Esta tese descreve a preparação, caracterização e desenvolvimento de biossensores baseados na imobilização de enzimas em filmes nanoestruturados. Os filmes foram obtidos pela técnica de automontagem do inglês Layer-by-Layer (LbL) ou pela técnica de Langmuir-Blodgett (LB). A tese se divide em três partes: a primeira parte teve como objetivo o estudo e a aplicação de filmes finos nanoestruturados, contendo enzima tirosinase (Tyr), em biossensores para detecção de moléculas antioxidantes (polifenóis), visando sua aplicação na indústria de alimentos, em especial a de vinhos tintos. Foi utilizada a técnica LB para a imobilização da enzima Tyr sobre substratos sólidos (ITO ou Pt) sem que a enzima perdesse sua atividade. A enzima foi incorporada a filmes LB mistos de ácido araquídico (AA) e bisftalocianina de lutécio (LuPc2) pela injeção na subfase aquosa. A LuPc2 foi usada como mediadora de transferência de cargas. Foi possível a detecção do composto fenólico representativo pirrogalol. Estudos de voltametría cíclica demonstraram que o biossensor possui uma boa reprodutibilidade com desvio padrão de ca. 2% (n = 4), limite dinâmico de até 400 \'mü\'M (potencial aplicado de 0,4 V; R2: 0,993), sensibilidade de 1,54 \'mü\'A.\'mü\'M POT.-1/\'CM POT.2\' e limite de detecção (critério 3\'sigma\'0/m) de 4,87 x \'10 POT.-2\' \'mü\'M (n = 10). A segunda parte do trabalho descreve o desenvolvimento de sensores eletroquímicos baseados em filmes automontados LbL de hidrocloreto de polialilamina (PAH) e LuPc2. A motivação para o estudo foi a troca do material biológico (Tyr) pela LuPc2, a qual possui poder catalítico e relativa seletividade, capaz de mimetizar algumas proteínas. A LuPc2 foi utilizada como enzima artificial na quantificação de catecol e pirogalol como representantes de compostos fenólicos. Em medidas de voltametria, o sensor automontado de PAH/LuPc2 apresentou boa linearidade (R2 = 0,992) na faixa de até 500 \'mü\'M, com uma sensibilidade de 90 nA/\'mü\'M e limite de detecção de 8 \'mü\'M. Nas medidas cronoamperométricas, os sensores apresentaram uma ampla faixa linear (R2 = 0,994; tempo de resposta de 60 s) de até 900 \'mü\'M e limite de detecção (LD) de 37,5 x \'10 POT.-8\' M (sensibilidade de 20 nA/\'mü\'M) para o catecol. Por fim, estudou-se a fabricação de filmes LbL baseados em dendrímero poli(propileno imina) (PPID) e metaloftalocianina tetrasulfonada de níquel (NiTsPc) em sensores baseados em transistores de efeito de campo (FET). Neste caso, os filmes foram utilizados como membranas sensíveis na aplicação de sensores de pH e \'H IND.2\'O IND.2\'. Também se demonstra a importância de se utilizar estruturas dendríticas nesse tipo de filme, comparando estes filmes com aqueles contendo um polieletrólito fraco linear (PAH). Foi dada ênfase à fabricação dos filmes pela técnica LbL e sua aplicação em sensores do tipo FET de porta estendida e separada (SEGFET). Filmes LbL baseados em enzimas artificiais se mostram bastante promissores em aplicações reais por serem relativamente baratos e simples, possibilitando o uso de variados tipos de materiais. A utilização desses filmes em dispositivos baseados em estruturas SEGFET possibilita a miniaturização dos sensores bem como sua produção unindo técnicas convencionais de fabricação microeletrônica. / This thesis describes the preparation, characterization and development of biosensors based on nanostructured films containing immobilized enzymes and metallophthalocyanines. The films were obtained using the Layer-by-Layer (LbL) or Langmuir-Blodgett (LB) techniques. In the first part of the thesis we describe the development of nanostructured thin films containing the enzyme tyrosinase (Tyr) and their use as biosensors for detection of antioxidants molecules (polyphenols), which find applications in the food industry, specialy red wines. The enzyme was incorporated into the mixed LB films of arachidic acid (AA) and lutetium bisphthalocyanine (LuPc2) by injection into the aqueous subphase followed by transference to ITO or Pt electrodes. The representative phenolic compound molecule to be detected was pyrogallol. Cyclic voltammetry studies shown that the biosensor response is highly reproducible with a standard deviation of ca. 2% (n = 4), dynamic range up to 400 \'mü\'M (applied potential of 0.4 V; R2: 0.993), sensitivity of 1.54 \'mü\'A/\'mü\'M.\'CM POT.2\' and detection limit (3 \'sigma\'0/m criteria) of 4.87 x \'10 POT.-2\' \'mü\'M (n = 10). The second part of this thesis focus on the development of electrochemical sensors based on LbL films of poly(allylamine hydrochloride) (PAH) and LuPc2. The purpose of the study was to change the biological material (Tyr) by LuPc2. LuPc2 was used as an artificial enzyme in the quantification of catechol and pyrogallol as representative of phenolic compounds. In voltammetric measurements, the LbL PAH/LuPc2 sensors presented good linearity (R2 = 0.992) in the range up to 500 \'mü\'M with a sensitivity of 90 nA/\'mü\'M and detection limit of 8 \'mü\'M. As revealed by chronoamperometry measurements, the sensors exhibited a wide linear range (R2 = 0.994; response time of 60 s) up to 900 M and detection limit of 37.5 × \'10 POT.-8\' \'mü\'M (sensibility of 20 nA/\'mü\'M) for catechol. Finally, we investigated the fabrication of LbL films based on poly(propylene imine) dendrimer (PPID) and nickel tetrasulfonated phthalocyanine (NiTsPc) as active elements in devices based on field effect transistors (FET). The films were used as sensitive membranes applied as pH and \'H IND.2\'O IND.2\' sensors. It was shown the importance on the LbL technique and its application in FET-based sensors such as the separated and extended gate FET (SEGFET). LBL films based on artificial enzymes exhibit great promise in real applications due to their low cost and simplicity. The use of these films in devices based on SEGFET structures allows miniaturization of the sensors and their production combining conventional microelectronics fabrication and nanotechnological tools.

