Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Zoologia, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-02-05T18:07:06Z No. of bitstreams: 1 2014_IsisCarolinaSoutodeOliveira.pdf: 2170234 bytes, checksum: 3e041531fdefa9851652d45970087c0a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-03-06T19:40:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_IsisCarolinaSoutodeOliveira.pdf: 2170234 bytes, checksum: 3e041531fdefa9851652d45970087c0a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T19:40:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_IsisCarolinaSoutodeOliveira.pdf: 2170234 bytes, checksum: 3e041531fdefa9851652d45970087c0a (MD5) / O gênero Brevipalpus Donnadieu destaca-se como um dos mais importantes na família Tenuipalpidae. Esses ácaros fitófagos podem causar danos a seus hospedeiros, sejam diretos, pela alimentação em folhas, ramos e frutos, sejam indiretos, devido à transmissão de vírus. A taxonomia dos ácaros Brevipalpus, especialmente das espécies de importância econômica, tem representado um desafio para os acarologistas; numerosas sinonímias têm sido estabelecidas e a ocorrência de espécies crípticas tem sido confirmada. A acurada identificação desses ácaros é fundamental para compreensão do papel de cada espécie na transmissão dos fitovírus, para a determinação dos hospedeiros de cada espécie, e para a definição de medidas de prevenção e controle. Estudos morfológicos com a utilização de diferentes técnicas de microscopia têm possibilitado um imenso avanço na taxonomia do grupo. Em uma abordagem integrativa, além dos estudos morfológicos é fundamental dispor de ferramentas adicionais para a construção de uma sistemática consistente dos grupos de organismos. Até o momento apenas um fragmento, da região Citocromo Oxidase I (COI) do DNA mitocondrial foi explorado na sistemática de Brevipalpus. A utilização de um maior número de marcadores moleculares, independentes, é importante para a consistência dos estudos. O presente trabalho teve como objetivos contribuir para o avanço da sistemática molecular de ácaros Brevipalpus, através da avaliação e otimização de protocolos de extração e amplificação de DNA; comparação de filogenias obtidas a partir de sequências de quatro regiões do genoma, incluindo marcadores mitocondriais - dois fragmentos da região COI -, e nucleares - regiões “Internal Transcriber Spacer II” (ITS2) e subunidade D1-D3 do gene 28S; apresentação de faixas de distâncias genéticas intra e interespecíficas; e avaliação de caracteres morfológicos em um contexto filogenético. Foram obtidas 25 amostras de Brevipalpus, de cinco países - Argentina, Brasil, Chile, Espanha, e Israel -, de 22 plantas hospedeiras. Foram avaliados dois protocolos de extração de DNA em relação ao rendimento da concentração de DNA, de sua qualidade e eficiência para amplificação, sendo um parcialmente destrutivo e um não destrutivo. Apesar do rendimento da concentração de DNA dos dois protocolos ser similar, observou-se maior eficiência de amplificação com o DNA obtido através do método parcialmente destrutivo. Para cada um dos quatro pares de primers foram testadas Reações de Polimerase em Cadeia (PCR) com variações nas concentrações de componentes da reação (MgCl2, BSA, DNTP e primers), assim como nas condições das reações (temperaturas de amplificação, número e tempo dos ciclos). As reações de PCR foram alteradas para possibilitar a amplificação do DNA com apenas 2μL de DNA molde, permitindo a amplificação dos quatro marcadores com DNA de um único espécime. Para as análises filogenéticas, além das sequências obtidas durante o desenvolvimento desse estudo, foram incluídas, nos datasets das análises filogenéticas, sequências de Brevipalpus recuperadas do GenBank. O fragmento da região COI amplificado com os primers DNR e DNF foi de 373 pares de base (pb) e o alinhamento final foi composto por 190 sequências de Brevipalpus (92 obtidas nesse estudo, 98 recuperadas do GenBank), as quais foram classificadas em 89 haplótipos, agrupados em 18 linhagens. O fragmento da região COI amplificado com os primers LCO e HCO foi de 650pb e o alinhamento final foi composto por 64 sequências (todas obtidas nesse estudo), as quais foram classificadas em 31 haplótipos, agrupados em 12 linhagens. O fragmento da região ITS2 foi de 500pb e o alinhamento final foi composto por 109 sequências (108 obtidas nesse estudo, uma recuperada do GenBank), as quais foram classificadas em 43 genótipos, agrupados em 14 linhagens. O fragmento da região D1-D3 foi de 900pb e o alinhamento final foi composto por 74 sequências (todas obtidas nesse estudo), as quais foram classificadas em 28 genótipos, agrupados em 11 linhagens. De forma geral, as topologias das árvores filogenéticas obtidas a partir de sequências das quatro regiões do genoma foram congruentes. Apesar de não ter sido possível obter sequências dos quatro fragmentos para todos os espécimes foi possível fazer a correspondência entre os clados das diferentes árvores a partir das infomações sobre as amostras e/ou espécimes sequenciados. Entretanto, entre as árvores dos diferentes marcadores, foram observadas algumas incongruências na divisão de linhagens dentro dos grupos phoenicis e obovatus. A principal diferença na topologia das ávores filogenéticas, foi a posição do clado do grupo cuneatus. O status taxonômico de algumas populações, que provavelmente consituem novos táxons para a ciência, foi aclarado. Os resultados das análises filogenéticas indicaram a necessidade da condução de estudos mais detalhados para esclarecer a posição taxonômica de linhagens próximas a B. yothersi, B. incognitus e B. phoenicis tipo 1, para as quais não houve consenso entre as filogenias das diferentes regiões. O valor filogenético de alguns dos caracteres morfológicos que têm sido utilizados para a taxonomia de Brevipalpus foi discutido com a finalidade de subsidiar a revisão da classificação de grupos. As informações geradas representam um ponto de partida para a construção de uma classificação taxonômica consistente para os ácaros Brevipalpus, baseada nas relações filogenéticas entre os táxons. