L’explosion de la nanotechnologie a permis l’intégration d’une multitude de nanoparticules dans des produits de consommation. Les nanoparticules d’argent (nAg) sont les plus utilisées à ces fins, selon les derniers recensements disponibles. La plupart des études toxicologiques, à ce jour, ont fait état de l’implication très évidente de l’ion Ag+ dans la toxicité aigüe des nAg; cependant, quelques études ont mis en évidence des effets toxicologiques dus aux nAg. Il y a un certain consensus à propos d’un risque de contamination des eaux douces via leur rejet par les effluents des réseaux d’aqueducs. Puisque les concentrations en Ag+ sont généralement très faibles dans les eaux douces (de l’ordre du pg L-1), de par la formation de complexes non-labiles avec des thiols (organiques et inorganiques) et des sulfures, la toxicité inhérente aux nAg pourrait ne pas être négligeable- comparativement aux tests en laboratoires. Cette étude s’intéressait donc aux mécanismes de bioaccumulation d’argent par l’algue verte C. reinhardtii suite à l’exposition à des nAg de 5 nm (enrobage d’acide polyacrylique). La bioaccumulation d’argent pour l’exposition à Ag+ servait de point de comparaison; également, les abondances de l’ARNm de l’isocitrate lyase 1 (ICL1) et de l’ARNm de Copper Transporter 2 (CTR2) étaient mesurées comme témoins biologiques de la bioaccumulation de Ag+. Les expériences ont été menées en présence d’un tampon organique (NaHEPES, 2 x 10-2 M; Ca2+, 5x 10-5 M) à pH de 7,00. Pour des expositions à temps fixe de 2 heures, la bioaccumulation d’argent pour nAg était supérieure à ce qui était prédit par sa concentration initiale en Ag+; cependant, il n’y avait pas de différence d’abondance des ARNm de ICL1 et de CTR2 entre nAg et Ag+. D’un autre côté, pour une exposition à temps variables, la bioaccumulation d’argent pour nAg était supérieure à ce qui était prédit par sa concentration initiale en Ag+ et une augmentation de l’abondance de l’ARNm de ICL1 était notée pour nAg. Cependant, il n’y avait aucune différence significative au niveau de l’abondance de l’ARNm de CTR2 entre nAg et une solution équivalente en Ag+. L’ajout d’un fort ligand organique (L-Cystéine; log K= 11,5) à une solution de nAg en diminuait radicalement la bioaccumulation d’argent par rapport à nAg-sans ajout de ligand. Par contre, l’abondance des ARNm de ICL1 et de CTR2 étaient stimulées significativement par rapport à une solution contrôle non-exposée à nAg, ni à Ag+. Les résultats suggéraient fortement que les nAg généraient des ions Ag+ au contact de C. reinhardtii. / The recent developments in nanotechnology have given rise to a new and increasing economical market where nanoparticles are at the forefront. Recent inventories of the nanoparticles-containing products have shown that silver nanoparticle- containing products are the most frequently used consumer nanomaterial. Due to the fear of a large scale contamination-and even pollution- of the aquatic environment from silver nanoparticles (nAg), studies have been conducted to assess their toxicities, which, in many cases, have been found to be mediated by the concomitant presence of Ag+. Notably, few studies have found evidence of toxicity due to the nAg, per se. Since numerous non-labile complexes are formed with Ag+ in freshwaters- especially with thiols and sulfides-, nAg toxicity might be more relevant in comparison to laboratory tests where the Ag+ tends to dominate toxicity studies. Therefore, this study investigated the mechanisms underlying silver bioaccumulation by the green alga, C. reinhardtii upon exposure to solutions of nAg (nominal size of 5 nm; poly-acrylate coating). Silver bioaccumulation upon exposures to the free ion alone served for comparison. In parallel, the abundance of two mRNAs- ICL1 and CTR2- were used to better understand the mechanisms underlying the bioaccumulation of Ag+ (and potentially nAg). The experiments were conducted in pH buffered solutions (NaHEPES, 2 x 10-2 M; Ca2+, 5x 10-5 M) at pH 7.00. For 2-hour exposures, the silver bioaccumulation for solutions of nAg exceeded what was expected from their Ag+ content only; however, no differences were noticed in the abundance of the expression of ICL1 and CTR2. For variable time exposures, the silver bioaccumulation for solutions of nAg exceeded what was expected from their Ag+ content only. Moreover, the expression of ICL1 was significantly higher for nAg than what was expected based upon an exposure to Ag+ only. When exposed to nAg, expression levels of CTR2 could be predicted from levels based solely on the Ag+ concentrations. The addition of a large excess of L-Cysteine, which is a very strong silver ligand (log K =11.5), to a nAg solution largely decreased silver bioaccumulation, however, bioaccumulation remained significant and the expression of both ICL1 and CTR2 were significantly higher than that of the control solutions (without Ag+). The results strongly suggest that nAg generated Ag+ ions when in contact with C. reinhardtii and that the nAg released to freshwaters might exert its toxicity through organism-contact-dependant release of Ag+.