A técnica de Microbalança de Cristal de Quartzo (QCM) tem sido utilizada para a aplicação em biossensores. Esta técnica consiste no monitoramento da freqüência de oscilação do cristal de quartzo e a variação de freqüência está relacionada com a variação de massa na superfície do cristal por meio da equação de Sauerbrey. Porém, sabe-se que há discrepância entre a massa calculada pela equação de Sauerbrey e a massa real aderida na superfície do cristal de quartzo, sendo tal discrepância causada por fatores tais como a viscoelasticidade, o que é especialmente observado para macromoléculas e sistemas biológicos. Com a técnica de Admitância Eletroacústica (AE) é possível analisar a massa real devido à análise em separado dos parâmetros que compõem o circuito equivalente do cristal de quartzo e também inferir informações sobre a estrutura das monocamadas montadas sobre a superfície do cristal de quartzo. Neste trabalho foi utilizada técnica de AE para se potencializar e detalhar o estudo da formação de monocamadas automontadas e interações entre diferentes proteínas e carboidratos. Em muitos casos verificou-se que durante a formação de determinadas monocamadas, grande parte da variação de massa estava relacionada a interações fracas e não-específicas. Também durante a formação das monocamadas de tióis de cistamina, verificou-se que a estrutura da monocamada é extremamente dependente das concentrações iniciais de cistamina utilizadas para formar a monocamada. As interações entre proteínas e carboidratos foram realizadas após formação de multicamadas nas quais as proteínas eram imobilizadas para depois estudar-se, então, sua interação com carboidratos específicos. No caso da Jacalina, um tipo de lectina, observou-se interações bastante específicas com a fetuína e interações fracas com a alfa-lactose. A atividade da enzima GumH também foi testada com sucesso utilizando a técnica de AE. / The Quartz Crystal Microbalance (QCM) has been largely used for biosensor applications. This technique consists on monitoring quartz crystal oscillation frequency. The relationship of quartz crystal frequency variation with mass deposited on the crystal surface is described by Sauerbrey´s equation. However, the relationship is not directly inferred and discrepancy exists caused mainly by viscoelasticity features of mass adsorbed on the quartz crystal surface. The viscoelastic influence is very common to be observed especially for macro-molecules and biological systems. By using Electroacoustic Admittance (EA) technique it is possible to calculate and separate the real mass deposited over the quartz crystal from other contributions. Therefore, the EA was used to infer about self-assembly monolayer structure being deposited over the quartz crystal. In this work EA technique was used to study details of self-assembled monolayer formation and specific interactions between different proteins and carbohydrate molecules. It was observed that during monolayer formation the majority of mass variation was related to non-specific interactions. For instance, regarding cystamine monolayer formation it was observed that the monolayer structure is dependent on the cystamine concentrations in the liquid medium. The study of interactions between proteins and carbohydrates was conducted by means of multilayers approach in which the proteins are immobilized previously to study the interaction between its active sites and carbohydrates. In the specific case of Jacalin, a type of lectin, it was observed a large formation of specific bonding between this protein and alpha-lactose or fetuin. The GumH enzyme activity was also tested successfully by using of EA technique.