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The genus Brevipalpus is one of the most important in the Tenuipalpidae family. These phytophagous mites can cause damage to their host plants either directly, by feeding on leaves, stems and fruits or indirectly, by transmitting plant virus. Brevipalpus mite taxonomy, particularly of economically important species, represents a challenge for acarologists; numerous synonyms have been established and the occurrence of cryptic species has been confirmed. The accurate identification of these mites is essential to understand the role of each species in the transmission of plant viruses, for listing host plants of each species, and for defining prevention and control strategies. Morphological studies applying different microscopy techniques have enabled a considerable advance in the taxonomy of the group. In an integrative approach, besides the morphological studies is essential to have additional tools for building a consistent systematics for groups of organisms. So far, only one fragment of the Cytochrome Oxidase I (COI) region, of the mitochondrial DNA had been explored in Brevipalpus systematics. Employing a higher number of independent molecular markers is important to give consistency for the studies. The present study aimed to contribute for the advance of Brevipalpus mite molecular systematics by evaluating and optimizing DNA extraction and amplification protocols; comparing phylogenies obtained from sequences of four different genome regions, including mitochondrial– two fragments of the COI region -, and nuclear markers – regions Internal Transcriber Spacer II (ITS2) and the subunit D1-D3 of the gene 28S; presenting intra and interspecific genetic distances; and evaluating the morphological traits in a phylogenetic context. For the study 25 samples of Brevipalpus were obtained, from five countries – Argentina, Brazil, Chile, Spain and Israel, from 22 host plants. Two protocols of DNA extraction were evaluated considering DNA concentration, quality and efficiency for amplification, being one partially destructive and the other one non destructive. Although the DNA concentration for both protocols has been similar, the partially destructive method was more efficient for DNA amplification. For each of the four pairs of primers Polymerase Chain Reactions (PCR) were tested with variations on the components of reaction (MgCl2, BSA, DNTP and primers) as well as in the reactions conditions (amplification temperatures, number and duration of cycles). Reactions were adjusted to make possible DNA amplification from 2μL of DNA, thus allowing amplification of the four markers from DNA of one specimen. For the phylogenetic analyses, in addition to the sequences obtained in this study, Brevipalpus sequences retrieved from Genbank were included in the datasets. The length of the amplified fragment of the COI region using primers DNF & DNR was 373 base pairs (bp) and the final alignment included 190 sequences (92 obtained in this study, 98 retrieved from Genbank), which were classified in 89 haplotypes, clustered in 18 lineages. The length of the amplified fragment of the COI region using primers LCO & HCO was 650bp and the final alignment included 64 sequences (all obtained in this study), which were classified in 31 haplotypes, clustered in 12 lineages. The length of the amplified fragment of the ITS2 region was 500bp and the final alignment included 109 sequences (108 obtained in this study, one retrieved from Genbank), which were classified in 43 genotypes, clustered in 14 lineages. The length of the amplified fragment of the subunit D1-D3 of the gene 28S was 900bp and the final alignment included 74 sequences (all obtained in this study), which were classified in 28 genotypes, clustered in 11 lineages. In general topologies of phylogenetic trees obtained from sequences of the four genome regions were congruent. Although it wasn’t possible to obtain sequences of the four fragments for all the specimens, it was possible to match clades trees from information of the sequenced samples and/or specimens. However, incongruences in the division of lineages within groups phoenicis and obovatus were observed between trees built from different markers. The main difference between the phylogenetic trees topologies, was the position of the cuneatus group. Taxonomic status of some populations, which probably constitute new taxa, was clarified. Results of phylogenetic analyses showed the need to conduct further studies to clarify the taxonomic position of lineages close to B. yothersi, B. incognitus and B. phoenicis tipo 1, to which were observed incongruencies between phylogenies. The phylogenetic value of some morphological characters used for Brevipalpus taxonomy was discussed to support the revision of groups classification. Information provided represents a starting point for the development of a consistent taxonomic classification of the Brevipalpus mites, based on the phylogenetic relations between groups and taxa.

Dissertação (Mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-15T12:35:31Z No. of bitstreams: 1 2012_SandrieleAiresdeOliveira.pdf: 2326927 bytes, checksum: 9d7022636d4e3822635264488ecb0119 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-15T12:35:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_SandrieleAiresdeOliveira.pdf: 2326927 bytes, checksum: 9d7022636d4e3822635264488ecb0119 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-15T12:35:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_SandrieleAiresdeOliveira.pdf: 2326927 bytes, checksum: 9d7022636d4e3822635264488ecb0119 (MD5) / A incidência e mortalidade por câncer têm aumentado em todo mundo e representam um problema de saúde pública. Os tratamentos mais comuns são muitas vezes invasivos e inespecíficos. Quimioterápicos mais potentes e específicos têm sido estudados para elaboração de novos tratamento contra vários tipos de câncer. O inibidor de tripsina e quimotripsina BTCI, extraído a partir de sementes de feijão-de-corda Vigna unguiculata, foi caracterizado como um potente agente anticancerígeno devido à sua capacidade de diminuir a proliferação e viabilidade das células de câncer da mama. No presente