In order to achieve cure for HIV-1 infection in patients undergoing suppressive antiretroviral therapy, eradication of all latently infected reservoirs of the virus is required. The focus of HIV cure is predominantly centred on the elimination of latently infected memory T cells, while information on possible elimination of infected macrophages is lacking. Macrophages support continuous virus replication without succumbing to cytopathic effects of HIV-1. Recently, our laboratory has shown a protective role for cellular inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) 1/2 in macrophages against Vpr-induced apoptosis. Depletion of cIAP1/2 by Smac mimetics (SM) reverse the IAP-mediated protection and sensitize macrophages to Vpr-induced cell death. My research aims to understand the role IAPs play in apoptotic resistance of HIV-infected macrophages. I hypothesized that ablation of cIAP1/2 by SM may induce apoptosis in HIV-infected macrophages. My results show that SM does not induce cell death in uninfected or healthy macrophages, but induces cell death in chronically infected U1 cells, in vitro infected monocyte-derived macrophages, and ex vivo derived HIV-infected macrophages from HIV-infected individuals. SM induce cell death of infected myeloid cells through apoptosis and not through necroptosis. Moreover, SM-induced apoptosis is independent of TNFα and other endogenously secreted cytokines. In vitro infection of monocyte-derived macrophages leads to the downregulation of RIPK1, RIPK3, and TRAF-1. Interestingly, necrostatin-1-mediated RIPK1- inhibition does not affect viability of healthy macrophages, but in combination with IAP degradation by SM leads to significant induction of apoptosis. This suggests a key role for RIPK1 in SM-induced apoptosis of HIV-infected macrophages. Altogether, the results from this project suggest that modulation of the IAP-associated signalling pathways by SM may be a potential strategy for selective killing of HIV-infected macrophages.

En l'actualitat, la indústria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producció de compostos d'elevat interès terapèutic i també, com a model biològic per assajar l'activitat de nous fàrmacs. Moltes empreses fan ús d'aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic més apropiat per obtenir proteïnes complexes. Tot i així, pel que fa l'ús de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, ja que s'ha comprovat que una gran part de les cèl·lules presents en aquests cultius moren per apoptosi. La principal causa d'aquest tipus de mort és l'esgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i l'acumulació de metabòlits tòxics per a la cèl·lula. L'apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix dràsticament la viabilitat del cultiu i en conseqüència, la productivitat del bioreactor.En el present treball, s'han utilitzat les eines que proporciona la biologia molecular per tal de modificar les cèl·lules, fent-les més resistents al procés d'apoptosi. L'objectiu final és aconseguir cèl·lules que mantinguin la viabilitat durant més temps, tot i que en el medi de cultiu es donin senyals per iniciar l'apoptosi. D'aquesta manera es milloraria la productivitat i l'eficiència d'aquests processos. En aquesta tesi doctoral s'han proposat dues estratègies d'inhibició genètiques, una que consisteix en inhibir l'actuació de les Caspases, proteïnes claus en el procés d'apoptosi, i l'altra que es centra a nivell del mitocondri, punt on conflueixen els diferents senyals apoptòtics d'origen intracel·lular. Entre els diferents gens assajats, els resultats més positius s'han obtingut amb la proteïna BHRF-1. En canvi, l'expressió de la proteïna P35 no ha permès protegir les cèl·lules enfront l'apoptosi. Gràcies a l'expressió del gen bhrf-1 és possible retardar la mort per apoptosi dels cultius cel·lulars, augmentant així la productivitat del procés, i garantir la supervivència de les cèl·lules sotmeses durant 72 hores a condicions inductores de l'apoptosi, ja sigui per raons accidentals o per situacions de limitació de nutrients o acumulació de metabòlits tòxics.També s'ha observat que després d'un cert període de manteniment de la resembra, les cèl·lules transfectades perden la capacitat de protegir-se contra l'apoptosi, ja que l'expressió del gen antiapoptòtic s'acaba silenciant. Per aquest motiu, es necessari l'ús de vectors que expressin el gen d'interès al llarg del temps. Els resultats obtinguts han demostrat que els vectors bicistrònics són una bona eina per modificar genèticament les cèl·lules animals ja que per una banda, permetent una integració adequada del fragment de DNA clonat i per l'altra que les modificacions genètiques realitzades perdurin al llarg de temps sense la necessitat d'exercir una selecció constant amb antibiòtic, aspecte molt important sobretot quan s'opera en bioreactors durant períodes molt llarg de temps i es treballa amb volums propis d'un bioreactor. En els cultius en perfusió s'ha vist que l'expressió del gen antiapoptòtic bhrf-1 permet reduir considerablement el nombre de cèl·lules mortes en el cultiu, tot mantenint la densitat de cèl·lules viables. Aquest fet és molt important, ja que es pot allargar la durada del cultiu i en conseqüència, augmentar els nivells de producció del procés. També s'ha observat que aquesta disminució de cèl·lules mortes coincideix amb un alentiment del cicle cel·lular dels hibridomes, suggerint que probablement la proteïna BHRF-1 actua directament sobre el cicle cel·lular i no sobre la via mitocondrial, ja que semblaria que, en condicions anòmales (limitació de nutrients), afavoreix l'entrada de les cèl·lules a l'estat de quiescència (fase G0), la qual cosa impediria l'activació de l'apoptosi. / Nowadays, the pharmaceutical industry uses the in vitro animal cell culture technology for the production of biologicals of therapeutic interest and as a model to test the activity of new drugs. It constitutes the most appropriate system to obtain complex proteins with biological activity. Nevertheless, animal cell culture has certain limitations, such as the early termination of cultures when cells activate the apoptotic program. The depletion of essential nutrients and growing factors in the medium, or increased concentrations of toxic metabolites, are common the cause for cell death. Therefore, the activation of apoptosis in bioreactors seriously compromises the productivity of the bioreactor.In this work, hybridoma cells were genetically engineered in order to make them more resistant to apoptosis under cell culture conditions. The goal was to increase viability of cultured cells, even under adverse apoptosis-inducing conditions, in order to improve productivity of such processes. Two different strategies of genetic inhibition were adopted: inhibition of Caspase activity, and overexpression of antiapoptotic members of the Bcl-2 family.From all genes tested, the best results were obtained with the one that expresses the protein BHRF-1. Otherwise, expression of the baculoviral P35 did not protect cells against apoptosis. Cell cultures expressing gene bhrf-1 lengthened its survival period up to 72 hours when submitted to adverse conditions leading to apoptosis. In this way death due to apoptosis was retarded when nutrients were limited or toxic metabolites accumulated in the medium; or when eventual mechanical incidents occurred. Therefore, the efficiency of the process resulted improved. After several passages in culture, transfected cells lost their capacity to protect themselves from apoptosis, which was attributed to the silencing of antiapoptotic gene expression. For this reason, the hybridoma cells were genetically engineered with bicistronic vectors (containing an IRES element) encoding the gene of interest and a selection marker. This strategy permitted stable expression for large passage number and, moreover, long-term expression of the antiapoptotic genes even in absence of selective pressure. This is of especial importance when operating large bioreactors for long operational periods of time.In perfusion cultures, cultures of cells expressing the antiapoptotic gene bhrf-1 exhibited reduced the number of dead cells and maintained, at the same time, the number of viable cells. This is an important achievement because it allows to lengthen the duration of the cell culture and, consequently, to increase productivity. It was also observed that this decrease in the number of dead cells coincided with a slowing down of the cellular cycle of the hybridomas, suggesting that protein BHRF-1 has a direct effect on the cellular cycle rather than in the mitochondrial pathway. It seems that in anomalous conditions (nutrient restriction) this expression facilitates the switch of the cells to a quiescent stage (phase G0), preventing apoptosis.

