As moléculas orgânicas podem ser a principal entrada de nitrogênio para plantas em ambientes onde as fontes inorgânicas de nitrogênio são limitadas, como o ambiente epífitico. Estudos recentes têm mostrado que plantas de Vriesea gigantea, uma bromélia epífita formadora de tanque, possuem alta capacidade de absorver ureia, fazendo dela um excelente modelo para estudar o metabolismo de ureia. Entretanto, os processos de absorção e assimilação de ureia estão pouco caracterizados nessas plantas. Várias aquaporinas de plantas têm mostrado ser capazes de facilitar a difusão de ureia através das membranas. Três genes que codificam para aquaporina foliares, VgPIP1;2, VgPIP1;5 e VgTIP2, recentemente foram clonados a partir de plantas V. gigantea tratadas com ureia, sendo que as expressões de VgPIP1,5 e VgTIP2, foram induzidas por essa fonte nitrogenada. No entanto, não tinha sido testado funcionalmente se, de fato, essas aquaporinas seriam capazes de transportar ureia, amônio ou água através das membranas. Uma vez absorvida, a ureia precisa ser metabolizada. Sugere-se que a assimilação do N ocorra por meio da via GS/GOGAT, com prévia hidrólise da ureia pela enzima urease, fornecendo amônio e CO2. Contudo, nunca se analisou a relevância da urease nesse processo em V. gigantea. Dessa maneira, no presente trabalho o transporte de ureia, amônio e água através de VgPIP1;2, VgPIP1;5 e VgTIP2 foi determinado por meio de ensaios de absorção em ovócitos de Xenopus laevis (água e ureia) e de estudos de complementação em Saccharomyces cerevisiae (NH4+/NH3). Os resultados mostraram que, enquanto VgTIP2 facilita o transporte de água quando expresso isoladamente em ovócitos, VgPIP1;2 e VgPIP1;5 precisaram de ser co-expressos com aquaporinas do tipo PIP2 para serem corretamente transportadas para a membrana plasmática e atuem como canais de água. Além disso, VgTIP2 foi a única aquaporina capaz de facilitar a difusão de ureia através das membranas, enquanto que VgPIP1;2 parece ser capaz de transportar NH4+/NH3. Adicionalmente, a relevância da urease no processo de assimilação de ureia foi analisada por meio do perfil isotópico dos aminoácidos em plantas de V. gigantea tratadas com um inibidor da urease (cloranil) antes de fornecer ureia duplamente marcada com C13 e N15. Os experimentos foram conduzidos em plantas nas fases ontogenéticas, atmosférica e adulta-tanque devido a existência de diferenças metabólicas e morfológicas. Os resultados sugeriram que a atividade da urease é um passo limitante na conversão do N da ureia em amônio para sua assimilação. Adicionalmente, foi visto que a diminuição na atividade da urease afeta principalmente a formação de glutamina (Gln) em plantas atmosféricas, enquanto que em plantas adultas-tanque a transaminação é o principal processo prejudicado. A diferença de assimilação de ureia entre as fases ontogenéticas podem ser consequência de diferenças morfológicas associadas com estratégias para captar nutrientes. Além disso, apesar da diminuição da atividade da urease pela ação do inibidor, processos de assimilação direta (sem prévia hidrólise da ureia anterior) em plantas V. gigantea parecem improváveis de acontecer / Organic molecules can be the main input of nitrogen for plants in environments where inorganic nitrogen sources are limited, such as the epiphytic habitat. Recent studies have shown a high capacity of Vriesea gigantean, an epiphytic tank-forming bromeliad, to absorb urea by their leaves, making this bromeliad an excellent model to study urea metabolism. Nevertheless, urea uptake and assimilation processes are little characterized in these plants. Several plant aquaporins from different species are able to facilitate the diffusion of urea through the membranes. Three foliar aquaporin genes, VgPIP1;2, VgPIP1;5 and VgTIP2, have been recently cloned from urea-treated V. gigantea plants. The expression of VgPIP1;5 and VgTIP2 was specifically up-regulated by urea in the basal part of the leaves. Nevertheless, it had not been tested whether these aquaporins were in fact capable of facilitating the membrane diffusion of either urea, ammonium or water. Moreover, it was suggested that after urea absorption, this organic N compound is hydrolyzed by the urease enzyme into CO2 and NH4+ prior to NH4+ assimilation by the GS/GOGAT pathway. In the present project, urea, NH4+/NH3 and water diffusion through VgPIP1;2, VgPIP1;5 and VgTIP2 were determined by uptake studies in Xenopus laevis oocytes (urea and water)and complementation assay in Saccharomyces cerevisiae (NH4+/NH3). The results showed that while VgTIP2 facilitates water transport when expressed alone in oocytes, VgPIP1;2 and VgPIP1;5 needed to be co-expressed with a PIP2 aquaporin to be targeted to the plasma membrane and act as water channels. Moreover, VgTIP2 was the only aquaporin able to facilitate the diffusion of urea through the membrane, while VgPIP1;2 seems to be capable of transporting NH4+/NH3. Additionally, the urease relevance in the urea assimilation process was investigated through the analysis of the amino acid profile in V. gigantea plants kept under a urease inhibitor (chloranil) and supplied with labeled [13C]-[ 15N]2-urea. The experiments were conducted in atmosphheric and adult-tank ontogenetic stages of V. gigantea due to their metabolic and morphological differences. The results suggested that urease activity may be a limiting step in the conversion of N from urea to ammonium. Moreover, decreases in urease activity by chloranil impared the first steps in N assimilation, droping the pool of glutamine (Gln) in atmospheric plants. In adult-tank plants the transamination appeared to be adversely affected. Those differences in urea assimilation might be due to differences in the morphology and the nutrient capture strategies of the ontogenetic phases. Finally, direct urea assimilation process (without previous urea hydrolysis) in V. gigantea plants seems unlikely to occur

