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La bioaccumulation d’une nanoparticule d’argent (nAg) par l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii : distinguer la contribution de la particule de celle de l’ion Ag+Leclerc, Simon 08 1900 (has links)
L’explosion de la nanotechnologie a permis l’intégration d’une multitude de nanoparticules dans des produits de consommation. Les nanoparticules d’argent (nAg) sont les plus utilisées à ces fins, selon les derniers recensements disponibles. La plupart des études toxicologiques, à ce jour, ont fait état de l’implication très évidente de l’ion Ag+ dans la toxicité aigüe des nAg; cependant, quelques études ont mis en évidence des effets toxicologiques dus aux nAg. Il y a un certain consensus à propos d’un risque de contamination des eaux douces via leur rejet par les effluents des réseaux d’aqueducs. Puisque les concentrations en Ag+ sont généralement très faibles dans les eaux douces (de l’ordre du pg L-1), de par la formation de complexes non-labiles avec des thiols (organiques et inorganiques) et des sulfures, la toxicité inhérente aux nAg pourrait ne pas être négligeable- comparativement aux tests en laboratoires. Cette étude s’intéressait donc aux mécanismes de bioaccumulation d’argent par l’algue verte C. reinhardtii suite à l’exposition à des nAg de 5 nm (enrobage d’acide polyacrylique). La bioaccumulation d’argent pour l’exposition à Ag+ servait de point de comparaison; également, les abondances de l’ARNm de l’isocitrate lyase 1 (ICL1) et de l’ARNm de Copper Transporter 2 (CTR2) étaient mesurées comme témoins biologiques de la bioaccumulation de Ag+. Les expériences ont été menées en présence d’un tampon organique (NaHEPES, 2 x 10-2 M; Ca2+, 5x 10-5 M) à pH de 7,00. Pour des expositions à temps fixe de 2 heures, la bioaccumulation d’argent pour nAg était supérieure à ce qui était prédit par sa concentration initiale en Ag+; cependant, il n’y avait pas de différence d’abondance des ARNm de ICL1 et de CTR2 entre nAg et Ag+. D’un autre côté, pour une exposition à temps variables, la bioaccumulation d’argent pour nAg était supérieure à ce qui était prédit par sa concentration initiale en Ag+ et une augmentation de l’abondance de l’ARNm de ICL1 était notée pour nAg. Cependant, il n’y avait aucune différence significative au niveau de l’abondance de l’ARNm de CTR2 entre nAg et une solution équivalente en Ag+. L’ajout d’un fort ligand organique (L-Cystéine; log K= 11,5) à une solution de nAg en diminuait radicalement la bioaccumulation d’argent par rapport à nAg-sans ajout de ligand. Par contre, l’abondance des ARNm de ICL1 et de CTR2 étaient stimulées significativement par rapport à une solution contrôle non-exposée à nAg, ni à Ag+. Les résultats suggéraient fortement que les nAg généraient des ions Ag+ au contact de C. reinhardtii. / The recent developments in nanotechnology have given rise to a new and increasing economical market where nanoparticles are at the forefront. Recent inventories of the nanoparticles-containing products have shown that silver nanoparticle- containing products are the most frequently used consumer nanomaterial. Due to the fear of a large scale contamination-and even pollution- of the aquatic environment from silver nanoparticles (nAg), studies have been conducted to assess their toxicities, which, in many cases, have been found to be mediated by the concomitant presence of Ag+. Notably, few studies have found evidence of toxicity due to the nAg, per se. Since numerous non-labile complexes are formed with Ag+ in freshwaters- especially with thiols and sulfides-, nAg toxicity might be more relevant in comparison to laboratory tests where the Ag+ tends to dominate toxicity studies. Therefore, this study investigated the mechanisms underlying silver bioaccumulation by the green alga, C. reinhardtii upon exposure to solutions of nAg (nominal size of 5 nm; poly-acrylate coating). Silver bioaccumulation upon exposures to the free ion alone served for comparison. In parallel, the abundance of two mRNAs- ICL1 and CTR2- were used to better understand the mechanisms underlying the bioaccumulation of Ag+ (and potentially nAg). The experiments were conducted in pH buffered solutions (NaHEPES, 2 x 10-2 M; Ca2+, 5x 10-5 M) at pH 7.00. For 2-hour exposures, the silver bioaccumulation for solutions of nAg exceeded what was expected from their Ag+ content only; however, no differences were noticed in the abundance of the expression of ICL1 and CTR2. For variable time exposures, the silver bioaccumulation for solutions of nAg exceeded what was expected from their Ag+ content only. Moreover, the expression of ICL1 was significantly higher for nAg than what was expected based upon an exposure to Ag+ only. When exposed to nAg, expression levels of CTR2 could be predicted from levels based solely on the Ag+ concentrations. The addition of a large excess of L-Cysteine, which is a very strong silver ligand (log K =11.5), to a nAg solution largely decreased silver bioaccumulation, however, bioaccumulation remained significant and the expression of both ICL1 and CTR2 were significantly higher than that of the control solutions (without Ag+). The results strongly suggest that nAg generated Ag+ ions when in contact with C. reinhardtii and that the nAg released to freshwaters might exert its toxicity through organism-contact-dependant release of Ag+.