Le NMD (nonsense-mediated mRNA decay) est un mécanisme qui reconnaît et dégrade les ARNm portant un codon stop prématuré afin d'empêcher la synthèse de protéines tronquées qui pourraient avoir des effets néfastes pour la cellule ou tout simplement être non fonctionnelles. Cependant, dans un certain nombre de cas, selon la position du codon stop prématuré, la protéine tronquée qui serait synthétisée si le NMD n'existait pas, pourrait remplir complètement ou partiellement la fonction de la protéine sauvage. Il faut noter qu'un codon stop prématuré est retrouvé dans le gène responsable d'une pathologie dans un tiers des maladies génétiques et de nombreuses formes de cancer. Dans la plus grande majorité des cas, la maladie se développe non pas parce qu'une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable est synthétisée, mais plutôt parce que le gène muté n'est pas exprimé du fait de l'intervention du NMD sur l'ARNm qui en dérive. Une nouvelle approche thérapeutique de ces maladies serait d'inhiber le NMD afin de permettre la synthèse de protéines tronquées fonctionnelles et sauver le phénotype clinique. Nous avons donc décidé de rechercher des inhibiteurs du mécanisme du NMD parmi des petites molécules chimiques. Pour cela, nous avons mis au point un système de criblage en culture cellulaire reliant l'efficacité du NMD dans une cellule avec une activité luciférase mesurable directement sur les cultures cellulaires, au moyen d'un luminomètre. A partir d'un premier criblage d'environ 1500 composés chimiques, nous avons identifié une nouvelle molécule capable d'inhiber efficacement le NMD. De façon intéressante, cette nouvelle molécule est capable également d'induire la synthèse de protéines entières à partir d'un ARNm portant un codon stop prématuré. Nous avons utilisé cet inhibiteur dans des expériences pour déterminer son potentiel thérapeutique sur des modèles cellulaires de maladies génétiques tels que la dystrophie musculaire de Duchenne, la mucoviscidose et le cancer. Nos résultats démontrent que l'inhibition du NMD peut être en effet envisagée comme une nouvelle approche thérapeutique pour des maladies causées par l'apparition d'une mutation non sens. Nous avons aussi identifié une autre molécule chimique capable d'inhiber le NMD et permettant de faire un lien entre efficacité du NMD et intégrité du cytosquelette.