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-11-23T13:25:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 803605 bytes, checksum: 9ec08b4e04571e5ee182d83cdd987654 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-23T13:25:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 803605 bytes, checksum: 9ec08b4e04571e5ee182d83cdd987654 (MD5) Previous issue date: 2018-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aquaporinas são proteínas de membrana responsáveis pelo transporte de água através das membranas celulares. Estas proteínas são encontradas e amplamente investigadas em insetos, porém pouco estudadas em Apis mellifera. As regiões do sistema digestório e os túbulos de Malpighi dos insetos expressam aquaporinas, o que aumenta a permeabilidade natural dos tecidos e a velocidade do transporte de água. Neste estudo foi avaliado o nível de expressão de cinco genes preditos para aquaporinas, que apresentaram diferentes níveis de expressão nos órgãos do sistema digestório – papo, intestino médio, íleo e reto – e túbulos de Malpighi de abelhas forrageiras. O gene Am_Eglp 1 apresentou maior expressão relativa no intestino médio, e a hibridização in situ confirmou a presença de RNA mensageiro para este gene em todas as regiões investigadas. Além disso, o ensaio de absorção de água, após a expressão heteróloga de Am_Eglp 1 em ovócitos de Xenopus laevis, comprovou que o gene da aquaporina codifica para uma proteína funcional, capaz de transportar água e que é bloqueada por mercúrio. Este foi o primeiro relato da funcionalidade de uma aquaporina de abelhas, que atua principalmente no intestino médio, aumentando a permeabilidade à água nas membranas da região. / Aquaporins are membrane proteins responsible for water transport through cell membranes. These proteins are found and widely investigated in insects, but still little studied in Apis mellifera. In insects, digestive tract and Malpighian tubules express aquaporin, increasing the natural permeability of tissues and the speed of water transport. In this study five predicted aquaporin genes had their expression level evaluated in forager honey bees, which presented different expression on digestive tract organs – crop, midgut, ileum and rectum – and Malpighian tubules. Am_Eglp 1 showed higher relative expression level in the midgut, and in situ hybridization confirmed the presence of mRNA to this gene in every organ evaluated. In addition, heterologous expression of Am_Eglp 1 was performed in Xenopus laevis oocytes, followed by water uptake assay, demonstrating that this gene encodes for a functional aquaporin, capable of transporting water and blocked by mercury. This was the first time a honey bee aquaporin was tested, and the results suggest that Am_Eglp 1 plays an important role on increasing membrane water permeability, mainly on A. mellifera midgut.

Introdução: A queilite glandular (QG) é uma doença inflamatória rara, de causa desconhecida, que afeta as glândulas salivares menores, principalmente do lábio inferior. Há secreção de saliva espessa através das glândulas salivares alteradas, causando desconforto ao doente. O quadro clínico consiste em graus variáveis de macroqueilia, acompanhada pela presença de ostíolos dilatados de glândulas salivares menores no vermilião. À expressão, há saída de material espesso e mucóide, que geralmente adere ao lábio acometido. A palpação cuidadosa pode revelar a presença de áreas nodulares endurecidas, que raramente podem supurar e drenar material purulento. O lábio inferior é o mais frequentemente acometido, e a doença tende a ser crônica e de difícil manejo. As opções terapêuticas incluem uso de corticóides tópicos ou intralesionais, antibioticoterapia oral, fotoproteção e cirurgia. A queilite glandular é considerada por alguns autores como uma condição pré-maligna, com alguns relatos de desenvolvimento de carcinoma epidermóide no lábio acometido. Aquaporinas são proteínas transmembrana que possuem a capacidade de transportar água entre os meios extra e intracelular. Desempenham, dessa maneira, papel importante na homeostase corporal. São proteínas amplamente distribuídas pelos tecidos humanos, existindo mais publicações sobre sua importância na fisiopatologia renal e do sistema nervoso central, até o momento. Os estudos sobre o papel das aquaporinas nas glândulas salivares são escassos, muitos realizados apenas em animais, não em humanos. Na queilite glandular, há alteração clínica evidente da viscosidade da saliva, o que é uma das queixas mais importantes. A alteração da expressão das aquaporinas na queilite glandular poderia corroborar o achado clínico-patológico de composição da saliva nesses doentes. Objetivos: Apresentar os achados clínicos e histopatológicos de 22 doentes com diagnóstico de queilite glandular, revisar os aspectos histopatológicos, assim como as terapias utilizadas e estudar a expressão das aquaporinas nas glândulas salivares menores labiais dos doentes em relação a controles de glândulas normais. Método: Foram analisados 22 doentes com diagnóstico de QG, acompanhados no Ambulatório de Estomatologia da Divisão de Dermatologia do HCFMUSP. Todos foram avaliados quanto aos dados clínicos e demográficos. Dez dos 22 doentes foram submetidos a tratamento cirúrgico, que consistiu na vermilionectomia do lábio inferior, seguida da dissecção das glândulas salivares menores, sendo o material analisado histopatologicamente. Em sete doentes foi realizada a análise da expressão das aquaporinas nas glândulas salivares menores labiais, comparando-os a glândulas salivares normais, através da técnica de imuno-histoquímica. Resultados: Os achados clínicos e histopatológicos evidenciaram maior prevalência de QG em indivíduos de pele clara. Observaram-se graus variáveis de sialadenite crônica e alterações epiteliais nos doentes submetidos a biopsias ou a tratamento cirúrgico. Dos 22 doentes, 3 apresentaram focos de carcinoma epidermóide no lábio inferior. A análise da expressão das aquaporinas nas glândulas salivares menores labiais mostrou positividade para AQP1, AQP2, AQP4, AQP5 e AQP8, em intensidades e localizações diversas em relação aos casos controles. Conclusões: Na queilite glandular, há aumento da chance de desenvolvimento de carcinoma epidermóide do lábio. A doença parece ter origem tanto a partir de causas exógenas, como a exposição aos raios ultravioleta, como causas endógenas, fato sugerido pelo encontro de alteração na expressão das aquaporinas nas glândulas salivares menores labiais dos doentes. Na literatura, algumas aquaporinas ainda não haviam sido detectadas por imuno-histoquímica na glândula salivar menor labial humana / Background: Cheilitis glandularis (CG) is a condition of unknown cause which thick saliva is secreted from swollen minor salivary glands from the lips. The condition is considered rare; there are few published case series, and most reports refer to single cases. The clinical picture of CG consists of variable degrees of macrocheilia accompanied by the presence of red, dilated ostia of minor salivary glands on the vermilion area. A thick, mucoid material can be obtained from these ostia by manual expression. This viscous saliva often