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Etude d'enzymes de modification d'ARN impliquées dans la réplication des flavivirus et des coronavirusBouvet, Mickaël 02 December 2011 (has links)
Ce travail de thèse a porté sur l’étude d’activités enzymatiques virales impliquées dans la réplication de deux genres viraux : les Flavivirus et les Coronavirus. Dans un premier temps, nous avons étudié des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la structure coiffe des ARNm viraux. En effet, du fait de leur cycle réplicatif cytoplasmique, ces virus n’ont pas accès à la machinerie de formation de la coiffe cellulaire et expriment donc une machinerie dédiée. Le processus canonique de formation de la coiffe fait appel à quatre activités enzymatiques, une ARN 5’-triphosphatase, une guanylyltransférase et deux méthyltransférases.Chez les flavivirus, nous avons développé des outils permettant d’identifier l’activité guanylyltransférase ainsi que des essais enzymatiques nécessaires à la caractérisation des activités méthyltransférases. Ces outils nous ont notamment permis d’évaluer l’effet inhibiteur de molécules choisies par des méthodes de criblages virtuels sur les deux activités méthyltransférases de la protéine NS5 nécessaires à la formation de la coiffe.Chez les coronavirus, nous nous sommes intéressés à une activité méthyltransférase impliquée dans la formation de la coiffe et notamment à sa régulation par un partenaire viral. Nous avons démontré que le processus de méthylation de la coiffe suit un ordre obligatoire, initié par la méthylation de la position N7 par la protéine nsp14. Dans une seconde étape, les structures coiffe-0 (7MeGpppA) sont converties en coiffe-1 (7MeGpppA2’OMe) par la protéine nsp16 en complexe avec nsp10. Nous avons démontré que l’activité 2’O-méthyltransférase portée par la protéine nsp16 nécessite une interaction spécifique avec la protéine nsp10 qui joue probablement un rôle d’échafaudage.Dans un second temps, nous avons démontré que l’activité exoribonucléase portée par la protéine nsp14 est également régulée par la protéine nsp10. La stimulation de l’activité passe par une interaction directe entre les deux protéines et il semble que les surfaces d’interaction de nsp10 avec nsp14 et nsp16 soient chevauchantes. Enfin, la caractérisation de l’activité exoribonucléase confirme la possibilité de son implication dans un mécanisme de réparation des erreurs incorporées lors de la synthèse d’ARN par la polymérase virale. / This work focused on enzymatic activities of two RNA virus genera, Flavivirus and Coronavirus.We first studied the mRNA cap synthesis machinery of these viruses. Indeed, as they replicate in the cytoplasm of the infected cell, these viruses encode their own mRNA cap-forming enzymes. The canonical mechanism of cap synthesis uses four enzymatic activities, a RNA 5’-triphosphatase, a guanylyltransferase and two methyltransferases.We tried to identify the guanylyltransferase activity involved in this process for flaviviruses and we developed enzymatic assays to characterize both guanylyltransferase and methyltransferase activities. We used the methyltransferase assay in order to test the inhibitor effect of molecules, selected by virtual screening, on the methyltransferase activities of the NS5 protein involved in the capping process.Concerning coronaviruses, we first focused on the methyltransferase activities of the nsp14 and nsp16 proteins. We have reconstituted the complete SARS-CoV mRNA cap methylation in vitro. We showed that mRNA cap methylation requires a third viral protein, nsp10, which acts as an essential trigger to complete RNA cap-1 formation. The obligate sequence of methylation events is initiated by nsp14, which first methylates capped RNA transcripts to generate cap-0 7MeGpppA-RNAs. The latter are then selectively 2′O-methylated by the 2′O-methyltransferase nsp16 in complex with its activator nsp10 to give rise to cap-1 7MeGpppA2′OMe-RNAs. Then, we took interest in the exoribonuclease activity of the nsp14 protein and found that this activity is also regulated by the same cofactor, the nsp10 protein. The interaction between the proteins is required to observe the stimulatory effect and it seems that the surface areas of nsp10 interacting with nsp14 and nsp16 overlap. The in vitro characterization of the nuclease activity of nsp14 is according with its potential implication in RNA proofreading mechanism.