Les neurones granulars de cerebel es generen a la capa granular externa i es diferencien i migren a traves de la capa molecular per donar lloc a la capa granular interna durant el desenvolupament postnatal del cerebel. Durant aquest procés de maduració,aquestes neurones necessiten l'aportació constant d'estímuls tròfics. Si no és el cas, moren per apoptosi. Aquesta situació que es dóna in vivo és mimetitzable en un cultiu de CGCs. Aquestes neurones són sensibles a les concentracions extracel·lulars de potassi i moren per apoptosi quan són exposades a 5mM de KCl (K5). Per contra, si s'addiciona al medi factors que s'han descrit que participen del seu manteniment in vivo com IGF-1, BDNF, PACAP, l'estimulació amb l'agonista glutamatèrgic NMDA o KCl 25 mM (K25) aquestes es desenvolupen i sobreviuen durant el cultiu. Les BMPs tenen un paper important en la regulació de la diferenciació de les CGCs i se'ls hi ha atribuït efectes anti-apoptòtics en diferents sistemes. En aquest treball ens varem plantejar l'estudi de les BMPs com a possibles factors tròfics per les CGCs. BMP-6 protegeix les CGCs en front de K5 en estadis madurs del cultiu, mentre que BMP-2 i BMP-7 no. Les BMPs senyalitzen a traves de tetràmers de receptors tipus I i II i l'activació d'aquests promou l'activació i translocació al nucli de les proteïnes Smads. La maquinària de resposta a les BMPs s'expressa en les CGCs in vitro. Tot i així, no detectarem diferències en l'estat d'activació de les Smads en les diferents condicions testades. La supervivència d'aquestes neurones s'ha relacionat principalment a l'activació de tres vies de cinases com són la PI3K-Akt, la via de MEK/ERK i la de JNK. Varem estudiar el grau d'activació d'aquestes en K5 i la possible modulació pel tractament amb BMP-6. Mentre que el tractament amb BMP-6 no produeix diferències en l'activació de les vies PI3K-Akt i JNK, sí que indueix una forta activació a temps curts de la via MEK/ERK quan es compara amb K5. Mitjançant l'ús d'inhibidors de la via hem observat com aquesta és la principal mediadora de l'efecte de BMP-6. En aprofundir en la senyalització que es desencadena per sota l'activació de MEK/ERK hem identificat a CREB com a factor de transcripció involucrat en l'efecte. La seva activació resulta en la regulació a l'alça dels nivells de la proteïna anti-apoptòtica Bcl-2 que resulta en la inhibició de l'activació de la caspasa-3 per K5 i la reducció dels nuclis apoptótics. Per altre banda, en la recerca del nexe d'unió entre l'activació del receptor i l'activació de la via MEK/ERK també hem descrit com BMP-6 és capaç d'activar a Rap-1 deixant la porta oberta a la participació d'aquesta proteïna G monomèrica en l'efecte de BMP-6. Així doncs, les nostres dades suggereixen un paper nou de BMP-6 com a factor tròfic en el desenvolupament de les CGCs i que realitzaria aquesta funció a través de l'activació de la via MEK/ERK/CREB. El tractament amb NMDA promou la supervivència de les CGCs en cultiu. Estudis previs en el nostre laboratori i en altres han relacionat l'activació de la via de PI3K-Akt i la inhibició de JNK amb l'efecte protector del NMDA. L'activació o inhibició de vies de cinases cursa en la modulació de l'activitat de factors de transcripció que resulta en canvis en el transcriptoma. Així, varem estudiar els canvis en l'expressió gènica induïts pel tractament amb NMDA.. Varem observar una inducció de gens corresponents a programes de desenvolupament neuronal, neurogènesi i anti-apoptosi. Mitjançant estudi comparatiu amb el treball de Zhang i cols. obtinguérem una llista de candidats a mediar l'efecte del NMDA: atf3, bdnf, cdp, Crem, Fos, Homer1, Nfil3, Pcsk1, Plagl1, Rem2, Snf1lk, vgf i NR4A1-3(Nur77, Nurr1 i NOR-1). Tot i que tots ells presentaven funcions relacionables amb supervivència cel·lular, ens varem centrar en l'estudi dels membres de la família de NR4a pel seu paper desconegut en el desenvolupament del cerebel. Encara que l'expressió dels missatgers de Nur77, Nurr1 i NOR-1 es correspon amb les dades del array, a nivell proteic només Nurr1 presenta una pujada en els seus nivells després del tractament amb NMDA. La reducció dels nivells de Nurr1 mitjançant shRNA resulta en una reducció de l'efecte de NMDA. Tanmateix, hem descrit que CREB és el responsable de la inducció de Nurr1 en resposta a NMDA i que la reducció en l'efecte del NMDA en presència del shRNA de Nurr1 ve acompanyat per una reducció en els nivells de BDNF. A més a més, Nurr1 i BDNF presenten un patró d'expressió correlatiu en el cerebel durant els dies postnatals que s'atribueixen a la migració de les CGCs des de la EGL a la IGL. Donant força a Nurr1 com a mediador de l'efecte supervivència de l'estimulació del NMDAR durant el desenvolupament del cerebel. / Cerebellar granule neurons (CGCs) are generated in the external granule layer (EGL) and they differentiate and migrate trough the molecular layer to form the internal granule layer (IGL) during the postnatal development of the cerebellum. During its maturation they need trophic support to survive. Otherwise, they die by apoptosis. That situation that occurs in vivo can be mimicked in a culture of CGCs. These neurons are sensitive to extracellular potassium concentrations and they die by apoptosis when they are exposed to low potassium concentrations (5 mM KCl, K5). In contrast, the presence in the media of molecules that have been described to participate in hte maintenance of these neurons in vivo like IGF-1, BDNF, PACAP, glutamatergic stimulation with the agonist NMDA or depolarizing concentrations of potassium promote the survival of CGCs during the days in vitro.BMPs have an important role in the regulation of CGCs differentiation and they have been described to promote survival against some pro-apoptotic paradigms. In these work we planned to study the eventual effect of BMPs on CGCs survival. BMP-6 protects from K5 induced apoptosis while BMP-2 and -7 do not. We analyzed the presence of the cannonical signaling machinery associated to BMPs in the CGCs in vitro and we observed that all the elements where expressed. However, they do not participate in BMP-6 effect as we do not observe an increase in the nuclear localization of smads in presence of BMP-6. The survival of CGCs have been closely related with the activation status of some signaling pathways like JNK, PI3K/Akt and MEK/ERK. In order to see if they where involved in BMP-6 effect we analyzed their activation. We didn't detect any difference in the JNK and PI3K/Akt pathways in presence or absence of BMP-6. By contrast MEK/ERK pathway was activated in BMP-6 treated cells. We Took in advance of inhibitors to determine the participation in BMP-6 effect and we observed that BMP-6 was mediate by MEK/ERK pathway. We went further in the study of the signaling involved in BMP-6 effect and we have described that CREB is downstream of MEK/ERK pathway activation and that its activation promotes an increase in Bcl-2 levels that results in the inhibition of caspase-3 induced activation of K5 and the reduction of apoptotic nuclei. Moreover, we show that Rap-1 can be a good candidate to be mediating MEK/ERK activation after BMP-6 treatment. Taking together, our data suggest that BMP-6 could be participating in CGCs maintenance