BEZERRA, Walderly Melgaço. Expressão de uma proteína YD de Chromobacterium violaceum em sistemas heterólogos: potencial no controle de pragas e fungos. 2008. 53 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T11:44:51Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:26:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) Previous issue date: 2008 / Chromobacterium violaceum is a free-living betaproteobacterium, which is found in the water and soil environments of tropical and subtropical regions. C. subtsugae, another species of the same genus, is toxic towards insects belonging to several orders. Among the genes that may be involved in the insecticidal activity displayed by these bacteria are those that encode chitinases. In addition to these chitinases, a protein containing YD repeats with potential insecticidal activity, encoded by the gene cv2776, was also identified in the genome of C. violaceum ATCC 12472. Similar proteins have also been found in the genomes of Xenorhabdus bovienii and Photorhabdus luminescens. The YD motif comprises 20 amino acids, with the consensus sequence Gx3-9YxYDx2GR(L, I or V)x3-10G, where x represents any amino acid. The protein TccC, from P. luminescens, has nine YD repeats in its sequence, as well as the protein SepC, from Serratia entomophila. SepC, along with two other toxins, SepA and SepB, are able to cause the "amber" disease in Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). In the present work, the DNA coding seuquence of the gene cv2776 of C. violaceum ATCC 12472 was cloned in two different heterologous systems. In Escherichia coli, the coding sequence was expressed under control of the promoter araBAD, induced by L-arabinose. The protein rCV2776 was detected by imunoblotting in the insoluble fraction of induced E. coli cells. The rCV2776 present in the total insoluble cell fraction caused the death of Callosobruchus maculatus larvae, reducing the number of emerged adults in 78% and also decreasing the average weight of the insects. The E. coli cell fraction containing the recombinant protein also affected the vegetative growth of the phytopatogenic fungi Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. When the fraction containing rCV2776 was incorporated at 1.% (w/v) in the medium, the inhibition percentages of the mycelium growth were 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) and 71.1% (S. rolfsii). In the yeast Pichia pastoris, the coding sequence was expressed under the control of the promoter PAOX, which is induced by methanol as the sole carbon source. When expressed in P. pastoris, the recombinant protein was apparently degraded by endogenous proteases and could not be detected by SDS-PAGE or Western Blotting, even when 8 mg of protein was loaded into the gel. In conclusion, the recombinant protein CV2776 present in the insoluble fraction of induced E. coli cells was effective in controlling the emergence of the cowpea weevil, as well as slowing the growth of M. phaseolina and S. rolfsii / Chromobacterium violaceum é uma betaproteobactéria de vida livre encontrada em regiões tropicais e subtropicais. C. subtsugae, bactéria do mesmo gênero, possui atividade tóxica contra insetos de diversos gêneros. Entre os genes que podem estar envolvidos no potencial inseticida dessa bactéria, destacam-se aqueles que codificam quitinases. Em adição, identificou-se também no genoma de C. violaceum ATCC 12472 uma proteína contendo repetições YD com potencial atividade inseticida, codificada pelo gene cv2776, similar àquelas produzidas por Xenorhabdus bovienii e Photorhabdus luminescens. O motivo YD compreende 20 aminoácidos, com sequência consenso Gx3-9YxYDx2GR(L, I ou V)x3-10G (x representa qualquer aminoácido). A proteína TccC, de P. luminescens, possui 9 repetições YD, assim como a proteína SepC, de Serratia entomophila. SepC, juntamente com outras duas toxinas, SepA e SepB, são suficientes para causar a doença “âmbar” em Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). No presente trabalho, a região codificadora do gene cv2776 de C. violaceum ATCC 12472 foi clonada em dois diferentes sistemas de expressão heteróloga. Em Escherichia coli, o gene foi expresso sob controle do promotor araBAD, induzido por L-arabinose. A proteína rCV2776 foi detectada por ensaio de imunoblotting na fração insolúvel das células de E. coli induzidas. A rCV2776 presente na fração insolúvel das células dessa bactéria teve efeito letal sobre larvas de Callosobruchus maculatus, diminuindo em até 78% o número de insetos adultos emergidos, além de diminuir o peso médio desses insetos. Além disso, a fração celular de E. coli contendo rCV2776 mostrou-se capaz de inibir o crescimento vegetativo de três fungos fitopatogênicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Quando incorporada no meio de cultura em uma concentração de 1% (m/v), essa fração causou percentuais de inibição de crescimento do micélio de 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) e 71.1% (S. rolfsii), respectivamente. Na levedura Pichia pastoris, a região codificadora foi expressa sob controle do promotor PAOX, que é induzido na presença de metanol como única fonte de carbono. Quando expressa em P. pastoris, a proteína recombinante foi aparentemente degradada por proteases endógenas, e não pôde ser detectada em análises de SDS-PAGE ou Western Bloting, mesmo quando foram aplicados 8,0 mg do sobrenadante concentrado e liofilizado no gel de eletroforese. Em conclusão, a proteína rCV2776 presente na fração insolúvel das células de E. coli induzidas foi efetiva em controlar a emergência do caruncho do feijão-de-corda, bem como em retardar o crescimento de M. phaseolina e S. rolfsii

