Orientador: Ljubica Tasic / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borin_PaulaFernandaLacarini_M.pdf: 1689128 bytes, checksum: c3f8712ed17691069b7fabb711257101 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é uma bactéria Gram-negativa que parasita plantas cítricas e é responsável pela doença conhecida como cancro cítrico, que apresenta grande importância econômica em todo mundo. Acredita-se que a infecção da célula hospedeira ocorre com atuação dos sistemas de secreção, onde fatores macromoleculares de virulência, normalmente proteínas ou complexos de ácidos nucléicos com proteínas, são excretados para o citosol da célula no caso dos sistemas do tipo III e IV, onde irão interferir no processo celular do hospedeiro. O alvo do estudo é a proteína hipotética XACb0033, codificada pelo locus virB do plasmídio pXac64. Ela foi identificada como possível chaperona secretória do sistema de secreção tipo IV, por apresentar diversas características destas proteínas, como baixo peso molecular, pI ácido e propensão a formação de dímeros, entre outras. A XACb0033 foi clonada no vetor de expressão pET23a(+) e expressa na bactéria Escherichia coli utilizando técnicas de biologia molecular de clonagem e expressão. Os resultados da expressão foram satisfatórios, obtendo-se a proteína em quantidade suficiente para sua purificação seguida pela caracterização estrutural. A XACb0033 foi analisada por Espectrometria de Massas (MALDI-Tof MS), Dicroísmo Circular (CD), fluorescência de emissão estática e dinâmica, Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1 (RMN de H) e Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Todos os dados indicam que a XACb0033 apresenta estrutura enovelada, não interage com os nucleotídeos (ATP e ADP) e tende em agir em forma dimerica seguindo o modelo de uma chaperona secretória, e, por fim, a estrutura do seu envelope molecular foi obtida. / Abstract: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a Gram-negative bacterium that parasites citric plants all over the world and is responsible for causing the citrus canker with significant economic importance. It is believed that infection of the host cell occurs with activity of Xac¿s secretion systems, where macromolecular virulence factors, usually proteins or nucleic acid complexes with proteins, are excreted into the cytosol of the host cells as in the case of type III and IV systems, where they will interfere with the key cell processes. The aim of our study was structural characterization of the XACb0033, Xac¿s hypothetical protein, encoded by the locus virB of pXac64 plasmid. This protein was identified as a possible type IV secretion system chaperona because it presents many features of these proteins, such as low molecular weight, acidic pI, and propensity to form dimers, among others. The XACb0033 was cloned at expression vector pET23a (+) and expressed in Escherichia coli using molecular biology techniques for cloning and expression. The expression results were satisfactory, obtaining sufficient protein for its purification followed by structural characterization. The XACb0033 was analyzed by Mass Spectrometry (MALDI-Tof MS), Circular Dichroism (CD), static and dynamic Fluorescence, Nuclear Magnetic Resonance (H NMR) and by Small Angle X-ray Scattering (SAXS). All collected data indicated that XACb0033 has folded structure, does not interact with nucleotides (ATP and ADP) and tends to act in dimeric form, following a model of a secretory chaperona, and, at last but not at least, its molecular envelope structure has been obtained. / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

All members of the genus Xanthomonas are considered to be plant pathogenic, with specific pathovars infecting several high value agricultural crops. One of these pathovars, X. campestris pv. zeae (as this is only a proposed name it will further on be referred to as Xanthomonas BLSD) the causal agent of bacterial leaf steak of maize, has established itself as a widespread significant maize pathogen within South Africa. Insufficient information about the present distribution of the pathogen is available. The main aim of the study was thus to isolate and characterise the pathogen using molecular methods. Results demonstrated that the causal agent of bacterial leaf streak disease (Xanthomonas BLSD: potentially X. campestris pv. zeae) was widely distributed within the major maize cultivation regions of South Africa. Most of the isolates collected originated from the Highveld maize production provinces (North West, Free State, Gauteng and Mpumalanga provinces) as well as from irrigated maize fields in the Northern Cape province. The XgumD gene marker was used to determine if the isolates belonged to the genus Xanthomonas. The gumD gene fragment is located within the gumB-gumM region of the operon and is conserved among Xanthomonas species. This gene fragment is partially responsible for xanthan production. This marker was amplified from all isolates and a selected number were sequenced. The marker was only able to confirm that the causal agent was a member of the genus Xanthomonas. PCR methods were used for the characterisation of the isolates. This included PCR and sequencing of ribosomal RNA- gyraseB and gumD genes. A fingerprinting method BOX-PCR was also employed. Good quality DNA of sufficient quantities was obtained from the various isolates. Amplification produced no non-specific amplification products. This resulted in good quality sequences that could be analysed using bioinformatics