sticks to the vermilion causing discomfort to the patient. Changes occur more frequently on the lower lip. The condition tends to be chronic and difficult to manage. Treatments vary from topical or intra lesional steroids, oral antibiotics, sun protection and surgery. Cheilitis glandularis is frequently regarded as a \"premalignant\" condition, with a few reported cases of development of squamous cell carcinoma. Aquaporins are small membrane proteins that exhibit channel activity specific for water and small solutes. They are considered essencial for corporal homeostasis, and are widely expressed through human tissues. Until now, most aquaporins studies are based on renal and nervous system fisiopathology, with few studies on situations involving salivary glands, such as Sjögrens disease. Some of them are performed over murine models, not human salivary glands. Objectives: In cheilitis glandularis, there is clinical evidence of thick saliva, which is one of the biggest complains of affected patients. We have diagnosed CG at our Oral Diseases Clinic in what seems to be a higher frequency than usually reported. This has prompted us to study these patients and present our results. Most CG reports are about isolated cases. We performed immunohistochemistry analysis to indicate aquaporins expression in human minor salivary glands affected by CG, since there is clinically thick saliva and its production is related to the activity of aquaporin channels. Methods: Data from 22 patients with diagnosis of cheilitis glandularis, from Oral Diseases Clinic of HC-FMUSP, were reviewed. Ten of 22 patients were submitted to surgical treatment, which was the surgical removal of the lower lip. We performed, on seven patients, analysis of aquaporins expression in minor labial salivary glands, in comparison to healthy tissues, through immunohistochemistry studies. RESULTS: Clinical findings showed higher prevalence of CG on fair skinned patients. Histopathological exams revealed variable degrees of chronic sialoadenitis and epithelial changes in patients submitted to surgical treatment or biopsy. Three of them have developed epidermoid carcinoma of lower lip. Analysis of aquaporins expression showed positivity for AQP1, AQP2, AQP4, AQP5 e AQP8, that differs from normal minor labial salivary glands. Conclusions: In CG, the chance of develop labial epidermoid carcinoma is increased. It seems that exogenous and endogenous components are related to the etiology of CG, as we found different expression of aquaporins in affected glands

Ao longo dos últimos anos, o metabolismo ácido das crassuláceas (CAM) tem sido bem estudado em espécies das famílias Bromeliaceae e, principalmente, Crassulaceae. Essa via fotossintética é caracterizada pelo acúmulo noturno de ácidos orgânicos dentro do vacúolo e pela fixação de CO2 durante a noite pela enzima fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC). No entanto, pouco se sabe sobre a preferência pela atividade da enzima ATPase ou PPiase no transporte de prótons e ácidos orgânicos no interior das vesículas do tonoplasto em espécies CAM. A fotossíntese CAM pode ser induzida em plantas caracterizadas como CAM-facultativas por diversos fatores ambientais, por exemplo, déficit hídrico, termoperíodo, salinidade e deficiência de nutrientes. Contudo, pouco tem sido discutido sobre a influência dos nutrientes na indução do CAM. Esse estudo investigou o transporte de prótons através da membrana do tonoplasto em seis espécies de bromélias CAM e duas espécies de Kalanchoë. Todas as espécies usadas nesse estudo mostrou uma preferência pela ATPase do que pela PPiase para o transporte de prótons e ácidos orgânicos no interior das vesículas do tonoplasto. Nós também observamos uma maior expressão do CAM nas plantas de Kalanchoë laxiflora e Kalanchoë tubiflora mantidas na presença de 2.5 mM de NO3-. Por outro lado, Guzmania monostachia, uma espécie de bromélia epífita, exibiu a maior intensidade do CAM nas folhas mantidas na presença de NH4+ + déficit hídrico. Nessa espécie de bromélia, a maior expressão do gene ALMT9 na porção apical das folhas, seguido pelas maiores taxas de transporte de prótons pela ATPase, acúmulo de açucares solúveis e a ativação das defesas antioxidantes parecem estar relacionados com o aumento da tolerância pelo ajuste osmótico e limitação do dano oxidativo nas folhas mantidas na presença de NH4+ + déficit hídrico. Uma outra explicação para a maior intensidade do CAM no ápice das folhas mantidas em NH4+ + déficit hídrico poderia ser a maior expressão dos genes que codificam aquaporinas, principalmente GmPIPs e GmTIPs, que talvez sejam responsáveis pelo transporte de água das porções basal e mediana para a porção apical das folhas. O maior conteúdo de água conservado na porção apical poderia ajudar a aumentar a intensidade da fotossíntese CAM nessa porção das folhas de G. monostachia mantidas na presença de NH4+ + déficit hídrico / Historically, crassulacean acid metabolism (CAM) has been studied in many families, mainly Bromeliaceae and Crassulaceae. This photosynthetic pathway is characterized by the nocturnal organic acid accumulation in the vacuole as well as CO2 fixation during the night by the phosphoenolpyruvate carboxylase enzyme (PEPC). However, little is known about the preference of ATPase or PPiase activities for the proton and organic acids transport in tonoplast vesicles in CAM species. CAM photosynthesis can be inducted in CAM-facultative species by environmental factors such as, water deficit, thermoperiod, salinity and nutrients deficiency. Although, little has been discussed about the influence of nutrients on CAM induction. This study investigated proton transport in CAM bromeliad species and two CAM Kalanchoë species. All of the species used in this study showed a preference for ATPase rather than PPiase for the proton and organic acids transport into the tonoplast vesicles. We also observed a higher CAM expression in Kalanchoë laxiflora and Kalanchoë tubiflora plants kept in the presence of 2.5 mM of NO3-. On the other hand, Guzmania monostachia plants, an epiphytic tank bromeliad species, exhibited the highest CAM intensity in the leaves kept in the presence of NH4+ + water deficit. In this same bromeliad, a malate transporter gene, ALMT9, showed its highest expression in the apical portion of the leaves and the highest proton transport rates into the vacuole by ATPase. Soluble sugars and antioxidant enzymes activities were also verified in this study in order to observe their influence on increasing the drought tolerance of