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-03-15T15:57:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 580067 bytes, checksum: 47340ceee417104c15e8ddd35f614b96 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-15T15:57:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 580067 bytes, checksum: 47340ceee417104c15e8ddd35f614b96 (MD5) Previous issue date: 2016-01-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Abelhas africanizadas e silvestres são potencialmente suscetíveis a inseticidas sintéticos, mas podem não ser a inseticidas botânicos. O objetivo do trabalho foi avaliar a seletividade dos extratos de Nicotiana tabacum L. (folha e rolo), Anadenanthera columbrina Vell. e Agave americana L., às abelhas Apis mellifera e Partamona helleri. Avaliou-se ainda o consumo de dieta, a taxa respiratória e o voo das abelhas como parâmetros subletais. Para tanto, realizou-se bioensaios de mortalidade com abelhas adultas mediante exposição por contato e ingestão, utilizando o inseticida imidaclopride como controle positivo. As abelhas sobreviventes foram submetidas aos testes de respiração e voo. A tolerância das abelhas aos extratos variou entre A. mellifera e P. helleri, de acordo com o tipo de extrato utilizado e em resposta ao tipo de exposição. Após contato, A. mellifera apresentou maior suscetibilidade aos extratos de N. tabacum (rolo) e A. americana. Nos bioensaios de ingestão, o extrato de A. americana reduziu a sobrevivência de P. helleri e A. mellifera. Já a ingestão de A. colubrina reduziu a sobrevivência de A. mellifera. Apesar de ter ocorrido toxicidade de alguns extratos às abelhas, a sobrevivência foi sempre maior em relação aos resultados obtidos com o imidaclopride, que foi letal para 100 % das abelhas. No consumo da dieta foram observadas diferenças entre os tratamentos, mas que não é observada quando comparados os tratamentos com seus respectivos controles. Foi observado que após o jejum, A. mellifera ingeriu pouco alimento contaminado independentemente do tratamento, e quando oferecido alimento livre dos extratos, consumiu maior quantidade do alimento. Ao contrário, P. helleri ingeriu maior quantidade de alimento contaminado e reduziu o consumo de alimento puro ao longo do tempo (exceto N. tabacum rolo). Ainda que tenham consumido maior quantidade de alimento contaminado, P. helleri foi mais tolerante aos extratos (exceto as análises de ingestão de A. americana). Tanto nos bioensaios por contato quanto por ingestão, não foram detectados efeitos negativos no voo e na taxa de respiração das abelhas sobreviventes. Concluímos então, que a suscetibilidade aos extratos é variável entre espécies de abelhas, entre compostos e de acordo com o tipo de exposição. De forma geral os extratos se apresentam seletivos as abelhas, e mesmo os extratos mais tóxicos foram mais seletivos do que o imidaclopride. Assim, caso sejam efetivos contra insetos-alvo, os extratos de N. tabacum (folha e rolo), A. columbrina e A. americana podem ser utilizados como alternativa aos compostos sintéticos de forma a contribuir para a preservação de abelhas melíferas e, principalmente, de abelhas sem ferrão. / Africanized and wild bees are potentially susceptible to synthetic insecticides, but may not be the botanical insectieides. The objective was to evaluate the selectivity on bees of botanical extracts of Nicotiana tabacum L. (leaf and roll), Anadenanthera columbrina Vell. and Agave americana L., to bees Apis mellífera and Partamona helleri. lt was also evaluated the dietary consumption, respiration rate and bee flight as sublethal parameters. Therefore, mortality bioassays of adult bees were done by means of contact exposure and ingestion, using the pesticide imidacloprid as a positive control. The surviving bees were submitted to respiration rate and flight tests. Apis mellifera reduced the probability of survival after contact wich the extract of N. tabacum (roll) and A. americana. In the ingestion bioassays, the extract of A. americana reduced the servival of P.helleri and A. mellifera, and A.colubrins reduced the survival of A. melífera. The imidacloprib was lethal to 100% of the bees. In dietary consumption differences were detected among treatments, but thatwas not observed when comparing the treatments with their respective controls. It was observed that after fasting. A. mellifera ingestede some contaminated food regardless of treatment, and when offeredfree foods extracts, it consumed greater amount of food. On the contrary, P. helleri ingested greater amount of contaminated food and reduced the consumption of pure food. Although they have consumed larger amounts of contaminated food, in general P. helleri was more tolerant to rhe extracts. In both biossays by contact and by ingestion negative effects were not detected for the flight and respiration rate of the surviving bees. It was conclude that extracts susceptility varies among species of bees between compounds and in accordance with the type of exposure. The extracts were seletive to bees in general, and even more toxic extracts were more selective than imidacloprid. So if they were effective against target insects, the evaluated extracts can be used as an alternative to synthetic compounds to contribute to the preservation of honey bees of stingless bees.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5234352 bytes, checksum: 404f7b4f1ab797fa6090d6cd85ee8163 (MD5) Previous issue date: 2013-08-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Plants are sessile organisms susceptible to biotic and abiotic stresses. Insect herbivore attacks are factors that affect their survival and development. To defend themselves, plants produce and release chemical compounds, such as non protein amino acids, that negatively affect the development processes of their attackers, as well as use phytohormones that regulate defense responses against herbivory. In the present work, we seek to understand in depth the insecticidal activity related to ConM, a lectin isolated from beach bean seeds (Canavalia maritima Aub.), through their crystal structure analysis in complex with the non protein amino acid GABA (gamma-aminobutyric acid) and adenine, a nitrogen base-precursor of cytokinins, phytohormones involved in defense responses against insect herbivores. In this way, we co-crystallized ConM with GABA and soaked the derived crystals into an adenine 5mM solution. It was viewed through ConM monomeric model that GABA stabilization occurs through interactions displayed with amino acid residues