BRCA1 est l'un des deux gènes majeur de prédisposition au cancer du sein. Les multiples partenaires protéiques de BRCA1 lui confèrent de nombreuses fonctions par lesquelles elle peut assurer la surveillance de l'intégrité cellulaire. L'équipe dans laquelle j'ai mené ma thèse a identifié un nouveau partenaire protéique de BRCA1, la protéine de liaison au poly(A) des ARN messagers PABP1, et a ainsi mis en lumière l'implication de BRCA1 dans la régulation de la traduction. De plus, de récents travaux suggèrent que dans des conditions dangereuses pour la cellule et potentiellement oncogéniques, comme par exemple un stress endommageant l'ADN (génotoxique), la synthèse protéique est fortement altérée. Mon travail de thèse a eu pour objectif de démontrer que cette nouvelle fonction de BRCA1 contribue, comme ses fonctions nucléaires, à son rôle de suppresseur de tumeur. Durant ma thèse, j'ai identifié les ARNm « cibles » de BRCA1 par la technique d'immunoprécipitation des complexes ribonucléoprotéiques (RIP), j'ai validé que ces ARNm « cibles » de BRCA1 lui sont associés pour leur régulation traductionnelle en réalisant une analyse comparative du contenu des polysomes de cellules épithéliales mammaires MCF-7 exprimant de façon transitoire un ARN interférent dirigé contre BRCA1 par la technique que j'ai mise en place au laboratoire, les profils polysomiques. Par la suite, j'ai établi les conditions de stress génotoxique induisant la localisation cytoplasmique de BRCA1, et en collaboration avec des cliniciens du Centre Léon Bérard j'ai permis l'acquisition d'échantillons tumoraux. Ceci nous permettra d'identifier parmi ces cibles de nouveaux marqueurs diagnostiques ou encore de nouvelles cibles thérapeutiques pour les cancers du sein déficientes en BRCA1 / BRCA1 is one of the two major breast cancer susceptibility genes. The numerous binding partners of BRCA1 allow it to participate to several cellular pathways which globally contribute to its cell surveillance capacity. The team in which I performed my PhD identified a new binding partner of BRCA1, the Poly(A)-Binding Protein 1 and, consequently, a new function of this tumor suppressor, namely, the translation regulation. Moreover, recent studies suggest that under conditions dangerous for the cell and potentially oncogenic, such as a genotoxic stress, protein synthesis is strongly altered. My thesis work was aimed at demonstrating that this new function of BRCA1 contributes, like its nuclear functions, to its role of tumor suppressor. During my thesis, I identified the mRNAs "targets" of BRCA1 by the technique of immunoprecipitation of the ribonucleoprotein complexes (RIP), I validated that these mRNAs "targets" of BRCA1 are associated to it for their translational control by realizing a comparative analysis of the contents of the polysomes of MCF-7 mammary epithelial cells transiently expressing an interfering RNA directed against BRCA1 by the technique that I have set up in the laboratory, the polysomal profiles. Subsequently, I established the conditions of genotoxic stress inducing the cytoplasmic localization of BRCA1, and in collaboration with clinicians of the Center Léon Bérard Hospital, I allowed the acquisition of tumor samples. This will allow us to identify among these targets new diagnostic markers or new therapeutic targets for breast cancers deficient in BRCA1

Contrairement à la vision classique des ARNms eucaryotes qui ne contiendrait qu’une seule séquence codante, de nombreuses évidences expérimentales montrent que ces ARNms contiennent plusieurs séquences codantes qui permettraient l’expression de plusieurs protéines différentes. Les ARNms sont donc multicodants et contiennent des cadres de lectures alternatifs (AltORFs pour alternative open reading frames). Ces ORFs alternatifs sont présents dans les régions non-traduites (UTRs) ou chevauchant le RefORF (cadre de lecture ouvert de référence) dans les cadres de lectures non-canoniques +2 et +3. Le protéome est donc plus complexe que ce que l’on pense. Toutefois, le rôle et la fonction de ces nouvelles protéines restent à être investigués. Au cours de mon projet de recherche à la maîtrise, j’ai commencé la caractérisation de la protéine alternative AltMiD51, codée dans le 5’UTR du gène bicistronique MIEF1/SMCR7L/MID51 et co-exprimée avec sa protéine de référence MiD51. Par des approches variées de biologie