G. monostachia. In the leaves kept in NH4+ + water deficit the highest antioxidant activities and accumulation of soluble sugars were observed, this suggests that this inorganic nitrogen source seems to increase the drought tolerance by osmotic adjustment and limitation of oxidative damage. These factors can favor the increase of CAM intensity in the leaves kept under NH4+ + water deficiency. Another explanation for why the highest CAM intensity was observed in the apical portion of the leaves kept in NH4+ + water deficiency is because of the higher expression of aquaporin genes in the basal and middle regions of the leaves in the presence of this N source, mainly GmPIP and GmTIP, which might be responsible for transporting water from the basal and middle portions to the apical portion where these AQP genes are repressed. The fact that the highest water content is conserved in the apical portion might help to explain the increase in the intensity of CAM photosynthesis observed in the leaves of G. monostachia kept in the presence of NH4+ + water deficit

Orientador: Paulo Mazzafera / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T08:03:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AdrianaBrombinidos_M.pdf: 1079927 bytes, checksum: 028eeeefe5616e233dd57be085df965f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Plantas das cultivares Catuaí Vermelho e Mundo Novo de Coffea arabica L. e da cultivar Apoatã de C. canephora Pierre ex Froehner, e plantas de Mundo Novo enxertadas sobre Apoatã foram avaliadas quanto a possíveis estratégias utilizadas para suportar a baixa disponibilidade de água no solo. Em paralelo, foi conduzido um ensaio com suspensões celulares de Catuaí Vermelho sob estresse osmótico induzido por PEG. Assim, este estudo teve por objetivo examinar alguns mecanismos de tolerância à seca em café através da avaliação de aspectos morfológicos (sistema radicular), fisiológicos (ajuste osmótico) e moleculares (expressão de deidrinas e aquaporinas) em plantas jovens e cultura de células. A análise de expressão do gene CaDh1 (deidrina) em suspensão celular de café tratada com PEG (15% m/v), por 8, 24 e 72 h, mostrou aumento na atividade sob estresse osmótico, o que poderia estar associado a um possível mecanismo de proteção de membranas e macromoléculas contra a dessecação. Não foi verificada alteração na resposta dos genes PIP1, PIP2 e TIP1(aquaporinas) sob condição de estresse nas células de café. Plantas de café cultivadas em vasos (4,0 L) foram submetidas a estresse hídrico moderado por suspensão da irrigação, sob condições de casa de vegetação, até que o potencial hídrico da folha no "predawn" atingisse cerca de -2,0 MPa. Verificou-se que as taxas de crescimento nos genótipos de café arábica, avaliada pelo acúmulo de biomassa total (folhas e raízes), foram intensamente afetadas pela seca, com redução em torno de 26,5% em Catuaí e 29,0% em Mundo Novo. Por outro lado, as plantas enxertadas não apresentaram redução significativa de crescimento em relação às plantas irrigadas, sugerindo uma contribuição positiva da enxertia para melhorar a eficiência na captação de água pelo porta-enxerto Apoatã, sob condição de baixa disponibilidade de água no solo. O conteúdo de açúcares solúveis totais nas folhas das plantas irrigadas foi maior que o observado para as plantas sob déficit hídrico. A maior redução foi constatada entre os genótipos de café arábica (23,0% em Catuaí e 43,8% em Mundo Novo), enquanto as reduções em Apoatã e MN/Apoatã não foram significativas. Verificou-se maior acúmulo de aminoácidos totais nas folhas e raízes de plantas de Catuaí sob estresse hídrico comparado a Mundo Novo. Apoatã e MN/Apoatã não mostraram aumentos significativos em relação às respectivas plantas irrigadas. Em todos os genótipos analisados, os teores de prolina (Pro) nas folhas e raízes de plantas sob estresse foram aumentados e, nas raízes, esse acúmulo foi bastante acentuado, sendo 6 vezes maior nos genótipos de café arábica, 4 vezes em Apoatã e 16 vezes na enxertia MN/Apoatã em relação às plantas irrigadas. Entretanto, tais aumentos não parecem estar diretamente associados a maiores graus de tolerância à seca em café. Os conteúdos dos aminoácidos asparagina (Asn), ácido ?- aminobutírico (Gaba), glutamato (Glu) e alanina (Ala) também foram alterados, observandose, de modo geral, aumento nos teores de Asn e Gaba e redução de Glu e Ala nas folhas e raízes das plantas sob estresse. Em conclusão observou-se que os genótipos com sistema radicular mais vigoroso como Apoatã e Catuaí foram menos afetados pela seca, provavelmente porque foram mais hábeis em explorar o perfil do solo para a captação de água. / Abstract: Seedlings of the cultivars Catuaí Vermelho and Mundo Novo of Coffea arabica L., of the cultivar Apoatã of C. canephora Pierre ex Froehner, and plants of Mundo Novo grafted on Apoatã were evaluated for possible strategies to withstand low water availability in the soil. In parallel, an assay with cellular suspension culture (Catuaí Vermelho) was carried out under osmotic stress induced by PEG. Thus, this study aimed to examine morphological (root systems), physiological (osmotic adjustment) and molecular (expression of dehydrins and aquaporins) traits in coffee plants and coffee cell suspension cultures as possible mechanisms of drought tolerance. The expression analysis of CaDh1 (dehydrin) in coffee cell suspensions grown with PEG (15% w/v) for 8, 24 and 72 h, showed an increase in activity under osmotic stress indicating a possible protection mechanism against desiccation. No changes were observed in the response of PIP1, PIP2 and TIP1 genes (aquaporins) under stress condition in coffee cells. Under greenhouse conditions, coffee seedlings were cultivated in 4.0 L pots submitted to moderate drought stress by suspending irrigation until leaf water potential at predawn reach about -2.0 MPa. Among the genotypes of arabica coffee subjected to water stress there was reduction in total dry weight, around 26.5% in Catuaí and 29.0% in Mundo Novo when compared with irrigated control plants. On the other hand, the grafted plants were not affected, suggesting a positive contribution of the grafting due to bigger efficiency in the water acquisition by the rootstock Apoatã under low water availability in the soil. The content of total soluble sugars was greater in leaves of irrigated plants than plants under water stress. The greatest reduction was verified among the genotypes of arabica coffee (23.0% in Catuaí and 43.8% in Mundo Novo) while the reduction in Apoatã and MN/Apoatã was not statistically significant. The accumulation of total amino acids was higher in leaves and roots of water stressed Catuaí than Novo Mundo. Apoatã and MN/Apoatã did not show significant increase in the content of amino acids in relation to irrigated control plants. In all genotypes, water stress induced an increase in the levels of proline (Pro) in leaves and roots. In the roots this increased was about 6 times in the genotypes of arabica coffee, 4 times in Apoatã and 16 times in the grafting MN/Apoatã in relation to irrigated control plants. However this increase in the levels of Pro does not seem to be directly associated to higher degrees of drought tolerance in coffee. The content of amino acids asparagine (Asn), ?