that participate in the coordination of its isomer alpha-aminobutyric acid (Abu). In the other hand, adenine molecule displays interactions with amino acid residues from ConM Carbohydrate Recognition Domain due ahydrophobic pocket adjacently localized to this ligand-binding site and formed from a secondary non repetitive structure of β-bulge. A dimeric model of ConM reveals that lectin insecticidal activity is related to conformational changes of Gln132, resulting in GABA release without quaternary structure change. Hence, the presented results might contribute to greater understanding of lectins interactions with different chemical ligands, helping their application as biotechnological tools. / Plantas são organismos sésseis que encontram-se susceptíveis a estresses bióticos e abióticos. O ataque de insetos herbívoros é um fator que afeta sua sobrevivência e seu desenvolvimento. Como defesa, estes organismos são capazes de produzir e liberar compostos químicos, como aminoácidos não proteicos, que interferem no desenvolvimento dos insetos agressores, e utilizam fitohormônios para regular suas respostas de defesa. No presente trabalho, buscamos entender o papel inseticida da ConM, uma lectina isolada de sementes do feijão-de-praia (Canavalia maritima Aub.), a partir da análise de sua estrutura tridimensional em complexo com o aminoácido não proteico GABA (ácidogama-aminobutírico) e com a base nitrogenada adenina, precursora das citocininas, fitohormônios envolvidos com processos de defesa contra insetos herbívoros. Para tanto, resolvemos a estrutura cristalográfica da ConM co-cristalizada com o GABA e soaked com a adenina 5mM. O modelo monomérico da lectina mostrou que o GABA encontra-se coordenado por interações com resíduos de aminoácidos previamente reportados como sendo participantes da estabilização do ácido alfaaminobutírico (Abu). A adenina, por outro lado, é estabilizada por interações com resíduos constituintes do domínio de reconhecimento a carboidrato da ConM, o que pode ser explicado pela presença de uma região hidrofóbica adjacente a este sítio, formada por uma estrutura secundária não repetitiva do tipo β-bulge. Um modelo dimérico da ConM revela que a atividade inseticida de lectinas está relacionada com mudanças conformacionais da Gln132, permitindo que o GABA seja liberado sem alteração da estrutura quaternária. Assim, os resultados aqui apresentados podem contribuir para um maior entendimento acerca da capacidade de interação de lectinas vegetais com diferentes tipos de ligantes, facilitando sua utilização como ferramenta biotecnológica.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-24T16:14:21Z No. of bitstreams: 1 Gustavo Neto Bandeira.pdf: 480654 bytes, checksum: e048697a909f44f9284d66f9f557a5c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-24T16:14:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gustavo Neto Bandeira.pdf: 480654 bytes, checksum: e048697a909f44f9284d66f9f557a5c9 (MD5) Previous issue date: 2009-07-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The family Brassicaceae is one of the most economically important in the world, having as their main pest to Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae), which causes great damage to the crop with up to 100% of yield losses. In order to investigate alternatives to synthetic insecticides, medicinal plants have been in recent years in search of compounds with insecticidal properties, repellent, fumigant or that act directly on the disruption of biological cycles of pests such as P. xylostella. Furthermore, the literature is scarce when it comes to studies with the use of essential oils and organic extracts to verify their potential insecticide. Accordingly, the medicinal plants chosen to carry out the research potential of the insecticide are the following families: Tiliaceae (Muntingia calabura) Piperaceae (Piper marginatum) Rutaceae (Citrus reticulata x Citrus sinensis, C. reticulata Blanco) and Myrtaceae (Melaleuca leucadendron). The bioassays carried out indicated that P. xylostella larvae were susceptible to all selected plant extracts and oils tested. Furthermore the extract etanolic of flowers (MCEFL) achieved 99.5% of larvalmortality and a lethal concentration LC50 estimated of 1.63 mg/mL. In addition the extract MCEFL caused 100% of pupal inviability on treated larvae. The development of larvae increased 1.62 days when being treated with the extract hexanic of fruits (MCHFR) compared to the untreated ones. P. xylostella was susceptible to all essential oils tested. Among the oils the mosttoxic was those prepared from Citrus (LC50 of 0.55ppm for C. reticulata and 0,78ppm for C. sinensis x C. reticulata). Also, the oil from C. reticulata x C. sinensis increased larval development in 2.2 days compared to the other oils and untreated larvae. / A família Brassicaceae é uma das mais economicamente importantes no mundo, tendo como sua principal praga a Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae), que causa grandes danos à cultura chegando a atingir até 100% de perdas na produção. Tendo em vista a investigação de alternativas aos inseticidas sintéticos, as plantas medicinais tem sido alvo nos últimos anos na busca de compostos com propriedades inseticidas, repelentes, fumigante ou que atuem diretamente na interrupção dos ciclos biológicos de pragas, como a P. xylostella. Por outro lado, a literatura é escassa, quando se trata de estudos com o uso de óleos essenciais e extratos orgânicos para verificar seu potencial inseticida. Nesse sentido, as plantas medicinais escolhidas para realização da investigação do potencial inseticida foram: Muntingia calabura; Piper marginatum; Citrus reticulata x Citrus sinensis, C. reticulata Blanco e Melaleuca leucadendra. Os experimentos realizados com extratos e óleos das diferentes plantas selecionadas mostraram que as larvas de P. xylostella foi sensível a todos. Com relação ao extratos, o mais tóxico foi o extrato etanólico da flor, que promoveu 99,5% de mortalidade de larvas e uma CL50 estimada de 1,63 mg/mL. Na duração da fase larval, o extrato hexânico do fruto prolongou essa fase em 1,62 dias em relação ao controle e quanto à mortalidade da fase pupal, o extrato etanólico da flor inviabilizou completamente a emergência de adultos. As larvas de P. xylostella foi sensível atodos os óleos testados. Os mais tóxicos foram os óleos de Citrus (CL50 0,55ppm para C. reticulata e CL50 0,78ppm para C. sinensis x C. reticulata). Quanto a duração da fase larval, o melhor resultado foi observado para o óleo de C. reticulata x C. sinensis, que apresentou um incremento de 2,2 dias com relação ao controle.