Macrophages are key regulators of immune system connecting innate and specific immune responses. Macrophages proliferate in presence of their growth factor, M-CSF. The addition of bacterial lipopolysacharide, LPS, induces macrophage activation and stops their proliferation engaging a pro-inflammatory response. The activation of ERK MAPK is required for both macrophage proliferation and activation. However, different time-course of ERK activation is displayed. Proliferation is a process dependent on early and short ERK activation, whereas LPS addition delays and elongates ERK activation inducing an inflammatory response. Proliferating or activating responses are balanced by the extent and duration of ERK phosphorylation that is regulated by mitogen kinase phosphatase MKP1 (DUSP1). MKP1 is induced by both M-CSF and LPS and its kinetics of induction is correlated with those of inactivation of MAPKs. The induction of MKP-1 by M-CSF or LPS is mediated by PKC-epsilon.Our studies in primary cultures of murine bone marrow derived macrophages, show that MKP-1 expression by both M-CSF and LPS is dependent on activation of Raf-1 kinase, and its interaction with PKC Õ. The time-course of activation of ERK is correlated with that of Raf-1 and MEK-1/2. The use of specific inhibitors and RNA of interference, has shown that ERK activation during proliferation is dependent on Raf-1 activation, whereas in response to inflamatory stimuli such as LPS an alternative pathway to Raf-1 to direct the activation of these kinases. Inhibition of Raf-1 activity causes a growth arrest. The cell cycle blockage at G1 phase correlated with increased expression of cyclin-dependent kinase (Cdks) inhibitors, p21Waf1 and p27Kip1. On the other hand, no effects were observed during macrophage activation as assessed by pro-inflammatory cytokine expression and induction of nitric oxide synthase following LPS stimulation. In addition, the transcriptional induction of MKP-1 phosphatase by both M-CSF and LPS is independent of ERK and p38 activation, but dependent on JNK activation as assessed using inhibitors. In consequence to inactivation of MKP-1, an elongation of other MAPKs activity, ERK and p38, is observed. Macrophages constitutively express JNK1 and JNK2 isoforms, while no JNK3 is detected. JNK1 is the main isoform involved in JNK activity. Using single knock-out mice for jnk1 and jnk2 genes, we have demonstrated that MKP-1 induction is mediated by JNK1 isoform. Moreover, JNK1 is also required for biosynthesis of proinflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-1beta and IL-6) and for induction of nitric oxide synthase. This requirement is independent on JNK1 function as regulator of MKP-1 induction, as shown using knock-out mice for this phosphatase. These data indicate that Raf-1 is critical in ERK MAPK activation during macrophage proliferation whereas its absence does not compromise macrophage activation. Furthermore, Raf-1 is involved in the expression of MKP-1 phosphatase implicated in MAPK deactivation, through interaction with PKC-epsilon isoform. In addition, MKP-1 phosphatase expression is also dependent on JNK activity suggesting a selfregulation of MAPKs through induction of phosphatases. From different JNK isoforms, JNK1 is involved both in the expression of MKP-1 phosphatase and displays a direct role in the LPS-dependent macrophage activation.

Glucocorticoids are frequently included in the chemotherapy regimens administered to patients with CLL because they are potent immunosuppressant agents and because they are able to induce apoptosis in CLL cells. Although used from a long time, the molecular mechanisms by which glucocorticoids induce cell death in CLL cells are largely unknown. Interestingly, CLL cells from prognostic groups defined by the mutational load of the IGHV genes and the expression of ZAP70 seem to have different responses to glucocorticoids. The hypothesis in this thesis is that there are genes or proteins that determine the different response to glucocorticoids among the specific prognostic groups of patients with CLL. Sensitivity to dexamethasone was analyzed ex vivo in 50 CLL and compared according to IGHV mutational status and/or ZAP70 expression. The response was further compared by gene expression profiling (GEP) of selected cases. Expression of genes of interest was validated by quantitative reverse transcriptase PCR. Response to dexamethasone is higher in cases with unmutated IGHV/high ZAP70 expression and the levels of induction of the pro-apoptotic BIM gen correlate with the degree of cell death. The different levels of apoptosis induced by dexamethasone observed in the CLL groups defined by ZAP70 expression translate into different profiles of gene expression. These differences are mainly quantitative; cases with high ZAP70 expression show higher levels of gene induction/repression than cases with low ZAP70 expression. Specific analysis of genes of interest performed in a large series disclosed that baseline mRNA and protein expression levels of FKBP5, the co-chaperone of the glucocorticoid receptor, correlate with the extent of CLL cells apoptosis induced by the treatment with dexamethasone. Baseline FKBP5 levels are higher in samples from patients with high ZAP70 expression. GILZ is differentially induced by dexamethasone in ZAP70 expression groups of CLL, being higher in cases with high ZAP70 expression. Induction of GILZ correlates with induction of BIM and levels of