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Formulation et vectorisation d’un ARN messager vaccinal codant l’antigène Gag du VIH-1 à l’aide de nanoparticules biodégradables de poly(acide lactique) / Formulation and vectorization of messenger RNA vaccine encoding HIV Gag antigen using biodegradable poly(lactic acid) nanoparticlesCoolen, Anne-Line 10 December 2018 (has links)
Le développement de vaccins à ARNm est en plein essor dans le domaine de la vaccinologie. Un des défis majeurs de ces approches est de parvenir à transporter et délivrer les ARNm dans le cytoplasme des cellules dendritiques (DC) pour permettre la production d’antigène et l’activation des réponses immunitaires.L’objectif de ce travail a porté sur la conception et l’évaluation de nouvelles stratégies de vectorisation des ARNm par des nanoparticules de poly(acide lactique) (NP-PLA). Une stratégie basée sur l’adsorption des ARNm à la surface des NP-PLA par l’intermédiaire du LAH4-L1, un peptide cationique amphipathique, a été développée. Des polyplexes formés suite à la condensation de l’ARNm par le LAH4-L1 ont été adsorbés sur les NP-PLA pour former des nanocomplexes. L’intérêt des polyplexes et nanocomplexes pour le ciblage des DC et l’activation des réponses immunitaires in vitro a été évalué. Dans des tests de transfection, ces formulations ont induit une expression efficace d’ARNm modèles dans des DC. La présence des NP-PLA dans les formulations semble favoriser l’expression des ARNm. Le traitement avec des inhibiteurs a révélé que les polyplexes et nanocomplexes semblent internalisés par phagocytose et endocytose clathrine-dépendante, et s’échappent des endosomes par un mécanisme dépendant de la pompe à protons v-ATPase. Suite à la transfection de DC dérivées de monocytes (moDC), nous avons montré que nos formulations stimulent les récepteurs de l’immunité innée et induisent une réponse pro-inflammatoire. Cette activation est associée à la maturation des moDC, à la présentation de peptides antigéniques sur le CMH-I et -II et à la sécrétion de cytokines et chémokines impliquées dans l’immunité adaptative. Ces données soulignent l’intérêt des NP-PLA associées au LAH4-L1 pour vectoriser des ARNm, cibler des DC et activer les réponses immunitaires. Dans le contexte du VIH-1, ce type de réponse pourrait aider le système immunitaire à contrôler la charge virale / MRNA-based vaccines currently raise a growing interest in vaccinology. However, the transport and delivery of mRNAs to DC cytoplasm in order to induce antigen production and immune responses remains challenging. The objective of this thesis concerns the design and evaluation of novel strategies to vectorize vaccine mRNAs by poly(lactic acid) nanoparticles (PLA-NPs). We developed a strategy based on mRNA adsorption onto PLA-NPs using, as intermediate, LAH4-L1, an amphipathic cationic peptide. To do this, mRNAs were condensed by LAH4-L1 to form polyplexes which was then adsorbed onto PLA-NPs in a second step to form nanocomplexes. The LAH4-L1/mRNA polyplexes and PLA-NP/LAH4-L1/mRNA nanocomplexes ability to target DCs and induce immune responses in vitro was evaluated. We showed that formulations induce an efficient transfection of mRNA in DCs in vitro. The addition of PLA-NPs in formulations seems to increase sustained expression of mRNAs. DC treatment by inhibitors revealed that polyplexes and nanocomplexes are taken up by phagocytosis and clathrin-dependent endocytosis, and escape endosomes by a v-ATPase-dependent mechanism. Transfection of monocyte-derived DCs (moDCs) showed that LAH4-L1/mRNA polyplexes and PLA-NP/LAH4-L1/mRNA nanocomplexes trigger innate-sensing activation with pro-inflammatory responses. This activation is associated with moDCs maturation, MHC-I and MHC-II presentation, and the secretion cytokines and chemokines involved in adaptive immunity.These data highlight the interest of these new platform formulations to vectorize mRNAs, target DCs and induce immune responses, which in the context of HIV-1, could help the immune system to control the viral load
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Etude des facteurs régulateurs de la traduction chez Escherichia coli. / Study of regulatory factors of translation in Escherichia coliNguyen, Huong LE 19 April 2019 (has links)