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-28T15:28:48Z No. of bitstreams: 1 NicolleRibeiro.pdf: 712752 bytes, checksum: ab82a73b9089c03e3b07ca085fd8630b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-28T15:28:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NicolleRibeiro.pdf: 712752 bytes, checksum: ab82a73b9089c03e3b07ca085fd8630b (MD5) Previous issue date: 2010-02-01 / The cultures of agronomic interest suffer with great infestations of whitefly, species Bemisia tabaci biotype B. Those infestations have been promoting economic losses due to the direct and indirect damages. The direct damages are characterized by the appearance of physiologic anomalies with alterations in the vegetative and reproductive development of the cultures. On the other hand, the indirect damages show for the appearance of fungus saprophytic that interfere in the process photosynthetic of the plants, besides presenting the capacity to transmit diseases you turn, as the geminivirus. With relationship to the damages provoked by the whitefly biotype B, several control strategies have been adopted objectifying to minimize the agricultural losses. Seeking an alternative to the synthetic insecticides, the use of products of vegetable origin has been revealing a promising source for the control of B. tabaci biotype B. Among those vegetable products, the essential oils have been presenting promising results with relationship to the effects in the repellence, inhibition of the feeding and of the growth, alterations in the sexual behavior, the adults' sterilization, mortality in the immature or adult phase, amongother characteristics for the control of the pest. This work objectified to evaluate the insecticide potential of the essential oil of the peel of six species of Citrus, cultivated in Santana of Mundaú - AL, on B. tabaci biotype B. The oil of C. limon promoted 97% of mortality in the concentrationof 4.5μL/L of air. The values of the CL50 of the oils of Citrus and eugenol varied of 0.20 to 5.80 μL/L of air. The minimum concentrations of oil tested to promote the oviposition deterrence were: 1.0; 3.0; 3.5; 3.7 and 7.0μL/L of air of the oil of C. reticulata, C. sinensis x C. reticulata, C. aurantium, C. limon and C. sinensis, respectively. With base in the biological potential of the oils of Citrus, the accomplishment of investigative studies facilitated to verify that the activity fumigant of those oils essential is promising for the control of the B. tabaci. / As culturas de interesse agronômico sofrem com grandes infestações de mosca-branca, espécie Bemisia tabaci biótipo B. Essas infestações têm promovido perdas econômicas devido aos danos diretos e indiretos. Os danos diretos se caracterizam pelo aparecimento de anomalias fisiológicas com alterações no desenvolvimento vegetativo e reprodutivo das culturas. Por outro lado, os danos indiretos se manifestam pelo aparecimento de fungos saprófitas que interferem no processo fotossintético das plantas, além de apresentar a capacidade de transmitir doenças virais, como o geminivírus. Com relação aos danos provocados pela mosca-branca biótipo B, várias estratégias de controle têm sido adotadas objetivando minimizar as perdas agrícolas. Visando uma alternativa aos inseticidas sintéticos, o uso de produtos de origem vegetal tem se revelado uma fonte promissora para o controle de B. tabaci biótipo B. Entre esses produtos vegetais, os óleos essenciais têm apresentado resultados promissores quanto aos efeitos na repelência, inibição da alimentação e do crescimento, alterações no comportamento sexual, esterilização dos adultos, mortalidade na fase imatura ou adulta, entre outras características para o controle dapraga. Este trabalho objetivou avaliar o potencial inseticida do óleo essencial da casca de seis espécies de Citrus, cultivados em Santana do Mundaú - AL, sobre B. tabaci biótipo B. O óleo de C. limon promoveu 97% de mortalidade na concentração de 4,5μL/L de ar. Os valores das CL50dos óleos de Citrus e eugenol variaram de 0,20 a 5,80μL/L de ar. As concentrações mínimas de óleo testado para promover a deterrência de oviposição foram: 1,0; 3,0; 3,5; 3,7 e 7,0μL/L de ar do óleo de C. reticulata, C. sinensis x C. reticulata, C. aurantium, C. limon e C. sinensis, respectivamente. Com base no potencial biológico dos óleos de Citrus, a realização de estudos investigativos possibilitou verificar que a atividade fumigante desses óleos essenciais são promissores para o controle da B. tabaci.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Chromobacterium violaceum à uma betaproteobactÃria de vida livre encontrada em regiÃes tropicais e subtropicais. C. subtsugae, bactÃria do mesmo gÃnero, possui atividade tÃxica contra insetos de diversos gÃneros. Entre os genes que podem estar envolvidos no potencial inseticida dessa bactÃria, destacam-se aqueles que codificam quitinases. Em adiÃÃo, identificou-se tambÃm no genoma de C. violaceum ATCC 12472 uma proteÃna contendo repetiÃÃes YD com potencial atividade inseticida, codificada pelo gene cv2776, similar Ãquelas produzidas por Xenorhabdus bovienii e Photorhabdus luminescens. O motivo YD compreende 20 aminoÃcidos, com sequÃncia consenso Gx3-9YxYDx2GR(L, I ou V)x3-10G (x representa qualquer aminoÃcido). A proteÃna TccC, de P. luminescens, possui 9 repetiÃÃes YD, assim como a proteÃna SepC, de Serratia entomophila. SepC, juntamente com outras duas toxinas, SepA e SepB, sÃo suficientes para causar a doenÃa âÃmbarâ em Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). No presente trabalho, a regiÃo codificadora do gene cv2776 