moléculaire, cellulaire et biochimique, j’ai d’abord démontré et confirmé la localisation cellulaire de la protéine AltMiD51 à la mitochondrie. Par la suite, j’ai pu démontrer que la présence d’AltMiD51 affecte significativement la morphologie mitochondriale en fragmentant celle-ci. De plus, j’ai pu davantage cibler la région qui contient l’information de sa localisation ainsi que son effet de fragmentation, soit seulement les 23 premiers acides aminés de sa séquence. J’ai également observé que cette région Nterminale (a.a.23) est encore plus efficace pour induire la fragmentation des mitochondries. J’ai pu démontrer que le motif protéique L-Y-R est essentiel pour l’activité de fragmentation. J’ai également validé l’interaction in vivo de AltMID51 avec sa protéine partenaire ACPM (Acyl carrier protein) dans des foci mitochondriaux. En conclusion, mes travaux à la maîtrise ont permis de mettre en évidence que la protéine AltMiD51 est un nouveau facteur impliqué dans la fission mitochondriale. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives en ce qui concerne la caractérisation de nouvelles protéines alternatives et par leur contribution dans la biologie moléculaire de la cellule. / Abstract : Challenging the dogma that eukaryotic mRNAs contain a single coding sequence, an ever-growing number of studies highlight the possibility for these mRNAs to have several coding sequences, and thereby code for multiple proteins. Thus, eukaryotic mRNAs are multicoding and present alternative open reading frames (AltORFs). These alternative ORFs are present in the non-translated region (UTRs), and within or overlapping the RefORF (reference open reading frame) in non-canonical frames (+2 and +3). The proteome is indeed more complex than we initially thought. However, the role and biological function of these proteins remain to be elucidated. Over the course of my MPhil, I started characterizing the alternative protein AltMiD51, encoded in the 5’UTR of the bicistronic MIEF1/SMCR7L/MID51 gene, and coexpressed with its reference protein (MiD51). Using a wide range of molecular biology, cellular and biochemistry assays, I first demonstrated AltMiD mitochondrial localisation. I then proved AltMiD51 expression alters mitochondrial dynamics, enhancing a fragmented morphology. Moreover, I further characterized the sequence region responsible for AltMiD51 localisation and mitochondrial fragmentation, namely the first 23 amino acids. I also observed that this N-terminal region alone presents a stronger phenotype of mitochondrial fragmentation. In addition, I proved the L-Y-R domain is essential for AltMiD51 fragmentation activity, and I validated AltMiD51 in vivo interaction with ACPM (Acyl Carrier Mitochondrial Protein) within mitochondrial foci. Eventually, the work presented here highlighted AltMiD51 as a novel factor involved in mitochondrial fragmentation. These results shed light on new perspectives regarding the characterisation of alternative proteins and their contribution to the cellular metabolism.

La désadénylation des ARNm fait intervenir les complexes de désadénylation PAN2-PAN3 et CCR4-NOT-TOB mais aussi le complexe de terminaison de la traduction eRF1-eRF3. Ces trois complexes ont la capacité d'interagir avec la protéine PABP. Cependant, le rôle d'eRF3 n'est pas clairement établi. Il a été décrit que les facteurs eRF3, PAN3 et TOB sont en compétition pour l'interaction avec PABP et qu'il y a un couplage entre la terminaison de la traduction et la désadénylation assuré par eRF3. Chez l'homme, le gène eRF3/GSPT1 présente 5 formes alléliques qui diffèrent par le nombre de répétitions de codons GGC à l'extrémité 5' du cadre de lecture (7, 9, 10, 11 et 12-GGC). Une corrélation entre l'allèle 12-GGC et le risque de développement de cancer du sein et de l'estomac a été mis en évidence. Notre objectif est (i) d'améliorer notre compréhension du rôle d'eRF3 dans le processus de couplage traduction-dégradation des ARNm, (ii) de comprendre l'effet du polymorphisme de la région N-terminale d'eRF3 sur son interaction avec PABP. A travers la méthode de résonnance plasmonique de surface (SPR), nous montrons que l'affinité de la forme allélique 12-GGC est 10 fois plus faible que celle d'eRF3a (10-GGC). Cette différence est essentiellement due à la plus faible association de la forme 12-GGC avec PABP. La plus faible affinité de la forme 12-GGC d'eRF3 