L’analyse des régulations de l’expression des gènes chez les bactéries permet de comprendre l’adaptation des bactéries à leur environnement et dans un contexte de biologie de synthèse d’optimiser la production microbienne de molécules d’intérêt. Notre objectif a été d’étudier la traduction au niveau du génome et ses relations avec les autres processus cellulaires par une approche de biologie des systèmes. Le traductome a été mesuré : pour chacun des ARN messagers, son pourcentage de copies en traduction et sa densité en ribosomes. Pour la première fois, une image complète de l’état traductionnel de E. coli en croissance rapide a été obtenue, caractérisée par une majorité de transcrits avec un très fort pourcentage de copies en traduction mais faiblement chargés en ribosomes. Notre modèle statistique a identifié des facteurs liés à la séquence comme déterminants de la traduction et le rôle important d’un paramètre physiologique : la concentration en ARNm. Pour la première fois, cet effet de la transcription sur la traduction a été validé à l’échelle moléculaire sur plusieurs gènes. Nous avons montré qu’une augmentation de la concentration d’un ARNm par induction transcriptionnelle entrainait une augmentation du pourcentage de copies en traduction et de la charge en ribosomes. / The analysis of gene expression regulation is necessary to better understand bacterial adaptation to environment and to be able in a context of synthetic biology to optimize the production of molecules of interest. The goal of this thesis was to study translation at the genome-wide level and its relationship to other cellular processes using a systems biology approach. First, translation activity at the -omic scale (called the traductome) was measured : for each messenger RNAs, its percentage of copies in translation and ribosome density. For the first time, a complete picture of the translational state in fast growing E. coli cells was obtained, characterized by a majority of transcripts with a very high percentage of copies in translation but a low ribosome density. Our model identified sequence-related factors as determinants of translation but, more surprisingly, the model predicted the important role of a physiological parameter: the mRNA concentration. Thus, more concentrated mRNA would have higher percentage of copies in translation and higher ribosome density. For the first time, this effect of transcription on translation has been validated at the molecular level on several genes. We showed that an increase in mRNA concentration by transcriptional induction results in increases in percentage of copies in translation and in ribosome load.
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Virulence et résistance aux antibiotiques du staphylocoque doré : recherche des ARNm ciblés par deux ARN régulateurs / Staphylococcal virulence and antibiotic resistance : research of mRNA targeted by two sRNAsIvain, Lorraine 12 July 2017 (has links)
Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène opportuniste de l’Homme et de l’animal qui représente l’une des premières causes d’infections nosocomiales. A l’heure actuelle, la sévérité de ces infections est accentuée par l’augmentation des multi-résistances aux antibiotiques qui en font un problème majeur de santé public. La découverte et l’étude des ARN régulateurs (ARNrég) exprimés par le staphylocoque doré a permis de mettre en évidence leurs rôles de régulateurs de l’étape de colonisation et d’infection (quorum sensing, virulence, résistance aux antibiotique, adaptation environnementales). Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l’étude de deux ARNrég, SprD impliqué dans la virulence de la bactérie sur modèle animal murin et SprX régulant la résistance aux glycopeptides. Dans le but de comprendre les bases moléculaires de leurs rôles dans la bactérie, nous avons souhaité identifier et valider l’ensemble des cibles directes à ces deux ARN. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à l’étude des nouvelles cibles de SprX. Pour cela, nous avons mis en place une approche in vivo de validation des cibles des ARNrég basée sur la technique des gènes rapporteurs. Nous avons ainsi pu valider deux nouvelles cibles de SprX, les ARNm ecb et purC impliqués respectivement dans l’évasion du système immunitaire et dans le métabolisme des purines. SprX interagit au niveau du site d’initiation de la traduction de ces deux ARNm, et inhibe leurs traductions. Par la suite, nous avons souhaité rechercher de nouvelles cibles pour SprD. Nous avons pu adapter à S. aureus une technique d’identification de nouvelles cibles des ARNrég. L’ensemble des résultats obtenus permettent de préciser les rôles déjà connus des deux ARNrég et offrent de nouvelles possibilités concernant l’étude et la validation des cibles potentielles. / Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen that causes a wide variety of nosocomial and community-acquired infections. Its adaptive capacities, multiple antibiotic resistances and high virulence makes it a major public health issue. The discovery and study of small regulatory RNAs (sRNAs) expressed by S. aureus showed their implication in the switch colonization to host infection. During my phD, I focused on the study of two sRNAs: (i) SprD, involved in staphylococcal virulence and (ii) SprX which regulates glycopeptides resistance. To understand the molecular basis of their roles in staphylococcal physiology, we searched for their direct targets using two different