-aminobutiric acid (Gaba), glutamate (Glu) and alanine (Ala) was also changed in the leaves and roots of stressed plants. In general, there was increase in levels of Asn and Gaba while was observed reduction in content of Glu and Ala. In conclusion it was found that the genotypes with more vigorous root system as Apoatã and Catuaí were less affected by drought, probably because they were more efficient in exploring the soil profile for the water absorption. / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

Orientadores: Antonio Marcos Orsi, Sergio Luis Felisbino / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T10:45:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domeniconi_RaquelFantin_D.pdf: 10868266 bytes, checksum: 8bdfe8a912508f6afd1b6131f9f8934e (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Estudos recentes têm identificado família de proteínas denominadas aquaporinas (AQP), relacionadas à alta permeabilidade de água em várias membranas biológicas. As AQP1, AQP2, AQP7, AQP8 e AQP9 são as principais AQPs identificadas no sistema genital masculino, sendo a sua localização espécie-específica e região-específica. Em vista da importância do fluido luminal na via espermática para a integridade morfofuncional dos espermatozóides, bem como dos componentes que os constituem, tais como a água e proteínas, é importante estudar a distribuição das AQPs ao longo da via espermática. Assim, este trabalho teve como objetivos principais estudar no cão as AQP1, AQP2, AQP7, AQP8 e AQP9, visando identificá-las e localizá-las, através de imuno-histoquímica e ¿Western blotting¿ na via espermática. No cão, a AQP1 foi notada na rede testicular, ductos eferentes e em vasos, sugerindo sua importância na rápida absorção de fluido testicular. Pela primeira vez a AQP2 foi detectada na rede testicular, ductos eferentes e epidídimo, e a AQP7 no epitélio epididimário e ducto deferente em mamíferos. Porém, o papel funcional dessas AQPs no sistema genital masculino do cão permanece desconhecido. A AQP8 não foi detectada ao longo dos ductos extratesticulares do cão. A AQP9 foi abundantemente expressada ao longo da via espermática do cão, que representa um importante caminho apical para o fluxo transmembrana de água e solutos. Portanto, os resultados confirmam o padrão de expressão espécie-específica e região-específica das AQPs, sugerindo variações de atividades de absorção de fluidos e solutos ao longo da via espermática. O conhecimento destas variações torna-se relevante para estudos clínicos de infertilidade, bem como para tecnologias de reprodução assistida / Abstract: Recent studies have identified proteins called aquaporins (AQP) related to the fast water permeability in some biological membranes. AQPs are small, intrinsic membrane proteins that are present in many cell types involved in fluid transport. AQP1, AQP2, AQP7, AQP8 and AQP9 had been the main AQPs identified in the male reproductive tract, being their localization species-specific and region-specific. In view of the importance of the luminal fluid to sperm maturation and integrity of the spermatozoa, it is important to study the distribution of the AQPs throughout the spermatic way. Thus, the aim of this study was to examine the expression of AQP1, AQP2, AQP7, AQP8 e AQP9 in epithelial cells in the adult dog efferent ducts, epididymis and vas deferens, using immunohistochemistry and estern blotting methods to characterize the aquaporins in male reproductive tract. In dog, AQP1 was noted in rete testis, efferent ducts and in vessels in intertubular space, suggesting that AQP1 is important for rapid absorption of testicular fluid. For the first time the AQP2 was detected in rete testis, efferent ducts and epididymis and the AQP7 was expressed in the epithelium epididymidis and in vas deferens in mammals. But its functional role in the male dog reproductive tract, remain unknown. No specific staining for AQP8 was detected in epithelial cells of excurrent ducts in dog testis. AQP9 was abundantly expressed in dog male reproductive tract, in which it is an important apical pathway for transmembrane flow of water and neutral solutes. Thus the results confirm that the AQPs are species-specific and region-specific, suggesting activity variations related with the fluid and solute absorption throughout male excurrent ducts. Investigations of AQP biology could be relevant to clinical studies of the male reproductive tract, as well as to technologies for assisted procreation / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Introdução: A queilite glandular (QG) é uma doença inflamatória rara, de causa desconhecida, que afeta as glândulas salivares menores, principalmente do lábio inferior. Há secreção de saliva espessa através das glândulas salivares alteradas, causando desconforto ao doente. O quadro clínico consiste em graus variáveis de macroqueilia, acompanhada pela presença de ostíolos dilatados de glândulas salivares menores no vermilião. À expressão, há saída de material espesso e mucóide, que geralmente adere ao lábio acometido. A palpação cuidadosa pode revelar a presença de áreas nodulares endurecidas, que raramente podem supurar e drenar material purulento. O lábio inferior é o mais frequentemente acometido, e a doença tende a ser crônica e de difícil manejo. As opções terapêuticas incluem uso de corticóides tópicos ou intralesionais, antibioticoterapia oral, fotoproteção e cirurgia. A queilite glandular é considerada por alguns autores como uma condição pré-maligna, com alguns relatos de desenvolvimento de carcinoma epidermóide no lábio acometido. Aquaporinas são proteínas transmembrana que possuem a capacidade de transportar água entre os meios extra e intracelular. Desempenham, dessa maneira, papel importante na homeostase corporal. São proteínas amplamente distribuídas pelos