during their development in vivo an that this function would be performed by the activation of MEK/ERK/CREB pathway.NMDA treatment promotes CGCs survival in culture. Previous studies in our laboratory have related the activation of PI3K/Akt and the inhibition of JNK with NMDA protective effect. The activation and inhibition of these pathways results in changes in the activation status of transcription factors that promote changes in the transcriptome. In order to analyze the expression changes after NMDA treatment we performed an array with the Genechip® Rat genome 230 Affymetrix platform. We found an enrichment of neuronal development, neurogenesis and anti-apoptotic programs. Moreover, we performed a comparative analysis with the work of Zhang and cols (Zhang et al., 2007) and we obtained a list o f candidates to mediate NMDA effect: atf3, bdnf, cdp, Crem, Fos, Homer1, Nfil3, Pcsk1, Plagl1, Rem2, Snf1lk, vgf i NR4A1-3(Nur77, Nurr1 i NOR-1). All of them are involved in cellular processes that could be related to CGCs survival. However, we focused our attention in Nr4a subfamily members as their role in cerebellum development haven't been explored. We detected the increase in the expression of Nur77, Nurr1 i NOR-1, although only Nurr1 protein levels were increased in presence of NMDA. Reduction of Nurr1 levels by shRNA revealed its participation in NMDA neuroprotection. Additionally, we described that Nurr1, regulated by CREB in NMDA treated cells, promotes an increase in BDNF levels to develop its function in NMDA effect. We also performed a translation to the in vivo situation and as a first approach we studied the expression of Nurr1 and BDNF in the cerebellum during the postnatal development. Both proteins present a similar kinetic and they are induced in the time that is believed to be when CGCs migrate from the EGL to the IGL. In conclusion, this is the first time that Nurr1 have been described as a mediator of NMDA neuroprotection and our results suggest that this situation could be also occurring in vivo.

La apoptosis es una forma de muerte controlada por unas proteasas llamadas caspasas. La activación de las caspasas lleva a la desintegración controlada de la célula y a su fagocitación por parte de macrófagos. La necrosis es una forma de muerte que no depende de caspasas, pero que sí que puede tener un control y ser homeostático. Buena parte de los tumores presentan la característica de tener un metabolismo glicolítico superior al de la mayoría de los tejidos. Además, esta gran dependencia en la glucosa hace a las células bastante sensibles tanto a su ausencia como a la inhibición del metabolismo glicolítico. Esta característica es usada tanto en diagnóstico como en tratamientos en pruebas: la 2-deoxiglucosa se está utilizando en ensayos clínicos. Otra característica de las células tumorales es la de ser resistentes a muchos inductores de muerte, tanto de apoptosis como de necrosis mediante la inducción de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 o la inhibición de las proapoptóticas BH3. Además, muchos tumores sólidos pueden sufrir ambientes con escasez de nutrientes. Se da la coincidencia de que muchos oncogenes están a su vez relacionados con el metabolismo. Todos estos datos hacen interesante el estudio del efecto de la privación de glucosa sobre varios tipos celulares. Por un lado, caracterizar los efectos de la privación de glucosa en células que tienen bloqueada la vía mitocondrial de la apoptosis al ser deficientes en las proteínas Bax y Bak (DKO). Por otro, estudiar los efectos de la privación de glucosa en células tumorales humanas. Dentro de esta caracterización, es importante averiguar si se mueren por apoptosis o necrosis. Qué elementos reguladores están implicados, protectores o sensibilizadores. Si es apoptosis, y la muerte depende de caspasas, averiguar qué caspasas son las iniciadoras y cómo se están activando. Y cuál es el papel del metabolismo en general y de la autofagia en particular en esta muerte. En esta tesis se muestra cómo la privación de glucosa induce actividad caspasa en células deficientes en Bax y Bak. Y que esta actividad caspasa es dependiente de la caspasa iniciadora 8, no sólo en fibroblastos DKO, sino también en células HeLa. Aquí enseñamos que la apoptosis inducida por la privación de glucosa en células DKO induce actividad caspasa, degradación del ADN, condensación atípica de la cromatina, externalización de la fosfatidilserina y demás rasgos típicos de apoptosis como el corte de sustratos específicos de caspasas. Todo esto, excepto la condensación de la cromatina es inhibido por inhibidores de caspasas. Nosotros hemos demostrado que la privación de glucosa induce apoptosis independientemente de la interacción de ligandos y receptores de muerte. Así mismo, hemos demostrado que la activación de caspasa-8 no se inhibe por FLIP, y probablemente FADD no es la molécula adaptadora o reclutadora de caspasa-8. Hemos intentado ver si otros mecanismos de activación de la caspasa-8 que han sido publicados en los últimos años podrían ser la causa. FLIP no está implicados en la muerte inducida por privación de glucosa. Un posible reclutamiento de la caspasa-8 al complejo formado por RIPK1 no es el responsable, ni tampoco la actividad kinasa de RIPK1 ya que la necrostatina no protege de la muerte. El estudio del papel de la autofagia da resultados contradictorios. Por un lado, la autofagia sería un proceso que sensibilizaría a las células a la privación de glucosa, ya que la 3-metil-adenina protege, y las células deficientes en Atg7 están también protegidas. Pero por otro lado, la autofagia no tendría un papel importante, porque la presencia de cloroquina no afecta a la privación de glucosa. La privación de glucosa induce una acumulación de p62, que no parece ser la causa de la activación de la caspasa-8 ya que su silenciamiento no protege. / Apoptosis induced by most stimuli proceeds through the mitochondrial pathway. One such stimulus is nutrient deprivation. In this study we studied death induced by glucose deprivation in cells deficient in Bax and Bak. These cells cannot undergo mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) during apoptosis, but they undergo necrosis when treated with MOMP-dependent apoptotic stimuli. We find in these cells that glucose deprivation, rather than inducing necrosis, triggered apoptosis. Cell death required caspase activation as inhibition of caspases with peptidic inhibitors prevented death. Glucose deprivation-induced death displayed many hallmarks of apoptosis, such as caspase cleavage and activity, phosphatidyl-serine exposure and cleavage of caspase substrates. Neither overexpression of Bcl-xL nor knockdown of caspase-9 prevented death. However, transient or stable knockdown of caspase-8 or overexpression of CrmA inhibited apoptosis. Cell death was not inhibited by preventing death receptor-ligand interactions, by overexpression of c-FLIP or by knockdown of RIPK1. Glucose deprivation induced apoptosis in the human tumor cell line HeLa, which was prevented by knockdown of caspase-8. Thus, we have found that glucose deprivation can induce a death receptor-independent, caspase-8-driven apoptosis, which is engaged to kill cells that cannot undergo MOMP.