Neste trabalho foi utilizada Espectroscopia Vibracional por Geração de Soma de Freqüências, uma técnica óptica não-linear que é sensível à conformação molecular em interfaces e superfícies, para caracterizar o ordenamento molecular de filmes poliméricos automontados de polieletrólitos durante todos os passos do processo de fabricação, tendo como modelo o par de polieletrólitos PAH (poli(cloreto de alilamina)) / PSS (poli(estireno sulfonato de sódio)). Os espectros SFG permitiram verificar que durante o mergulho (in situ) do substrato na solução de polieletrólitos, estes adsorvem, mas se encontram numa configuração desordenada. Observou-se também que a secagem dos filmes pela ação de jato de nitrogênio produz filmes menos homogêneos do que por secagem espontânea, e às vezes até destruindo completamente o ordenamento molecular. Além disso, verificou-se também que camadas de polieletrólitos adsorvidas influenciam o ordenamento das camadas previamente adsorvidas. Com base nos resultados, modelos para a representação das estruturas desses filmes de polieletrólitos in situ e ex situ foram propostos. / In this work, Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy, a nonlinear optical technique that is sensitive to molecular conformation at interfaces and surfaces, was used to characterize the molecular ordering of self-assembled films during all steps of self-assembly, having as model poly(allylamine hydrochloride) (PAH) / poly(styrene sulfonate) (PSS) polyelectrolyte assemble. SFG spectra showed that during immersion (in situ) of substrate in polyelectrolytes solutions, adsorption occurs but the molecules are in a disordered configuration. It was observed that the films drying by nitrogen flow are more inhomogeneous than those dried by spontaneous water evaporation. In some cases, dried films by nitrogen flow are quite disordered. Furthermore, it was observed that polyelectrolytes layers affect the ordering of the previously adsorbed layers. Based on our results, models were proposed to represent the structure of polyelectrolytes films in both: in situ and ex situ.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosana Mossanha.pdf: 1591695 bytes, checksum: aac2e3d256b391dd0e8f113bb72eb620 (MD5) Previous issue date: 2011-03-03 / In this work were studied investigated different types of modifiers for the formation of self-assembled monolayers on the gold surface. The monolayers used were formed by different structural arrangements, alkyl chains and functional groups. The thiols groups used were: 3-mercaptopropionic acid (MPA), thiolactic acid (TLA), cystamine (CYS) and 11-mercaptoundecanoic acid. The electroactivity of films of different thiols was assessed by the probe molecule, Fe(CN)63-/4-. It was possible to observe through the cyclic voltammetry technique, the formation and organization of the films, monitoring the behavior of the redox couple. The voltammograms showed a decrease in the faradaic current response with the increase of immersion time of the gold substrate in ethanolic solution of thiols, suggesting that the process of electron transfer occurs through the pinholes of the electrodes surface and tunneling. The monolayers of 3-mercaptopropionic acid (MPA) and thiolactic acid (TLA) had a better coating of the surface in immersion time of 3 hours. While the 11-mercaptopropionic acid (MUA) and cystamine (CYS) needed more time to organize the monolayer, 24 hours, because the MUA is a long chain molecule and CYS because the cleavage of S-S. The size of thiol chain influenced the surface organization, short-chain thiols tend to form monolayers with a considerable amount of defects, leading to a lower coating on the electrode surface. Indeed, the MUA that contains a high number of carbons in the chain showed a higher surface coverage, which caused loss of voltammetric response. The electrode surface roughness and the active area, calculated by the voltammetric data, showed a decrease with the formation of the monolayers on gold surface. Aiming to estimate the amount of molecules immobilized on the surface, it was calculated the superficial excess ) by voltammetric charge obtained from the reductive desorption. The obtained values were of 1.88x10-10 for Au-CYS, 5.03x10-10 to Au-MPA, 1.06x10-8 for Au-MUA and 1.35x10-10 mol.cm-2 for the Au-TLA, demonstrating an almost complete coverage of active sites on the surface. By the electrochemical impedance spectroscopy technique, it was possible to determine the kinetic parameters of the SAMs, which were consistent with those obtained by cyclic voltammetry. Analyzing the performance of sensors for dopamine determination through the VC, it was found that the SAM formed by TLA presented the most satisfactory results regarding the sensitivity and selectivity compared to the analyte DA. Studies at different scan rates for the electrodes, Au-MPA, Au-TLA and Au-CYS in the presence of the analite showed that the anodic peak current linearly increases with the square root of scan rate, indicating that the electron transfer process is controlled by diffusion of species to the electrode surface. Dopamine was quantified by CV and SWV technique, in the linear range from 1.1 to 6.6x10-7 mol L-1 with detection limits of 1,42x10-7 mol L-1 and 4,77x10-8 mol L-1, respectively. Using the technique of VOQ, TLA-Au electrode was able to distinguish between AA and DA, when present in the same solution, with a potential difference of approximately 340 mV. / Neste trabalho foram investigados diferentes tipos de modificadores para a formação de monocamadas auto-organizadas sobre a superfície do ouro. As monocamadas utilizadas foram formadas por diferentes arranjos estruturais, tamanho da cadeia carbônica e grupos funcionais. Os tióis utilizados foram: ácido 3- mercaptopropiônico (MPA), ácido tioláctico (TLA), cistamina (CYS) e o ácido 11-mercaptoundecanóico. A eletroatividade dos filmes dos diferentes tióis foi avaliada pela molécula sonda, Fe(CN)6]3-/4-. Foi possível constatar através da técnica de voltametria cíclica, a formação