trabalho, nanopartículas de quitosana contendo BTCI foram escolhidas para serem sintetizadas devido ao potencial anticarcinogênico do inibidor e às propriedades biomédicas de quitosana, que é atóxica e biodegradável. Além disso, peptídeos derivados de BTCI foram sintetizados e purificados a fim de estudar a atividade inibitória contra proteinases e a capacidade destes peptídeos de se translocarem através da membrana celular na ausência de receptores. Os peptídeos derivados apresentaram atividade inibitória contra tripsina e quimotripsina, e foram capazes de desestabilizar a bicamada de lipossomas POPC, utilizados neste trabalho como modelos de membrana. O diâmetro da nanopartícula contendo quitosana e BTCI variou entre 25 e 200 nm, em relação a diferentes pHs e concentrações de BTCI. A eficiência de encapsulamento do BTCI foi superior a 50%, apresentando liberação prolongada em condições fisiológicas. Análises de espectroscopia de fluorescência e dicroísmo circular sugeriram que a molécula de BTCI interage com a superfície externa das nanopartículas, apresentando algumas modificações estruturais, mas mantendo ainda a atividade inibitória contra proteinases. Estes resultados mostraram que os sistemas de nanopartículas de quitosana contendo BTCI são estáveis e ativos, podendo ser testados em ensaios in vitro com células de câncer da mama, visando investigar a atividade antitumoral destes sistemas contendo BTCI associado a polímeros de quitosana. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The incidence and mortality caused by cancer have increased and represent a public health problem. The common treatments are often invasive and nonspecific. More potent and specific chemotherapeutic agents have been studied for the alternative treatment of several types of cancer. The black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor (BTCI), a Bowman-Birk inhibitor isolated from Vigna unguiculata seeds, was characterized as a potent anticarcinogenic agent due its ability to significantly decrease the proliferation and viability of breast cancer cells. In the present work, chitosan nanoparticles encapsulating BTCI were chose to be synthesized due the anticarcinogenic potential of inhibitor and the nontoxic and biodegradable properties of chitosan. In addition, peptides derived from BTCI were synthesized and purified in order to study their activity against serine proteinases and the ability to translocate through the cell membrane models. The peptides presented inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin and were able to destabilize POPC phospholipids from membrane model. The diameter of chitosan-BTCI nanoparticles ranged from 25 and 200 nm in different pH and concentrations of BTCI. The encapsulation efficiency of the BTCI into chitosan particles was > 50% and the liberation of the inhibitor in physiological condition was prolonged. Analysis of fluorescence spectroscopy and circular dichroism suggested that BTCI interacts with the external surface of nanoparticles. Although the BTCI presents structural changes in this condition its inhibitory activity against proteinases was preserved. Altogether, these results showed that Chitosan-BTCI nanoparticles are active and stable and should be tested in vitro assays with breast cancer cells aiming investigation of the BTCI anticarcinogenic action in this system.

Dissertação (mestrado)-Universidade Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-07-11T14:22:35Z No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1320639 bytes, checksum: d8a0c917dabc31eb56d6427c44f07a2d (MD5) / Rejected by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com), reason: Documento não está bloqueado on 2012-07-13T10:36:42Z (GMT) / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-07-13T11:54:18Z No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1241121 bytes, checksum: 4e480e573263804ce2f125d7ac2c2c26 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-26T13:52:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1241121 bytes, checksum: 4e480e573263804ce2f125d7ac2c2c26 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-26T13:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1241121 bytes, checksum: 4e480e573263804ce2f125d7ac2c2c26 (MD5) / O estudo do enovelamento de proteínas e a predição de suas estruturas nativas são de grande importância para a ciência. Uma das abordagens possíveis para tal predição tem base nos enterramentos atômicos, entendidos como a distância do átomo até o centro geométrico da proteína normalizada pelo raio de giro da proteína. Esses enterramentos podem ser discretizados em camadas concêntricas e equiprováveis e já foi mostrado que a informação sobre estas camadas é su_ciente para levar a proteína ao seu estado nativo (Pereira de Araújo et al., Proteins 70:971-983, 2008; Pereira de Araújo e Onuchic, PNAS 106:19001-19004, 2009), mas não se sabe como esta informação está codi_cada na sequência. O objetivo do presente trabalho é medir a transinformação, quantidade de informação compartilhada por duas ou mais variáveis aleatórias discretas, entre sequência e enterramentos atômicos a partir de quatro diferentes alfabetos de sequência e de diversos números de níveis de enterramento atômico visando entender as relações entre essas variáveis e, assim, fornecer um máximo teórico para a e_ciência dos algoritmos de predi- ção de enterramentos atômicos. Os resultados deste trabalho mostram que a sequência de aminoácidos possui densidade de entropia entre 0; 9969 _ 0; 0002 bit e 4; 176 _ 0; 004 bit, dependendo do número de símbolos do alfabeto considerado (dois, três, cinco ou vinte símbolos), e excesso de entropia sempre próximo a zero. Portanto, infere-se que não existe correlação local entre os elementos da sequência. Por outro lado, os enterramentos atômicos apresentam densidade de entropia variando de 0; 617_0; 002 bit a 2; 16_0; 04 bit para C_ e de 0; 735_0; 002 bit a 2; 54_0; 01 bit para C_, de acordo com a quantidade de níveis de enterramento considerados (de dois a dez níveis), e excesso de entropia compreendido entre 0; 53 _ 0; 01 bit e 1; 4 _ 0; 1 bit para C_ e entre 0; 48 _ 0; 02 bit e 0; 93 _ 