Per a que el desenvolupament i la maduració testicular tinguin lloc d'una manera correcta, es fa necessari que existeixi un equilibri entre els fenomens de proliferació, diferenciació i mort cel.lular. Tot i que desde fa uns anys es coneix la importància de l'apoptosi en l'eliminació de les cèl.lules germinals anòmales durant l'espermatogènesi dels mamifers, incloent l'home, els mecanismes i gens que la regulen han estat poc estudiats. El desenvolupament d'animals transgènics ha permès conèixer la participació d'alguns gens en la meiosi com són Bax, PMS2, CREM, Mhl1, ATM i HSP70-2. El fenotip comú que presenten aquests animals consisteix en aturada espermatogènica durant la primera divisió meiòtica, inducció d'apoptosi en cèl.lules pre-meiòtiques o meiòtiques i aparició de cèl.lules germinals multinucleades, donant lloc a una disminució de la fertilitat. Amb la finalitat d'identificar gens reguladors de l'apoptosi durant l'espermatogènesi en la rata així com l'estudi de la relevància del mecanisme d'apoptosi i de l'expressió dels gens que la regulen en els problemes de fertilitat en els humans, es van posar a punt dos models d'inducció d'apoptosi en les cèl.lules germinals que la actuen mitjançant mecanismes diferents. Un model de deprivació hormonal, mitjançant l'administració de sulfonat d'etil dimetà (EDS), un tòxic de les cèl.lules de Leydig, que provoca la mort d'aquestes cèl.lules, la qual cosa condueix a la desaparició dels andrògens en el testicle, donant lloc a la mort per apoptosi de les cèl.lules germinals. Un model de toxicitat, mitjançant l'administració d'àcid metoxiacètic (MAA), un tòxic dels espermatocits primaris en fase de paquitè, que provoca la seva mort per apoptosi. Dels resultats obtinguts en el present estudi es desprén que, els membres de la familia de Bcl-2 (Bax i Bcl-2) i la Caspasa-3 participen activament en l'apoptosi induïda en els dos models, co-existint en el mateix estadi tubular i presentant un curs temporal similar. El tractament amb MAA indueix canvis en l'expressió del mRNA i les proteïnes AR, ABP i ERb, que es manifesten en forma de diferències en la distribució en funció de l'estadi del cicle cel.lular en el cas de les dues primeres, i en un notable augment d'expressió a nivell de les cèl.lules germinals en el cas de la tercera. Finalment, s'han aïllat dos nous gens que participen en l'apoptosi induïda a les cèl.lules germinals, Rdes i HARP. Rdes és un homòleg d'un grup de desaturases involucrades en processos meiòtics durant l'espermatogènesi, i HARP és un nou membre de la familia de factors de creixement HDGF, alguns dels quals han estat igualment involucrats en processos meiòtics durant l'espermatogènesi. / To reach a correct testicular development and maduration, it is necessary a balance between proliferation, differentiation and cell death. Since severals years ago it is known, that apoptosis is important to eliminate damaged cells during mammal spermatogenesis, including humans. However, the mechanisms and genes that regulate apoptosis during spermatogenesis are poor understood. Transgenic animals have proven to be useful tool for studying meiotic regulation in mammals. Among genes whose targeted disruption causes meiotic arrest in transgenic animals are Bax, PMS2, CREM, Mhl1, ATM and HSP70-2. Most of these animals show a common phenotype that includes, meiotic arrest, apoptotic induction in pre-meiotic or meiotic cells and multinucleated cells. In order to identify genes regulating apoptosis during spermatogenesis in the rat, as well as study of the apoptotic mechanisms involved, we used two different models of induction of apoptosis in rat germ cells, each model acting by different ways. One model of hormonal deprivation, using ethane dimethane sulphonate (EDS) as a toxicant, which induces death of Leydig cells and androgen withdrawal, that leads to apoptotic germ cell. One model of toxicity, using methoxyacetic acid (MAA) as a toxicant, which induces death of pachytene spermatocytes by apoptosis. The results obtained in this study confirm the active participation of the Bcl-2 family members (Bax and Bcl-2) and Caspasse-3 in the apoptosis induced in both models, co-existing in the same stage of the seminiferous tubule and presenting a similar time course. MAA treatment induces changes in the expression of AR and ABP mRNAs and proteins, showed by the differences in the seminiferous tubule stage distribution. MAA treatment also induces an elevation in the mRNA and protein levels of ERb in germ cells. Finally, we have isolated two new genes which participate in the germ cell induced apoptosis, Rdes and HARP. Rdes is a homologous of a desaturases group involved in meiotic processes during spermatogenesis, and HARP is a new member of the HDGF family, some of those have been involved in meiotic processes during spermatogenesis.