apoptosis. Unmutated IGHV/high ZAP70 CLL cells exhibit better response to dexamethasone treatment, which is accompanied by a differential expression of genes involved in the glucocorticoid-receptor pathway and by an increased induction of genes related to apoptosis. / Los glucocorticoides son frecuentemente incluidos en la quimioterapia administrada a pacientes con leucemia linfática crónica (LLC), pues son potentes inmunosupresores e inducen la apoptosis de las células de LLC. Los mecanismos moleculares por los cuales los glucocorticoides inducen la apoptosis de las células de LLC son en gran parte desconocidos. Las células LLC de grupos pronósticos definidos por el estado mutacional de los genes IGHV y por la expresión de ZAP70 parecen tener diferentes respuestas a los glucocorticoides. La hipótesis de esta tesis es que hay genes o proteínas expresados de forma diferente en los grupos pronósticos de pacientes con LLC que determinan los diferentes niveles de apoptosis inducidos por los glucocorticoides. La sensibilidad al glucocorticoide dexametasona, se determino ex vivo en 50 muestras de pacientes con LLC y se comparo en función del estado mutacional de los genes IGHV y/o de la expresión de ZAP70. También se compararan los perfiles de expresión génica (GEP) de casos seleccionados. Los niveles de expresión de los genes de interés se validaran por QRT-PCR. La respuesta a la dexametasona es superior en los casos de LLC con genes IGHV no mutados/alta expresión de ZAP70. Los niveles de inducción del gen proapoptótico BIM se correlacionan con el grado de muerte celular. Los diferentes niveles de apoptosis inducida por dexametasona en los grupos de LLC definidos por la expresión de ZAP70 se traducen diferentes GEP. Las diferencias entre los GEP de cada grupo fueran principalmente cuantitativas, los casos con alta expresión de ZAP70 muestran niveles más altos de inducción/represión génica que los casos con baja expresión. Se observo que los niveles basales de ARNm y proteína de FKBP5, una cochaperona del receptor de los glucocorticoides, se correlacionan con el grado de apoptosis inducida por la dexametasona y que los niveles de FKBP5 son más elevados en los casos con alta expresión de ZAP70. GILZ induce diferencialmente por la dexametasona, observándose mayores inducciones en los casos con alta expresión de ZAP70. La inducción de GILZ se correlaciona con la inducción de BIM y con la magnitud de la apoptosis.

Una de las vías que se postula que tienen una mayor importancia en las enfermedades neurodegenerativas es la de los inositoles fosfato. Para el estudio de esta vía se ha utilizado un inhibidor farmacológico de la fosfoinositol 3 cinasa (PI3K), el LY294002, en un modelo in vitro de células granulares de cerebelo de rata (CGC). Al tratar las CGC con una dosis de 30μM de LY294002 se produce una muerte celular por apoptosis que es independiente de calpaínas y dependiente de caspasas, además no se observa la fragmentación de p35 ni de α espectrina que se da por activación de las calpaínas. Los ensayos de actividad caspasa nos muestran un incremento significativo de la actividad de las caspasas 6 y 9 pero no de la 3 como sucede en otros modelos de apoptosis como la deprivación de S/K+. Nuestros estudios muestran que aunque existen algunas similitudes entre los modelos de inhibición de la PI3K y la deprivación de S/K+ también existen importantes diferencias. En ambos se produce una desfosforilación de AKT en Ser476 y consecuentemente una desfosforilación de GSK3β en Ser9, lo que indica la activación de GSK3β. Respecto a la proteína Rb en ambos modelos se observa un incremento de su fosforilación, si bien su papel es distinto ya que en la deprivación de S/K+ conduce a la liberación del E2F y a la transcripción de proteínas relacionadas con el ciclo celular. Además, se observó un incremento de la síntesis de DNA. Por el contrario el tratamiento con LY294002, pese a provocar un incremento en la fosforilación del Rb, no lleva a la expresión de ciclinas, CDKs ni un aumento de la síntesis de DNA.. Sin embargo el uso de inhibidores de CDK como flavopiridol y roscovitina muestran una protección significativa frente a la apoptosis inducida por LY294002, nuestros estudios muestran por vez primera que, no solo flavopiridol sino también otros inhibidores de CDK como la roscovitina tienen capacidad para inhibir la actividad GSK3β. Rb puede ser fosforilado por p38, un miembro de la vía de las MAPK las cuales son inhibidas por AKT. Nuestros resultados indican que LY294002 produce un incremento de la actividad de p38, pero no de JNK. Además, los cultivos Knockout de JNK3 no muestran una protección frente al tratamiento con LY294002, lo que refuerza la idea de que JNK no juega un papel central en este modelo. El incremento de actividad de p38 fue revertido con SB203580, un inhibidor de p38, así como por SP600125, inhibidor de JNK. Ambos fármacos mostraron una protección significativa frente a la apoptosis inducida por LY294002 y una reducción de la fosforilación del factor de transcripción c‐Jun, implicado en la apoptosis. La activación de c‐Jun conduce a la expresión de genes proapoptóticos como dp5 relacionados con la vía intrínseca, la inhibición de p38 previno del aumento de expresión de dp5. Por el contrario otras proteínas implicadas en la vía como Bim no están reguladas por c‐Jun ya que la inhibición de esta vía no reduce su activación. En nuestro estudio podemos concluir que, LY294002 produce una apoptosis