduced the recognition of ß-Lg specific IgE present in the sera of animals sensitized with ß-Lg N or ß-Lg 0.25 Cys 25TG. After digestion with pepsin and pancreatin, the samples polymerized after heat treatment or in the presence of Cys showed reduced antigenicity. The digest of the samples treated with Cys (not treated with TG) was not recognized as antigens. The denaturation by Cys and polymerization by TG in both conditions were effective in increasing the digestibility of ß-Lg. In turn, the combination of these methods with digestion by gastrointestinal enzymes led to reduction of antigenicity of the protein and that peptides generated showed low antigenic potential / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

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Lors de la transmission sexuelle du VIH-1, un seul ou un nombre très limité de variants viraux sont transmis parmi ceux présents chez le donneur. Il est important de comprendre si le variant transmis est sélectionné aléatoirement parmi ceux présents chez le donneur ou s’il possède un avantage sélectif qui le prédispose à établir plus efficacement une nouvelle infection. Lors de nos différents travaux, nous avons pu observer chez quatre patients une évolution parallèle des propriétés génétiques, antigéniques et fonctionnelles de la glycoprotéine d’enveloppe au cours de l’infection. L’évolution de certaines propriétés est répercutée à l’échelle populationnelle. Néanmoins nous avons montré que malgré ces évolutions, les virus transmis au sein d’une même chaîne de transmission présentent des propriétés biologiques conservées. L’ensemble de nos résultats vont en faveur d’une sélection d’un variant viral avec des propriétés particulières lors de la transmission. De plus le variant transmis possède une région V3 particulièrement conservée associée à un tropisme CCR5, une sensibilité au Maraviroc et semble avoir besoin d’un taux élevé de CD4 à la surface de la cellule cible. / During HIV-1 sexual transmission, a single virus among the numerous viral variants present in the donor is transmitted most often. The key question is to understand if transmitted variants are randomly selected among variants from the donor or they have biological properties that predispose them to establish more efficiently a new infection. We observed a parallel evolution of genetic, antigenic and functional properties of the envelope glycoprotein in four patients during the infection. In addition, the evolution of some properties is also observed at the populational level. However, we showed that transmitted variants from a same transmission chain share similar biological properties. Together our results suggest that the transmission bottleneck is mainly non-stochastic and involves the selection viral variants harboring specific phenotypic properties. Despite transmitted variants have a conserved V3 region associated with a CCR5 tropism, sensitivity to Maraviroc and seem to require high level of CD4 to efficiently infect target cells.

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T11:45:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vuolo_MilenaMorandi_M.pdf: 1172548 bytes, checksum: 0065404d0770c2d788c07526e0f82ae8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O leite bovino contém proteínas que são consideradas antigênicas e capazes de induzir algum tipo de resposta imunológica, dentre elas destaca-se a ß-lactoglobulina (ß-Lg). A utilização da enzima transglutaminase (TG), que catalisa reações de ligação e-(?-glutamina)lisil inter ou intramoleculares, incorporação de aminas e desaminação tem demonstrado eficiência em alterar o potencial antigênico de alimentos. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da reação de polimerização induzida pela TG na atividade antigênica da ß-Lg e sua digestibilidade, na presença dos agentes redutores glutationa (GSH) e ácido ascórbico (AA). As modificações da ß-Lg com a TG na presença dos agentes redutores foram realizadas através de experimentos fatoriais 22 nos quais as variáveis independentes foram a relação enzima:substrato (E/S) (0 ¿ 51,6 U TG g -1 de proteína) e concentração dos agentes redutores, [GSH] (0 - 0,67 mmol/L) ou [AA] (0- 0,02 mol/L) e as variáveis dependentes foram grau de polimerização e concentração de IgE. A polimerização foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), e grau de polimerização (GP) através da determinação de lisinas livres. A avaliação da antigenicidade foi feita por ELISA, utilizando soro de camundongos BALB/c sensibilizados com ß-Lg na forma nativa. A resistência das amostras à ação da pepsina foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e tricina (SDSPAGE/Tricina). Os tratamentos realizados com TG e GSH apresentaram polímeros de alta massa molar (MM > 97,4 kDa), exceto