Els mecanismes moleculars i cel·lulars responsables del fenotip metastàtic en el càncer de mama són poc coneguts. Tanmateix, l'habilitat de les cèl·lules tumorals per resistir els senyals de mort podria contribuir a crear les condicions favorables per al desenvolupament de les metàstasis. Bcl-2 i Bcl-xL són proteïnes de la família de Bcl-2 capaces d'inhibir l'apoptosi. L'objectiu d'aquest estudi fou obtenir un model experimental de carcinoma de mama ortotòpic amb el qual estudiar la contribució que la sobreexpressió de Bcl-2 i Bcl-xL, junt amb la inhibició de l'apoptosi que indueixen, pot tenir en diferents etapes de la progressió metastàtica del càncer de mama humà. Amb aquest objectiu es van transfectar amb l'ADN complementari del bcl-2 i bcl-xL línies cel·lulars derivades d'adenocarcinoma de mama humana amb diferent capacitat tumorígena, metastàtica i hormonodependent: MCF-7, MDA-MB-468 i MDA-MB-435P. Els nostres resultats mostren que Bcl-2 i Bcl-xL confereixen resistència a l'apoptosi induïda per factors de creixement (TGF-alfa i TNF-beta) i agents quimioterapèutics (paclitaxel i tamoxifen) en funció de la dotació oncogènica de les cèl·lules. La sobreexpressió de les proteïnes antiapoptòtiques Bcl-2 i Bcl-xL afavoreix l'activitat metastàtica de les cèl·lules 435 en diferents etapes del procés: disminució de l'adhesió cel·lular a proteïnes de la matriu extracel·lular (laminina, fibronectina i col·lagen IV), inhibició de la mort cel·lular per desadhesió de la matriu extracel·lular o anoikis i avantatge per sobreviure en el torrent sanguini i/o en l'òrgan diana facilitant el creixement metastàtic. La inhibició de l'apoptosi i de l'anoikis induïdes per la sobreexpressió de Bcl-2 i Bcl-xL requereix alhora altres alteracions genètiques necessàries perquè les cèl·lules de càncer de mama esdevinguin metastàtiques. Així, Bcl-2 i Bcl-xL no indueixen el fenotip metastàtic dels tumors obtinguts amb les cèl·lules no metastàtiques 468. Les cèl·lules derivades dels tumors organotòpics van ser exposades repetidament al microambient de la glàndula mamària per analitzar si la perllongada supervivència induïda per la sobreexpressió de Bcl-2 o Bcl-xL afavoria la selecció d'un fenotip metastàtic més agressiu en els tumors 435 o si induïa el fenotip metastàtic en els tumors 468 no metastàtics. La sobreexpressió de Bcl-xL en cèl·lules 435 afavoreix la ubiqüitat de les metàstasis, induint metàstasis ganglionars i pulmonars. Però, la perllongada supervivència induïda per Bcl-2 no indueix l'aparició d'altres localitzacions metastàtiques. Altrament, Bcl-2 no és capaç d'induir el fenotip metastàtic a les cèl·lules 468 després dels successius implants in vivo/in vitro. Les cèl·lules tumorals no metastàtiques 468 no posseeixen tots els canvis genètics necessaris o propietats cel·lulars requerides per a la metàstasi, i la perllongació de l'expressió de Bcl-2 no és suficient per induir-los. De fet, l'augment de l'activitat metastàtica pulmonar i ganglionar induïda per la sobreexpressió de Bcl-xL es neutralitza en els tumors induïts amb cèl·lules 435/Bcl-xL transfectades amb la construcció antisentit de bcl-xL, cosa que reafirma el paper decisiu d'aquest gen en l'evolució metastàtica dels tumors. D'altra banda, la inhibició de l'apoptosi induïda per la sobreexpressió de Bcl-2 o Bcl-xL en els tumors afavoreix la selecció de cèl·lules 435 amb major capacitat tumorígena. En contraposició, Bcl-2 i Bcl-xL contribueixen a disminuir la tumorigènesi de les cèl·lules no metastàtiques 468 amb les successives fases de selecció in vivo/in vitro, comprovant-se in vitro menor proliferació. Així, la disregulació de les proteïnes antiapoptòtiques Bcl-2 i Bcl-xL afavoreix la selecció de cèl·lules de càncer de mama amb un fenotip més agressiu. I, consegüentment, la capacitat per modular la funció i/o expressió de Bcl-2 o Bcl-xL en tumors de mama amb sobreexpressió d'aquestes proteïnes pot representar un esdeveniment crític per induir la reversió del fenotip metastàtic i regular la sensibilitat de les cèl·lules tumorals a drogues terapèutiques, millorant la resposta als mètodes tradicionals de tractament del càncer.

La Tesi Doctoral porta per títol "CONTROL DE PROTEÏNES REGULADORES DE L'APOPTOSI EN CÈL·LULES LEUCÈMIQUES", i ha estat realitzada a la Unitat de Bioquímica del Departament de Ciències Fisiològiques II de la Universitat de Barcelona. Hem estudiat el control de la regulació de diferents proteïnes encarregades de regular el procés d'apoptosi. S'ha estudiat la regulació de dos gens de la família de Bcl-2, un d'antiapoptòtic com mcl-1, i un de proapoptòtic, com bim.S'ha estudiat la regulació a nivell transcripcional i a nivell traduccional d'mcl-1 a la línia limfocitaria Jurkat, derivada d'una leucèmia aguda de cèl·lules T, durant l'apoptosi induïda per les drogues estaurosporina i aspirina. Ambdues drogues redueixen els nivells de la proteïna Mcl-1, tant per vies dependents com per vies independents de l'activació de caspases, ja que l'inhibidor general de caspases Z-VAD.fmk només protegeix parcialment el descens de la proteïna induït per les dues drogues d'estudi. El tractament amb estaurosporina també redueix els nivells de missatger d'mcl-1, de manera paral·lela a la reducció dels nivells de proteïna, i dependent de l'activació de les caspases, suggerint que aquesta droga inhibeix la transcripció del gen, a més de tenir altres efectes a nivell post-transcripcional caspasa-independents. El tractament amb aspirina en canvi no te cap efecte a nivell de regulació transcripcional, però sembla afectar la taxa de síntesi proteica de la cèl·lula. Hem determinat que aquesta droga afectaria la síntesi proteica de la cèl·lula per vies dependents i independents de l'activació de les caspases, on sembla tenir importància la fosforilació del factor eIF2-alfa, determinant que es dóna un pic transitori de fosforilació d'aquests factor al poc d'iniciar-se el tractament. També hem determinat que durant l'apoptosi induïda per aspirina es produeix una aturada de la síntesi proteica que afectaria de forma general a tots els gens cel·lulars amb una traducció CAP-dependent, mentre que alguns gens regulats a nivell traduccional per elements IRES, com XIAP, podrien escapar d'aquesta inhibició. Els resultats obtinguts amb els tractaments amb ciclohexinida, que redueix els nivells de la proteïna Mcl-1 sense afectar la viabilitat de les cèl·lules, ens permeten afirmar que la caiguda d'Mcl-1 pot ser necessària, però no suficient per induir l'apoptosi a les cèl·lules Jurkat. Aquest estudi ha estat publicat amb el títol: "Transcriptional and translational control of Mcl-1 during apoptosis. Iglesias-Serret D, Pique M, Gil J, Pons G, Lopez JM. Arch Biochem Biophys. 