dependiente de caspasas 6 y 9, sin implicación ni de calpaínas ni de proteínas del ciclo celular. La inhibición de AKT lleva a la activación de GSK3β y de p38. Además, p38 es capaz de fosforilar c‐Jun que regula la expresión de genes relacionados con la apoptosis por la vía intrínseca. / The inositol pathway has been reported that plays a key role in neurodegenerative diseases We study the mechansims involved in the apoptosis induced by inhibiting the phosphoinositol 3 kinase (PI3K) using a pharmacological inhibitor named LY294002 in an in vitro model of rat cerebellar granule cells (CGC). LY294002 induced apoptotic cell death through calpain independent and caspase dependent. Furthermore, we could not observed neither fragmentation of of p35 or α espectrin which is caused by calpains. The caspase activity assays showed a significant increase in caspase 6 and 9 but not in caspasa 3, in contrast with other apoptotic models such as de S/K+ deprivation. Our studies show that although exist several common points between inhibition of PI3K and S/K+ deprivation, also exist important differences between them. In both cases it has been observed AKT dephosphorylation at Ser476 and consequently GSK3β dephosphorylation at Ser9, which indicates GSK3β activation. On the other side, it was observed an increase of Rb phosphorylation in both models. However, it seems that the role played by this protein is different since in the de S/K+ deprivation leads to E2F released which participates in the transcription of proteins related to cell cycle. Moreover, the BrdU assay showed an increase in DNA synthesis. On the contrary, the LY294002 treatment, in spite of the fact that induced an increase of Rb phosphorylation, it did not induce any change of the levels neither cell cycle proteins or However, CDK inhibitors such as flavopiridol and roscovitine protected from the apoptosis induced by LY294002, our studies showed for the first time, that not only flavopiridol, but also other CDK inhibitors such as roscovitine could inhibit the GSK3β activity. Furthermore Rb can be phosphorylated by p38, which is a protein of MAPK pathway that is down‐regulated by AKT. Our results showed that LY294002 produced an increase of p38 activity, but not of JNK. Moreover, JNK3 Knockout cultures were not significantly protected from LY294002 treatment, this reinforces the idea that JNK is not the main target involved in this model. The increase of p38 activity was prevented with SB203580, a specific p38 inhibitor, and either with SP600125, a JNK inhibitor. Both drugs shown a significant protection from the apoptosis induced by LY294002 and prevented from c‐Jun phosphorylation, a transcription factor implied in apoptosis. The activation of c‐Jun triggered the expression of proapoptotic genes such as dp5 which is related to the intrinsic pathway, p38 inhibition prevented from the increase in dp5 expression. On the contrary, other proapoptotic proteins related to this pathway such as Bim was not regulated by c‐Jun since the inhibition of p38 pathway did not reduce its expression. In our study we can conclude that LY294002 induced apoptosis mediated by caspasas 6 and 9. Neither calpains nor cell cycle proteins were involved in this apoptotic model. The inhibition of AKT leaded to GSK3β and p38 activation. Moreover, p38 was able to phosphorylate c‐Jun that triggers the expression of proapoptotic genes implied in the apoptotic intrinsic pathway.

L'apoptosi o mort cel.lular programada és un procés central al desenvolupament, homeòstasi cel.lular, la resposta a l'estrés, l'envelliment i diferents malalties, als organismes eucariotes pluricel.lulars. Una de les vies que regula l'activació de l'apoptosi és la via intrinseca mitocondrial, a la que el citocrom c (Cit c), alliberat des de la mitocòndria en reposta a un estímul proapoptòtic, en presència de dATP indueix l'oligomerizació d'Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1) i posterior reclutament de la caspasa-9, conduint a la formació del complex macromolecular activador de l'apoptosi anomenat apoptosoma. Citocroms de diferents vertebrats són equivalents en quant a la seva capacitat d'induir apoptosi a sistemes in vitro, mentre que el de llevat (YCit c) no presenta aquesta activitat. En concret s'ha determinat a partir d'estudis amb mutants derivats de HHCit c (citocrom c de cor de cavall) i YCit c, que els residus de Lys 7, 25, 39 i 72, així com els residus 62-65 dels citocroms de mamífer participen a la interacció amb Apaf-1. En base a aquests antecedents, i dins de la línia de treball iniciada al nostre laboratori encaminada al descobriment de molècules d'interès terapèutic relacionades amb l'apoptosi, es va plantejar com objetiu d'aquesta tesi l'estudi de la interacció entre Cit c i Apaf-1, com un pas preliminar per a l'obtenció de compostos orgànics capaços de modular aquesta interacció. En base als antecedents citats, es va proposar la generació de mutants de YCit c que incorporessin modificacions a la seva regió N-terminal que aproximessin la seva seqüència a la de HHCit c, per dotar-los d'activitat apoptòtica, així com pèptids derivats dels mateixos que mantinguessin unit el grup prostètic hemo. Les mutacions plantejades comprenien la delecció de la cua de cinc residus de l'extrem N-terminal de la seqüència de YCit c (Delta), i la substitució dels residus Ala 7 i Pro 25 d'aquest, per dos residus de Lys (A7K, P25K). Addicionalment es va introduir una Met a la possició 27 (K27M), que permetria generar els hemopèptids derivats dels mutants anteriors per degradació química amb BrCN. Per a la realització dels estudis de funcionalitat d'aquests derivats de YCit c, que comprenien assaigs in vitro d'activació de la caspasa -9 i -3, així com estudis de polarització de la fluorescència, es requeria disposar de la proteïna Apaf-1 en quantitat suficient, pel que es plantejà l'obtenció de dues construccions derivades d'Apaf-1-XL que poguessin expresar-se a E.coli, corresponents als dominis N-terminals CARD- NOD, constitutivament actius, i al C-terminal WDR, responsable de la interacció amb Cit c. Així, es van generar i caracteritzar mitjançant diferents tècniques espectroscòpiques, els mutants derivats de YCit c, YCit c (Delta/A7K/K27M), YCit c (Delta/P25K/K27M) i YCit c (Delta/A7K/P25K/K27M), així com l'hemopèptid derivat d'aquest, HP 7K25K 1-27. Igualment es van obtenir construccions derivades d'Apaf-1-XL que comprenien els residus 1-570 i 1-572, corresponents als dominis N-terminals, així com les que comprenien els residus 570-1248 i 583-1248, corresponents al domini C-terminal. Els estudis d'activació de caspases en cap cas van posar de manifest una capacitat proapoptòtica dels mutants generats. El mateix resultat negatiu es va obtenir per a l'hemopèptid anterior i pèptids sintètics derivats de la seqüència de HHCit c, sintetitzats al laboratori del grup col.laborador del Dr. E. Pérez- Payá (Centro de investigación Príncipe Felipe, València). No obstant, els estudis de polarització de la fluorescència van posar de manifest la capacitat del mutant YCit c (Delta/A7K/P25K/K27M) d'interaccionar amb Apaf-1. El conjunt d'aquests resultats indicava que les mutacions introduïdes a la seqüència de YCit c eren suficients per induir en aquest la capacitat per interaccionar amb Apaf-1, però no suficients per induir la formació de l'apoptosoma actiu. Per a l'hemopèptid es va determinar una potencial capacitat inhibidora de la formació de l'apoptosoma, que quedava emmascarada per l'efecte oxidatiu del grup prostètic hemo. Aquests mateixos assaigs van permetre establir la funcionalitat per a totes les proteïnes recombinants derivades d'Apaf-1-XL. Amb motiu d'una estada al laboratori del Profesor G. Núñez (University of Michigan, Ann Arbor, EUA) es plantejà un objetiu addicional que va consistir en la determinació dels components del complex de reconeixement del component bacterià muramil dipèptid (MDP), responsable de l'activació de la resposta inflamatòria mediada per Nod2, proteïna de la família NOD, a la que pertany igualment Apaf-1. Així, assaigs d'immunoprecipitació amb derivats del MDP, van indicar una interacció no directa entre aquest i Nod2. Mitjançant cromatografia d'afinitat i posterior anàlisi per espectrometria de masses s'han determinat potencials components del complex de reconeixement del MDP. Addicionalment, estudis preliminars de localizació cel.lular del MDP ha indicat que aquest seria incorporat per les cèl.lules de macròfag per la via endocítica.

Los objetivos principales de esta Tesis doctoral fueron: 1) cuantificar los efectos agudos y crónicos de fármacos opiáceos (mi-, delta- y kappa-selectivos) así como los cambios inducidos durante los estados de abstinencia (procesos de tolerancia y dependencia) sobre la vía de señalización del receptor Fas (formas de expresión de Fas, proteína de acople FADD y caspasas efectoras) en cerebro de rata; 2) identificar el tipo de receptor opioide involucrado en la modulación del complejo de señalización Fas/FADD mediante la utilización de ratones deficientes en receptores opioides (mi-, delta- y kappa-KO), e investigar la posible existencia de un tono opioide endógeno regulando las proteínas de esta vía en el cerebro; 3) averiguar si la modulación del complejo Fas y/o FADD por fármacos opiáceos implica (como mecanismo molecular) la participación de MAPK ERK1/2, analizando la reversión de un efecto opioide tras inhibición selectiva de los enzimas MEK1/2, tanto "in vitro" (PD98059) en células SH-SY5Y, como "in vivo" (SL 327) en cerebro de rata; 4) cuantificar en cerebro humano "postmortem" el estatus de la vía Fas/FADD y caspasas efectoras, así como los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC/PKA/CREB) y de las MAPK (Ras/Raf/MEK/ERK) en la corteza prefrontal de adictos a opiáceos, como modelo experimental más directo al problema de la adicción en humanos.Las diversas proteínas de estudio se cuantificaron mediante técnicas inmunológicas cuantitativas (separación electroforética seguida de Western blot) empleando anticuerpos específicos. Los principales resultados y conclusiones mayores de este trabajo de Tesis doctoral son:1. La adicción a opiáceos en cerebro de rata se asocia con incrementos en la densidad del receptor apoptótico Fas y con decrementos de la proteína FADD, transductora de la señal de muerte, sin que además se alteren las caspasas efectoras 8 y 3, lo que sugiere que los procesos de adicción a estos fármacos no están asociados con la inducción de apoptosis cerebral mediados por esta vía.2. La modulación de Fas (receptor nativo) por opiáceos depende mayormente del receptor mi-opioide, y la regulación de sus formas agregadas (trímeros relevantes en el inicio de la señalización) así como la de FADD se asocia con el receptor delta-opioide, lo que demuestra una modulación diferencial de los componentes de esta vía por el sistema opioide que podría tener repercusiones terapéuticas.3. La modulación inhibitoria de FADD por agonistas delta-opiáceos es dependiente, a través de un mecanismo indirecto, de la activación de las quinasas MAPK ERK1/2, vía de señalización que a su vez se ha relacionado con la regulación de varios mecanismos anti-apoptóticos. 