entrainerait une dérégulation de la désadénylation au moins pour certains ARNm et pourrait ainsi promouvoir la prolifération cellulaire et la carcinogenèse. La région N-terminale d'eRF3 contenant la répétition de glycine joue un rôle crucial dans l'interaction eRF3-PABP, dans la désadénylation et donc dans la stabilité de l'ARNm. / The mRNA deadenylation involves the deadenylation complexes PAN2-PAN3 and CCR4-NOT-TOB and the translation termination complex eRF1-eRF3. All three proteins, eRF3, PAN3 and TOB, interact with the PABP protein. However, the role of eRF3 is still unclear. It has been reported that eRF3, TOB and PAN3 compete for the binding to PABP. Recently, it has been suggested that eRF3 may regulate mRNA deadenylation in a translation termination-coupled manner. In human, the gene eRF3/GSPT1, contains a trinucleotide GGC repeat in its 5’ end which lead to 5 allelic forms of the gene. There are five known alleles of this gene (7, 9, 10, 11 and 12-GGC). A strong correlation between the longest allele (12-GGC) and gastric and breast cancer development has been reported. Our project was (i) to improve our understanding on the role of eRF3 in the coupling of mRNA deadenylation with translation termination, (ii) to understand whether the GGC repeat polymorphism of eRF3 influences eRF3-PABP interaction. The kinetic measurements of eRF3-PABP interaction obtained by Surface Plasmon Resonance (SPR) show that the affinity of the allelic 12-GGC form is 10 fold lower than that of eRF3a (10-GGC). This decrease is mostly due to difference in the association rate of the complex. The weaker affinity of the 12-GGC allelic form may result in a deregulation of deadenylation, at least for some mRNAs, and thus, could promote cell proliferation and carcinogenesis. In fine, we show that the N-terminal region of eRF3 containing the glycine expansion plays a key role in the eRF3-PABP interaction, in the deadenylation process, and hence, in mRNA stability.

Le 5-Fluorouracile (5-FU) est un anti-métabolite intensément utilisé dans les traitements chimio-thérapeutiques de nombreux cancers. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'action de cet agent anti-cancer, son impact sur la biologie cellulaire et les processus de résistance restent encore largement à déterminer. Nous avons proposé que le 5-FU, en s'intégrant dans l'ARN induit une altération de la traduction. Dans cette étude, nous avons déterminé pour la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 la dose et le temps de traitement qui induit une modification du comportement cellulaire sans conduire à une mort cellulaire massive. Nous avons ensuite analysé le translatome de ces cellules traitées et celui de cellules non traitées. Pour cela, les fractions cytoplasmiques ont été purifiées et séparées sur gradients de saccharose pour séparer les ARNm qui sont associés aux polysomes de ceux associés aux monosomes et des ARN libres. L'analyse des modifications du translatome induites par le 5-FU montre que cette drogue est capable de stimuler la traduction d'un grand nombre d'ARNm qui codent pour des protéines possédant diverses fonctions. Cette activation traductionnelle est probablement médiée, au moins en partie, par une action du 5-FU sur les microARN. C'est ainsi que nous avons démontré que la stimulation de la traduction de l'ARNm du gène HIVEP2 est un mécanisme dépendant du microARN miR-155 / 5-Fluorouracil (5-FU) is an anti-metabolite intensely used in chemotherapeutic treatments in various cancers. The cellular and molecular mechanisms of action of this anti-cancer agent still remain to be determined. Because 5-FU is incorporated within all classes of RNA, knowledge of the different levels of gene expression regulation affected by 5-FU will help to decipher its mode of action. We hypothesized that the translational control is altered by 5-FU treatment as a consequence of disrupted RNA metabolism. In this study, the colorectal cancer cell line HCT116 has been treated or not by different doses of 5-FU for different periods of time to determine the time and dose window that induces modifications of cell behavior without leading to an extensive cell death. Translational reprogramming was then analyzed during this time and dose window. For this, cytoplasmic fractions were purified and separated through sucrose gradients to distinguish the actively translated mRNAs that are associated with polysomes from the inactive mRNAs associated with monosomes or free mRNAs. A microarray analysis was then performed to identify the mRNAs presented in monosome and polysome fractions with and without treatment. This polysome profiling approach reveals that 5-FU treatment did not turn-off the global translation efficiency, but rather modulates translation efficiency of specific mRNAs. Secondly, more than 640 mRNAs were found to be up-translated following 5-FU treatment. Finally, we have demonstrated that 5-FU induced up-regulation of HIVEP2 by a molecular mechanism involving an action of 5-FU on miR-155