2003 Sep 15;417(2):141-52".També hem estudiat les insercions descrites al promotor d'mcl-1 a les cèl·lules B de pacients amb leucèmia limfàtica crònica de cèl·lules B (LLC-B). S'ha descrit que aquestes insercions són exclusives de pacients amb LLC-B (es troben en un 30%), que indueixen a augments de missatger i proteïna, correlacionant amb un mal pronòstic, una progressió més ràpida de la malaltia i una supervivència més baixa dels malalts. Els resultats obtinguts en aquests estudi demostren que la presència de les insercions no es exclusiva ni de les cèl·lules B ni dels malalts de LLC-B, tractant-se d'un polimorfisme present a la població general. Aquests resultats han estat acceptats per a ser publicats a la revista "Journal of the Nacional Cancer Institute".També hem estudiat la regulació del gen proapoptòtic bim de la família de Bcl-2, durant l'apoptosi induïda per diferents drogues en les cèl·lules de LLC-B i durant la supervivència induïda per diferents factors. Hem estudiat les isoformes majoritàries d'aquest gen i la regulació d'aquestes a nivell transcripcional i traduccional, així com les vies implicades en la seva fosforilació, important pel control dels seus nivells. Una part de la Tesi també s'ha dedicat a estudiar la regió 5'-no traduida (5'-UTR) i el promotor del gen antiapoptòtic XIAP, de la família de les IAPs, on hem intentat mapar l'inici de transcripció del gen i caracteritzar la regió promotora. Aquests estudis no han tingut un resultat satisfactori, i els resultats no són concloents. / The name of the thesis is "Control of apoptotic regulatory proteins in leukaemic cells". In this study we analyzed the regulation of two Bcl-2 family genes, an antiapoptotic member, mcl-1, an proapoptotic member, bim.We have studied the transcriptional and translational regulation of the mcl-1 gene during apoptosis induced by staurosporine and aspirin in Jurkat T cells. Both drugs reduced the levels of Mcl-1 protein in Jurkat cells. The caspase inhibitor Z-VAD.fmk and the proteasome inhibitor MG132 reduced Mcl-1 decay, indicating that both caspase and proteasome-dependent pathways are involved in the regulation of Mcl-1. Treatment with cycloheximide, at doses that inhibit protein synthesis without affecting cell viability, also induced Mcl-1 protein decay, suggesting that the Mcl-1 disappearance might be necessary but not sufficient for the induction of apoptosis by staurosporine and aspirin. Different patterns of transcriptional and translational control during apoptosis emerge depending on the stimulus although translational shutdown seems to be a common point during apoptosis. We analyzed the short sequence insertions in the Mcl-1 promoter of B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) samples and confirmed their presence in samples from patients of our hospital. Surprisingly, when we analyzed genomic DNA from normal lymphocytes (10 control subjects) and from mouth epithelial cells (10 additional healthy individuals) we also found the presence of the same insertions. Moreover, different allelic combinations for this polymorphism were present in all kind of samples. As the frequency of the 3 alleles was almost equal in all B-CLL and normal cells we concluded that these Mcl-1 insertions represent hereditary polymorphisms that likely do not predispose to chronic lymphocytic leukaemia and their significance in the pathogenesis of B-CLL should be re-evaluated. We investigated the effect of several drugs used in the therapy of B-CLL and different survival factors on BIM isoforms levels, and the signal transduction pathways involved in the control of BIM. Only the glucocorticoid dexametasone, a potent proapoptotic drug for B-CLL cells, induced an increase of BIM levels. The survival factors TPA and SDF-1 induced the phosphorilation of the two major isoforms of BIM, and the subsequent degradation of BIMEL isoform by the proteasome pathway, suggesting that this could be one of the survival mechanisms induced by these factors in B-CLL cells. We also studied the 5'-UTR of the antiapoptotic gene XIAP, but the results have not been conclusive.

La apoptosis es un mecanismo fisiológico que contribuye a regular el número de células de un organismo de tal forma que aquéllas que realizan funciones transitorias, que están lesionadas, o en exceso, serán eliminadas. Éste es un proceso estrictamente regulado durante el desarrollo embrionario e íntimamente ligado con el inicio o progresión de determinadas patologías. Así pues, el exceso de apoptosis contribuye al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas mientras que su defecto sería el origen de neoplasias. El principal regulador del proceso apoptótico es la activación de las caspasas, cisteína-proteasas con especificidad para residuos de aspartato. Los principales mecanismos que activan las caspasas son la salida de citocromo C de la mitocondria por una alteración de la función mitocondrial, y la activación de proteínas de membrana denominadas receptores de muerte (DRs, Death Receptors). Estos últimos han sido ampliamente caracterizados en el sistema inmune, mientras que en tejidos como el sistema nervioso sus funciones están en las fases iniciales de caracterización.El objetivo del presente trabajo es contribuir a esclarecer los mecanismos moleculares que regulan la actividad de estos receptores en el sistema nervioso, a través de la caracterización funcional de dos nuevas proteínas, FAIM y Lifeguard, propuestas inicialmente como antagonistas del receptor de muerte CD95/Fas/APO-1. Para ello se han usado las líneas celulares PC12 y SH-SY5Y, ampliamente utilizadas en modelos de diferenciación y muerte celular, junto con cultivos primarios de neuronas corticales y neuronas granulares de cerebelo.En la primera parte de este trabajo se describe la clonación del ortólogo de ratón de Lifeguard, y su caracterización como antagonista funcional de CD95 en el sistema nervioso. Hemos demostrado que su sobreexpresión es capaz de bloquear la muerte inducida por CD95 en el modelo del neuroblastoma humano SH-SY5Y así como en neuronas corticales murinas. También hemos comprobado que la disminución de sus niveles endógenos sensibiliza a las neuronas granulares y las corticales de ratón. Además, se ha constatado que su mecanismo molecular de acción depende de su localización exclusiva en microdominios de membrana llamados Lipid Rafts, donde puede interaccionar con CD95 e inhibir la activación de caspasas iniciadoras.De los resultados obtenidos en la segunda parte del trabajo se deduce que los niveles de la isoforma larga del antagonista FAIM, FAIML, específica del sistema nervioso, aumentan durante el desarrollo embrionario. Su máxima expresión es en los períodos del desarrollo en los que se modelan y ajustan las estructuras neurales que darán lugar al cerebro adulto. Funcionalmente, hemos demostrado que no participa en procesos de neuritogénesis (a diferencia de la isoforma corta de FAIM, FAIMS) y que no bloquea la muerte apoptótica inducida a través de estímulos mitocondriales. Sin embargo, FAIML es capaz de antagonizar la apoptosis inducida a través de los DRs CD95 y TNFR1. Los ensayos >con RNA de interferencia nos han permitido elucidar que FAIML es, al menos en parte, responsable del bloqueo de la actividad de caspasas iniciadoras activadas por DRs.Por tanto, este trabajo aporta claves sobre las bases moleculares que regulan la actividad de los DRs en el sistema nervioso y que pueden constituir una base para el desarrollo de estrategias terapéuticas en neuropatologías en las que los DRs participan de forma relevante. / Apoptosis is a physiological process by which the number of cells in metazoan organisms is regulated. Thus, cells with transient function, supranumerary cells or damaged ones are selectively eliminated by this process. Apoptosis is strictly regulated and recently it has been suggested that it could be involved in the pathogenesis of some nervous system diseases. In that sense, an excess of cell death could contribute to neurodegenerative disorders and, on the other hand, a defect could be one of the reasons for neoplasia development. The main regulator of apoptosis is the activation of caspases. These are cysteine-proteases which have