0; 04 bit para C_. Estes resultados evidenciam que os enterramentos atômicos são correlacionados localmente entre si. Foi encontrada uma relação entre enterramento atômico e estrutura secundária, na qual as _-hélices são distribuídas por todo o espaço ocupado pela proteína, as folhas-_ tendem aos níveis mais internos e segmentos sem estrutura secundária regular tendem a ocupar os níveis mais externos. A densidade de entropia da sequência é maior que a dos enterramentos atômicos se considerados alfabetos de mesmo tamanho, ou seja, aquela é potencialmente capaz de armazenar a informação necessária para a determinação deste. Entretanto, a transinformação entre sequência e enterramento (calculada para C_ e para C_) não é maior que 20% da dúvida do mesmo. Essa porcentagem é aparentemente pequena, mas é possível que mesmo esta quantidade de informação seja su_ciente para a predição dos enterramentos nativos, uma vez que a dúvida em relação ao enterramento de um átomo deve diminuir quando o de seu vizinho é conhecido, o que também foi mostrado neste trabalho. A combinação dos resultados deste provê um máximo teórico para os algoritmos de predição e permite saber se eles estão próximos deste máximo. _________________________________________________________________________ ABSTRACT / Protein folding understanding and protein terciary structure prediction are two main areas in science nowadays. One approach to terciary structure prediction has its basis in atomic burials, understood as the distance from a speci_c atom to the molecular geometrical center divided by protein's radius of giration. Atomic burials can be discretized in concentric and equiprobable burial layers, and it has been shown that information about these layers cary an amount of information enough to lead protein to its native structure (Pereira de Araújo et al., Proteins 70:971-983, 2008; Pereira de Araújo and Onuchic, PNAS 106:19001-19004, 2009), althougth it is not elucidated how this information is held to the sequence. The intend of this work is to measure mutual information, de_ned as the amount of information shared between two or more discrete random variables, between sequence and atomic burials considering di_erent combinations of sequence alphabets and number of burial layers, with the aim of understanding the relations between them and, therefore, contribute protein terciary structure prediction algorithms. The obtained results show that aminoacids sequence has entropy density ranging from 0; 9969_0; 0002 bit to 4; 176_0; 004 bit, according to the number of symbols of the considered alphabet (two, three, _ve or twenty symbols), and excess entropy approximately equal to zero. Taken together, these results demonstrate that sequence elements are not locally correlated. On the other hand, C_ and C_ atomic burials have shown entropy density from 0; 617_0; 002 bit up to 2; 16_0; 04 bit, and from 0; 735_0; 002 bit up to 2; 54_0; 01 bit, respectively, according to the number of burial levels considered (from two to ten levels). Its excess entropy vary from 0; 53_0; 01 bit to 1; 4_0; 1 bit and from 0; 48_0; 02 bit to 0; 93_0; 04 bit, taking C_ and C_ respectively. These results point that atomic burials elements have local correlation. In addition, a relation between atomic burials and secondary structure was evidenced, taken that Loops tend to external levels, _-sheets tend to internal levels and _-helices are homogeneously distributed through the protein radius. Sequence entropy density is major than atomic burials entropy density, i.e. sequence is theoretically capable of holding the amount of information necessary to determine atomic burials. However, mutual information between sequence and burials (calculated considering C_ and C_) is not greater than 20% of burial uncertainty. This percentage is apparently small, but is it possible that even this few information is enough to a correct prediction of atomic burials once that the entropy with respect to one atom shall decrease once its neigbour's position is known, which has also been shown here. The results obtained here provide a theoretical maximum that can be achieved by prediction algorithms, and therefore permit measure their e_ciency.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Laboratório de Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-07-11T20:25:23Z No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-30T12:10:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-30T12:10:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Quase todos os vetores de expressão de Pichia pastoris utilizam a sequência da região pré-pró do fator-α de Saccharomyces cerevisiae como sinal de secreção, o qual pode ser processado incorretamente em condições de hiperexpressão. Utilizar um sinal de secreção nativo de P. pastoris pode contornar este problema, mantendo a estrutura correta da proteína heteróloga. Utilizando o software Signal P. 3.0, os peptídeos sinais de 13 proteínas nativas do secretoma e a região “pré-pró” do fator α putativo de P. pastoris foram identificados e em seguida suas sequências foram amplificadas via PCR. Essas sequências foram clonadas no vetor pPIC9, integradas e expressas nessa levedura, junto com o gene repórter α-amilase de Bacillus subtillis. O fator α de S. cerevisiae presente nesse vetor foi removido, permitindo que apenas as sequências testadas neste trabalho influenciassem a secreção da enzima heteróloga. Após análise dos halos de hidrólise em placa e ensaios enzimáticos utilizando sobrenadante de cultura, observou-se que pelo menos quatro sinais de secreção testados possuíam níveis de secreção semelhantes ao fator α de S. cerevisiae. O sequenciamento do N-terminal da α-amilase será feito por espectrometria de massa, após purificação da enzima em coluna de níquel, e permitirá a análise da eficiência de processamento dos peptídeos sinais testados. Este último teste permitirá a escolha de um novo sinal de secreção nativo de P. pastoris, introduzindo novas opções para expressão heteróloga nesta levedura, além das disponíveis comercialmente pela empresa Invitrogen (EUA). _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Almost