4. La adicción a opiáceos en cerebro humano se asocia con una disminución en la densidad de FADD en la corteza prefrontal (efectos a corto y largo plazo) sin que se alteren las diversas formas del receptor Fas y ciertas caspasas efectoras, lo que de nuevo demuestra una probable menor actividad de esta proteína acopladora de Fas en este modelo humano de adicción a opiáceos. 5. La adicción a opiáceos en cerebro humano (efectos a largo plazo) también se asocia con una aparente normalización de los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC I, PKA, CREB y pCREB) y con una marcada inhibición de la vía de las MAPK (formas fosforiladas de MEK y de ERK1/2), lo que sugiere la inducción de alteraciones de plasticidad neuronal en estos cerebros humanos.En su conjunto, los resultados de esta Tesis demuestran la clara participación del complejo Fas/FADD en la adicción a opiáceos, tanto en los procesos de tolerancia como de dependencia física, lo que añade un nuevo nivel de complejidad a la señalización de los receptores opioides, probablemente mediatizando efectos no-apoptóticos relacionados con fenómenos de plasticidad neuronal. / The aim of this PhD work was to investigate the interactions between opioids receptors and the signaling pathway of the Fas/FADD (Fas Associated-Death Domain) receptor, involved in the regulation of apoptosis and neuronal plasticity. The main results and conclusions are: 1) opiate addiction in rat brain is associated with a strong up-regulation of the pro-apoptotic Fas receptor and a moderate down-regulation of the anti-apoptotic Bcl-2 oncoprotein, without altering the content of caspases-8/3, suggesting that possible apoptotic signals engaged by Fas activation would be offset by decreased signal transduction through FADD and effector caspases-8/3; 2) the mi-opioid receptors appears to be associated with a tonic stimulation of monomeric Fas receptor, whereas the delta-opioid receptors tonically inhibits the basal density of trimeric Fas as well as that of FADD. This suggests posible homeostatic interactions between mi- and delta-opioid receptors in the control of Fas receptor machinery, being a major task of the delta-receptor to restrain the activation of Fas signalling; 3) the direct involvement of the two MAP kinases (sequential activation of MEK and ERK) in the in vivo regulation of FADD by the opiate; 4) opiate addiction in human brain is associated with a down-regulation of the inmunodensity of FADD in the prefrontal cortex (short-term and long-term abuse) without altering Fas receptor and effector caspases-8/3; 5) opiate addiction in human brain (long-term abuse) is associated with a normal regulation of the components of the cyclic AMP pathway components (AC I, PKA, CREB, pCREB) and with an important down-regulation of the MAPK (specially pMEK and pERK) pathway components in the prefrontal cortex, suggesting alterations in the neuronal plasticity in those human brains. In summary, the results of this PhD work demonstrated a clear participation of the complex Fas/FADD in opiate addiction, suggesting a new level of complexity in the signaling mediated through the activation of opioids receptors, probably mediating non-apoptotic effects related with neuronal plasticity.

El presente trabajo de tesis doctoral se ha centrado en la determinación de la función fisiológica de la proteína desacopladora mitocondrial UCP3 en relación con la apoptosis y las especies reactivas de oxígeno (ROS). UCP3 es un miembro de la familia de transportadores mitocondriales que se expresa preferencialmente en el músculo esquelético. UCP3 es una proteína homóloga a la termogenina o proteína desacopladota UCP1. Ésta se expresa exclusivamente en tejido adiposo marrón dónde desempeña una función esencial en la termogénesis adaptativa, desacoplando la respiración mitocondrial de la fosforilación oxidativa con la consiguiente generación de calor. Así, como homólogo de la termogenina UCP3 podría desarrollar una actividad desacoplante mitocondrial influenciando el metabolismo energético celular, sin embargo su función biológica exacta continúa siendo fruto de controversia. En un primer trabajo, demostramos como la expresión ectópica de UCP3 en células de riñón humanas (293 HEK) mediante un sistema de expresión inducible sensible a tetraciclina, es consistente con un papel desacoplante mitocondrial de la proteína en la mitocondria de estas células. Observamos que la expresión de UCP3 no induce apoptosis directamente pero incrementa la sensibilidad a un agente inductor de apoptosis dependiente de vías de activación mitocondriales como es la staurosporina. Además, la inducción de UCP3 amuenta la sensibilidad del MPTP (mitochondrial transition pore) al calcio, facilitando la apertura del poro lo que se considera un evento crucial en la apoptosis dependiente de regulación mitocondrial. Estos datos sugieren una función de UCP3 en la regulación de la actividad del MPTP y sugieren que la presencia de UCP3 en la mitocondria sensibiliza a las células a los estímulos pro-apoptóticos que dependen de vías mitocondriales. Tras la obtención de los mencionados resultados, procedimos a inducir la expresión ectópica de UCP3 in vivo utilizando vectores adenovíricos