cleavage specificity for aspartic residues. Caspases are activated by two main mechanisms: (1) release of citocrome C from altered mitochondria to the cytoplasm and (2) activation of membrane receptors called death receptors (DRs). These proteins have been widely characterized in the immune system, whereas in the nervous system their functions are at the initial stages of characterization.The present project is focussed on the characterization of two novel antagonists of the death receptor CD95/Fas/APO-1 which are specifically expressed in the nervous system, Lifeguard and FAIM. For this purpose PC12 and SH-SY5Y cell lines, widely used in models of differentiation and cell death, have been used along with primary cultures of cortical neurons and cerebellar granule neurons.Results obtained in the first part of this study allowed us to clone mouse Lifeguard, and describe its function as an antagonist of CD95 in the nervous system. We have demonstrated that its overexpression is able to block CD95 induced cell death in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, and in mouse embryonic cortical neurons. Furthermore, reduction of Lifeguard endogenous levels sensitizes both, mouse granular and cortical neurons to CD95 induced apoptosis. In addition, it has been stated that the molecular mechanism of action of Lifeguard depends on its exclusive location in plasma membrane microdomains called Lipid Rafts, where it can interact with CD95 and inhibit the activation of initiator caspases.In the second part of this study, our results demonstrate that the expression of the long form of the CD95 antagonist FAIM, FAIML, specific of the nervous system, increases during the embryonic development. It reaches maximum levels in the periods of the development in which the neural structures are being defined, thus creating adult brain structures.Functionally, we have demonstrated that FAIML, in contrast to the short form of FAIM (FAIMS), does not participate in neurotrophic factor induced neurite outgrowth and it is not able to block apoptotic induced cell death through mitochondrial stimuli. Nevertheless, FAIML is able to antagonize the apoptosis induced through DRs CD95 and TNFR1. FAIML RNA interference efficiently reduced its endogenous levels and allowed us to conclude that FAIML is one of the molecules responsible for maintaining initiator caspases inactive upon receptor engagement.Therefore, this work will contribute to the understanding of the molecular basis for DRs activity regulation in the nervous system, and it could constitute a starting point for the development of new therapeutic strategies for DRs associated neuropathologies.

La isquèmia/reperfusió (IR) intestinal és una patologia clínica amb una elevada mortalitat del 70% que no ha disminuït durant dècades. La IR intestinal succeeix quan hi ha una disminució o una reducció total del flux sanguini cap a l’intestí, seguida pel restabliment d’aquest flux o reperfusió. Aquesta situació pot succeir per diferents causes, entre elles per trombosi, aneurismes o diverses intervencions quirúrgiques, essent la més característica el transplantament intestinal. El procés d’isquèmia/reperfusió provoca alteracions en el metabolisme cel•lular, entre elles el pas de metabolisme aeròbic a anaeròbic i la conseqüent formació de radicals lliures de l’oxigen (ROS). A més, en els neutròfils, s’ha descrit que una IR provoca un retard en la seva mort cel•lular programada o apoptosi, tot i que en el cas concret de la IR intestinal aquesta situació no ha estat descrita. Una correcta apoptosi dels neutròfisl permet que el seu contingut tòxic intracel•lular no provoqui danys en els teixits circumdants, doncs aquestes restes són fagocitades pels macròfags, comportant una millora de la inflamació. Un retard en l’apoptosi condueix a un augment dels ROS y a la incorrecta resolució de la inflamació degut a l’alteració dels mecanismes fagocítics. L’objectiu del nostre estudi és aconseguir una millora o reducció de la inflamació associada a la IR intestinal mitjançant la modulació del retard de l’apoptosi del neutròfil. Per a aquest fi s’han realitzat experiments en models animals de rata (soques Sprague Dowley i Brown Norway) a les que se’ls hi ha realitzat una IR intestinal mitjançant el clampatge de l’artèria mesentèrica. Per a la modulació de l’apoptosi dels neutròfils es va administrar intravenosament Escherichia coli morta i opsonitzada. El mecanisme apoptòtic dels neutròfils s’ha estudiat amb un model anòxic in vitro amb la línia cel•lular MPRO clon 2.1. Aquesta línia cel•lular és capaç de diferenciar-se a neutròfils madurs en presència de factor de creixement (GM-CSF) i àcid retinòic. Els resultats obtinguts en aquest treball demostren que l’apoptosi dels neutròfils es troba retardada després d’una IR intestinal, i que la modulació d’aquesta apoptosi és capaç de millorar el dany associat. La disminució de l’oxigen provoca l’estabilització del Factor Induïble per la Hipòxia (HIF) en els neutròfils, el que porta a una disminució de la via de senyalització WNT i del seu gen diana 24p3, provocant el retard en l’apoptosi d’aquestes cèl•lules. / Intestinal ischemia/reperfusion (IR) injury is a clinical pathology with a high mortality rate that has not diminished through decades. Intestinal IR occurs when there is a blood flow diminution or total reduction through the intestine, followed by the restoration of this flow or reperfusion. This situation can happen because of many causes, between them, thrombosis, aneurisms or different surgical interventions, being the most characteristic of them intestinal transplantation. Ischemia/reperfusion process provokes alterations in the cellular metabolism, between them, the transition from aerobic metabolism to anaerobic and the consequent formation of Reactive Oxygen Species (ROS). Furthermore, in neutrophils, it has been described that IR provokes a delay in their apoptosis, although it has not been described in the intestine yet. A delay in neutrophil apoptosis drives to an increase of ROS and the incorrect resolution of the inflammation because the phagocytic mechanisms are altered. On the contrary, correct neutrophil apoptosis avoids the possibility of damaging the surrounding tissue because their citotoxic content is phagocytosed by macrophages, driving to an amelioration of the inflammation The aim of our work is to obtain an improvement or a reduction of the intestinal IR associated inflammation through the modulation of the neutrophil apoptosis delay. For this end, experiments were conducted in rats (Sprague Dowley and Brown Norway), and the intestinal IR was provoked through the obstruction of the mesenteric artery with ac clamp. For the neutrophil apoptosis modulation, death and opsonized Escherichia coli were intravenously administered. Neutrophil apoptotic mechanism was studied in an in vitro anoxic model (MPRO clon 2.1 cellular line). This cellular line is able to differentiate into mature neutrophils in presence of growth factor (GM-CSF) and retinoic acid. The results obtained in this work demonstrate that neutrophil apoptosis is delayed after an intestinal IR, and that the modulation of this apoptosis is able to ameliorate the associated injury. The decrease of oxygen provokes the stabilization of the Hypoxia Inducible Factor (HIF) in neutrophils, what drives to a decrease in the WNT signaling pathway and its target gene 24p3, provoking a delay in the apoptosis of these cells.