tools. Phylogenetic analyses of the ribosomal RNA and gyraseB genes could not detect differences amongst the 47 Xanthomonas BLSD isolates. However, these genes were able to distinguish between the type strain of these isolates and various Xanthomonas species and pathovars. From all three neighbour joining trees the Xanthomonas BLSD isolates had close association with X. axonopodis pv. vasculorum strain ATCC 35938. For the 16S rRNA gene there exists no sequence differences between Xanthomonas BLSD and X. axonopodis pv. vasculorum strain ATCC 35938. A single nucleotide difference was observed between Xanthomonas BLSD and X. axonopodis pv. vasculorum strain ATCC 35938 for the 23S rRNA gene. The gyraseB gene detected a total of six nucleotide variations between these two Xanthomonas species. For all of the phylogenetic trees there was no clustering of Xanthomonas BLSD with X. campestris pathovars. Genetic profiling (via BOX-PCR) based on present/absent analysis revealed no variations amongst the Xanthomonas BLSD isolates. All isolates shared an identical pattern produced by 12 distinct PCR products. This profiling technique did differentiate between the isolates of Xanthomonas BLSD and X. axonopodis pv. vasculorum strain ATCC 35938. Their profiles shared common bands, but differed in the number and overall pattern of the bands. These results suggest two main conclusions: (i) Xanthomonas BLSD has a clonal origin with geographical separation not impacting genetic variation. The fact that all the isolates appear to be clonal may imply that when resistant maize cultivars are developed these should be resistant to all isolates of the pathovar irrespective of their geographical origin. This is a suggestion that will have to be corroborated using more isolates and additional genetic fingerprinting techniques (ii) the Xanthomonas BLSD isolates from this study may not belong to X. campestris. Further studies using other markers should be conducted to determine the real identity of Xanthomonas BLSD. / MSc Environmental Sciences, North-West University, Potchefstroom Campus, 2015

All members of the genus Xanthomonas are considered to be plant pathogenic, with specific pathovars infecting several high value agricultural crops. One of these pathovars, X. campestris pv. zeae (as this is only a proposed name it will further on be referred to as Xanthomonas BLSD) the causal agent of bacterial leaf steak of maize, has established itself as a widespread significant maize pathogen within South Africa. Insufficient information about the present distribution of the pathogen is available. The main aim of the study was thus to isolate and characterise the pathogen using molecular methods. Results demonstrated that the causal agent of bacterial leaf streak disease (Xanthomonas BLSD: potentially X. campestris pv. zeae) was widely distributed within the major maize cultivation regions of South Africa. Most of the isolates collected originated from the Highveld maize production provinces (North West, Free State, Gauteng and Mpumalanga provinces) as well as from irrigated maize fields in the Northern Cape province. The XgumD gene marker was used to determine if the isolates belonged to the genus Xanthomonas. The gumD gene fragment is located within the gumB-gumM region of the operon and is conserved among Xanthomonas species. This gene fragment is partially responsible for xanthan production. This marker was amplified from all isolates and a selected number were sequenced. The marker was only able to confirm that the causal agent was a member of the genus Xanthomonas. PCR methods were used for the characterisation of the isolates. This included PCR and sequencing of ribosomal RNA- gyraseB and gumD genes. A fingerprinting method BOX-PCR was also employed. Good quality DNA of sufficient quantities was obtained from the various isolates. Amplification produced no non-specific amplification products. This resulted in good quality sequences that could be analysed using bioinformatics tools. Phylogenetic analyses of the ribosomal RNA and gyraseB genes could not detect differences amongst the 47 Xanthomonas BLSD isolates. However, these genes were able to distinguish between the type strain of these isolates and various Xanthomonas species and pathovars. From all three neighbour joining trees the Xanthomonas BLSD isolates had close association with X. axonopodis pv. vasculorum strain ATCC 35938. For the 16S rRNA gene there exists no sequence differences between Xanthomonas BLSD and X. axonopodis pv. vasculorum strain ATCC 35938. A single nucleotide difference was observed between Xanthomonas BLSD and X. axonopodis pv. vasculorum strain ATCC 35938 for the 23S rRNA gene. The gyraseB gene detected a total of six nucleotide variations between these two Xanthomonas species. For all of the phylogenetic trees there was no clustering of Xanthomonas BLSD with X. campestris pathovars. Genetic profiling (via BOX-PCR) based on present/absent analysis revealed no variations amongst the Xanthomonas BLSD isolates. All isolates shared an identical pattern produced by 12 distinct PCR products. This profiling technique did differentiate between the isolates of Xanthomonas BLSD and X. axonopodis pv. vasculorum strain ATCC 35938. Their profiles shared common bands, but differed in the number and overall pattern of the bands. These results suggest two main conclusions: (i) Xanthomonas BLSD has a clonal origin with geographical separation not impacting genetic variation. The fact that all the isolates appear to be clonal may imply that when resistant maize cultivars are developed these should be resistant to all isolates of the pathovar irrespective of their geographical origin. This is a suggestion that will have to be corroborated using more isolates and additional genetic fingerprinting techniques (ii) the Xanthomonas BLSD isolates from this study may not belong to X. campestris. Further studies using other markers should be conducted to determine the real identity of Xanthomonas BLSD. / MSc Environmental Sciences, North-West University, Potchefstroom Campus, 2015