dirigidos al hígado de ratón. El hígado normal no expresa ninguna proteína desacoplante y constituye por tanto un entorno ideal para determinar la función de UCP3. Resultados preliminares sugieren que la expresión ectópica de UCP3 no altera significativamente a parámetros metabólicos como la producción de ROS, aunque hallamos una estimulación de la apertura del MPTP en respuesta al calcio. Estos resultados procedentes de los estudios in vivo corroboran nuestros resultados previos obtenidos en líneas celulares en cultivo.Se cree que las proteínas desacoplantes podrían controlar la producción de ROS gracias a su capacidad para promover un desacoplamiento suave en la membrana mitocondrial interna. Hemos estudiado la función de UCP3 en su entorno natural de expresión, la célula del músculo esquelético, concretamente en lo que hace referencia a la muerte celular programada o apoptosis y las especies reactivas de oxígeno. Se demuestra que la expresión e UCP3 en miotubos no disminuye la producción de ROS, sino que incluso se incrementa en respuesta a un agente inductor de ROS como es la staurosporina. Igualmente, encontramos una sobreestimulación de la producción de ROS en respuesta a elevadas concentraciones de ácidos grasos, una situación en la que se estimula la expresión y actividad de las proteínas desacoplantes. Las ceramidas son productos secundarios del acúmulo de ácidos grasos capaces de inhibir la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial. Los desacoplantes químicos pueden incrementar la producción de ROS en aquéllas situaciones en que la cadena respiratoria se encuentra inhibida. Pensamos que la sobre-inducción de ROS que observamos en presencia de UCP3 se deba a la acción conjunta de la proteína las ceramidas sobre la actividad respiratoria. Concluimos que UCP3 se comporta en los miotubos de forma compatible con una actividad desacoplante, promoviendo una sensibilización a la producción de ROS en respuesta a ciertos estímulos de estrés, como pueden ser un agente pro-apoptótico o elevadas concentraciones de ácidos grasos. Además, UCP3 promueve una sensibilización de la célula a la muerte programada inducida por estímulos dependientes de regulación mitocondrial. El análisis de la función de UCP3 en su entorno natural de expresión, el músculo esquelético, supuso además una profunda caracterización del comportamiento de la célula muscular ante los estímulos pro-apoptóticos. / My work of thesis has been focused on determining the role of mitochondrial uncoupling protein 3 (UCP3) in relation to apoptosis and reactive oxygen species (ROS). The mitochondrial uncoupling protein-3 is a member of the mitochondrial carrier protein family that is preferentially expressed in skeletal muscle. As a homologue of the thermogenic brown fat uncoupling protein-1, it possesses a mitochondrial uncoupling activity and thus can influence cell energy metabolism but its exact biological function remains unclear. We have previously proved that the induced expression of uncoupling protein-3 in the mitochondria of 293 cells using a tetracycline-inducible system was in agreement with its expected physiological behavior as an uncoupling protein (UCP). We observed that Uncoupling protein-3 expression did not cause apoptosis per se but increased the responsiveness of the cells to a mitochondrial apoptotic stimulus such as staurosporine, an apoptosis-inducer dependant on mitochondrial pathways. Moreover, the induction of uncoupling protein-3 increased the sensitivity of mitochondria to open the permeability transition pore (MPTP) in response to calcium, a well-known inducer of its opening which is a critical event in mitochondrial-driven apoptosis. This suggested for first time a role for UCP3 in cthe regulation of this channel activity. We could conclude that the presence of uncoupling protein-3 in mitochondria sensitizes cells to apoptotic stimuli involving mitochondrial pathways. Then, we induced in vivo ectopic expression of UCP3 in the liver of mice, using an adenoviral vector. Although preliminary, our results suggest that ectopic UCP3 expression is not significantly affecting to metabolic parameters or ROS production, but it is, as it happened in 293 cells, enhancing sensitivity of MPTP to its opening, corroborating our previous results. We are now characterizing the biochemical behaviour of UCP3 in the liver to finish a manuscript compelling all these results.Uncoupling proteins are thought to control ROS production due to their capacity to promote a mild uncoupling of the inner mitochondrial membrane. We have been studying UCP3 function in its natural environment of expression, the skeletal muscle cell. We have proved that UCP3 expression in myotubes does not decrease ROS production even in response to ROS-inducing agents such as staurosporine. In fact, it promotes enhanced ROS production in response to high fatty acid concentration. Ceramides are secondary products of fatty acid accumulation and can inhibit respiratory chain activity. Chemical uncouplers are known to increase ROS production in situations in which respiratory chain is inhibited. We are therefore currently exploring the possibility that ROS over-production could be due to the overlapping action of ceramides and UCP3.As a whole, we have demonstrated an involvement of UCP3 in apoptosis regulation and in the modulation of ROS production besides of performing a deep characterization of apoptosis responsiveness within skeletal muscle cell.