techniques. For SprX, we set up an in vivo technique to validate mRNA targets previously predicted using bioinformatics tools. This method based on the use of a fluorescent reporter gene allowed us to validate two novels SprX targets, the ecb and purC mRNAs involved in immune evasion system and purine metabolism, respectively. We further showed that SprX interacts at the ribosome binding sites preventing translation initiation. In another chapter of my phD project, we adapted the MAPS technique to S. aureus and applied it to the search of SprD direct partners by affinity purification of sRNA-mRNA duplexes. Overall, the results obtained during my thesis allowed us to precise the roles of SprD and SprX and will offer novel possibilities for the staphylococcal community to identify and/or validate of sRNA targets.
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Approches bioinformatiques pour identifier et caractériser les ARN régulateurs chez les procaryotes / Computational approaches to regulatory RNA identification and characterization in prokaryotesOtt, Alban 13 February 2014 (has links)
L’objectif de cette thèse était de progresser dans la compréhension de la régulation génique ARN‑dépendante chez les procaryotes. Le développement de nouvelles approches bioinformatiques a permis de découvrir de nouveaux ARN régulateurs non-codant (ARNrnc), de les caractériser notamment évolutivement et d’identifier leurs cibles putatives. Les ARNrnc ont en commun de pouvoir modifier l’abondance de certaines protéines en interagissant avec l’ARN messager (ARNm) qui les code. Cet effet peut être obtenu selon divers modes d’action qui mènent à la distinction de trois classes d’ARNrnc, les petits ARN régulateurs (pARN), les ARN cis-régulateurs (ARNcis) et les ARN antisens (ARNa). Avec la généralisation des approches d‘identification expérimentale des ARN (transcriptomique), il devient plus facile d’obtenir la liste des pARN que d'identifier les ARNm qu’ils ciblent. Dans le cas des ARNcis, c’est l’inverse, les méthodes expérimentales ne permettent pas de les identifier, mais une fois connus leurs cibles sont évidentes.Pour répondre à ces problématiques, nous avons principalement développé deux nouvelles méthodes : la première permet de prédire des couples pARN/ARNm en se basant leurs profils d’expressions, les résultats nous ont permis de proposer un réseau de régulation pour lequel les pARN auraient un rôle central dans la sporulation bactérienne. La seconde permet d’identifier de nouveaux ARNcis dans les génomes sur la base d’un profilage phylogénétique. Nos résultats nous conduisent à penser que le nombre de pARN et d’ARNcis dans les génomes est actuellement sous estimé. Nous proposons aussi la présence de plusieurs ARNcis chez une Archée, dont un candidat capable de détecter des variations de températures.Les avancées réalisées lors de cette thèse ont permis de mieux appréhender l’importance des ARNrnc dans la régulation génique. Les ARNrnc sont présents dans plus d’organismes et en plus grand nombre que ce que nous le pensions jusqu’à présent. Ces résultats constituent des éléments supplémentaires en faveur d’un rôle plus central des pARN que ce qui était admis jusqu’alors. / The aim of this thesis was to improve our understanding of the RNA-dependent gene regulation in prokaryotes. Newly developed bioinformatics approaches revealed new non-coding regulatory RNAs and allowed us to identify putative targets.Regulatory RNAs can change the abundance of certain proteins by interacting with cognate messenger RNAs (mRNA). This effect is achieved through various modes of action that lead to the distinction of three RNA classes: small RNA (sRNA), cis-regulatory RNA (cisRNA) and antisense RNA (asRNA). With the generalization of experimental RNA identification (transcriptomics), it becomes easier to obtain the list of expressed RNA but most of their target mRNA remain unknown. Conversely, cisRNA cannot be easily identified through experimental procedures but their targets are obvious.To address these issues, we developed two new methods: the first predicts pairs of sRNA and mRNA targets based on the analysis of expression profiles and led us to propose a new regulatory network with sRNAs playing a central role in bacterial sporulation. The second identifies new RNAs in genomes based on the analysis of phylogenetic profiles. Our results suggest that the abundance of sRNAs and cisRNA were previously underestimated. We also suggest the presence of several cisRNAs in an Archaea, including a strong candidate of thermosensitive regulator.Progress made in this thesis contributed to a better understanding of RNA importance in bacterial cell regulation. Regulatory RNAs are abundant and present in more organisms than expected previously. These results are new evidences that the physiological roles of sRNAs are more central than was previously thought.