La traduction locale permet un contrôle spatial de l'expression des gènes. Dans ce travail, j'ai participé à deux cribles de localisation d'ARNm concernant plus de 1000 transcrits. Le premier était un crible double ARNm/protéine qui utilisait une approche de BAComics pour co-détecter les ARNm et la protéine pour laquelle ils codent. Le second a été réalisé à l'aide d'une nouvelle approche smFISH à haut-débit et a analysé tous les ARNm codant pour des protéines centrosomales et des régulateurs mitotiques. Le premier crible a révélé des cas de traduction locale dans divers compartiments subcellulaires, et notamment au niveau des protrusions cytoplasmiques, des centrosomes, de l’appareil de Golgi, des endosomes et des pores nucléaires, ce qui n'avait jamais été décrit auparavant. De manière remarquable, la traduction du peptide naissant était nécessaire pour le transport de nombreux transcrits localisés. De plus, j'ai montré que plusieurs ARNm (tels que ASPM et DYNC1H1) sont traduits dans des structures dédiées appelées usines de traduction.Le deuxième crible a révélé 8 transcrits localisés et traduits au niveau des centrosomes. J'ai montré que la localisation de ces 8 transcrits est régulée par le cycle cellulaire et qu'elle nécessite également la traduction du polypeptide naissant. En utilisant le gène ASPM comme modèle, j'ai visualisé des ARNm et des polysomes uniques avec les systèmes MS2 et SunTag, respectivement. Cela a révélé un transport dirigé des polysomes ASPM vers les centrosomes au début de la mitose, lorsque cet ARNm commence à être localisé. Ces données fournissent des preuves fortes d'un mécanisme de ciblage co-traductionnel dépendant de moteurs moléculaires ainsi que de la protéine naissante. Cela va à l'encontre du dogme actuel selon lequel le transport d'ARNm est un processus basé sur l'ARN et agissant sur des molécules réprimées pour la traduction. En revanche, cela suggère que des mécanismes tels que celui utilisé par le SRP sont plus répandus qu'on ne le pensait auparavant. / Local translation allows a spatial control of gene expression. Here, I participated in two mRNA localization screens imaging more than 1000 transcripts in total: (i) the first was a dual mRNA/protein screen that used a BAComics approach to co-detect mRNAs and the protein they encode; (ii) the second was done using a new high-throughput smFISH approach to screen all genes that encode centrosomal proteins and mitotic regulators. The first screen revealed cases of local translation at various subcellular compartments including cytoplasmic protrusions, centrosomes, Golgi, endosomes and the nuclear pore, which was never described before. Remarkably, translation of the nascent peptide was required for the transport of many localized transcripts. In addition, I showed that several mRNAs (such as ASPM and DYNC1H1) are translated in dedicated structures called translation factories.The second screen revealed 8 transcripts that are localized and translated at the centrosome. I showed that the localization of these 8 transcripts is regulated by the cell cycle, and that it also requires translation of the nascent polypeptide. Using the endogenous ASPM gene as a model, I imaged single mRNAs and polysomes with the MS2 and SunTag systems, respectively. This revealed a directed transport of ASPM polysomes towards centrosomes at the onset of mitosis, when this mRNA starts localizing. These data provide definitive evidence for a co-translational targeting mechanism dependent on motors as well as the nascent protein. This argues against the current dogma that mRNA transport is an RNA-based process acting on translationally repressed molecules. Instead, it suggests that SRP-like mechanisms are more widespread than previously thought.