DE LA TESI:L´apoptosi és un dels principals tipus de mort cel.lular programada i es caracteritza per ser un procés actiu encaminat a produir la mort cel.lular de manera controlada. Aquest procés juga un paper important en el correcte desenvolupament del sistema nerviós central, ja que permet l'eliminació de les cèl.lules innecessàries. En canvi, l´activació anòmala d´aquest mecanisme en el cervell adult contribueix de manera significativa en el desencadenament de moltes malalties neurodegeneratives, com són la malaltia d´Alzheimer o la de Parkinson entre d´altres. Així doncs, la determinació i comprensió de les diferents rutes senyalitzadores pro-apoptòtiques involucrades en aquestes malalties permetrà identificar noves dianes terapèutiques.L´objectiu d´aquesta tesi doctoral ha estat estudiar el paper anti-apoptòtic en neurones granulars de cerebel (CGNs) dels inhibidors de dos proteïnes cinases: la Glycogen Sinthase Kinase-3beta (GSK-3beta) i la c-Jun NH2-terminal Kinase (JNK), i determinar per quines rutes senyalitzadores protegeixen a les neurones de la mort apoptòtica provocada per la deprivació de sèrum i potassi (DV S/K). El model escollit per realitzar aquests estudis ha estat la DV S/K en cultius primaris de CGNs, ja que permet reproduir in vitro la mort neuronal programada provocada per la deprivació de factors tròfics.En quant a la GSK-3beta s´ha demostrat que la seva inhibició protegeix de la mort induïda per la DV S/K i que aquesta protecció ve donada, com a mínim, per dos mecanismes no descrits prèviament. En primer lloc s´ha determinat que la GSK-3beta intervé en l'activació anòmala del cicle cel.lular, fet que en CGNs condueix a l'activació de l'apoptosi, i en segon lloc que la GSK-3beta intervé en l'alliberament desde els mitocondris de la proteína pro-apoptòtica AIF. En quant a la JNK també s'ha detectat que la seva inhibició protegeix d'aquest estímul apoptòtic i que una de les raons subjacents a aquest fet, és que la inhibició de la JNK manté activa la via de supervivència de l'AKT.La conclusió final d'aquesta tesi doctoral és que tant la GSK-3beta com la JNK tenen un paper clau en l'activació de l'apoptosi en neurones i que per aquest motiu podrien ser considerades potencials dianes farmacològiques per tractar malalties neurodegeneratives.

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Cancer is the second disease leading cause of death in industrialized countries. Although early detection and more efficient drugs are responsible of the reduction of mortality, several cancers still present difficult treatments and low survival rates. Conventional drugs only exhibit moderate therapeutic index between cancer and normal tissues but recent advances are focused to improve lesstoxic treatments. Hence, new drugs must target specific signaling pathways involved in cell growth and proliferation. Concerning this aim, two mechanism involved in cancer disease, named apoptosis (or programmed cell death) and pentose phosphate pathway, have been selected in this work to search new inhibitors to target crucial proteins of both cell routes.Overexpression of antiapoptotic genes has been correlated with tumor growth and resistance tochemotherapy, thus many efforts have been done to block the activity of XIAP and Survivin, central proteins acting in apoptosis and studied in the present work. Moreover, the two most active proteins detected in both the oxidative and nonoxidative branches of the pentose phosphate pathway, Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PDH) and Transketolase (TKT), have been also selected in this thesis.Molecular Modeling methods, covering topics in protein and peptide recognition, molecular dynamics, pharmacophore generation, database searching, docking and scoring in virtual screening and binding free energy prediction, have been applied with success to discover new active molecules inhibitors of XIAP, Survivin, G6PDH and TKT proteins. / TÍTULO: "Ruptura del reconocimiento proteína-proteína en rutas tumorales mediante modelizaciónmolecular".TEXTO:El cáncer es el segunda causa de muerte por enfermedad en los paises industrializados. A pesar de la existencia de métodos eficaces de detección precoz y tratamientos cada vez más efectivos responsables de la reducción de mortalidad, algunos tipos de tumores presentan todavía tratamientos difíciles y bajos índices de supervivencia. Los fármacos convencionales sólo exhiben un índice terapéutico moderado, entre células sanas y tumorales, por ello los avances recientes se centran en encontrar tratamientos menos tóxicos para esta enfermedad. Así pues, los fármacos del futuro deberán incidir en rutas biológicas específicas, involucrando el crecimiento celular y laproliferación descontrolada. Siguiendo este planteamiento, en este trabajo se han seleccionado dos mecanismos biológicos involucrados en el cáncer, llamados apoptosis (o muerte celular programada) y ruta de las pentosas fosfato, con el objetivo de encontrar nuevos inhibidores de las proteínas más sensibles de ambas rutas.La sobreexpresión de genes antiapoptóticos se ha correlacionado con el crecimiento tumoral y laresistencia a los tratamientos habituales. Así, se está trabajando en entender el funcionamiento de dos proteínas importantes de esta ruta, el XIAP y el Survivin, las cuales se han seleccionado en este trabajo, debido a que todavía no existen fármacos en el mercado que actúen sobre estas dos proteínas y debido a que su interés terapéutico se ha demostrado claramente.Por otro lado, en este trabajo también se han estudiado las dos proteínas más activas detectadas en la rama oxidativa y no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato, la Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa y la Transketolasa.El objetivo principal ha consistido en aplicar métodos de la Modelización Molecular, que cubrentópicos recientes, como el reconocimiento de péptidos y proteínas, la búsqueda en bases de datos, el anclaje y evaluación del cribado virtual de compuestos y la predicción de energías libres de unión, para encontrar nuevos inhibidores de las proteínas XIAP, Survivin, Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa y Transketolasa.