all Pichia pastoris expression vectors uses Saccharomyces cerevisiae α-factor secretion signal, which can be improperly processed in conditions of hiperexpression. Using a native P. pastoris secretion signal should overcome this problem, maintaining the right structure of the heterologous protein. Using Signal P. 3.0 software, 13 secretion signals of native secretome proteins and the putative α factor of P. pastoris were identified and then their sequences were amplified via PCR. These sequences were cloned in pPIC9 vector, integrated and expressed in this yeast, along with a Bacillus subtillis α-amylase gene as a reporter. The S. cerevisiae α factor present in this vector was removed, allowing that only the sequences tested in this work had influence on the secretion of the heterologous enzyme. After analyses of hydrolysis halos on plates and enzymatic assays using culture supernatants, it was observed that at least four secretion signals tested had similar secretion levels of the S. cerevisiae α factor. Sequencing of the N-terminus of α-amylase will be carried out by mass spectrometry, after purification of the enzyme in a nickel based column, and will allow analysis of processing efficiency of the signal peptides tested. The latter test will enable the selection of a new native P. pastoris secretion signal, introducing new options for heterologous expression in this yeast, aside the ones commercially available by Invitrogen Company (USA).

Tese (Doutorado)—Universidade Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-20T10:35:52Z No. of bitstreams: 1 2011_AdrianoBragaBrasilierodeAlvarenga.pdf: 714179 bytes, checksum: 836be2a04699982e2a5f4548328145b3 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-20T10:36:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_AdrianoBragaBrasilierodeAlvarenga.pdf: 714179 bytes, checksum: 836be2a04699982e2a5f4548328145b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-20T10:36:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_AdrianoBragaBrasilierodeAlvarenga.pdf: 714179 bytes, checksum: 836be2a04699982e2a5f4548328145b3 (MD5) / Com a introdução de raças exóticas e crescimento do rebanho nacional de ovinos, a avaliação de aspectos relacionados com a adaptação destes animais na região Centro-Oeste, Brasília - DF, podendo auxiliar no aprimoramento das técnicas de manejo, alcançar maiores índices de produtividade e garantir o bem-estar animal. Neste estudo, foram avaliados dezoito machos de seis diferentes raças de ovinos de diferentes origens em duas épocas do ano. Os parâmetros hematológicos, o perfil bioquímico sérico, a concentração sérica de glicocorticóides e as imagens termográficas resultaram em informações importantes no tocante à resposta fisiológica de raças alóctones quando submetidas às condições climáticas e ambientais do Distrito Federal, podendo as mesmas ser utilizadas como referência local. Os dados foram analisados pelo programa SAS®. A temperatura retal, os parâmetros hematológicos e bioquímicos séricos indicam a raça Santa Inês (deslanada), comparativamente às demais raças lanadas, como a mais bem adaptada às condições climáticas da região. De acordo com as concentrações de cortisol sérico a raça Texel é a menos adaptada e a Santa Inês a mais adequada para a criação de machos reprodutores em unidade de produção animal e essas concentrações podem ser utilizadas para o monitoramento do estresse térmico. A termografia revelou que as diferentes raças apresentam diferenças nas temperaturas retais, do olho, da cernelha, da garupa e do joelho, refletindo a termogênese, o estresse térmico sofrido e podendo as mesmas ser utilizadas como referências. Seguindo o protocolo de mensuração de proteínas do estresse (HSP70), não foi possível mensurar as concentrações de HSP70 no soro de ovinos. _________________________________________________________________________ ABSTRACT / With the introduction of exotic breeds and growth of the national herd of sheep, the evaluation of aspects related to the adaptation of these animals in the Midwest, Brasília - DF, which could aid in the improvement of management techniques, to achieve higher productivity levels and ensure the animal welfare. This study evaluated eighteen rams from six different breeds of sheep from different backgrounds and two seasons of the year. Hematologic parameters, serum biochemical profile, serum concentrations of glucocorticoids and the thermographic images resulted in important information regarding the exotic breeds in terms of the physiological response when exposed to weather and environmental conditions of the Federal District and may be used as a reference in the region. Data were analyzed by SAS® and the rectal temperature, the hematological and biochemical parameters indicate the woolless breeds, compared to other breeds were better suited to the climatic conditions. Considering concentrations of serum cortisol, the Texel breed is less well adapted and Santa Inês the most suitable for the breeding males in the animal production unit and these concentrations can be used to monitor heat stress. Thermography revealed that different breeds have differences in rectal temperatures, eye, withers, croup and knee, reflecting thermogenesis, heat stress suffered and can be used as a references. Following the protocol used, it was not possible to measure the concentrations of HSP70 in the serum of sheep.