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Etude des petits ARNs extracellulaires pour le diagnostic de cancer du rein à cellules claires / Study of circulating small RNAs for diagnostic clear cell renal cell carcinomaZhao, An 05 July 2013 (has links)
Le cancer du rein est un problème majeur de santé publique. Un diagnostic précoce améliore les chances de survie. Le diagnostic repose essentiellement sur les examens d’imagerie comme l’échographie, la tomodensitométrie et l’IRM. Ces examens sont parfois associés à la biopsie et sont couteux et parfois invasifs. De plus, l’imagerie n’est pas capable de faire la distinction entre les tumeurs bénignes et les tumeurs malignes et entre les sous-types histologiques de carcinome à cellules claires qui est le plus fréquent. Il n’existe pas dans le cancer rénal de marqueur comme la PSA dans le cancer de la prostate ou la Foetoprotéine et l’HCG dans le cancer du testicule. Le but de cette étude est concentré sur la recherche des marqueurs mARNs ou miARNs dans les liquides biologiques (sérum, plasma, urine) pour le cancer du rein à cellules claires. Nous avons montré que les petits ARNs dans le sérum et les urines et l’intégrité des ARNs dans les urines étaient des outils diagnostiques dans le cancer du rein à cellules claires. Si ces petits ARNs circulants sont validés, on peut éventuellement imaginer l’intérêt pratique en clinique comme la détection des petits ARNs circulants dans l’urine pour prédire le cancer, la classification de la tumeur pour aider le clinicien, la prédiction d’une récidive ou d’une progression soit après néphrectomie soit au cours d’un traitement médical / Kidney cancer is a major public health problem. Early diagnosis improves the chances of survival. The diagnosis is mainly based on the imaging tests such as ultrasound, CT and MRI. These tests are sometimes associated with biopsy and are expensive and sometimes invasive. In addition, the imaging test is not able to distinguish between benign and malignant tumors and between histological subtypes of renal cell carcinoma. There don’t exist tumor marker in renal cancer such as PSA in prostate cancer or Fetoprotein and HCG in testicular cancer. For this purpose, the study has focused on finding markers mRNAs and miRNAs in biological fluids (serum, plasma, urine) for clear cell renal cell carcinoma. We have shown that the small cell-free RNAs in serum and urine and the integrity of cell-free RNA in urine were diagnostic tools for clear cell renal cell carcinoma. If these circulating small RNAs are validated, we can possibly imagine the interest in clinical practice as the detection of circulating small RNAs in urine to predict cancer, the classification of the tumor to help the clinician, the prediction of recurrence and progression after nephrectomy or during medical treatment
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Etude des facteurs impliqués dans la terminaison de la traduction et la dégradation des ARNm chez Saccaromyces cerevisiae / Study of the factors involved in translation termination and mRNA decay in S. cerevisiaeRispal, Delphine 16 September 2011 (has links)
Au cours de mon travail de thèse j’ai étudié la relation entre les facteurs participant à la terminaison de la traduction et ceux participant à la dégradation des ARNm chez S. cerevisiae.D’une part, je me suis intéressée au facteur Tpa1, caractérisé pour son rôle dans la terminaison de la traduction et la stabilité des ARNm chez S. cerevisiae et dont l’homologue chez S. pombe, Ofd1, participe au contrôle de la réponse hypoxique. Je me suis basée sur la structure de ce facteur, établie par nos collaborateurs pour comprendre plus précisément la fonction moléculaire de Tpa1 et rechercher des similitudes avec sa fonction chez S. pombe.Tpa1 est composée de deux domaines de type DSBH dont le premier, contenant le site catalytique, présente des homologies structurales avec la famille des prolyl-hydroxylases.Nous avons reproduit l’effet de la protéine Tpa1 sur la translecture in vivo et montré que son site catalytique prédit, ainsi que la présence des deux domaines étaient nécessaires pour cette activité. Nous avons aussi observé que Tpa1 inhibait par un mécanisme inconnu le facteur de transcription Hap1, qui régule des gènes