para a condição do ensaio 5 (0,34 mmol/L GSH), que não utilizou TG. Os tratamentos com TG e AA também apresentaram polímeros de alta massa molar (MM > 97,4 kDa), exceto para a condição do ensaio 2 (44,1 U de TG g -1 e 0,003 mol/L de AA) e ensaio 5 (0,01 mol/L AA, que não utilizou TG). O GP foi maior para as amostras tratadas com TG na presença de agentes redutores, quando comparadas às amostras tratadas somente com TG ou agente redutor. Os resultados mostraram que a presença dos agentes redutores levou ao aumento da polimerização pela TG ao desnaturar a proteína levando à maior exposição dos aminoácidos lisina e glutamina. Não houve diminuição na antigenicidade da ß-Lg tratada com TG na presença de GSH ou AA, porém houve aumento da antigenicidade de algumas amostras obtidas sob algumas das condições dos ensaios realizados com os agentes redutores quando comparadas à ß-Lg. Os tratamentos realizados com TG na presença dos agentes redutores não aumentaram a digestibilidade da ß-Lg pela pepsina. Os digeridos das amostras obtidas sob as condições relativas aos níveis extremos do planejamento experimental (±1,41) e o ponto central, foram avaliados quanto à sua antigenicidade. Os resultados mostraram que não houve diminuição da antigenicidade da ß-Lg tratada com TG e GSH ou TG e AA., quando comparadas à ß-Lg. A polimerização com TG na presença de agentes redutores GSH e AA não foi capaz de modificar a antigenicidade das amostras digeridas, sugerindo que não houve modificações na proteína capazes de aumentar sua digestibilidade pela pepsina ou modificar regiões de epítopos / Abstract: Cow¿s milk contains proteins which are considered antigenic and able to lead to immune response, among them ß-lactoglobulin (ß-Lg) is the most important. The transglutaminase (TG) is the only enzyme commercially used that catalyses inter or intramolecular cross linking reaction in various proteins and demonstrates efficiency to alter the antigenic potential of food. The current work aimed at studying the effect of the reaction of induced polymerization by TG in presence of the reducing agents glutathione (GSH) as well as ascorbic acid (AA) in the antigenic activity of ß-Lg and its digestibility. The modifications in ß-Lg induced by TG in presence of reducing agents were carried out using factorial experiments 22, in which the independent variables were the enzyme:substrate ratio (E/S) (0 ¿ 51,6 U TG g -1) and concentration of reducing agents, [GSH] (0 - 0,67 mmol/L) or [AA] (0- 0,02 mol/L), and the dependent variables were the polymerization degree and concentration of IgE. Polymerization was assessed by electrophoresis in polyacrylamide gel (SDSPAGE), and the polymerization degree (PD) was determined by the free lysine content. The assessment of antigenicity was by ELISA assay, using serum of BALB/c mice sensitized with native ß-Lg. The resistance of the samples to the action of pepsin was evaluated by electrophoresis in polyacrylamide gel in presence of SDS and tricine (SDSPAGE/Tricine). The treatments using TG and GSH showed high molecular weight polymers (MM > 97,4kDa), except for a test condition 5 (0,34 mmol/L GSH), where TG was not used. The treatments with TG and AA also showed polymers of high molecular weight (MM > 97,4kDa), except for the test condition 2 (44,1 U TG g -1 and 0,003 mol/L of AA) and test 5 (0,01 mol/L AA, without TG). The PD was higher in the samples treated with TG in presence of reducing agents, when compared to samples treated only with TG or reducing agents. The results showed that the presence of reducing agents led to the increase of polymerization by TG since they denature the protein, leading to increased exposure of the amino acids glutamine and lysine, substrate for TG. The results showed that there was no reduction in the antigenicity of ß-Lg treated with TG in presence of GSH or AA, however an increase in the antigenicity of some modified samples was observed when compared to the native ß-Lg. . The treatments carried out with TG and reducing agents did not increase the digestibility of the ß-Lg by pepsin. The antigenicity of the digested from the samples obtained under the conditions of the extreme levels of experimental planning (±1,41) and at the central point were assessed. The results showed that after digestion with pepsin there was no decrease of the antigenicity of ß-Lg treated with TG in the presence of GSH or AA as compared to digested ß-Lg. Polymerization with TG in the presence of reducing agents was not able to alter the antigenicity of the samples, which suggests that there were no modifications in the protein that would be able to increase its digestibility by pepsin as well as the epitopes regions of the ß-Lg / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientadores: Flavia Maria Netto, Ricardo