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de CIências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2012. / Submitted by Sabrina Silva de Macedo (sabrinamacedo@bce.unb.br) on 2012-07-18T14:03:22Z No. of bitstreams: 1 2012_RubemCruzHuacarpuma.pdf: 2198938 bytes, checksum: 7873175586685ed25fd99884e923ad63 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-30T12:35:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RubemCruzHuacarpuma.pdf: 2198938 bytes, checksum: 7873175586685ed25fd99884e923ad63 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-30T12:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RubemCruzHuacarpuma.pdf: 2198938 bytes, checksum: 7873175586685ed25fd99884e923ad63 (MD5) / O rápido avanço nas técnicas de sequenciamento de alto desempenho de fragmentos de DNA/RNA criou novos desa os computacionais na área de bioinformática. Um desses desa os é administrar o enorme volume de dados gerados pelos sequenciadores automáticos, particularmente o armazenamento e a análise desses dados processados em larga escala. A existência de diferentes formatos de representação, terminologia, estrutura de arquivos e semânticas, faz muito complexa a representação e administração desses dados. Neste contexto, um modelo de dados para representar, organizar e garantir o acesso aos dados biológicos é essencial para suportar o trabalho dos pesquisadores do campo da biologia, quando fazendo uso de pipelines de sequenciamento de alto desempenho. Este trabalho propõe tanto um modelo de dados conceitual, como também seu respectivo esquema relacional, permitindo a representação e o gerenciamento de um pipeline de sequenciamento de alto desempenho para projetos transcritômicos no intuito de organizar e armazenar de maneira simples e e ciente os dados gerados em cada fase da análise do pipeline. Nesta dissertação, trabalhamos com pipelines de sequenciamento de alto desempenho com três fases: ltragem, mapeamento e análise. Para validar nosso modelo, apresentamos dois estudos de casos para identi car a expressão diferencial de genes usando dados de sequenciamento de alto desempenho transcritômico. Estes estudos de caso mostraram que introduzir o modelo de dados, e o esquema correspondente, tornou o pipeline mais e ciente, organizado, para dar suporte ao trabalho dos biólogos envolvidos em um projeto de transcritoma. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The rapid advances in high-throughput sequencing techniques of DNA/RNA fragments created new computational challenges in bioinformatics. One of these challenges is to manage the enormous volume of data generated by automatic sequencers, specially storage and analysis of these data processed on large scale. The existence of representation format, terminology, _le structure and semantics, becomes very complex representation and management of such data. In this context, a data model to represent, organize and provide access to biological data is essential to support the researchers works into biology_eld when using high-throughput sequencing. This work proposes a conceptual model as well as its database schema to representand manage a high-throughput transcriptome pipeline in order to organize and store in a simple and efficient way data generated in each pipeline phase. In this dissertation, we work with three phases high-throughput sequencing pipeline: _ltering, mapping and analysis. In order to validate our model, we present two case studies both having the objective of identifying deferentially expressed genes using high-throughput sequencing transcriptome data. These case studies showed that uses a data model, and its database schema, became the pipeline more efficient, organized, and support the biologists works involved in a transcriptome project.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-20T14:42:51Z No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-09-28T12:56:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-28T12:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / O pH ambiental é um sinal importante para fisiologia de fungos, intervindo na regulação da transcrição de vários genes. Em fungos filamentosos e leveduras, PacC é um importante fator transcricional que regula a expressão de genes tanto em pH ácido como alcalino. A produção de enzimas envolvidas na bioconversão de biomassa vegetal é regulada principalmente no nível da transcrição. No entanto, o envolvimento da via de regulação por pH na expressão de enzimas lignocelulolíticos não tem sido extensivamente estudado. Nosso grupo havia demonstrado anteriormente que o deuteromiceto termofílico Humicola grisea var. thermoidea é um potente produtor de celulases, apresentando um considerável potencial biotecnológico para bioconversão de resíduos agrícolas. Nossos resultados sustentam a existência de uma via de regulação por pH para as glicosil hidrolases em H. grisea. Neste trabalho, foram realizadas análises quantitativas por RT-PCR em tempo real para vários transcritos de H. grisea. O perfil transcricional de oito genes codificadores de enzimas lignocelulolíticas (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 e xyn1) e de dois fatores de transcrição (pacC e creA) foi avaliado na presença de glicose ou de bagaço de cana-de-açúcar em condições de pH ácido e alcalino. A análise por qRT-PCR revelou uma indução forte e precoce de quase todos os genes de enzimas lignocelulolíticas, de uma maneira sinérgica quando o fungo foi cultivado com a fonte de carbono complexa e em condições alcalinas (pH 8,0). A única exceção foi egl4, que foi induzido por pH ácido. Um padrão oposto para a expressão dos dois fatores transcricionais foi observado. Enquanto pacC foi induzido em condições alcalinas e fortemente reprimido na presença de glicose, creA foi induzido por glicose e reprimido em condições alcalinas. Os dados de perfil de transcrição, combinados com a análise da ligação in vitro de PacC e CreA aos promotores dos genes analisados, apóiam a repressão por carbono, mediada por CreA, e a via de regulação por pH, mediada por PacC em H. grisea. Além disso, ensaios de mobilidade eletroforética (EMSAs) com o promotor de pacC mostraram que, in vitro, PacC e CreA competem pelo mesmo sítio de ligação. Tomados em conjunto, estes dados corroboram as hipóteses de que PacC possa ser o mediador da regulação influenciada pelo pH e de que a repressão por glicose, possivelmente atribuída a CreA, é capaz de sobrepujar a ação indutória do pH alcalino. Temos ainda evidências de que CreA também esteja envolvido na repressão de PacC, estabelecendo uma interação entre os dois sistemas regulatórios. O foco do segundo capítulo desse trabalho foi a produção e caracterização de Xyr1 (regulador de xilanases 1), que é o principal fator transcricional que atua na regulação da expressão dos genes codificadores de xilanases em Trichoderma reesei. Os resultados apresentados mostraram a bem sucedida produção heteróloga da