en fonction de la quantité d’oxygène. Basé sur l’existence d’un inhibiteur d’Ofd1 chez S. pombe, nous avons ensuite montré qu’Ett1 (l’homologue de cet inhibiteur chez S. cerevisiae) avait un rôle similaire à Tpa1 dans la translecture. Une étude structurale collaborative d’Ett1 a mis en évidence une région conservée, se liant à une molécule de sulfate et à un ligand inconnu. Cette région est importante pour la translecture. Cependant, le substrat de Tpa1 reste pour l’instant inconnu comme les rôles précis de Tpa1 et Ett1 dans la terminaison de la traduction et dans la réponse à l’hypoxie.D’autre part, j’ai étudié le processus de NMD, particulièrement en me focalisant sur le mécanisme de discrimination entre un codon stop précoce (PTC) et un codon stop normal, et en analysant également la modification post-traductionnelle d’un facteur central du NMD, Upf1. Nous avons mis en évidence, qu’en plus de la région aval, la région en amont du PTCparticipait à sa reconnaissance. Nous avons testé plusieurs hypothèses sur le rôle de cette région, qui ont confirmé son rôle sans permettre de démontrer un mécanisme définitif. En parallèle, l’étude de la protéine Upf1 s’est concentrée sur ses modifications posttraductionnelles, particulièrement par phosphorylation. En effet, une telle modification est importante chez son homologue humain. Nous avons pu confirmer l’existence d’une forme modifiée et démontrer que celle-ci était localisée entre les acides aminés 153 et 971. Cette modification s’est avérée être très labile ce qui n’a pas permis de confirmer qu’il s’agissait d’une phosphorylation, ni de la cartographier plus précisément. / During my PhD thesis, I analyzed the relation between factors that participate intranslation termination and those participating in mRNA decay in yeast S. cerevisiae.First, I focused on Tpa1, that had been proposed to participate in translationtermination and mRNA decay in S. cerevisiae, and whose homologue in S. pombe, Ofd1,participates to the control of hypoxic response. Based on the structure of Tpa1, established byour collaborators, I performed functional analysis to understand more precisely the molecularfunction of Tpa1 and similarities with its role in S. pombe. Tpa1 is composed of two DSBHdomains; the first, which contains the catalytic site, has structural homologies with the familyof prolyl-hydroxylase. We could reproduce the effect of Tpa1 on stop codon readthrough invivo and we showed that the predicted catalytic site and the presence of the two domains ofTpa1 were necessary for its activity. We also showed that Tpa1 inhibited one factor, Hap1,implicated in regulation of gene expression by oxygen. The existence of an inhibitor of Ofd1in S. pombe, allowed the identification of Ett1 (its homologue in S. cerevisiae). We showedthat Ett1 has a role similar to the one of Tpa1 in translational readthrough. A collaborativestructural and functional study of Ett1 revealed a conserved region, which binds a sulfate ion,and an unknown ligand. This region is important for the readthrough. However, thesubstrate(s) of Tpa1 remain(s) for the moment unknown, and the precise roles of Tpa1 andEtt1 in translation termination and in response to hypoxia remain to be deciphered.I also analyzed the NMD process by focusing more particularly on the mechanism thatallows the discrimination between a normal stop and a PTC (premature termination codon)and on the analysis of the post-translational modification of an important factor for the NMD,Upf1. This study revealed that, not only the region downstream of the PTC but also theupstream region participates to its recognition. We have tested several hypotheses on the roleof this upstream region, which confirmed its implication but did not reveal a definitivemechanism. In parallel, we started the study of the post-translational modifications of Upf1,and more particularly by phosphorylation. Indeed, the phosphorylation of Upf1 in human isvery important for the NMD process. We could confirm the presence of a modified form ofyeast Upf1 and we have demonstrated that it was localized between amino acids 153 and 971.This modification appeared to be highly labile. This prevented us to confirm definitively thatit was really a phosphorylation and to cartography precisely its location.