e a organização dos filmes, monitorando o comportamento do par redox. Os voltamogramas mostraram um decréscimo nas respostas da corrente faradaica com o aumento do tempo de imersão do substrato ouro na solução etanólica dos tióis, sugerindo que o processo de transferência de elétrons ocorre através dos pinholes da superfície e por tunelamento. Os eletrodos com as monocamadas de ácido 3-mercaptopropiônico (MPA) e o ácido tioláctico (TLA) obtiveram melhor recobrimento da superfície no tempo de imersão de 3 horas. Enquanto que o ácido 11-mercaptopropiônico (MUA) e a cistamina (CYS) necessitaram de maior tempo de imersão para organização da monocamada, de 24 horas, devido o MUA ser uma molécula de cadeia longa e a CYS devido a quebra da ligação S-S. O tamanho da cadeia do tiol influenciou no empacotamento da superfície, tióis de cadeia curtas tendem a formar monocamadas com uma quantidade de defeitos considerável, levando ao um menor recobrimento na superfície eletródica. O MUA que contém um número elevado de carbonos na cadeia apresentou um maior recobrimento da superfície, o que ocasionou perda da resposta voltamétrica. A rugosidade e a área ativa dos diferentes eletrodos, calculadas a partir dos voltamogramas, diminuíram com a formação das monocamadas sobre a superfície do ouro. Com o objetivo de estimar a quantidade de moléculas imobilizadas sobre a superfície, foram calculados os excessos superficiais por meio da carga voltamétrica obtida da dessorção redutiva. Os valores obtidos foram de = 1,88x10-10 para Au-CYS, 5,03x10-10 para Au-MPA, 1,06x10-8 para Au-MUA e 1,35x10-10 mol.cm-2 para o Au-TLA, demonstrando uma cobertura quase completa dos sítios ativos da superfície. Pela técnica de espectroscopia de impedância eletroquímica foi possível determinar os parâmetros cinéticos das SAMs, os quais foram consistentes com os obtidos pelos voltamogramas cíclicos. Analisando o desempenho dos sensores para a determinação de dopamina (DA) através da VC, verificou que a SAM formada pelo TLA foi a que apresentou resultados mais satisfatórios quanto a sensibilidade e seletividade em relação a este analito. Estudos em diferentes velocidades de varredura para os eletrodos Au-MPA, Au-TLA e Au-CYS na presença do analito mostraram que a corrente de pico anódica aumenta linearmente com a raiz quadrada da velocidade de varredura, indicando que o processo de transferência de elétrons é controlado pela difusão das espécies à superfície do eletrodo. A dopamina foi quantificada pela técnica de VC e VOQ, na faixa linear de 1,1 a 6,6x10-7 mol L-1 com limites de detecção de 1,42x10-7 mol L-1e 4,77x10-8 mol L-1, respectivamente. Utilizando-se a técnica de VOQ, o eletrodo Au-TLA foi capaz de distinguir o ácido ascórbico (AA) e DA quando presentes na mesma solução, com uma diferença de potencial de aproximadamente 340 mV.

Les azobenzènes sont des molécules photochromes très étudiées, leurs propriétés de photoisomérisation donnent notamment lieu à d’importants phénomènes de transport de matière photoinduit en milieu polymère. L’objectif de cette thèse est de mieux comprendre les différents paramètres régissant de tels effets photomécaniques. Pour ce faire, nous avons entrepris des études sur des monocouches de dérivés azobenzenes auto-assemblés ou SAMs (Self-Assembled Monolayers) sur substrats d’or atomiquement plans, de façon à pouvoir réaliser à la fois des caractérisations d’ensemble (propriétés de mouillage : mesures d’angles de contact) ou des caractérisations à l’échelle de la molécule individuelle (par microscopie à effet tunnel, STM). Nous avons choisi le système d'un alcane thiol fonctionnalisé par un azobenzène pour bénéficier de la facilité que possèdent les alcanes thiols à former des SAMs hautement organisées. L'autre avantage que propose ce système est de pouvoir jouer avec la longueur de la chaîne carbonée, ce qui permet d'espacer plus ou moins le groupe photo-actif de la surface métallique du substrat d'or. Ainsi ces systèmes paraissent bien adaptés pour identifier l’influence de paramètres tels que (1) les phénomènes de transferts d’énergie ou de charges pouvant exister entre molécules ou entre molécules et substrat et (2) les problèmes éventuels de gêne stérique.Nous avons étudié des azobenzenes greffés (1) sur une courte chaîne alcanethiol (3 atomes de C - "azoc3"), et (2), sur une chaîne plus longue (12 C - "azoc12"). Les caractérisations STM ont mis en évidence un réseau dense similaire aux alcanes thiols non substitués dans le cas des "azosc3" mais aucune modification sous éclairement n’a été observée. Des mesures d’angle de contact, utilisant le changement de polarité entre les photoisomères Trans et Cis, confirment cette absence de réaction pour ces SAMs. Une photo-réactivité a par contre été mise en évidence par des mesures d'angle de contact pour l’espaceur long ("azoc12") sur des substrats d’or polycristallins. Les raisons d'un tel comportement proviennent des propriétés intrinsèques d'une SAM d'alcanethiol : un réseau très dense implique un volume libre restreint et d'importantes interactions intermoléculaires qui ajoutent des voies supplémentaires de désexcitation et donc inhibent les changements de conformation photo-induits, à l’exception des zones de défauts. Ces conclusions ont pu être étayées par des caractérisations complémentaires de fluorescence de SAMs similaires. Nous avons pu démontrer qu’un espaceur alcane correspondant à 11 C permettait un découplage électronique suffisant pour observer de la fluorescence sur des SAMs non denses de dérivés thiolés de fluorescéine. Ces études ont cependant confirmé la difficulté de contrôler la densité surfacique de molécules photosensibles (photochromisme ou fluorescence) insérées au sein de SAMs de thiols. A ce titre, nous avons pu démontrer l’intérêt d’un système moléculaire original possédant une accroche en surface d’encombrement supérieur à celui de la base soufrée des alcanes thiols. Ces systèmes se physisorbent sur des surfaces de graphite, leurs propriétés d’auto-assemblage étant également conservées