de C. violaceum ATCC 12472 foi clonada em dois diferentes sistemas de expressÃo heterÃloga. Em Escherichia coli, o gene foi expresso sob controle do promotor araBAD, induzido por L-arabinose. A proteÃna rCV2776 foi detectada por ensaio de imunoblotting na fraÃÃo insolÃvel das cÃlulas de E. coli induzidas. A rCV2776 presente na fraÃÃo insolÃvel das cÃlulas dessa bactÃria teve efeito letal sobre larvas de Callosobruchus maculatus, diminuindo em atà 78% o nÃmero de insetos adultos emergidos, alÃm de diminuir o peso mÃdio desses insetos. AlÃm disso, a fraÃÃo celular de E. coli contendo rCV2776 mostrou-se capaz de inibir o crescimento vegetativo de trÃs fungos fitopatogÃnicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Quando incorporada no meio de cultura em uma concentraÃÃo de 1% (m/v), essa fraÃÃo causou percentuais de inibiÃÃo de crescimento do micÃlio de 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) e 71.1% (S. rolfsii), respectivamente. Na levedura Pichia pastoris, a regiÃo codificadora foi expressa sob controle do promotor PAOX, que à induzido na presenÃa de metanol como Ãnica fonte de carbono. Quando expressa em P. pastoris, a proteÃna recombinante foi aparentemente degradada por proteases endÃgenas, e nÃo pÃde ser detectada em anÃlises de SDS-PAGE ou Western Bloting, mesmo quando foram aplicados 8,0 mg do sobrenadante concentrado e liofilizado no gel de eletroforese. Em conclusÃo, a proteÃna rCV2776 presente na fraÃÃo insolÃvel das cÃlulas de E. coli induzidas foi efetiva em controlar a emergÃncia do caruncho do feijÃo-de-corda, bem como em retardar o crescimento de M. phaseolina e S. rolfsii / Chromobacterium violaceum is a free-living betaproteobacterium, which is found in the water and soil environments of tropical and subtropical regions. C. subtsugae, another species of the same genus, is toxic towards insects belonging to several orders. Among the genes that may be involved in the insecticidal activity displayed by these bacteria are those that encode chitinases. In addition to these chitinases, a protein containing YD repeats with potential insecticidal activity, encoded by the gene cv2776, was also identified in the genome of C. violaceum ATCC 12472. Similar proteins have also been found in the genomes of Xenorhabdus bovienii and Photorhabdus luminescens. The YD motif comprises 20 amino acids, with the consensus sequence Gx3-9YxYDx2GR(L, I or V)x3-10G, where x represents any amino acid. The protein TccC, from P. luminescens, has nine YD repeats in its sequence, as well as the protein SepC, from Serratia entomophila. SepC, along with two other toxins, SepA and SepB, are able to cause the "amber" disease in Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). In the present work, the DNA coding seuquence of the gene cv2776 of C. violaceum ATCC 12472 was cloned in two different heterologous systems. In Escherichia coli, the coding sequence was expressed under control of the promoter araBAD, induced by L-arabinose. The protein rCV2776 was detected by imunoblotting in the insoluble fraction of induced E. coli cells. The rCV2776 present in the total insoluble cell fraction caused the death of Callosobruchus maculatus larvae, reducing the number of emerged adults in 78% and also decreasing the average weight of the insects. The E. coli cell fraction containing the recombinant protein also affected the vegetative growth of the phytopatogenic fungi Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. When the fraction containing rCV2776 was incorporated at 1.% (w/v) in the medium, the inhibition percentages of the mycelium growth were 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) and 71.1% (S. rolfsii). In the yeast Pichia pastoris, the coding sequence was expressed under the control of the promoter PAOX, which is induced by methanol as the sole carbon source. When expressed in P. pastoris, the recombinant protein was apparently degraded by endogenous proteases and could not be detected by SDS-PAGE or Western Blotting, even when 8 mg of protein was loaded into the gel. In conclusion, the recombinant protein CV2776 present in the insoluble fraction of induced E. coli cells was effective in controlling the emergence of the cowpea weevil, as well as slowing the growth of M. phaseolina and S. rolfsii

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-09-12T13:35:51Z No. of bitstreams: 2 Jaqueline_Oliveira2018.pdf: 1156255 bytes, checksum: ee45a479286ea424be160c8d58b44964 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-12T13:35:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Jaqueline_Oliveira2018.pdf: 1156255 bytes, checksum: ee45a479286ea424be160c8d58b44964 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-07-06 / Lectins are proteins belonging to a diverse superfamily, which has as its main characteristic, the capacity to specifically and selectively recognize carbohydrates. They are present in a great variety of microorganisms, such as viruses, bacteria, fungi, plants, and animals. Due to its ability to recognize a large number of glycans, they behave as mediators in many biological processes, as in cell migration, immunologic defense and in bacterial, protozoan and viral infections. Among all, plant lectins are the most studied, showing structural heterogeneities, mainly on its carbohydrates binding sites, what grants several biological activities to these proteins, among them, the antimicrobial, insecticide, mitogenic, anti-tumoral and anti-inflammatory activities. On the last decades, a large number of studies have demonstrated the application of lectins as a potential biotechnological tool on diverse fields like on agriculture, being used at the genetic improvement of grains; on biochemistry, where it’s used at pre-purification of glycoproteins, and on the histochemistry, applied at the distinction between normal and tumoral cells. Nowadays, one of the researched applications is the potential of lectins as a carcinogenic agent, so as its uses on the discovery of biomarkers. The present study shows a brief history of the plant lectins, their functional characteristics, and