tecidos humanos, existindo mais publicações sobre sua importância na fisiopatologia renal e do sistema nervoso central, até o momento. Os estudos sobre o papel das aquaporinas nas glândulas salivares são escassos, muitos realizados apenas em animais, não em humanos. Na queilite glandular, há alteração clínica evidente da viscosidade da saliva, o que é uma das queixas mais importantes. A alteração da expressão das aquaporinas na queilite glandular poderia corroborar o achado clínico-patológico de composição da saliva nesses doentes. Objetivos: Apresentar os achados clínicos e histopatológicos de 22 doentes com diagnóstico de queilite glandular, revisar os aspectos histopatológicos, assim como as terapias utilizadas e estudar a expressão das aquaporinas nas glândulas salivares menores labiais dos doentes em relação a controles de glândulas normais. Método: Foram analisados 22 doentes com diagnóstico de QG, acompanhados no Ambulatório de Estomatologia da Divisão de Dermatologia do HCFMUSP. Todos foram avaliados quanto aos dados clínicos e demográficos. Dez dos 22 doentes foram submetidos a tratamento cirúrgico, que consistiu na vermilionectomia do lábio inferior, seguida da dissecção das glândulas salivares menores, sendo o material analisado histopatologicamente. Em sete doentes foi realizada a análise da expressão das aquaporinas nas glândulas salivares menores labiais, comparando-os a glândulas salivares normais, através da técnica de imuno-histoquímica. Resultados: Os achados clínicos e histopatológicos evidenciaram maior prevalência de QG em indivíduos de pele clara. Observaram-se graus variáveis de sialadenite crônica e alterações epiteliais nos doentes submetidos a biopsias ou a tratamento cirúrgico. Dos 22 doentes, 3 apresentaram focos de carcinoma epidermóide no lábio inferior. A análise da expressão das aquaporinas nas glândulas salivares menores labiais mostrou positividade para AQP1, AQP2, AQP4, AQP5 e AQP8, em intensidades e localizações diversas em relação aos casos controles. Conclusões: Na queilite glandular, há aumento da chance de desenvolvimento de carcinoma epidermóide do lábio. A doença parece ter origem tanto a partir de causas exógenas, como a exposição aos raios ultravioleta, como causas endógenas, fato sugerido pelo encontro de alteração na expressão das aquaporinas nas glândulas salivares menores labiais dos doentes. Na literatura, algumas aquaporinas ainda não haviam sido detectadas por imuno-histoquímica na glândula salivar menor labial humana / Background: Cheilitis glandularis (CG) is a condition of unknown cause which thick saliva is secreted from swollen minor salivary glands from the lips. The condition is considered rare; there are few published case series, and most reports refer to single cases. The clinical picture of CG consists of variable degrees of macrocheilia accompanied by the presence of red, dilated ostia of minor salivary glands on the vermilion area. A thick, mucoid material can be obtained from these ostia by manual expression. This viscous saliva often sticks to the vermilion causing discomfort to the patient. Changes occur more frequently on the lower lip. The condition tends to be chronic and difficult to manage. Treatments vary from topical or intra lesional steroids, oral antibiotics, sun protection and surgery. Cheilitis glandularis is frequently regarded as a \"premalignant\" condition, with a few reported cases of development of squamous cell carcinoma. Aquaporins are small membrane proteins that exhibit channel activity specific for water and small solutes. They are considered essencial for corporal homeostasis, and are widely expressed through human tissues. Until now, most aquaporins studies are based on renal and nervous system fisiopathology, with few studies on situations involving salivary glands, such as Sjögrens disease. Some of them are performed over murine models, not human salivary glands. Objectives: In cheilitis glandularis, there is clinical evidence of thick saliva, which is one of the biggest complains of affected patients. We have diagnosed CG at our Oral Diseases Clinic in what seems to be a higher frequency than usually reported. This has prompted us to study these patients and present our results. Most CG reports are about isolated cases. We performed immunohistochemistry analysis to indicate aquaporins expression in human minor salivary glands affected by CG, since there is clinically thick saliva and its production is related to the activity of aquaporin channels. Methods: Data from 22 patients with diagnosis of cheilitis glandularis, from Oral Diseases Clinic of HC-FMUSP, were reviewed. Ten of 22 patients were submitted to surgical treatment, which was the surgical removal of the lower lip. We performed, on seven patients, analysis of aquaporins expression in minor labial salivary glands, in comparison to healthy tissues, through immunohistochemistry studies. RESULTS: Clinical findings showed higher prevalence of CG on fair skinned patients. Histopathological exams revealed variable degrees of chronic sialoadenitis and epithelial changes in patients submitted to surgical treatment or biopsy. Three of them have developed epidermoid carcinoma of lower lip. Analysis of aquaporins expression showed positivity for AQP1, AQP2, AQP4, AQP5 e AQP8, that differs from normal minor labial salivary glands. Conclusions: In CG, the chance of develop labial epidermoid carcinoma is increased. It seems that exogenous and endogenous components are related to the etiology of CG, as we found different expression of aquaporins in affected glands

Orientador: Maria Alice da Cruz Höfling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T19:45:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stavale_LeilaMiguel_M.pdf: 25008584 bytes, checksum: 8754f8fc3865217986eb0137679176e9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV), também conhecida como aranha armadeira, é uma mistura complexa de peptídeos com ação neurotóxica em alguns canais iônicos. No sistema nervoso central (SNC) alguns peptídeos do PNV causam permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE) e interferem na liberação de neurotransmissores. A BHE, embora essencial para a manutenção da homeostase do SNC, pode representar uma barreira muito restritiva para o acesso de drogas terapêuticas ao microambiente neural. O entendimento dos mecanismos associados à disfunção da BHE é relevante do ponto de vista científico e médico. O objetivo do estudo foi investigar alguns mecanismos envolvidos na neurotoxicidade do veneno da Phoneutria nigriventer