versão completa da proteína Xyr1, algo até então inédito entre reguladores de xilanases em fungos filamentosos. Nossas análises empregando técnicas de interação DNA-proteína e géis nativos indicaram que Xyr1 pode naturalmente formar homodímeros em solução. Contudo, a dimerização não é fundamental para a interação com o DNA, o que implica em uma dinâmica complexa de ligação ao promotor do gene xyn1. São possíveis as formas de monômero, dímero e interação com ambos os motivos do sítio palindrômico. A capacidade de dimerização do fator fortalece a proposição de modulação adicional da atividade de Xyr1 por meio de possíveis interações proteína-proteína com outros fatores transcricionais, sendo candidatas as proteínas Ace1 e Ace2. O papel de modificações pós-traducionais tem sido apontado como crucial na regulação mediada por Xyr1. Mostramos que a fosforilação possivelmente está envolvida na regulação da atividade de Xyr1, sendo necessária para a interação DNA-proteína in vitro, mas sem afetar a formação de dímeros. Apresentamos ainda indícios de modulação alostérica de Xyr1 que depende tanto da interação com o DNA quanto, possivelmente, com carboidratos, o que torna mais complexo este modelo de regulação. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Environmental pH is an important signal in fungal physiology, acting at transcriptional regulation of several genes. In filamentous fungi and yeasts, the PacC zinc-finger transcription factor regulates gene expression in response to changes of external pH. The production of enzymes involved in plant cell wall breakdown is regulated mainly at the transcriptional level. Nonetheless, the involvement of the pH-related regulatory pathway in the lignocellulolytic enzymes expression has not been extensively studied. We have demonstrated that the thermophilic deuteromycete Humicola grisea var. thermoidea is a potent cellulases producer, presenting a considerable potential for agricultural wastes bioconversion processes. Previous results of our group support the existence of a pH regulatory pathway in H. grisea var. thermoidea. In this work, we have performed a time course transcription analysis of several H. grisea genes by quantitative real time RT-PCR. Eight enzyme genes (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 and xyn1), and two transcription factors genes (pacC and creA) were analyzed in the presence of simple (glucose) or complex (sugarcane bagasse) carbon source, in acid and alkaline medium conditions. The qRT-PCR analyses revealed an early and strong induction of almost all glycoside hydrolase genes transcription, in a synergistic way, when the mycelia were grown in the presence of the complex carbon source, under alkaline conditions (pH 8.0). The only exception was egl4, which was acid-induced. An opposite pattern was observed for the expression of the two transcription factors. While pacC was induced in alkaline conditions and strongly repressed in presence of glucose, creA was induced by glucose and repressed in alkaline conditions. The transcriptional profile data combined with the analysis of the in vitro binding of PacC and CreA transcription factors to the promoters support the CreA-mediated carbon repression and the PacC-related pH regulation of H. grisea cellulase and xylanase encoding genes. Moreover, electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) employing the upstream regulatory sequences of pacC showed that an in vitro interaction occurs between the proteins PacC and CreA on the pacC upstream regulatory sequence, with both factors competing for the same binding site. Taken together, this data corroborate our previous evidences, supporting the existence of a pH transcriptional regulatory pathway in H. grisea, mediated by PacC. Moreover, PacC is probably transcriptionally auto-regulated and may be subject to the carbon repression mechanism mediated by CreA. The second chapter of this work describes the production and characterization of Xyr1 (xylanase regulator 1), which is the main transcription factor that acts regulating the expression of xylanase encoding genes in Trichoderma reesei. The results showed the successful heterologous production of the full version of Xyr1, something never previously described for xylanases regulators in filamentous fungi. Our analyses employing techniques of DNA-protein xviii interactions and native gels indicated that Xyr1 can form homodimers in solution. Nevertheless, dimerization is not essential for the interaction with DNA, suggesting a complex binding dynamics to the xyn1 promoter region (as monomer, dimer and interacting with both palindromic binding sites). The dimerization capacity of Xyr1f strengthens the proposition of an additional modulation for this factor activity, probably by protein-protein interactions with other transcription factors, such as Ace1 and Ace2. A crucial role for post-translational modifications was proposed for gene regulation mediated by Xyr1. We initially showed that phosphorylation has a possible role in the regulation of Xyr1 activity, being necessary for the DNA-protein interactions in vitro, but not affecting the dimer formation. Additionally, we present evidence suggesting an allosteric modulation of Xyr1, dependent on interactions, both with DNA and carbohydrates, which adds an additional degree of complexity to this regulatory model.