structural, their biotechnological applications, such as in the biomarkers discovery, covering too, some of the techniques employed to this function, like the Lectin Affinity Chromatography (LAC), Lectin Microarrays and the Antibody-Lectin Sandwich Array. / As lectinas são proteínas pertencentes a uma diversificada superfamília, que possui como principal característica a capacidade de reconhecer carboidratos de modo específico e seletivo. Estão presentes nos mais variados organismos, tais como, vírus, bactérias, fungos, vegetais e animais. Devido à sua habilidade de reconhecer uma grande quantidade de glicanos, são mediadoras em diversos processos biológicos, como migração celular, defesa imunológica, infecção por bactérias, vírus e protozoários. As lectinas de plantas são as mais estudadas e revelam-se com heterogeneidades estruturais principalmente na constituição de seus sítios de ligação ao carboidrato, o que lhes confere múltiplas atividades biológicas, dentre elas, a ação antimicrobiana, a ação inseticida, a ação mitogênica, a ação antitumoral e a anti-inflamatória. Nas últimas décadas, um grande número de publicações tem demonstrado a aplicação das lectinas como ferramenta biotecnológica potencial em diferentes áreas, como na agricultura, para melhoria genética de cultura de grãos; na bioquímica, utilizadas na pré-purificação de glicoproteínas e na histoquímica, para distinguir células tumorais das normais. Umas das aplicações amplamente pesquisadas na atualidade é o potencial das lectinas como agentes carcinogênicos, como também a sua utilização na descoberta de biomarcadores. Neste trabalho, apresentamos uma visão geral sobre as lectinas, incluindo um breve histórico das lectinas vegetais, suas características funcionais e estruturais básicas, suas atividades com potenciais aplicações biotecnológicas dentre elas a inseticida, a antimicrobiana e a antitumoral, bem como o emprego dessas proteínas na descoberta de biomarcadores tumorais. Algumas técnicas utilizadas para essa finalidade como a cromatografia de afinidade com lectina imobilizada (LAC - Lectin Affinity Chromatography) e os microarranjos de lectinas e lectinas/anticorpo no formato sanduíche (ALSA - Antibody-Lectin Sandwich Array) são apresentadas.

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-03-23T18:09:27Z No. of bitstreams: 1 Lima, Barbara Gomes [Dissertação, 2012].pdf: 3884662 bytes, checksum: 0524ca3a870ee99db72a293200787c80 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T18:09:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima, Barbara Gomes [Dissertação, 2012].pdf: 3884662 bytes, checksum: 0524ca3a870ee99db72a293200787c80 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A espécie Eugenia sulcata, popularmente conhecida como “murtinha” pertence à família Myrtaceae, sendo rica em estruturas secretoras de óleo essencial. Neste trabalho, é descrita a análise da composição do óleo essencial de folhas e caules em que, o sesquiterpeno β- cariofileno apresenta-se como componente majoritário em ambos os óleos, 24,65% no óleo de folhas e 18,78% no óleo de caules. Além das substâncias já descritas para o óleo essencial de folhas da espécie, foram identificadas pela primeira vez as seguintes substâncias: α-cubebeno (1,15%), β-copaeno (0,54%), cis-muurola-3,5-dieno (0,61%), cis-muurola-4 (14),5-dieno (1,32%), γ-himachaleno (2,03%), epizonareno (0,89%), trans-calameneno (4,39%), trans-cadina-1,4-dieno (3,38%). A análise do óleo essencial de caules ainda não havia sido descrita. Também foram isolados e identificados pela primeira vez na espécie os ácidos triterpênicos ursólico e sumaresinólico do extrato hexânico de folhas. O óleo essencial de folhas foi avaliado quanto as atividades: antimicrobiana, anticolinesterásica, inseticida, hipotensora e anti-herpesvirus. O teste de susceptibilidade antimicrobiana utilizando cepas de Staphylococcus aureus ATCC 29213, apresentou um CMI de 500μg/mL. Na avaliação da atividade anticolinesterásica, o óleo essencial de folhas foi eficiente na inibição da enzima AChe exibindo um valor de IC50 de 4,66 μg/mL. A atividade inseticida foi avaliada frente aos fitófagos Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus e percevejos hematófagos da espécie Rhodnius prolixus. Tanto nos fitófagos quanto nos percevejos hematófagos, o óleo essencial de folhas, na concentração 500μg/mL, exibiu uma taxa de mortalidade superior a 80%. Já na avaliação da atividade hipotensora, o óleo essencial de folhas mostrou-se um potente agente hipotensor sendo capaz de reduzir a pressão arterial sistólica e diastólica em 16% e 31% respectivamente. No teste de atividade antiviral frente ao vírus HSV, o óleo essencial de folhas na concentração de 250μg/mL, apresentou uma baixa citotoxicidade para as células Vero, utilizadas como sistema hospedeiro, (CC50 ˃ 1000), e ED50 de 114,41 μg/mL para HSV- 1 e de 197,09 μg/mL para HSV-2. É a primeira vez que são descritas para a espécie Eugenia sulcata as atividades inseticida, anticolinesterásica, hipotensora e antiviral. Como pode ser observada, a espécie possui um rico potencial biotecnológico que merece ser mais estudado / The species Eugenia sulcata is commonly known as "murtinha" and belongs to Myrtaceae’s family, it is rich in secretory structures of essential oil. This work describes the analysis of the essential oil composition from leaves and stems which the sesquiterpene β-caryophyllene was the major component in both essential oils, 24.65% and 18.78% in essential oil from leaves and stems respectivelly. Among the substances that have been already described for this spicies essential oil from leaves , were first identified the following substances: α-cubebeno (1.15%), β-copaene (0.54%), cis-muurola-3,5 - diene (0.61%), cis-muurola-4 (14) ,5-diene (1.32%), γ-himachalene (2.03%), epizonarene (0.89%), trans-calamenene (4.39%), trans-cadina-1 ,4-diene (3.38%). The analysis of the essential oil from stems had not been described yet. The triterpenes acids ursolic and sumaresinolic were also isolated and identified in the hexane extract from leaves for the first time in E. sulcata. The essential