A indústria dos citros é de grande importância econômica e social para o Brasil, que é considerado o maior produtor e exportador de suco concentrado de laranja do mundo. Porém, sérios problemas relacionados a doenças têm afetado a produção e qualidade dos citros. Com o desenvolvimento da engenharia genética e a clonagem de genes relacionados à resistência a doenças em plantas, a transformação genética têm se mostrado uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento genético de citros. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce das variedades ‘Hamlin’, ‘Valência, ‘Natal’ e ‘Pêra’ expressando o gene hrpN, sob o controle do promotor Pgst1, induzível pelo patógeno. A avaliação da resposta de plantas transgênicas da variedade ‘Hamlin’ contra o agente causal do cancro cítrico, a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, também foi realizada. Segmentos de epicótilo foram transformados via Agrobacterium tumefaciens, e selecionados em meio de cultura suplementado com canamicina ou gentamicina. A transformação genética foi confirmada por PCR e Southern blot. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e a produção da proteína harpina foi analisada por western blot. A eficiência de transformação variou de 2,7 e 6,2% de acordo com a variedade de laranja. Algumas linhagens de plantas transgênicas apresentaram desenvolvimento anormal, não permitindo a realização da análise por Southern blot nem a multiplicação por enxertia. Plantas de laranja ‘Hamlin’ foram propagadas por enxertia e avaliadas para resistência a Xanthomonas axonopodis pv. citri. Todas as linhagens apresentaram redução na severidade dos sintomas causados pela bactéria X. axonopodis pv. citri, avaliados 30 dias após a inoculação. / The citrus industry has a great economic and social importance for Brazil, which is considered largest producer and orange juice exporter in the world. However, serious problems related to pathogens have affected citrus production and quality. With the development of genetic engineering and the characterization of genes related with plant disease resistance, the genetic transformation became an important tool in citrus breeding programs. The objective of this work was the production of transgenic plants of four sweet orange cultivars ‘Hamlin’, ‘Valencia’, ‘Natal’ and ‘Pera’ expressing hrpN gene under the control of Pgst1 inducible promoter. The evaluation of ‘Hamlin’ sweet orange transgenic plants infected with the causal agent of citrus canker, Xanthomonas axonopodis pv. citri was carry out. Epicotyl segments were inoculated with Agrobacterium tumefaciens, and selected in a culture medium supplemented with kanamycin or gentamycin. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and the production of harpin protein was detected by western blot. The genetic transformation efficiency varied from 2,7% to 6,2% depending on the cultivar. Some transgenic lines had abnormal development, not allowing performing Southern blot analysis or multiplication by grafting. Plants of ‘Hamlin&#146 sweet orange were propagated by grafting and evaluated for Xanthomonas axonopodis pv. citri resistance. All tested plants presented reduction in the severity of the symptoms caused by bacterium X. axonopodis pv. citri 30 days after the inoculation.

Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Valmir Luiz de Souza / Banca: João Pereira Torres / Banca: Rafael Moreira Soares / Resumo: O crestamento bacteriano comum do feijoeiro (CBCF), incitado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, é responsável por expressivos danos na cultura e por reduções no rendimento e qualidade dos grãos. A preocupação com o meio ambiente e o uso indiscriminado de agrotóxicos tem impulsionado a pesquisa para a busca de métodos alternativos ao controle de patógenos em plantas. Os indutores de resistência têm se mostrado eficientes e promissores no controle de diversos patógenos de culturas. O presente trabalho teve como objetivos verificar o potencial de tinturas etanólicas de Lippia alba (erva cidreira), Lippia sidoides (alecrim pimenta), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (cavalinha) e Hedera helix (hera), óleos essenciais de Rosmarinus officinalis (alecrim) e Cinnamomum zeylanicum (canela) e de piraclostrobina e acibenzolar-S-metil no controle do crestamento bacteriano comum em feijão vagem cultivar Bragança. Esses produtos foram utilizados nos seguintes ensaios: atividade antimicrobiana in vitro (exceção ao acibenzolar-S-metil), atividade in vivo em plantas cultivadas sob condições de casa de vegetação, tratadas com os produtos e calculada a área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD); atividade de polifenoloxidases, peroxidases e proteínas solúveis totais em folhas tratadas e não tratadas de feijão vagem, inoculadas e não inoculadas, coletadas em diferentes épocas (0, 3, 5, 8 e 10 dias após pulverização das tinturas etanólicas, óleos essenciais, acibenzolar-S-metil e pyraclostrobin). Os resultados