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Etude fonctionnelle du dégradosome d'Escherichia coli et régulation de la RNase E par phosphorylationToesca, Isabelle 17 March 2005 (has links) (PDF)
Le dégradosome d'E. coli est un complexe protéique impliqué dans la dégradation des ARNm constitué de quatre protéines majeures : RNase E, PNPase, RhlB et l'Enolase. Dans le but de mieux comprendre l'action du dégradosome, des études de l'interaction de RhlB et des autres hélicases DEAD-box de la cellule avec la RNase E ont été menées. Deux sites distincts d'interaction ont été mis en évidence dont l'un spécifique de RhlB. Ceci suggère l'existence de dégradosome alternatif différents selon les conditions de croissance. Des travaux menés sur l'Enolase afin de déterminer son rôle au sein du complexe semblent écarter un rôle structural du complexe ou global de la dégradation des ARNm. L'hypothèse d'un effet plus spécifique est privilégiée. Enfin, des travaux sur la régulation de la RNase E par phosphorylation ont conduit à plusieurs modèles de mécanismes son inhibition par ce processus. Une relation étroite entre le domaine NTH et CTH de la RNase E a ainsi été mise en évidence. De plus, il semble qu'une kinase endogène de E. coli puisse phosphoryler le CTH de la RNase E, uniquement en absence du NTH.
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Les cadres ouverts de lecture alternatifs contribuent significativement au protéome des eucaryotesVanderperre, Benoît January 2013 (has links)
Un défi majeur de l’ère post-génomique est de définir l’ensemble des protéines encodées par le génome : le protéome. Un ARNm mature est en général associé à un seul cadre ouvert de lecture (ORF, open reading frame en anglais) de référence (RefORF) codant pour une protéine. Des ORFs alternatifs (AltORFs) sont cependant présents dans les régions non-traduites (UTRs), ou chevauchant le RefORF dans les cadres de lecture alternatifs +2 et +3. Les AltORFs offrnt le potentiel d’augmenter la diversité protéique, mais leur réelle contribution au protéome est peu caractérisée. Par des techniques de biologie moléculaire, de biochimie, et de biologie cellulaire, j'ai tout d’abord mis en évidence chez plusieurs mammifères supérieurs, l’expression endogène d'une protéine alternative appelée AltPrP à partir du gène PRNP. La découverte d'AltPrP devrait améliorer notre compréhension des rôles pathologiques et physiologiques de ce gène. Suite à la découverte d'AltPrP, et basé sur ce modèle d’AltORF chevauchant un RefORF, j'ai entrepris d’investiguer l’étendue de l’utilisation de ces AltORFs comme source de diversité protéique, chez l’humain en particulier. Par des méthodes computationnelles, j'ai participé à la création d'une base de données d'AltORFs prédits dans les ARNm humains (HA1tORF, pour Human Alternative ORFs). HA1tORF est consultable et interrogeable en ligne. Elle facilitera et accélérera la découverte et l’étude des AltORFs. J'ai ensuite mis au point une approche protéomique afin d'apporter des preuves expérimentales de l’utilisation à grande échelle des AltORFs. Une base de données d’AltORFs, mise à jour pour inclure ceux chevauchant en tout ou partie les UTRs, a été créée et utilisée pour déterminer par spectrométrie de masse la contribution des protéines alternatives au protéome humain. J'ai validé l’expression de 1259 protéines alternatives prédites à travers différents échantillons. J'ai aussi démontré que l’expression d'AltORFs impliquait d’importants biais dans les dessins expérimentaux (transfections ou criblage de banques d’ADNc par exemple). Enfin, un grand nombre de protéines alternatives semblent conservées à travers l’évolution, suggérant leur importance fonctionnelle. En conclusion, mes travaux de doctorat ont permis de mettre en évidence que les AltORFs conduisent à l’expression de nouvelles protéines jusqu’alors ignorées. Ces résultats redéfinissent notre vision du protéome, remettent en question notre compréhension de la structure et de la fonction des gènes eucaryotes, et ouvrent la voie vers l’étude fonctionnelle des protéines alternatives.
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