El producte de growth arrest-specific gene6 (GAS6) és un lligand per als receptors tirosina quinasa TYRO3, AXL i MERTK (TAM). Aquesta proteïna dependent de la vitamina K, està estructuralment relacionada amb la Proteïna S anticoagulant i ha estat implicada en diferents mecanismes de supervivència, proliferació i adhesió cel·lulars i la inhibició de l'apoptosi. El fet que el ratolí deficient en Gas6 estigués protegit en front d'episodis trombòtics demostrà la importancia del paper d'aquesta proteïna en el sistema cardiovascular. L'estructura genètica i proteica de GAS6 és altament homòloga amb la de la Proteïna S. La present tesi tenia com a objectiu determinar l'estructura d'exons i d'introns del gen GAS6 per tal d'analitzar posteriorment la presència de variants al gen que puguessin estar associades a malalties humanes.L'anàlisi bioinformàtic ens va permetre localitzar 15 exons de GAS6, determinar-ne les seqüències d'aquests i de les seves regions intròniques flanquejants en una regió que ocupa 43,5 Kb al braç llarg del cromosoma 13. Un cop obtinguda aquesta estructura es procedí a identificar la presència de variants al·lèliques mitjançant l'anàlisi amb SSCP de productes amplificats de PCR (de mostres de DNA d'un grup d'individus control) que contenien les seqüències exòniques amb les seves regions intròniques flanquejants. Aquestes anàlisis revelaren la presència de diferents variants al·lèliques que varen ser confirmades com a polimorfismes de cadena senzilla (SNP). Un primer estudi d'associació d'aquests SNP identificats mostrà que un d'aquests polimorfismes (c.834+7G>A a l'intró 8 de GAS6) presentava una diferència estadísticament significativa en la distribució al·lèlica i genotípica en el grup de pacients respecte a la població control en una població amb malaltia aterotrombòtica, sobretot en el subgrup de malaltia cerebrovascular. Posteriorment, es va realitzar la confirmació d'aquests resultats en una població amb malatia cerebrovascular molt més gran i independent de l'anterior utilitzant estudis de genotips i haplotips, i es confirmà l'associació del genotip c.834+7 AA amb la reducció del risc per a la malaltia cerebrovascular. L'anàlisi d'alguns polimorfismes coneguts dels gens PROZ i F5 i F7 de la coagulació (situats a la mateixa regió cromosòmica que GAS6) que han estat implicats en malaltia cerebrovasculat tampoc indiquen cap associació entre aquest i la malaltia ni estan en desequilibri de lligament amb cap dels polimorfismes identificats a GAS6.L'anàlisi d'haplotips indicà que aquesta associació era encara més forta quan es combinava amb altres SNP, en un haplotip específic (CACA), per a 4 polimorfismes de GAS6 (rs8191973, rs7331124, rs7323932 (c.834+7G>A), rs8191974). D'una banda, aquests resultats suggereixen un paper protector que disminueix en més de dues vegades el risc a patir un accident cerebrovascular d'origen ateroscleròtic o el que afecta a la microvasculatura de l'al·lel c.834+7A i més concretament de l'haplotip CACA de GAS6 D'altra banda, els estudis funcionals realitzats per a determinar el possible paper del polimorfisme de l'intró 8 de GAS6 no mostraren diferències en plaques aterosclerosades d'artèries coronàries respecte a artèries sense placa. Així, l'efecte observat a nivell poblacional d'aquest polimorfisme identificat podria indicar l'efecte no conegut fins ara d'aquest o d'un altre polimorfisme en desequilibri de lligament amb aquest que estaria afectant la via de GAS6 i els seus receptors tirosina quinasa. / The product of the growth arrest-specific gene 6 (GAS6), a ligand for the TYRO3,AXL, and MERTK tyrosine kinase receptors, is a vitamin K-dependent protein, structurally related to anticoagulant protein S. Gas6-deficient mice are protected against thrombosis, demonstrating the importance of this protein in the cardiovascular system.The present thesis was aimed at determining the human GAS6 intron-exon structure and analyzing the gene for the presence of allelic variants that could be associated with human diseases. Online analyses allowed us to localize 15 GAS6 exons and to determine the sequence of their intron-flanking regions, in a chromosome 13 region spanning 43.5 kb of DNA. SSCP analysis of PCR-amplified GAS6 exons with their intron-flanking regions from control DNA samples, revealed the presence of different variants, which were confirmed to be single nucleotide polymorphisms (SNPs). A preliminary analysis of these SNPs in a group of patients with atherothrombotic disease revealed statistically significant differences between controls and stroke patients in the allelic distributions of one of these variants (c.834+7G>A in intron 8). We confirmed these results in a larger and independent stroke population using genotype and haplotype studies: the GAS6 c.834+7AA genotype was found associated with decreased risk for stroke (OR:0.59; 95%CI:0.37-0.93). Furthermore, haplotype analysis revealed that association was even stronger (OR:0.48;95%CI:0.28-0.83, for ischemic stroke) when the c.834+7 A allele was present in a specific haplotype (CACA) of four GAS6 polymorphisms (rs8191973, rs7331124, rs7323932, rs8191974).These results suggest a protective role for stroke of this haplotype.