obtidos demonstraram que as tinturas de L. alba e L. sidoides e os óleos essenciais apresentaram atividade in vitro aos isolados de X. axonopodis pv. phaseoli, enquanto que piraclostrobina não apresentou ação in vitro sobre a bactéria. A tintura etanólica de L. alba, pyraclostrobin e acibenzolar-S-metil apresentaram menores valores da AACPD, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Common bacterial blight of snap bean (CBCSB), caused by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli responsible for expressive culture damage and reduction of seeds production and quality. The environmental impact of the indiscriminate use of pesticides has lead to search alternative methods of plant pathogens control. Resistance inducers have been efficiently successful on several plant pathogens control. Thus, this study aimed to evaluate the potential of alcohol extracts of Lippia alba (Melissa), Lippia sidoides (pepper-rosmarin), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (horsetail) and Hedera helix (English Ivy), essential oils of Rosmarinus officinalis (rosemary) and Cinnamomum zeylanicum (cinnamon) and, pyraclostrobin and acibenzolar-S-metil on the control of common bacterial blight in snap beans, Bragança cultivar. These products were used in the following assays: in vitro bactericidal activity (except for acibenzolar-S-metil), in vivo activity of greenhouse-cultivated plants treated with products and the area under the disease progress curve (AUPDC) was calculated; activity of poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins in treated anduntreated bean leaves, infected and non-infected leave collected in different stages (0, 3, 5, 8 and 10 days after sprinkling with alcohol extracts, essential oils, acibenzolar-S-metil and pyraclostrobin). Results showed in vitro activity against X. axonopodis pv. phaseoli for L. alba and L. sidoides extracts, and essential oils while pyraclostrobin did not show any in vitro activity effect. L. Alba alcohol extract, pyraclostrobin and acibenzolar-S-methy showed the lowest AUPDC values compared to control treatment. The highest poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins values were observed in plant leaflets sprinkled with these products which probably are related to resistance induction. Essential oils did not show difference on AUPDC nor protein induction. / Doutor

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2018-10-15T13:46:38Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Helton Salles da Silva - 2017.pdf: 3105351 bytes, checksum: 0468af71a8e8a4810e5e7793d972203c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-15T14:48:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Helton Salles da Silva - 2017.pdf: 3105351 bytes, checksum: 0468af71a8e8a4810e5e7793d972203c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-15T14:48:27Z (GMT). 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In this sense, the main objectives of the present study was to: (i) evaluate the genetic potential and to select superior progenies from a population of recurrent selection for resistance to CBB in common bean of the black commercial group; (ii) study the adaptability and stability of families S0:4, S0:5 and S0:6 in different environments; (iii) estimate the genetic gains obtained with the selection of the ten best families; and (iv) select families that are resistant to CBB while associated to other variables of agronomic importance such as grain yield, plant bedding and resistance to anthracnose. Sixty families of a C0 population were evaluated in the years 2015 and 2016 in different environments, in randomized blocks design with three replicates. After the evaluations, analyzes of individual and joint variance were performed, as well as the application of the ranks sum index using “Genes” software. Subsequently, analyzes of adaptability and phenotypic stability were performed in the selected families, using the methodology of Nunes et al. From the simultaneous selection for grain yield and resistance to CBB, ten families considered more promising were selected. Then, a new selection was made, including the plant bedding criteria and, lastly, the variable anthracnose resistance was included. Selection gains were obtained for all the variables. Most of the selected families presented better individual results in relation to the resistance to CBB variable. And the great majority of the selected families presented themselves adapted and stable, mainly in comparison with other bean treatments. Among the families with the best performance, the families SRCP.55 and SRCP.318 were highlighted for grain yield, resistance to CBB and anthracnose. By selecting these families, it is expected that they may be used in hybridization stages carried out in new studies, either as parents in other programs as sources of resistance to CBB, or in their use as new cultivars. / A cultura do feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) tem grande importância na alimentação humana e seu emprego se dá nos mais variados sistemas de plantio. Logo, há a necessidade de desenvolvimento de cultivares adaptadas a esses diferentes sistemas e que atendam concomitantemente às necessidades de produtores e consumidores. Diferentes fatores têm contribuído para diminuir a produtividade da cultura, dentre estes, destaca-se o crestamento bacteriano comum (CBC) causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e Xanthomonas fuscans subsp. fuscans. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivos: (i) avaliar o potencial genético e selecionar progênies superiores oriundas de uma população de seleção recorrente para resistência ao CBC em feijoeiro-comum do grupo comercial preto. (ii) estudar a adaptabilidade e estabilidade das famílias S0:4, S0:5 e S0:6 em diferentes ambientes; (iii) estimar ganhos genéticos obtidos com a seleção das dez melhores famílias; (iv) selecionar famílias resistentes ao CBC associadas a outras variáveis de importância agronômica como produtividade de grãos, acamamento de planta e resistência à antracnose. Foram avaliadas 60 famílias de uma população C0 nos anos de 2015 e 2016 em diferentes ambientes, no delineamento em blocos ao acaso com três repetições. Após as avaliações, foram feitas análises de variância individual e conjunta, bem como a aplicação do índice da soma de “ranks” utilizando-se o programa “Genes”. Posteriormente, as famílias selecionadas foram submetidas às análises de adaptabilidade e estabilidade fenotípica, de acordo com a metodologia de Nunes et al. Foram selecionadas, partindo-se da seleção simultânea para produtividade de grãos e resistência ao CBC, dez famílias consideradas mais promissoras. Em seguida, foi feita nova seleção, incluindo-se o acamamento de planta e sendo incluída, por fim, a variável resistência à antracnose. Obteve-se ganhos de seleção para todas as variáveis. A maior parte das famílias selecionadas apresentou melhores resultados individuais em relação à variável de resistência ao CBC. E a grande maioria das famílias selecionadas mostraram-se adaptadas e estáveis, principalmente, quando comparadas às testemunhas. Dentre as famílias de melhor desempenho, se destacaram as famílias SRCP.55 e SRCP.318 para produtividade de grãos, resistência ao CBC e antracnose. Com a seleção dessas famílias, espera-se que as mesmas possam vir a ser utilizadas em etapas de hibridizações realizadas em novos estudos, seja como genitores em outros programas como fontes de resistência ao CBC, seja também em sua utilização como novas cultivares.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:02:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camillo_LucianaRodrigues_M.pdf: 5919875 bytes, checksum: 5cf571ac0a143a68d6340c3ad3c97f49 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A doença cancro cítrico, causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), emergiu como uma das principais ameaças à citricultura brasileira pois afeta todas as variedades comerciais de citros, diminuindo a produção e qualidade dos frutos e podendo se dispersar rapidamente em áreas de cultivo de citros. Entre os gêneros de Xanthomonas, foram encontrados muitos genes associados com patogenicidade e virulência, entretanto, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos nas interações entre Xac e laranjeira e os genes envolvidos no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico em folhas de citros (Citrus sinensis) em resposta à infecção por Xac. Neste trabalho, foi analizada a expressão diferencial de genes envolvidos no desenvolvimento do cancro cítrico em folhas de laranja, em resposta à infecção por Xac. Para tanto foram construídas duas bibliotecas de Hibridização Subtrativa Suprimida (SSH) com mRNAs de folhas infiltradas com Xac ou H20 após 10 dias de inoculação. O "screnning" das bibliotecas foi feito por dot blot e 17 genes diferencialmente expressos foram sequenciados e identificados por homologia no banco de dados ncbi-BLAST contra o banco de dados de EST de citros. A expressão gênica diferencial foi analizada por Northern Blot e PCR em tempo real (qPCR). Para complementar nossos dados, a expressão dos 17 genes diferenciais foi aI).alisada a partir de cDNAs de folhas de citros que foram infiltradas com Xac, H20 ou Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa), que não é patogênica à laranja, mas causa cancro no limão galego. Nossos resultados demonstraram que Xac e Xaa induzem e reprimem o mesmo grupo de genes, porém em diferentes níveis. Nós identificamos que ambos patóg;enos alteram as vias de transdução de sinal de auxina, tráfico e fusão de vesículas, resposta de defesa e doença, síntese de proteínas e ciclo celular, metabolismo de carbono-nitrogênio e metabolismo secundário. A análise desses genes poderá ser de grande importância para o entendimento dos eventos que levam ao desenvolvimento dos sintomas do cancro / Abstract: The citrus canker disease, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), has emerged as one of the major threats to the Brazilian citriculture because it affects all commercial citrus varieties, decreases the production and quality of the fruits and can spread rapidly in the citrus growing areas. The symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruits and leaves and general tree decline. Within the genus Xanthomonas, several genes have been found associated with pathogenicity and virulence. However, little is known about the mechanisms involved in the Xac- citrus interaction and the development of the canker disease. In this work we analyzed the differential expression of genes involved in the development of the canker disease in sweet orange (Citrus sinensis) leaves in response to Xac infection. Therefore we constructed two Supression Subtracted Hybridization (SSH) libraries with mRNA from leaves infiltrated with Xac or water after 10 days of inoculation. The libraries were screnned by dot blot and the 17 differentially expressed genes were sequenced and identified through BLAST searches against the Citrus EST and protein databases. The differential