dans le cas de substrat de graphène sur Cuivre. Ces feuillets possèdent l’avantage d’être facilement transférables sur des substrats transparents. Ces travaux offrent ainsi de nouvelles perspectives pour la réalisation d'expériences in situ simultanées couplant des analyses topographiques à l'échelle moléculaire via l’utilisation de sondes locales (STM ou AFM) et mesures optiques à plus grande échelle (microscopie optique inversée), ouvrant la voie à des caractérisations plus approfondies. / One of the most widely studied type of photochromic molecules are azo-dye molecules whose photo-isomerization reaction entails important mass transport processes in polymer matrices.The aim of this PhD Thesis was to get a better understanding of the key parameters controling such photomechanical properties. For this purpose, we have driven some studies on Self-Assembled Monolayers (SAMs) formed by azobenzene derivatives grafted to alkanethiol linkers on atomically flat gold surfaces. Self-assembling offers the possibility to perform both scanning tunnelling microscopy (STM) experiments at the molecular scale and contact angle measurement at the macroscopic scale.A derivative alkanethiol system has been chosen to take benefit from the alkanethiol ability to form dense and regular self-assembled monolayers. Another interest of the alkanethiol linker is to easily adjust distance between the azo moiety and the gold surface through the length of the alkane chain. Then, this type of SAMs seems to be the good candidate to study the influence of (1) charges coupling effects between the neighbouring azo moieties and between the molecules and the metallic surface and (2) steric hindrance problems. Both a short (3 carbon atoms – “azoC3”) and a long (12 carbon atoms – “azo-C12”) alkane linker have more specifically been investigated. Although STM characterization have shown that azoC3 was organizing into a dense and regular packing showing a network quite similar to the one observed in the case of alkanethiols self-assembly, no modification could be evidenced upon illumination. Polarity modification between the trans and cis photoisomers, probed by wetting measurements, confirm the lack of photo-reactivity of these molecules grafted through a short linker to the metallic substrate. However, photo-isomerization effects have been observed at the macroscopic scale on polycristallines substrates for the long linker (“azo-C12”). The reasons for such behavior come from the intrinsic properties of alkanethiol SAMs: a dense network involves a restricted free volume and significant intermolecular interactions that add additional de-excitation channels thus leading to a quenching of the photoinduced conformational changes, except at surface defects areas. These findings have been supported by complementary characterizations of fluorescence of similar thiolates SAMs. We have demonstrated that an alkane spacer corresponding to 11 C was allowing electronic decoupling thus leading to fluorescent emission in the case of non-dense thiolated SAMs of fluorescein derivatives. However, these studies have also confirmed the difficulty to control the dilution of photosensitive molecules (photochromic or fluorescent) inserted within thiolated SAMs. In order to overcome this problem, we have demonstrated the interest of another original molecular system whose extended head group permits the formation of a network less densely-packed than those formed by alkanethiol derivatives. These molecular systems self-assemble by physisorption onto graphite (HOPG) substrates, their organization properties being also maintained for graphene sheets deposited onto copper substrates. Advantageously, these sheets can easily be transferred to transparent substrates. These studies open thus new perspectives for the realization of simultaneous in-situ experiments coupling molecular scale topography informations using local probe microscopy (AFM or STM) and larger scale optical measurents (inverted optical microscopy) towards more accurate characterizations.

Este trabalho consistiu de estudos da viabilidade da geração e identificação de radicais livres envolvidos em processos oxidativos avançados por via eletroquímica. Para a geração e identificação de radicais livres em eletrodos modificados com organotióis via eletroquímica, escolheu-se uma técnica pouco aplicada para este fim; a espectroscopia de impedância eletroquímica, e o ajuste dos dados experimentais pela proposta de modelos de circuitos equivalentes. O eletrodo de trabalho utilizado (Au) foi caracterizado em meio ácido e básico e diversas monocamadas auto-organizadas conhecidas foram adsorvidas sobre o mesmo e também caracterizadas por esta técnica. Parâmetros importantes como constante dielétrica, capacitância de uma monocamada livre de defeitos e grau de recobrimento foram determinados com êxito. Também foram empregadas moléculas menos utilizadas como modificadoras de eletrodos (fenotiazinas e derivados). As mesmas foram caracterizadas no sistema Au/adsorvente/NaOH, pois, o pH alto garante a formação do radical superóxido e do ânion hidroperóxido. Os mesmos modelos de circuitos equivalentes puderam ser empregados na obtenção dos parâmetros físicos relativos a essas moléculas no sistema eletroquímico utilizado. Em uma etapa subsequente obteve-se a valiosa informação, se as moléculas adsorvidas sobre Au poderiam ser usadas para a geração de superóxido e outros radicais. As monocamadas de tióis, quando utilizadas para gerar radicais livres, se mostraram aptas a gerar superóxido em meio alcalino saturado com oxigênio molecular. Como se demonstrou na etapa de caracterização, as SAM-3 e SAM-6 não formaram um empacotamento totalmente hidrofóbico. Por este motivo, mesmo que superóxido tenha sido gerado, não pôde ser detectado. Já para a fenotiazina e seu metil-derivado, a cinética de adsorção e a utilização de soluções aquosas impediram a formação de um filme completo e homogêneo, imprescindível para a constituição de uma interface hidrofóbica e isolante. Além