de Lima Zollner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T22:30:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morais_JanainaMadruga_M.pdf: 1775595 bytes, checksum: 5ee1d5b4bacec45d3dfff615d49f7ca8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O leite bovino contém várias proteínas capazes de induzir resposta alérgica, sendo que a ß-lactoglobulina (ß-Lg) e a a-lactalbumina (a-La), proteínas mais abundantes do soro, estão entre as principais proteínas antigênicas. A homogeneização à alta pressão (HAP) é uma tecnologia emergente que pode alterar a estrutura das proteínas do soro de leite (IPS) e, portanto, seu caráter alergênico. Estudos anteriores apontam que a polimerização com a enzima transglutaminase (TG) reduziu o potencial antigênico da ß-Lg. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da HAP associada à polimerização por TG na suscetibilidade à digestão gástrica e gastrointestinal e na resposta antigênica da ß-Lg e a-La antes e após a digestão gástrica. Soluções de IPS (1% m/v), tratadas termicamente (72 °C/22 min) ou não, foram homogeneizadas a diferentes níveis de pressão (0, 100, 180 MPa) ou multiprocessadas por 3 ciclos consecutivos a 180 MPa. As amostras foram caracterizadas por turbidez, pelo teor de grupos sulfidrila reativos e livres e por eletroforese em sistema nativo e em SDS-PAGE em condições redutoras e não-redutoras. As amostras processadas foram polimerizadas com TG (25 U g-1 de proteína) e caracterizadas por eletroforese SDS-PAGE em sistema redutor e densitometria dos géis. Foi avaliada a suscetibilidade da ß-Lg e da a-La à digestão gástrica e gastrointestinal após tratamento térmico, HAP e polimerização, associados ou não. As condições de digestão foram: 182 U de pepsina g-1 de proteína e a relação 1:25 (enzima:proteína) para a pancreatina. A caracterização dos digeridos foi realizada por eletroforese SDS-PAGE/Tricina e cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (CLAE-FR). A antigenicidade das proteínas foi avaliada pelo método ELISA, utilizando soro anti-ß-Lg ou anti-a-La de camundongos BALB/c imunizados com as proteínas nativas. A homogeneização das soluções de IPS, previamente tratadas termicamente ou não, resultou na diminuição da turbidez e do teor de grupos sulfidrila reativos e livres com o aumento dos níveis de pressão. A polimerização com TG resultou na formação de polímeros com massa molecular (MM) acima de 97,4 kDa, principalmente nas amostras tratadas termicamente e homogeneizadas a 180 MPa por 1 e 3 ciclos, alcançando aproximadamente 20% de polímeros de alta MM. As amostras pré-tratadas e polimerizadas foram mais suscetíveis à digestão gástrica e gastrointestinal, resultando em menor residual de proteína intacta em relação às amostras homogeneizadas pré-tratadas termicamente ou não. Foi observado aumento (P< 0,05) da capacidade de ligação à IgE anti-a-La para a amostra de IPS tratado termicamente e homogeneizado a 180 MPa (IPS-TT-180, 27,88 µg IgE mL-1), em relação ao IPS nativo (IPS-N, 12,80 µg IgE mL-1), sugerindo que a associação do tratamento térmico e HAP aumentou a exposição de seus epítopos. Após a digestão gástrica, não foi observada redução da atividade antigênica da a-La em nenhuma das amostras analisadas. Já para a ß-Lg verificou-se que após a digestão gástrica a amostra de IPS tratado termicamente, homogeneizado a 180 MPa e polimerizado (IPS-TT-180 TG) apresentou diminuição (P< 0,05) da resposta antigênica para IgE anti-ß-Lg (13,59 µg IgE mL-1) em relação ao IPS-N (34,21 µg IgE mL-1). Em conclusão, os tratamentos utilizados alteraram a estrutura das principais proteínas do IPS, resultando na diminuição moderada da resposta antigênica da ß-Lg e no aumento da antigenicidade da a-La / Abstract: Bovine milk contains several proteins, which can induce allergic response. The most abundant whey proteins, â-lactoglobulin (â-Lg) and á-lactalbumin (á-La) are among the major antigenic proteins of cow¿s milk. High pressure homogenization (HPH) is an emergent technology which can alter whey proteins (WPI) structures and possibly WPI antigenicity. Previous studies indicated that polymerization with transglutaminase enzyme (TG) reduced the antigenic potential of â-Lg. The objective of the present study was to evaluate the effect of HPH associated to polymerization by TG on the susceptibility to simulated gastric and gastrointestinal digestion and on antigenic response of â-Lg and á-La before and after gastric digestion. Solutions of WPI (1% w/v) previously heat treated (72 °C/22 min) or without heat treatment were homogenized at several pressure levels (0, 100 and 180 MPa) or at 180 MPa for three consecutive cycles. The samples were characterized by turbidity, content of exposed and free sulfhydryl groups and by electrophoresis on native system and SDS-PAGE