em ratos Wistar (Rattus norvegicus). Para esse fim, o efeito vasogênico causado pela neurotoxicidade do veneno no cérebro, foi examinado através da avaliação da expressão de aquaporina 4 (AQP4), uma proteína formadora dos canais de água e abundantemente localizada nos pés astrocitários perivasculares e relacionada com o aparecimento de edema no cérebro. A análise da expressão da proteína foi feita por imunohistoquímica e western blotting e a expressão de RNAm por PCR em tempo real no cerebelo e hipocampo de animais neonatos (14 dias) e adultos (8 semanas). Os resultados obtidos mostraram aumento da expressão de AQP4 e seu RNAm nos animais envenenados, que entretanto foi variável em função do tempo de envenenamento (2, 5 ou 24 h), da região do cerebelo ou hipocampo examinada e da idade dos animais. Os resultados mostraram também intensa marcação anti-AQP4 ao redor de vasos com edema perivascular ou não, como também entre os corpos neuronais e seus prolongamentos. Concluímos que a AQP4 tem papel nas alterações de volume dos astrócitos perivasculares e na formação e resolução do edema ao redor da BHE causado pelo PNV. A dinâmica da expressão da AQP4 no cerebelo e hipocampo em função do tempo, região e idade dos animais sugere a existência de fatores intrínsicos que modulam diferencialmente a funcionalidade da BHE em função do microambiente local. A compreensão dos mecanismos envolvidos no envenenamento por PNV pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas úteis para a intervenção clínica, bem como pode ser relevante para o entendimento dos mecanismos relacionados ao funcionamento da BHE e de proteínas envolvidas na formação de canais de água, como a AQP4 / Abstract: The Phoneutria nigriventer spider venom (PNV), also known as armed-spider, is a complex mixture of ion channels-acting peptides which exhibit neurotoxic action. In the central nervous system (CNS), PNV-containing peptides cause permeabilization of the blood-brain barrier (BBB) and interfere with neurotransmitter release. The BBB, although essential for the maintenance of homeostasis of the CNS, may represent a very restrictive barrier for the access of therapeutic drugs into the neural microenvironment. The understanding of BBB impairment-associated mechanisms are of scientific and medical importance. The aim of this study was to investigate some of the mechanisms involved in the neurotoxicity caused by Phoneutria nigriventer venom in Wistar rats (Rattus norvegicus). To this end, the vasogenic effect caused by the venom neurotoxicity in the brain was examined by evaluating the expression of aquaporin 4 (AQP4), a water channel forming protein abundantly expressed in perivascular astrocytic endfeet processes and associated to the formation and resolution of edema in the brain. The analysis of AQP4 expression was assessed in the cerebellum and hippocampus of neonate (14 day-old) and adult rats (8 week-old) through immunohistochemistry and western blotting, and the expression of mRNA by Real Time-PCR. The results showed increases of AQP4 expression and its mRNA in the envenomed animals, which though showed time- (2, 5 or 24h), regional- (regions of the cerebellum and hippocampus examined) and age-associated differences. Marked anti-AQP4 labeling was found around vessels with or without edema and among the neuron bodies and their processes. We conclude that AQP4 has a role in the volume alterations of the perivascular astrocytes and in the formation and resolution of edema around the BBB induced by PNV. The variability of the dynamics of AQP4 expression in the cerebellum and hippocampus in function of the time, region and animals age suggests the existence of intrinsic factors that modulate the BBB functionality depending on the molecular biology dynamics of the local microenvironment. The understanding of the mechanisms involved in the envenomation by PNV can contribute to the development of useful tools for clinical intervention, and may be relevant for understanding the mechanisms related to the functioning of the BBB and proteins involved in the formation of water channels, such as AQP4 / Mestrado / Histologia / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

A patogenia da hiponatremia decorrente do uso da Fluoxetina em pacientes idosos não está bem definida. Este achado tem sido atribuído a uma secreção inapropriada do Hormônio Antidiurétido (HAD), embora ainda não tenha sido evidenciado um aumento dos níveis plasmático deste hormônio nestes pacientes. Desta forma, este trabalho visa investigar o efeito da Fluoxetina sobre o rim e mais especificamente se ela teria um efeito direto sobre o Ducto Coletor Medular Interno (DCMI) de ratos normais: 1) Estudos in vivo- 10 ratos foram suplementados com aplicações intraperitoniais diárias de 10mg/kg de Fluoxetina. Após 10 dias os animais foram sacrificados e o sangue e os rins foram coletados para posterior análise. 2) Estudos in vitro- a) estudos com a técnica de Imunoblotting para avaliar a expressão da proteína da Aquaporina 2 (AQP2) em ratos suplementados e em suspensão de túbulos de DCMI de 10 ratos normais incubados com 10-7M de Fluoxetina por 30 min. b) estudos com microperfusão de segmentos isolados do nefron- a permeabilidade osmótica à água (Pf, mm./sec) foi determinada em DCMI perfundidos de ratos normais(n=6) com a técnica standart, na presença de10-7M de Fluoxetina. Resultados: 1) Os estudos in vivo mostraram que o peso caiu de 179±1,28g para 158±1,15g (p<0,0001), o Na plasmático caiu de 139,3±0,78mEq/l para 134,9±0,5mEq/l (p<0,0001) e não houve alterações do K e do HAD plasmáticos. 2) Os estudos in vitro-a) a análise densitométrica dos ensaios com imunoblotting mostraram um aumento da expressão da proteína da AQP2 de 40%, ambos, em ratos suplementados (cont-99,6± 5,2 vs Fx 145,6±16,9, p< 0,05) e em frações de membrana da suspensão de túbulos incubados com Fluoxetina (cont-100,0±3,5.vs 143,0±2,0, p<0,01). b) A Fluoxetina aumentou a Pf nos DCMI, na ausência de HAD de 7,24±2,07 para Fx- 15,77±3,25 (p<0,01). Em resumo, nossos dados revelaram que a Fluoxetina determinou uma diminuição do peso corporal e do nível plasmático de Na sem alterar os níveis plasmáticos de K e HAD e ocasionou um aumento da expressão da proteína da AQP2 e um aumento da permeabilidade à água nos DCMI, levando-nos à conclusão de que o efeito direto da Fluoxetina no DCMI, aumentando a reabsorção de água, pode ser responsável pela hiponatremia encontrada nos pacientes idosos com depressão que fazem uso desta droga. / The pathogenesis of the hyponatremia after Fluoxetine(Fx) supply in elderly is not well understood. This event has been attributed to an inappropriate antidiuretic hormone secretion although the vasopressin enhanced plasma level has not been demonstrated yet in these pacients. Thus, this experiment was designed to investigate the effect of Fx on the kidney and more specifically if it would have a direct effect in the inner medullary collecting duct (IMCD) from normal rats: 1) in vivo study- 10 rats were supplied daily with i.p. injections of Fx 10 mg/kg. After five days, the rats were sacrificed and blood and kidneys were collected. 