Parmi les régulateurs nucléiques, les petits ARN régulateurs sont un moyen rapide d’adaptation. On les retrouve dans tous les domaines du vivant. Chez les bactéries, l’action d’un grand nombre d’entre eux dépend de la protéine chaperonne d’ARN Hfq. Leur mode d’action consiste à d’apparier directement à l’ARNm cible par complémentarité imparfaite de séquence. Il en résulte une régulation positive ou négative, de la traduction et/ou de la stabilité de l’ARNm cible.Au cours de la première partie cette thèse, nous avons essayé de caractériser la régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs. Pour ce faire, nous avons étudiés les différents composants de cette régulation et nous avons pu montrer que les sites de fixation à la protéine Hfq sur les ARN devaient être compatibles pour obtenir une régulation optimale des ARNm par les petits ARN régulateurs.Lors de la seconde partie de la thèse, nous avons pu identifier un nouveau type de régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs : la polarité transcriptionnelle. Nous avons pu montrer que la fixation du petit ARN ChiX sur la région 5’UTR de l’ARNm chiPQ entrainer l’inhibition de la traduction de chiP mais également une terminaison prématurée rho-dépendante de la transcription de l’ARNm.Nous avons par la suite cherché à savoir si ce type de régulation pouvait se retrouver dans la régulation d’autre ARNm comme l’opéron dppABCDF et l’opéron pgaABCD. En parallèle de ces études, nous avons également essayé de caractérisé la terminaison Rho-dépendante entre S. Typhimurium et E.coli au sein de l’ARNm chiPQ. / Among the nucleic regulators, small regulatory RNAs are a quick way to adapt. They are found in all areas of life. In bacteria, the action of a large number of them depends on the chaperone protein of Hfq RNA. Their mode of action consists of matching directly to the target mRNA by imperfect complementary sequence. This results in a positive or negative control, translation and/or stability of the target mRNA.During the first part of this thesis, we have tried to characterize the regulation of mRNA by small regulatory RNAs. To do this, we studied the different components of this regulation and we have shown that the binding sites on protein Hfq on RNA should be consistent for optimal regulation of mRNA by small regulatory RNAs.In the second part of the thesis, we identified a new type of mRNA regulation by small RNA regulators: transcriptional polarity. We could show that the fixing of small RNA ChiX on the 5 'UTR region of the mRNA chiPQ cause inhibition of translation of chiP but also a Rho-dependent premature termination of mRNA transcription.We subsequently investigated whether this type of regulation could be in the control of other mRNAs as dppABCDF’s operon and pgaABCD’s operon. In parallel with these studies, we have also tried characterized Rho-dependent termination between S. Typhimurium and E. coli in mRNA chiPQ.

Le transport subcellulaire et la traduction localisée des molécules d'ARNm semble être un processus très répandu et important pour contrôler la distribution asymétrique des protéines dans les cellules. L’ARNm, Bsg25D, connu pour se localiser aux centrosomes et aux microtubules astraux dans les embryons de drosophile au cours des premiers événements d'embryogenèse, a été sélectionné pour déterminer le rôle et l'importance du ciblage de l'ARNm à l'appareil mitotique lors de la division cellulaire. La localisation de Bsg25D aux centrosomes dans les embryons de drosophile est conservée entre espèces telles que D. melanogaster, D. simulans et D. yakuba. Bsg25D encode une protéine qui est étroitement liée à la Ninein (Nin) et à la Ninein-like protein (Nlp), deux protéines associées aux centrosomes présentes dans les cellules mammifères. L’analyse structure-fonction démontre que la région codante et la région 3’UTR de Bsg25D sont nécessaires pour son ciblage. Ceci suggère qu’un élément de régulation en cis, qui favorise sa localisation se situe dans la région codante + 3’UTR. / The subcellular transport and localized translation of mRNA molecules is emerging as a highly prevalent and important process for controlling asymmetric protein distribution in cells. A candidate mRNA, Bsg25D, known to localize to centrosomes and astral microtubules in Drosophila embryos during early events of embryogenesis, was selected to determine the role and importance of mRNA targeting to the mitotic apparatus during cell division. The localization of Bsg25D to centrosomes in Drosophila embryos is conserved between species such as D. melanogaster, D. simulans and D. yakuba. Bsg25D encodes a protein closely related to centrosome-associated proteins Ninein (Nin) and Ninein-like protein (Nlp) in mammalian cells. Structure function analysis revealed that the coding and 3’UTR of Bsg25D are necessary for its targeting pattern, suggesting that a cis-regulatory motif that drives its localization, is in the coding + 3’ UTR region.