gene expression was evaluated by Northem blot and Real Time PCR (qPCR). To complement our analysis, the expression of 17 genes was compared in cDNA samples from citrus leaves that had been infilt:r:ated with Xac, water or X axonopodis pv. aurantifolii (Xaa), wich is not pathogenic to orange but causes canker in key lime. Our results show that Xac and Xaa induce and repress a similar set of genes, however at different leveis. We found that both pathogens altered the pathways of auxin transport and signaling, vesicle trafficking and transport, cell cycle and protein synthesis, photorespiration and disease response. Further analysis of these genes will be of great importance to understand the events triggering the development of the canker symptoms / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A indústria dos citros é de grande importância econômica e social para o Brasil, que é considerado o maior produtor e exportador de suco concentrado de laranja do mundo. Porém, sérios problemas relacionados a doenças têm afetado a produção e qualidade dos citros. Com o desenvolvimento da engenharia genética e a clonagem de genes relacionados à resistência a doenças em plantas, a transformação genética têm se mostrado uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento genético de citros. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce das variedades ‘Hamlin’, ‘Valência, ‘Natal’ e ‘Pêra’ expressando o gene hrpN, sob o controle do promotor Pgst1, induzível pelo patógeno. A avaliação da resposta de plantas transgênicas da variedade ‘Hamlin’ contra o agente causal do cancro cítrico, a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, também foi realizada. Segmentos de epicótilo foram transformados via Agrobacterium tumefaciens, e selecionados em meio de cultura suplementado com canamicina ou gentamicina. A transformação genética foi confirmada por PCR e Southern blot. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e a produção da proteína harpina foi analisada por western blot. A eficiência de transformação variou de 2,7 e 6,2% de acordo com a variedade de laranja. Algumas linhagens de plantas transgênicas apresentaram desenvolvimento anormal, não permitindo a realização da análise por Southern blot nem a multiplicação por enxertia. Plantas de laranja ‘Hamlin’ foram propagadas por enxertia e avaliadas para resistência a Xanthomonas axonopodis pv. citri. Todas as linhagens apresentaram redução na severidade dos sintomas causados pela bactéria X. axonopodis pv. citri, avaliados 30 dias após a inoculação. / The citrus industry has a great economic and social importance for Brazil, which is considered largest producer and orange juice exporter in the world. However, serious problems related to pathogens have affected citrus production and quality. With the development of genetic engineering and the characterization of genes related with plant disease resistance, the genetic transformation became an important tool in citrus breeding programs. The objective of this work was the production of transgenic plants of four sweet orange cultivars ‘Hamlin’, ‘Valencia’, ‘Natal’ and ‘Pera’ expressing hrpN gene under the control of Pgst1 inducible promoter. The evaluation of ‘Hamlin’ sweet orange transgenic plants infected with the causal agent of citrus canker, Xanthomonas axonopodis pv. citri was carry out. Epicotyl segments were inoculated with Agrobacterium tumefaciens, and selected in a culture medium supplemented with kanamycin or gentamycin. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and the production of harpin protein was detected by western blot. The genetic transformation efficiency varied from 2,7% to 6,2% depending on the cultivar. Some transgenic lines had abnormal development, not allowing performing Southern blot analysis or multiplication by grafting. Plants of ‘Hamlin&#146 sweet orange were propagated by grafting and evaluated for Xanthomonas axonopodis pv. citri resistance. All tested plants presented reduction in the severity of the symptoms caused by bacterium X. axonopodis pv. citri 30 days after the inoculation.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T05:38:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_BrunaMedeia_D.pdf: 41386343 bytes, checksum: 8048b677c8a43e7438a1c349c584b9ec (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) constitui uma doença que afeta todos os cultivares comerciais de citros e é uma ameaça para a citricultura brasileira. A doença é caracterizada pela formação de pústulas, devido à hiperplasia e hipertrofia induzida pela bactéria. A patogenicidade de Xac é dependente do sistema secretório tipo III, que transloca proteínas efetoras pertencentes à família AvrBs3/PthA para dentro da célula hospedeira. Estudos recentes mostram que PthAs funcionam como fatores de transcrição no hospedeiro, transativando genes específicos da planta que irão beneficiar a bactéria ou desencadear uma resposta de defesa. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação de PthAs como ativadores da transcrição, nosso laboratório identificou, através da técnica de duplo-híbrido, várias proteínas de laranja (Citrus sinensis) que interagiram com diferentes PthAs. Entre elas, destacamos uma ciclofilina (CsCyp), que realiza isomerização de resíduos de prolina, uma proteína com domínio tioredoxina (CsTdx), relacionada com interação proteína-proteína e redução de pontes dissulfeto e uma cisteína protease (CsCP), envolvida na resposta de defesa da planta. Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de CsCyp. A resolução da estrutura de CsCyp mostrou que CsCyp pertence ao grupo de ciclofilinas divergentes que possuem um loop adicional (KSGKPLH), duas cisteínas invariáveis (C40 e C168) e um glutamato (E83) conservado. Este último interage com resíduos do loop, estabilizando-o. A função destes elementos era desconhecida até o momento e o trabalho visou elucidar sua atuação na regulação da atividade PPIase da proteína. Neste trabalho, verificamos que C40 e C168 formam uma ponte dissulfeto. Dados de modelagem e simulação suportaram a hipótese de que a formação da ponte dissulfeto induz mudanças conformacionais que quebram a interação do E83 com o loop divergente, levando ao fechamento do sítio ativo de CsCyp. O estudo descreveu, portanto um mecanismo de regulação redox, que controla a atividade PPIase da proteína. Adicionalmente, mostrou-se que CsTdx interage com CsCyp através dos resíduos conservados C40 e C168, sendo críticos para tal interação. Foi mostrado também que CsCyp interage com o domínio C-terminal (CTD) da RNA Polimerase II (RNA Pol II), especificamente com a repetição YSPSAP. Surpreendentemente, através da transformação de plantas com construções para silenciamento e superexpressão de CsCyp, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsCyp apresentaram um aumento dos sintomas do cancro cítrico quando infiltradas com Xac, enquanto que plantas com níveis aumentados de CsCyp apresentaram sintomas reduzidos quando infiltradas com Xac, indicando que CsCyp tem papel importante no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. Este trabalho também mostra a expressão e purificação das proteínas CsTdx e CsCP e a comprovação de que CsCP interage com PthAs 2 e 3 através de ensaios de duplo-híbrido / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a disease that affects most species of the genus Citrus and represents a threat to the Brazilian citrus industry. The disease is characterized by the formation of pustules due to hyperplasia and hypertrophy induced by the bacteria. Xac pathogenicity is dependent on a type III secretory system that translocates effector proteins which belongs to AvrBs3/PthA family inside the host cell. Recent studies showed that these proteins work as transcriptional factors that transactivate specific plant genes which will either benefit the bacteria or trigger defense response. To gain insights into PthA mechanism of action as transcription activators, our laboratory identified that PthA targeted the citrus protein complex comprising the thioredoxin CsTdx, ubiquitin-conjugating enzymes CsUev/Ubc13 and cyclophilin CsCyp. Also, we showed previously that the CsCyp binds the citrus thioredoxin CsTdx and the C-terminal domain of RNA Polymerase II (CTD), and that CsCyp complements the function of Cpr1 and Ess1, two yeast prolyl-isomerases that regulate transcription by the isomerization of proline residues of the regulatory C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II. In this work we solved the 3D structure of CsCyp in complex with its inhibitor cyclosporine A (CsA), showing that CsCyp is a divergent cyclophilin that carries the additional loop KSGKPLH, invariable cysteines C40 and C168, and conserved glutamate E83. Despite the suggested roles in ATP and metal binding, the function of these unique structural elements remains unknown. Here we show that the conserved cysteines form a disulfide bond that inactivates the enzyme, whereas E83, which belongs to the catalytic loop and is also critical for enzyme activity, is anchored to the divergent loop to maintain the active site open. In addition, we demonstrate that C40 and C168 are required for the interaction with CsTdx and that CsCyp binds the citrus CTD YSPSAP repeat. Our data support the model where formation of the C40- C168 disulfide bond induces a conformational change that disrupts the interaction of the divergent and catalytic loops, via E83, causing the active site to close. This suggests a new type of allosteric regulation in divergent cyclophilins, involving disulfide bond formation and a loop displacement mechanism. Moreover, we present evidence that PthA2 inhibits the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) activity of CsCyp in a similar fashion as CsA, and that silencing of CsCyp, as well as treatments with CsA, enhance canker lesions in Xac-infected leaves. Given that CsCyp appears to function as a negative regulator of cell growth and that Ess1 negatively regulates transcription elongation in yeast, we propose that PthAs activate host transcription by inhibiting the PPIase activity of CsCyp on the CTD / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

A indução de resistência envolve a ativação de mecanismos de defesa latentes existentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou abióticos. As plantas apresentam sistema de defesa induzível, com a finalidade de economizar energia. Desse modo, a resistência induzida em condições naturais representará custo apenas na presença do patógeno. Porém, plantas que investem seus recursos para se defenderem na ausência de patógenos arcarão com custos que refletirão na produtividade, uma vez que as alterações metabólicas que levam a resistência apresentam custo adaptativo associado, o qual pode pesar mais do que o benefício. O efeito negativo na produtividade ocorre principalmente onde indutores químicos são utilizados repetidas vezes ou em doses mais elevadas. Assim, em alguns casos podemos estar caminhando sobre uma estreita linha entre custo e benefício, onde a cura pode ser tão ruim