disso, possíveis reações de complexação entre as moléculas e superóxido, reações entre a fenotiazina cátion-radical e superóxido fazem necessários mais estudos acerca da natureza eletroquímica do sistema, que já é bastante conhecido fotoquimicamente. Posterior a modificação, todos os eletrodos se mostraram ser bastante sensíveis ao pH e aos eletrólitos utlizados, alterando-se a estrutura interna muito facilmente, o qual implica uma limitação no tempo de uso e reprodutibilidade quando da geração de um radical tão reativo quanto superóxido. / This work consisted in testing the viability of investigations into the electrochemical generation and identification of free radicals involved in advanced oxidative processes. In these studies, a technique which is rarely used for the electrochemical generation and identification of free radicals at organothiole-modified electrodes, electrochemical impedancy spectroscopy, was chosen and the experimental data obtained were fitted by equivalent circuit models. A working electrode (Au) was characterized in both acidic and basic media and several known self-assembled monolayers were adsorbed over this electrode and also characterized using this technique. Important parameters such as dielectric constants, capacitance of the monolayers free of defects and coverage were determined with success. Other lesser-known molecules such as phenothiazines and their derivatives were also used .The modified electrodes were characterized in NaOH solution, since the high pH assures the production of superoxide radicals and hydroperoxylate anions. The equivalent circuit model was employed to obtain physical parameters for these molecules in the electrochemical systems studied. In a subsequent step, a valuable piece of information was obtained; it was noted that the molecules adsorbed over Au could be used in order to generate superoxide and other radicals. The ability of thiol monolayers used in the generation of free radicals, to produce superoxides in alkaline media saturated with molecular oxygen was demonstrated. However, characterization of the self-assembled monolayers, SAM-3 and SAM-6, revealed that these were not able to pack in a completely hydrophobic manner. This may account for the fact that the superoxide could not be detected even when it was believed to have formed. For the phenothiazine-modified electrodes, the adsorption kinetics and the utilization of aqueous solutions prevented the formation of an intact and homogeneous film, which is essential in establishing a hydrophobic and isolating interface. Furthermore, possible complexation reactions between the molecules and the superoxide and reactions between the phenothiazine cation-radical and superoxide, point to the need for further studies regarding the electrochemical nature of this system, whose photochemical properties are very well known. Following modification, all the electrodes were shown to be too sensitive to pH and to the electrolytes used, since the inner structure was easily modified, which implies that they would have a limited time of use and in addition that the reproducibility of the rate of generation of reactive radical species such as superoxides could be compromised.

This thesis covers different topics in the field of synthetic organic chemistry combined with the field of surface science and glycobiology. First, the text presents a series of orthogonally protected oligosaccharides (tri-, penta-, and heptasaccharides) of varying length and structures, which are synthesized with the aim of developing novel heterobifunctional biocompatible cross-linkers. Successful conjugation with different chemical handles is also described and used to illustrate the potential implementation of defined carbohydrate based compounds have potential use in biosensing applications. The results of incubation experiments using living cells indicate that the linker is incorporated into cell surfaces and enriched in microdomains. Second, synthesis of various saccharide-terminated alkane thiols immobilized on gold surfaces is reported. The protein adsorption and antifouling characteristics of these surfaces were investigated using model proteins and the common fouling organisms, Ulva linza and Balanus amphitrite. Further, oligo(lactose)-based thiols (di-, tetra-, and hexasaccharides) were synthesized and immobilized on gold nanoparticles to investigate how well these rigid, rod-like oligosaccharides can stabilize such nanoparticles for future use in constructing hybrid nanoparticles. Finally, the thesis describes synthesis of a systematic series of oligo(ethylene) glycols possessing either hydrogen- or methyl-terminated groups. Investigation of the fundamental characteristics of self-assembled monolayers, will give important insights into the design of protein repellant surfaces.

Neste trabalho, aplicamos técnicas de óptica não-linear de segunda ordem, em particular a Espectroscopia por Geração de Soma de Freqüências (SFG) e a Geração de Segundo Harmônico (SHG), para investigar a adsorção e o ordenamento molecular de filmes automontados de polieletrólitos variando-se os parâmetros que influenciam a adsorção (pH, força iônica, densidade de carga), além de investigar a estabilidade térmica e possíveis transições de fases nesses filmes multicamadas como função do pH das soluções e o do número de camadas. A espectroscopia SFG de filmes dos polieletrólitos poly(allylamine hydrochloride) (PAH) e poly(styrene sulfonate) (PSS) permitiu acompanhar a adsorção das camadas pelo monitoramento do campo elétrico na interface (substrato+filme adsorvido)/solução. As medidas de fase do sinal SFG confirmaram a supercompensação de cargas em todos os valores de pH estudados, exceto a pH 12, onde a adsorção foi possível devido a interações eletrostáticas locais. Os filmes secos mostraram grande ordenamento e homogeneidade quando a secagem era espontânea (sem a ação de jato de N2), independentemente do pH. Nestes filmes, observou-se pela primeira vez que as camadas adsorvidas podem alterar o ordenamento e