2) in vitro studya) Immunobloting studies for AQP2 protein expression, in IMCD from supplied rats and in IMCD tubules suspension from 10 normal rats incubated with mm./sec) Fx. by 30 min. b) Microperfusion studies- the osmotic water permeability (Pf, mm./sec) was determined in normal rats IMCD(n=6) isolated and perfused by the standart methods.Fx (10-7M) was added to the bath fluid. Results: In vivo study showed that the weight decreased from 179±1.28g to 158±1.5g(p<0.0001); the Na+ plasma level decreased from 139.3±0.78mEq/l to 134.9±0.5mEq/l(p<0.0001), the K+ and the ADH plasma level remained unchanged. In vitro study- a) the densitometric analysis of the immunobloting essays showed an increase in AQP2 protein abundance of about about 40%, both, in supplied rats (cont-99.6± 5.2 vs Fx 145.6±16.9, p< 0.05), and in membrane fraction extracted from IMCD tubule suspension incubated with Fx ( cont-100.0±3.5.vs 143.0±2.0,p<0.01). b) Fx increased the Pf in IMCD in absence of vasopressin from the control period- 7.24±2.07 to Fx- 15.77±3.25 (p<0.01). In summary, our data revealed that, after Fx, weight, and plasma Na+ level decreased, the plasma K+ and ADH levels remained unchanged, whereas the AQP2 protein abundance and the water absorption in IMCD increased, leading us to conclude that the direct effect of Fx in the IMCD, could account for the hyponatremia produced by this drug in depressed elderly.

Introdução: As glândulas salivares humanas passam por diversos e complexos processos durante o período de desenvolvimento, até que adquiram maturidade estrutural para desempenhar sua função, a formação e secreção de saliva. Considerada essencial à saúde e homeostase da cavidade oral, a saliva é um fluido aquoso que depende de um mecanismo de transporte entre as membranas celulares por meio das aquaporinas. A família de proteínas aquaporinas possui treze membros. Somente algumas dessas proteínas atuam nas glândulas salivares formando poros na bicamada lipídica das membranas celulares facilitando o transporte de água e pequenos solutos, cruciais à regulação da qualidade e quantidade de saliva secretada. Proposição: Diante deste cenário, avaliamos por meio da técnica de imunoistoquímica o padrão de expressão das aquaporinas 1, 3 e 5 de glândulas salivares em desenvolvimento, com o intuito de contribuir com informações de base para futuras pesquisas. Metodologia: 47 espécimes parafinados de glândulas salivares em desenvolvimento, de diferentes sítios da cavidade oral de 20 fetos humanos, com idade entre 14 e 25 semanas, foram submetidos à técnica de imunoperoxidase. Os resultados foram analisados, de acordo com o estágio da morfogênese glandular e localização da expressão das aquaporinas. Resultados: Na fase de botão, houve a expressão das aquaporinas 1, 3 e 5 em todas as células epiteliais; na fase pseudoglandular, a expressão dessas proteínas foi vista nos ductos rudimentares (com exceção da aquaporina 1) e nas porções terminais (futuros ácinos); na fase canalicular as aquaporinas foram principalmente detectadas nos ácinos rudimentares e ductos. Finalmente, na fase de botão terminal, as aquaporinas 3 e 5 foram detectadas nas membranas das células acinares e os ductos expressaram todas as aquaporinas. Conclusão: O presente trabalho evidenciou a imunoexpressão das aquaporinas 1, 3 e 5 nas glândulas salivares humanas durante o período de embriogênese. A análise topográfica dessas proteínas nos permitiu identificar diferenças no padrão de expressão entre as diferentes regiões estruturais e estágios do desenvolvimento glandular, sugerindo diferentes papéis para cada proteína / Introduction: The human salivary glands morphogenesis depends on complex processes during the development period until they reach full structural maturity to perform its function - the synthesis and secretion of saliva. The saliva is a complex aqueous fluid considered essential to health and homeostasis of the oral cavity; its synthesis depends on several molecular mechanisms, including the transport of water, solutes, ions, amongst others across the cell membranes. The aquaporin family of proteins is essential in this process. This protein family consists of thirteen members that form channels across the cell membrane facilitating water and small solutes transportation, crucial to the regulation of quality and quantity of secreted saliva. Aims: In this scenario, we evaluated, using the immunohistochemistry technique, the expression pattern of aquaporins 1, 3 and 5 in the different phases of salivary glands development, in order to understand the role of these protein in the formation of human salivary gland morphogenesis. Methodology: 47 specimens of paraffin embedded human salivary glands at various developmental phases were included in the study. The specimens were derived from various sites of the oral cavity of 20 human fetuses aged between 14 and 25 weeks of gestation. All specimens were subjected to the imunohistochemical immunoperoxidase technique. The results were qualitatively and semiquantitatively analyzed according to the stage of glandular morphogenesis and express location of aquaporin. Results: In the bud stage, there was expression of aquaporin 1, 3 and 5 in all glandular epithelial cells; in pseudoglandular stage, the expression of these proteins was seen in rudimentary ducts (except aquaporin-1) and the terminal end buds (future acini); in the canalicular phase the aquaporins were mainly detected in the rudimentary ducts and acini. Finally, in terminal bud stage, the aquaporin 3 and 5 were detected in the membranes of the ducts and acinar cells expressed all aquaporins. Conclusion: This study showed the presence of aquaporins 1, 3 and 5 in human salivary glands during embryogenesis period. The topographic analysis of these proteins allowed us to identify differences in the expression pattern between the different structural regions and stages of glandular development, suggesting different roles for each of these proteins