oil from leaves was evaluated for the following biological activities: antimicrobial, anticholinesterasic, insecticide, hypotensive and antiviral. The antimicrobial susceptibility testing against Staphylococcus aureus ATCC 29213 strain, showed a MIC of 500μg/mL. For the anticholinesterasic activity evaluation, the leaves essential oil was effective in inhibiting AChE enzyme and showed an IC50 value of 4.66 μg/mL. Insecticidal activity was evaluated in phytophagous species Oncopeltus fasciatus and Dysdercus peruvianus and also for the species of bedbugs Rhodnius prolixus. For all insects, the essential oil from leaves (500μg/mL), exhibited a mortality rate above 80%. The evaluation of the hypotensive activity of the essential oil from leaves showed a hypotensive effect and it was able to reduce both systolic and diastolic blood pressure without significantly changing the cardiac frequency in rats. The antiviral activity test of the essential oil from leaves at the concentration of 250μg/mL,against HSV showed a low cytotoxicity for the Vero cells used as host for the herpesvirus (CC50 ˃ 1000) and ED50 value of 114,41 μg/mL for HSV- 1 and 197,09 μg/mL forHSV-2. It is the first time that the species Eugenia sulcata is a target of a phytochemical and biological study. As can be seen, the species has a rich biotechnological potential that requires further studies

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work was divided into three parts focusing two main topics: the study of volatiles compouds of P. graveolens and the study of the essential oil of L. alba and its evaluation of insecticidal activity against Spodoptera frugiperda. The chapter 2 approuch the study of the volatile compounds of the leaves of P. graveolens extracted by dynamic headspace using Porapak Q® as adsorbent and in nature peat, a novel adsorbent in the extraction of plant volatiles, and the results were compared with those obtained by hidrodestilation. The results showed that hydrodistilation (HD) was more efficient for extracting linalool and citronellyl formate. While citroneol, geraniol and geranyl tiglate were obtained in greater quantity by dynamic headspace using in nature peat (HSD-T), isomenthone, 6,9- guaiadiene and - muurolene by headspace using Porapak Q® (HSD-P). The study of conversion proved that geraniol converts in linalool when geraniol is subjected to water vapor and high temperature, nevertheless a small ratio. This also prove, in parts, the high percentage of linalool obtained by HD compared to HSD-T and HSD-P. The chapter 3 approuch the study of the essential oils of 9 accessions of L. alba collected in 4 states of Brazil using statistical methods and checking the accessions with the best essential oil content. The statistical methods of hierarchical cluster analysis (HCA) and Principal component analysis (PCA) were used to prove the experimental data and confirmation of training groups. Three groups representatives of the three chemotypes were formed: Group I was characterized by linalool and 1,8-cineole; group II, by limonene and carvone; and group III by neral and geranial. In chapter 4 was approached the evaluation of insecticidal activity of the essential oils of P. graveolens (PEL-001) and L. alba (accessions LA-10, LA-22 and LA-57) and also of the main compounds (geraniol, linalool, 1,8-cineole, limonene, carvone) against S. frugiperda via topical aplication. The test of topical application showed that the essential oils of P. graveolens (PEL-001) and L. alba (accessions LA-10, LA-22, LA-57) showed acute toxicity against larvae of S. frugiperda, causing mortality of up to 100% at a dose 192 μg/larvae. / O presente trabalho foi dividido em 3 partes os quais abordam 2 temas centrais: estudo dos compostos voláteis de Pelargonium graveolens e do óleo essencial de Lippia alba e avaliação de atividade inseticida frente à Spodoptera frugiperda. O capítulo 2 abordou o estudo dos voláteis das folhas de P. graveolens extraídos por headspace dinâmico utlizando Porapak Q® como adsorvente e turfa in natura, um adsorvente inédito empregado na extração de voláteis de plantas, sendo os resultados comparados com àqueles obtidos por hidrodestilação. Os resultados mostraram que a hidrodestilação (HD) foi mais eficiente na extração de linalol e formiato de citronelila. Enquanto citronelol, geraniol e tiglato de citronelila foram obtidos em maior proporção por headspace dinâmico utilizando turfa in natura como adsorvente (HSD-T), isomentona, 6,9- guaiadieno e -muuroleno foram identificados em maior proporção por headspace dinâmico utilizando Porapak Q® (HSD-P). O estudo de conversão comprovou que geraniol se converte em linalol, quando o geraniol é submetido a vapor d água e altas temperaturas, porém a um pequeno percentual. Isso também comprova, em partes, o alto percentual de linalol obtido por HD em relação à HSD-T e HSD-P. A extração do hidrolato revelou variações na composição volátil em comparação com os outros métodos de extração. O Capítulo 3 abordou o estudo dos óleos essenciais de 9 acessos de L. alba coletados em 4 estados do Brasil empregando métodos estatísticos e verificando os acessos com melhores teor de óleo essencial. Os métodos estatísticos de análise hierárquica de agrupamentos (HCA) e análise de componentes principais (PCA) foram empregados para comprovar os dados experimentais e confirmar a formação dos grupos. Três grupos, representando os três quimiotipos, foram formados, dos quais o grupo I foi caracterizado por linalol e 1,8-cineol, grupo II por limoneno e carvona e grupo III por neral e geranial. No capítulo 4 foi abordado a avaliação de atividade inseticida dos óleos essenciais de P. graveolens (PEL-001) e L. alba (acessos LA-10, LA-22 e LA-57), bem como dos seus principais compostos majoritários (geraniol, linalol, 1,8-cineol, limoneno e carvona) frente à S. VII frugiperda. O ensaio de aplicação tópica mostrou que óleos essenciais de P. graveolens (PEL-001) e L. alba (acessos LA-10, LA-22, LA-57) apresentaram toxicidade aguda nas lagartas S. frugiperda, ocasionando mortalidade de até 100% na dose 192 μg/lagarta.