a conformação das cadeias previamente adsorvidas. A espectroscopia SFG também apontou para a redução da densidade de carga e do ordenamento molecular quando a força iônica era aumentada, devido ao efeito de blindagem eletrostática. Os filmes tornaram-se mais inomogêneos e desordenados em virtude da compensação extrínseca. O efeito da força iônica foi o de reduzir a densidade de carga e assim o ordenamento molecular, mesmo se a secagem fosse espontânea. A técnica de SHG foi aplicada a filmes automontados de PAH e PS-119 para confirmar sua estabilidade térmica em função do pH e do número de camadas, além de verificar o ordenamento molecular antes e após o tratamento térmico. Os resultados mostraram que os filmes não são termicamente estáveis: o sinal é completamente destruído à temperatura de 150oC aproximadamente, ao contrário do que relata a literatura. As medidas SHG também confirmaram a isotropia dos filmes no plano das amostras, independente do pH ou do número de camadas. Comparando-se o sinal SHG antes e depois do aquecimento, comprovou-se que após o resfriamento lento, o sinal era restituído a quase o mesmo valor que antes, mostrando que o processo de desordem térmica é reversível. Entretanto, nenhuma transição de fase foi observada, pois a redução do sinal SHG foi lenta e gradual, sem nenhuma variação brusca que caracterizasse uma transição vítrea. Enfim, nossas medidas do sinal SHG em função do número de camadas também discordaram dos resultados da literatura, pois a susceptibilidade de segunda ordem não cresceu linearmente com o número de bicamadas. Isso indica que as moléculas não adsorvem com mesmo ordenamento em cada bicamada. Desse modo, podemos concluir que as técnicas SFG e SHG fornecem informação a nível microscópico que podem levar ao aprimoramento das aplicações dos filmes automontados, e que seriam difíceis de obter com técnicas tradicionais. / In this study, we have applied second-order nonlinear optical techniques, in particular Sum-Frequency Generation (SFG) and Second-Harmonic Generation (SHG), to investigate the adsorption and the molecular ordering of self-assembled polyelectrolyte films varying the parameters which are relevant to polyelectrolyte adsorption (pH, ionic strength, charge density), besides investigating the thermal stability and possible phase transistions in these multilayer films as function of pH of the solutions and of the number of layers. SFG spectroscopy of films fabricated with the polyelectrolytes PAH and PSS allowed us to monitor the adsorption of each layer by the electric field at the (substrate+adsorbed film)/solution interface. Phase-measurements of the SFG signal confirmed that charge supercompensation occurred at all pH values investigated, except at pH 12, where the adsorption was possible by local electrostatic interactions. Dry films have shown great order and homogeneity if the drying was spontaneous (without blow-drying with N2), independently of pH. In these films, it was observed for the first time that layer adsorption can modify the order and the conformation of previously adsorbed chains. SFG spectroscopy also pointed to the reduction of the charge density and of the molecular order if the ionic strength was increased, due to the electrostatic screening effect. The films were more inhomogeneous and disordered due to extrinsic charge compensation. The effect of the ionic strength was to reduce the charge density and the molecular order, even if the drying were slow (spontaneous). The SHG technique was applied to LBL films of PAH and PS-119 to confirm their thermal stability as a function of pH of the solutions and the number of layers, besides comparing the molecular order before and after the thermal treatment. The results have shown that the films are not thermally stable, with the SHG signal nearly vanished if the temperature of 150 oC is reached, in contrast of what is reported in the literature. SHG measurements have also confirmed that the films are isotropic in the plan of the samples, independent of pH or the number of layers. Comparing the SHG signal before and after heating, it was found that the SHG signal was considerably reduced at high temperatures, but after slow cooling it was recovered to almost the same value as before heating, showing that the thermal disorder is reversible. However, no phase transistion was observed, since the SHG signal reduction was slow and gradual, without any sudden change that would characterize a glass transition. At last, our SHG measurements as a function of the number of layers also disagreed with results in the literature, therefore the second order susceptibility did not grow linearly with the number of bilayers. This indicates that the molecules do not adsorb with same order in each bilayer. Therefore, we can conclude that SFG and SHG techniques provide information on the film arrangement at the microscopic level which could be difficult to get with traditional techniques and could also lead to the improvement of applications of LBL films.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-06-02T19:23:04Z No. of bitstreams: 1 RitaCarvalho.pdf: 1268991 bytes, checksum: 9f30de20b2377b94837ba5ffe305debe (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-02T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RitaCarvalho.pdf: 1268991 bytes, checksum: 9f30de20b2377b94837ba5ffe305debe (MD5) Previous issue date: 2016-07-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / Cardiovascular diseases (CVDs) are considered as an important cause of morbidity and premature mortality worldwide. Rapid diagnosis of CVD is extremely important to ensure the survival of the patient. Myoglobin (Mb), for its low molecular weight is quickly released in the body, resulting in high sensitivity in order to be as valuable biomarker of acute myocardial infarction (AMI). Therefore, this study aims to develop an efficient platform, sensitive and stable for the immobilization of antibodies (Ab) myoglobin applicable to the monitoring of antigens (Ag) myoglobin using