Il est à ce jour bien établi que la régulation de l’expression génique dépend en grande partie des évènements post-transcriptionnels et que la traduction des ARNm tient un rôle de premier plan dans ces processus. Elle est particulièrement importante pour définir le protéome, maintenir l’homéostasie et contrôler la croissance et la prolifération cellulaire. De nombreuses pathologies humaines telles que le cancer découlent de dérèglements de la synthèse protéique. Ceci souligne l’importance d’une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires contribuant au contrôle de la traduction des ARNm. Le facteur d’initiation eIF4E est essentiel à la traduction et son activité est régulée par ses partenaires protéiques dont font partie les protéines 4E-BP et 4E-T. Les voies de signalisation PI3K/mTOR et MAPK qui sont fortement impliquées dans l’étiologie du cancer, contrôlent la traduction en modulant l’activité d’eIF4E via l’inhibition des protéines 4E-BP et la localisation de 4E-T. Afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes régulant la traduction des ARNm, nous avons utilisé plusieurs approches. Tout d’abord, nous avons caractérisé les mécanismes par lesquels le complexe mTORC1 est activé en réponse aux facteurs de croissance et avons déterminé que la kinase RSK, en aval de la voie Ras/ERK, contrôle directement l’activité de mTORC1 en phosphorylant Raptor, la sous-unité régulatrice du complexe mTORC1. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés au rôle joué par mTORC1 dans l’initiation de la traduction. Pour cela, nous avons réalisé un criblage protéomique dans le but d’identifier de nouveaux facteurs sous le contrôle de mTORC1 qui participent activement à la traduction. Ces travaux ont ainsi permis l’identification de la protéine de liaison à l’ARN LARP1 comme effecteur majeur de la traduction des ARNm et de la croissance cellulaire en aval de mTORC1. Finalement, notre étude de l’effet du stress oxydant dans la répression de la traduction nous a permis de montrer que la kinase JNK contrôle la localisation du répresseur 4E-T au sein des P-bodies, qui sont des granules cytoplasmiques concentrant des ARNm non traduits et des facteurs de la dégradation des ARNm. Nos travaux ont donc abouti à la découverte de mécanismes moléculaires cruciaux impliqués dans la régulation de la traduction des ARNm et de la synthèse protéique. Ces derniers étant largement impliqués dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale, nos recherches ouvrent sur un champ d’investigation plus large pour le développement de nouvelles molécules anti-cancéreuses. / It is now well established that gene expression is predominantly regulated by post-transcriptional events and that mRNA translation plays an essential role in this process. Translation of mRNAs is especially important in defining the proteome, maintaining homeostasis and controlling cell growth and cell proliferation. Several human diseases such as cancer are associated with aberrant regulation of protein synthesis highlighting the need to better understand the molecular mechanisms contributing to translational control. The translation initiation factor eIF4E is a key component of the translational machinery whose activity is controlled by its partners, the 4E-BP and 4E-T proteins. The PI3K/mTOR and MAPK signaling pathways, which are strongly implicated in cancer etiology, control mRNA translation by modulating eIF4E activity through the inhibition of the 4E-BPs and the regulation of eIF4E localization by 4E-T. In order to better understand how mRNA translation is regulated we used several approaches. First, we characterized the mechanisms contributing to mTORC1 activation in response to growth factor. We found that the kinase RSK, that lies downstream of the Ras/ERK pathway, directly controls mTORC1 activity by phosphorylating Raptor, the regulatory sub-unit of the complex. This provides evidence of an additional mechanism by which MAPK pathway regulates mTORC1. We next performed a proteomic screen to identify novel mTOR-regulated factors that actively participate in translation. This approach led to the identification of several candidate proteins which included the RNA-binding protein LARP1 that we found to be a major effector of mTORC1-mediated mRNA translation, cell growth and proliferation. Finally we investigated the impact of oxidative stress on translation inhibition and found that the JNK kinase controls 4E-T localization in P-bodies that are cytoplasmic granules containing non-translating mRNAs and proteins from the mRNA decay and silencing machineries. Together this work provides important novel insights into the regulation of mRNA translation and protein synthesis that represent processes strongly connected to tumorigenesis and brings precious information on the mechanisms by which signaling pathways control cell growth and proliferation.