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Brazilian lemon balm (Lippiaalba (Mill.) N. E. Brown) is a medicinal and aromatic species widely used to fight diseases. Its essential oil, rich in carvone, has insecticidal activity on pests of agricultural interest. Cutting ants cause severe economic damage to forest and horticultural species and hinder cultivation worldwide. Plant aging is one of the main factors that alter the biological activity of essential oils. The objective of this work was to evaluate the influence of plant age on the essential oil of L. alba accessionsand of a recurrent selection cycle onformicidal activity. The experiments were carried out at the Experimental Farm - Campus Rural UFS.The experiment consisted of a randomized blocks design with three replications. For the first experiment, 18 L. albaaccessions were used at two plant ages: one-year-old plants (February2006), and ten-year-old plants (February 2016). In the second experiment, a recurrent selection cycle was carried out with three accessions of the limonene/carvonechemotype. For the progeny competition experiment, three parent genotypes and 11 progenies were taken to the field. In the first experiment, plant age influenced the essential oil production and the chemical composition.The highest essential oil content increase was observed for accessions LA-41 (0.69-2.48%) and LA-53 (0.76-2.84%). The compounds with the greatest variation in the second harvest were p-cymene (0.00-5.12%), limonene (0.00-11.08%), and elemol (0.00-10.54%), because of plant aging. In the second experiment, the highest dry weight of aerial part was observed for parental LA-56 (57.54 g plant-1). The essential oil content was higher in the progeny LA-57-10 (2.844%) and the parental LA-57 (2.664%). Carvone concentration was higher for LA-57 (59.02%), with a significant difference when compared with the evaluated progenies. Among the progenies, the highest carvone concentration was observed for LA-56-04 (57.78%) and the lowest for LA-57-01 (17.71%) and LA-57-02 (17.27%).One recurrent selection cycle resulted in increased formicidal activity of some progenies. Higher mortility of Acromyrmex balsani was caused by the essential oils of the progenies LA-56-04 and LA-70-03. / A erva-cidreira-brasileira [Lippia alba (Mill.) N. E. Brown] é uma espécie medicinal e aromática que apresenta vários quimiotipos. O óleo essencial rico em carvona possui atividade inseticida sobre pragas de interesse agrícola. Diante disso, o objetivo do trabalho foi avaliar a influência da idade da planta nos óleos essenciais de acessos de L. alba e de um ciclo de seleção recorrente na atividade formicida. Os ensaios foram conduzidos na Fazenda Experimental “Campus Rural da UFS”. Para o primeiro ensaio foram testados 18 acessos de L. alba, que foram colhidos quando as plantas estavam com um ano de idade (fevereiro/2006) e dez anos (fevereiro/2016). No segundo experimento foi realizado um ciclo de seleção recorrente com três acessos com alto teor de carvona no seu óleo essencial. Para o ensaio de competição de progênies foi implantado um ensaio testando 11 progênies e os três parentais. A idade da planta influenciou na produção e composição química dos óleos essenciais dos acessos de L. alba testados. Observou-se maior aumento doteor de óleo essencial para os acessos LA-41 (0,69-2,48%) e LA-53 (0,76-2,84%). Com o envelhecimento das plantas notou-se maior variação nos óleos essenciais para os compostos p-cimeno (0,00-5,12%), limoneno (0,00-11,08%) e elemol (0,00-10,54%). No segundo experimento a maior produção de massa seca da parte aérea foi observada para o genótipo LA-56 (57,54 g planta-1). O teor de óleo essencial foi superior na progênie LA-57-10 (2,844%) e o parental LA-57 (2,644%). A carvona foi superior para o LA-57 (59,02%) com diferença significativa em comparação as progenies avaliadas. Entre as progênies, o maior teor foi observado para a progênie LA-56-04 (57,78%) e o menor para o LA-57-01 (17,71%) e LA-57-02 (17,27%). Um ciclo de seleção recorrente resultou no aumento da atividade formicida de algumas progênies.Maior mortalidade de Acromyrmex balsani foi causada pelos essenciais das progênies LA-56-04 e LA-70-03. / São Cristóvão, SE