surface plasmon resonance (SPR). In this sense, the cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry and impedance spectroscopy were used in selfassembled monolayers research (SAMs) simple and mixed acid 11-mercaptoundecanoic (MUA) and 3-mercaptopropionic acid (MPA). The mixed SAM MPA / MUA 3: 1 ratio showed low resistance to charge transfer and high surface coverage. In order to investigate the SAM capacity MPA / MUA opposite the locking Ac-MB were made comparative studies for the evaluation of the interaction of Ac-MB SAM MPA / MUA well as for SAM MPA / MUA modified polyamidoamine dendrimer of generation 5 (G5 PAMAM). Then, after choosing the more sensitive platform made up AC-Mb interaction studies with different concentrations of Ag-Mb (0,001; 0,5; 0,8; 1 and 500 µg.mL-1) through immunoassay in a "sandwich". The three-dimensional structure of the dendrimer PAMAM G5 favored amplification of SPR signal as grants most accessible area for the immobilization of antibody Mb. The sandwich immunoassay amplified the interaction signal Ac / Ag Mb, with significant advantages in sensitivity immunosensor. The results show that it was possible to develop an immunosensor capable of detecting low concentrations (0.00067 μg.mL-1) Ag-Mb. In this sense, the proposed system has great potential alternative to early diagnosis, simple and fast IAM. / As doenças cardiovasculares (DCVs) são consideradas como importante causa de morbidade e mortalidade prematura em todo o mundo. O diagnóstico rápido das DCVs é extremamente importante para garantir a sobrevivência do paciente. A mioglobina (Mb), por seu baixo peso molecular, é rapidamente liberada no organismo, resultando em elevada sensibilidade de forma a se constituir como precioso biomarcador de infarto agudo do miocárdio (IAM). Portanto, este trabalho tem por objetivo o desenvolvimento de uma plataforma eficiente, sensível e estável para a imobilização de anticorpos (Ac) de mioglobina aplicável ao monitoramento de antígenos (Ag) de mioglobina empregando ressonância de plásmons de superfície (SPR). Neste sentido, as técnicas de voltametria cíclica, voltametria de pulso diferencial e impedância eletroquímica foram empregadas na investigação de monocamadas auto-organizadas (SAMs) simples e mistas de ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA) e ácido 3-mercaptopropiônico (MPA). A SAM mista MPA/MUA de proporção 3:1 apresentou baixa resistência à transferência de carga e elevada cobertura de superfície. Com o propósito de investigar a capacidade da SAM de MPA/MUA frente à imobilização de Ac-Mb foram feitos estudos comparativos para a avaliação da interação da do Ac-Mb com a SAM de MPA/MUA bem como para a SAM de MPA/MUA modificada com dendrímero de poliamidoamina de geração 5 (PAMAM G5). Em seguida, após a escolha da plataforma mais sensível, fez-se os estudos da interação do Ac-Mb com diferentes concentrações do Ag-Mb (0,001; 0,5; 0,8; 1 e 500 µg mL-1) através de imunoensaio em formato “sanduíche”. A estrutura tridimensional do dendrímero PAMAM G5 favoreceu a amplificação do sinal de SPR, pois concede uma maior área acessível para a imobilização do anticorpo da Mb. O imunoensaio em sanduíche amplificou o sinal de interação Ac/Ag da Mb, apresentando vantagens significativas na sensibilidade do imunossensor. Os resultados mostram que foi possível desenvolver um imunossensor capaz de detectar baixas concentrações (0,00067 µg.mL-1) do Ag-Mb. Neste sentido, o sistema proposto apresenta grande potencial alternativo de diagnóstico precoce, simples e rápido do IAM.

Neste trabalho foi estudado o desenvolvimento de uma superfície modelo de silício monocristalino, SiO2/Si, modificada com organossilanos derivados de N-heterocíclicos que permitisse a imobilização de um complexo de coordenação, FeTIM. Estas superfícies modificadas poderão ser empregadas em estudos de reatividade frente a analitos de interesse, como o NO. Sob esse aspecto, a síntese desses novos silanos, contendo N-heterocíclicos, e o desenvolvimento de uma metodologia de formação dos filmes finos automontados, sobre a superfície de SiO2/Si, tornou-se de grande relevância na aplicabilidade deste trabalho. Para a obtenção dessas superfícies, fez-se necessária a compreensão dos parâmetros de formação dos filmes de silanos. Os parâmetros estudados foram os efeitos do tempo de adsorção, da concentração da solução dos silanos, da polaridade do solvente e do tamanho da cadeia alquílica do silano no processo de formação dos filmes. Deste modo, foi possível inferir sobre as alterações na morfologia e na estrutura química dos filmes formados, através de medidas de Espectroscopia de Fotoelétrons excitados por Raios-X (XPS), Microscopia de Força Atômica (AFM) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A imobilização do complexo de FeTIM sobre a superfície organomodificada foi comprovada pela variação da linha de fotoemissão do Fe 2p nas medidas de XPS. / This work describes the study of model surfaces on oxidized silicon wafer, SiO2/Si, modified with N-heterocycles rings, that allows the grafting of a macrocycle iron complex, FeTIM, that could be used in reactivity studies, with biologically relevant molecules, as nitrogen monoxide (NO). On this way, the synthesis of these silanes and a new methodology of the formation of self-assembled monolayers had become a relevant question on this work applicability. These thin films contain silanes bearing nitrogenated Lewis bases on silicon surfaces. In order to obtain these modified surfaces, it was necessary a comprehensive study of the adsorption parameters of the thin films. The parameters studied were the effect of: adsorption time, the solution concentration, the role of the solvents polarity and the chain length alkylsilanes in the film formation. Then, it was possible to infer about the film\'s morphology differences and chemical structures by the XPS, AFM and MEV measurements. X-ray photoemission lines of Fe 2p were used to probe the iron chemical environment in the chemically adsorbed macrocycles complexes.