quanto a própria doença. Neste trabalho foram conduzidos experimentos objetivando verificar alterações bioquímicas e fisiológicas, correlacionando-as com parâmetros de produção do feijoeiro entre a indução mediada por acibenzolar-S-metil (ASM), indutor químico, e, a mediada por Bacillus cereus, indutor biológico, antes da chegada do patógeno. Para tanto, foram avaliados plantas de feijão, induzidas por esses dois indutores e desafiadas com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, para constatar a ocorrência do fenômeno da indução de resistência. Na ausência do patógeno, foram avaliados os parâmetros fisiológicos respiração e fotossíntese, determinada a atividade de enzimas envolvidas no processo de defesa como peroxidase, quitinase, β-1,3-glucanase, fenilalanina amônia-liase e polifenoloxidase e a atividade de enzimas envolvidas no catabolismo como proteases, a síntese de compostos do metabolismo secundário como fenóis totais e lignina, a síntese de compostos do metabolismo primário como proteínas e açúcares redutores. Também se avaliou o crescimento das plantas, a produtividade e parâmetros de produção e alguns parâmetros de qualidade dos grãos. Observou-se a ocorrência da indução de resistência em função da aplicação dos dois indutores utilizados, porém para o indutor ASM a indução de resistência estava associada a aumentos na atividade de peroxidase, quitinase, β-1,3-glucanase e proteases, aumento da síntese de lignina e redução no teor de fenóis, aumentos no teor de proteínas solúveis e de açúcares redutores nas folhas, redução do crescimento e da produtividade, aumento do teor de proteína dos grãos e redução do teor de amido nestes. Já o B. cereus apenas ocasionou aumento na atividade de peroxidase de forma atenuada e tendeu a aumentar a atividade de proteases, e reduzir o teor de proteínas nas folhas sem interferir no crescimento ou na produtividade, mas reduziu o teor de proteína dos grãos, mas aumentou o teor de amido nestes. Portanto, o indutor B. cereus , aparentemente alterou muito pouco o metabolismo do feijoeiro, sem interferir na produtividade e melhorando a qualidade da produção, enquanto que o indutor abiótico ASM alterou muito mais seu metabolismo, gerando um custo metabólico e redirecionando os fotoassimilados para investir em defesas, a custo da redução da produtividade. / The induction of systemic resistance involves the activation of latent resistance mechanisms in plants against pathogens in response to the treatment with biotic or abiotic agents. The plants present latent defense system that can be activated with the goal of saving energy. Thus, the induced resistance under natural conditions will represent cost only in the pathogen presence. In this way, plants that invest their resources to defend themselves in the absence of the pathogen will pay off with costs that will reflect in productivity, since the metabolic changes that led to resistance have associated fitness cost which could outweigh the benefit. The negative effects on plant productivity usually occur when chemical inducers are used repeatedly or in higher doses, mainly in the absence of the pathogen. Thus, we can say that in some cases we can be walking on a fine line between cost and benefit, where the cure may be as bad as the disease itself. In this work, experiments were carry out to verify biochemical and physiologic alterations, correlating them with production parameters of bean plants treated with acibenzolar-S-methyl (ASM), chemical inducer, or Bacillus cereus , biological inducer, before the pathogen arrival. Initially, bean plants were evaluated for induced resistance against Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli when treated with the two inducers. In the absence of the pathogen, it was evaluated the physiological parameters respiration and photosynthesis and the activity of enzymes involved in the defense as peroxidase, chitinase, β-1,3-glucanase, phenylalanine ammonia-lyase and polifenoloxidase and activity of enzymes involved in the catabolism as proteases, and the synthesis of compounds of the secondary metabolism as phenols and lignin, and the synthesis of compounds of the primary metabolism as proteins and sugars. The growth of the plants was evaluated as well as their productivity and production parameters. Some quality parameters of the grains were also evaluated. The occurrence of the resistance induced in the bean plants against the pathogens was observed for the two inducers. However, for the ASM the resistance induced was associated to increases in peroxidase, chitinase and β-1,3-glucanase activities, increase in the protease activity, increase in lignin synthesis and reduction in the phenol content, increase in soluble proteins and sugar content in the leaves, reduction of the growth and productivity, increasing the protein and reducing the starch content of the grains. The B. cereus only increased peroxidase activity in a lower way and showed a tendency to increase protease activity, and to reduce the protein content in the leaves without interfering in the growth or in the productivity, but it reduced the protein content and it increased the starch content of the grains. Therefore, the biotic inducer, B. cereus altered a minimum the metabolism of the bean plant, without interfering in the productivity and improving the quality of the production, while the abiotic inducer ASM altered its metabolism, generating a metabolic cost and consuming the plant photosyntathes to invest in defenses, causing a reduction in the productivity.