under non-reducing and reducing conditions. The processed samples were polymerized with TG enzyme (25 U g-1 of protein) and characterized by SDS-PAGE under reducing conditions followed by densitometry of gels. The susceptibility of â-Lg and á-La to gastric and gastrointestinal digestion was evaluated after heat treatment, HPH and polymerization, associated or not with each other. The digestion conditions were: 182 U pepsin g-1 protein and pancreatin:protein ratio of 1:25. Characterization of the digests was carried out by SDS-PAGE/Tricine and reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Protein antigenicity was evaluated by ELISA assay, using serum from BALB/c mouse immunized with native â-Lg and á-La. The homogenization of the WPI solutions, previously heat treated or without heat treatment, resulted in reducing both turbidity and exposed and free sulfhydryl group content as the pressure levels increased. The polymerization with TG enzyme resulted in polymers with molecular mass (MM) above 97.4 kDa, mainly in the samples heat treated and homogenized at 180 MPa for 1 or 3 cycles, forming around 20% of high MM polymers. Either polymerized samples previously treated with heat and/or HPH were more susceptible to gastric and gastrointestinal digestion, resulting in less residual intact protein as compared to the homogenized samples previously heat treated or without heat treatment. It was observed higher (P< 0.05) binding capacity to anti-á-La IgE for the sample heat treated and homogenized at 180 MPa WPI (WPI-TT-180, 27.88 ìg IgE mL-1) than for native WPI (WPI-N, 12.80 ìg IgE mL-1) suggesting that the association of heat treatment and HPH increased the exposition of á-La epitopes. After gastric digestion it was not observed a reduction of á-La antigenic activity. In relation to â-Lg antigenicity, after gastric digestion, the WPI sample heat treated, homogenized at 180 MPa and polymerized (WPI-TT-180 TG) showed reduction (P< 0.05) of anti-â-Lg IgE response (13.59 ìg IgE mL-1) as compared to WPI-N (34.21 ìg IgE mL-1). In conclusion, the treatments studied altered the structure of major protein of WPI, resulting in moderate reduction of â-Lg antigenic response and increased á-La antigenicity / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestra em Alimentos e Nutrição

The envelope glycoprotein (Env) of Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) has developed several immune-evasion mechanisms to avoid the induction of neutralising antibodies, including immunodominant non-neutralising epitopes, conformational flexibility of conserved epitopes, and spontaneous subunit dissociation, thus impeding vaccine development. Here, chemical modification of Env-based vaccine antigens is explored to overcome these obstacles. Firstly, covalent fixation of Env by chemical cross-linking was used to stabilise the conformationally flexible structure and prevent subunit dissociation. Cross-linked Env constructs showed reduced binding of many non-neutralising antibodies whilst largely maintaining antibody recognition by broadly neutralising antibodies. Compared to unmodified material, immunisation with some of these cross-linked proteins led to the induction of significantly increased antibody titres targeting the conserved CD4 binding site of Env despite similar overall antibody titres. These refocused antibody responses resulted in increased serum neutralising titres compared to animals receiving unmodified protein. Secondly, an epitope masking strategy was developed to reduce or eliminate the immunogenicity of neutralisation-irrelevant surfaces. This was achieved using site-selective addition of theoretically immunosilent glycoconjugates to lysine residues. Masking of model protein hen egg lysozyme (HEL) led to site-selective loss of antibody binding to the modification sites in vitro, which translated into refocusing of antibody responses from masked to unmasked epitopes in vivo. Mutant HIV-1 and influenza virus surface glycoproteins were designed that had lysine residues removed from close proximity to the respective broadly neutralising epitopes, but added throughout the remaining surface. Masking of these mutant proteins with second-generation glycoconjugates led to predictable perturbations of antibody binding in vitro. However, administration of these modified glycoproteins revealed unexpectedly that the masking glycans were highly immunogenic in vivo. Thus, this strategy may well prove useful if truly non-immunogenic glycoconjugates can be identified. Taken together, these chemical modifications of vaccine antigens may allow focused targeting of specific antigenic regions for increased B cell recognition, and may thus be a valuable tool for vaccine antigen design.

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