Es planteja la següent HIPÒTESI DE TREBALL que: 1. En els pacients amb MCP alcohòlica amb major grau de lesió miocàrdica, existeix un cert grau de regeneració miocàrdica que actua com a mecanisme compensador. 2. La miostatina té un efecte regulador sobre l’apoptosi i la regeneració en la MCP alcohòlica. 3. L’acció de la miostatina es pot veure influenciada de forma directa per l’efecte tòxic de l’alcohol, que n’incrementa la seva activitat. 4. L’alcohol té un efecte propi directe sobre els fenòmens d’apoptosi i regeneració i sobre l’expressió de miostatina al miocardi: actua com a potenciador de l’apoptosi, inhibidor de la regeneració i, a més, regula l’expressió de la miostatina que influeix sobre l’apoptosi i la regeneració. Aquest estudi es du a terme en mostres d’explants miocàrdics humans obtinguts durant el procés de donació d’òrgans per a trasplantament. Amb aquestes mostres es realitza un estudi cas-control els objectius del qual són: 1. Estudi de la presència de regeneració miocàrdica mitjançant: A.- L’estudi immunohistoquímic de l’antigen nulear Ki67. B.- La quantificació de l’activitat telomerasa amplificada per PCR (protocol TERT). 2. Estudi de la presència d’apoptosi miocàrdica mitjançant la tècnica immunohistoquímica TUNEL. 3.- Valoració immunohistoquímica de l’activitat miostatina com a factor regulador de la regeneració miocàrdica. 4.- Correlació dels paràmetres de regeneració miocàrdica amb: 4.1.- Paràmetres de consum d’alcohol: comparació amb un grup d’hipertensos no consumidors d’alcohol i amb un grup de controls sans. 4.2.- Funció ventricular i grau de miocardiopatia dels grups. 4.3.- Presència d’apoptosi miocàrdica. 4.4.- Activitat miocàrdica de miostatina. Els resultats obtinguts en els estudis que conformen la present tesi doctoral, ens permeten extreure les següents CONCLUSIONS: 1) Els individus afectes de miocardiopatia, independentment de la seva etiologia, presenten una major estimulació de la regeneració miocàrdica com a mecanisme compensatori enfront el dany miocàrdic. Aquest fet es reflecteix en un augment significatiu de l’expressió de l’antigen nuclear Ki67 en miocardiòcits de donants afectes de miocardiopatia de divers origen respecte als controls sans. 2) En la nostra experiència, l’expressió de TERT no ha resultat un bon marcador per a estudiar la regeneració miocàrdica, essent indetectable la seva expressió en totes les mostres estudiades en aquest treball. 3) Els individus afectes de cardiopatia, independentment del seu origen, presenten un augment significatiu de l’índex d’apoptosi mesurat per la tècnica TUNEL. 4) El grup d’alcohòlics i el d’hipertensos presenten unes activitats de BAX i BCL-2 superiors a les del grup de controls sans. Quan hi ha cardiopatia estructural aquests valors són encara més elevats, essent els individus amb miocardiopatia alcohòlica els que presenten major activitat dels mecanismes proapoptòtics. 5) Els individus afectes de miocardiopatia alcohòlica presenten un menor increment de l’expressió de Ki67 respecte els altres afectes de cardiopatia. Aquest fet reflecteix que l’alcohol inhibeix, per una altra banda, la proliferació miocàrdica. 6) Els individus afectes de cardiopatia, independentment del seu origen, presenten un increment significatiu de l’expressió de miostatina. Els individus amb miocardiopatia alcohòlica són els que en mostren major expressió. Aquest fet, juntament amb el menor increment de l’expressió de Ki67 que presenten els individus amb miocardiopatia alcohòlica respecte els altres individus afectes de cardiopatia, posa en rellevància que l’alcohol exerceix una sobreregulació de l’activitat de la miostatina. De manera global, es pot concloure que l’alcohol té un efecte diferencial sobre els processos de regeneració, apoptosi i activitat de la miostatina, reflectint així que la fisiopatologia de la miocardiopatia alcohòlica és complexa, multifactorial i amb molta interrelació dels processos esmentats. / Chronic effect of alcohol on the myocardium may induce increase of apoptosis as well as inhibition of myocyte proliferation through increased myostatin activity. We hypothesize that this imbalance would induce a clear loss of total myocyte volume and progressive cardiac dysfunction. We evaluated myocyte proliferation response in the heart of chronic alcoholic donors with telomerase activity (TERT) compared to Ki-67 nuclear expression, the activity of myocyte miostatin and myocardial apoptosis. Heart samples were prospectively obtained from organ donors on life support. We included donors with 1) High lifetime alcohol consumption, 2)Longstanding hypertension , 3) Other causes of CMP (valve, coronary or idiopathic) and 4) Previously healthy donors . Groups 2 and 3 were subdivided according to the presence of CMP. Evaluation comprised parameters of ethanol consumption, left ventricular (LV) function by chest X ray and 2-D echocardiography and histology and immunohistochemical studies. Conclusions: Toxic myocardial effects of alcohol produce myocyte loss through apoptosis, but also inhibit myocyte proliferation through an up-regulation in myostatin expression. The final result is a net loss in ventricular myocyte mass, and progressive ventricular dysfunction. Inhibition of the myocardial myostatin activity as well as reduction in myocyte apoptosis could be future useful approaches in alcoholic CMP. Heart Ki-67 proliferation activity increases in organ donors with CMP, independently of its origin. Alcoholics presented non-significant lower myocyte proliferation capacity compared to the other groups of CMP. TERT activity was not a useful marker of proliferation in this model. Ki-67 is a better procedure to evaluate proliferation than TERT expression in alcohol–induced heart damage.