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-04-02T15:07:00Z No. of bitstreams: 1 2012_RenatodePaula.pdf: 7698577 bytes, checksum: dc8fd7334d6b68f154510b6f7fc82753 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-03T14:02:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RenatodePaula.pdf: 7698577 bytes, checksum: dc8fd7334d6b68f154510b6f7fc82753 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-03T14:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RenatodePaula.pdf: 7698577 bytes, checksum: dc8fd7334d6b68f154510b6f7fc82753 (MD5) / Avanços tecnológicos, tanto em equipamentos quanto em algoritmos, têm tornado a execução de experimentos científicos cada vez mais rápida e eficiente. Isso permite que os cientistas executem mais experimentos e possam compará-los entre si, o que traz maior acurácia às análises. Porém, a quantidade de dados que devem ser tratados aumenta a cada novo experimento executado, o que dificulta a identificação da origem dos dados e como os mesmos foram transformados em cada experimento. Assim, tem-se a necessidade de novas ferramentas que tornem possível preservar, não só as conclusões de um experimento científico, mas também a origem dos dados utilizados e as condições e parâmetros com os quais foram executados. Estudos recentes mostram que a utilização de modelos de proveniência de dados facilita o gerenciamento dos dados tanto em ambiente científico quanto naqueles disponibilizados pela internet. Uma importante área para o uso de proveniência de dados é o da bioinformática, principalmente em projetos genoma e transcritoma de alto desempenho, visto que seus experimentos geram grande volume de dados e seus processos podem ser executados diversas vezes com diferentes ferramentas, dados e parâmetros. Neste trabalho propomos a utilização de uma estrutura de proveniência de dados baseada no modelo PROV-DM para experimentos em projetos de bioinformática a fim de permitir que os cientistas possam trabalhar com seus experimentos em detalhes e, quando necessário, possam consultá-los e reexecutá-los de forma mais planejada e controlada. _____________________________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Technological Advances, both in equipment and algorithms, have made the execution of scientific experiments increasingly faster and more e efficient. This allows scientists to execute more experiments and compare them, generating greater accuracy in analyses. However, the great quantity of data to be treated increases with each new experiment performed, which makes it difficult to identify the origin of data and how they were transformed in each experiment. Thus, there is a pressing need for new tools that make possible the preservation of, not only conclusions of scientific experiments, but also the origin of data used and the conditions and parameters with which each were performed. Recent studies show that the use of data provenance models facilitates the management of data, both in the scientific environment and those available on the internet. An important area for the use of data provenance is in bioinformatics, mainly in genome and high performance transcriptome projects, since these experiments generate a large volume of data and their process can be executed many times with different tools, data and parameters. In this work we propose the use of a data provenance structure based on the model PROV-DM for experiments in bioinformatics projects with the objective of allowing scientists to work with their experiments in ne detail, and, when necessary, consult them or re-execute them in a more planned and controlled way.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2006. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-16T13:45:06Z No. of bitstreams: 1 2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-16T13:45:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-16T13:45:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Em algumas regioes do mundo, inclusive no Brasil, o numero de acidentes com escorpioes e bastante significativo. Devido a necessidade, entao, de se produzir antidotos ou anti-soros eficazes para combater os prejuizos causados a saude humana em decorrencia desses acidentes, estudos envolvendo a caracterizacao quimica e farmacologica da peconha desses animais foram intensificados. A peconha dos escorpioes e composta por varios tipos de moleculas, principalmente polipeptideos geralmente toxicos para um grande numero de organismos como mamiferos, insetos e crustaceos. Muito se tem estudado sobre as diferentes propriedades fisiologicas e farmacologicas dessas moleculas e atualmente ja sao conhecidas a atuacao em canais ionicos, atividade antimicrobiana, antimalaria, fosfolipasica e inseticida. Esse trabalho tem como objetivo principal o isolamento e a caracterizacao de peptideos biologicamente ativos presentes na peconha do escorpiao Tityus fasciolatus, especie endemica do cerrado. Os animais foram coletados na regiao do Distrito Federal e a peconha foi obtida por meio de estimulacao eletrica moderada proximo a glandula produtora de peconha do especime e, em seguida, liofilizada. A purificacao dos peptideos foi realizada em duas etapas: filtracao em gel (Superdex 75 HR 10/30) em tampao formiato de amonia e RP-HPLC (Vydac C18 218TP54) com a eluicao mediada pela aplicacao de um gradiente linear de acetonitrila. Os peptideos de interesse foram reduzidos e alquilados com 4-vinilpiridina e suas massas moleculares foram obtidas por meio de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). A estrutura primaria dos peptideos isolados foi obtida por meio da degradacao de Edman e tambem foram realizados ensaios biologicos a fim de se determinar a atividade de tais peptideos. Tres peptideos que apresentaram bom grau de pureza e abundancia tiveram suas estruturas primarias determinadas. O peptideo Tf14 possui massa molecular igual a 14 kDa e temos indicios de se tratar de um homodimero ligado por pontes dissulfeto; Tf3.5 e um provavel bloqueador de canais de potassio, uma vez que possui alta similaridade estrutural com peptideos dessa natureza e, finalmente, Tf2.7, um peptideo linear com 25 residuos de aminoacidos e massa molecular igual a 2,75 kDa. Ensaios biologicos revelaram tratar-se de um peptideo com atividade semelhante a bradicinina, alem de ser capaz de bloquear o fluxo de ions em canais de potassio voltagem-dependentes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In some regions of the world, including Brazil, the number of injuries caused by scorpions is rather relevant. In order to minimize the deleterious effects in human health caused by those injuries by means of counter poison or anti-serum, efforts were expanded to further investigate the biochemical and pharmacological properties of the poison of these animals. The scorpion venom are constituted by several and different kinds of molecules, mainly polypeptides, generally toxic for a large number of organisms like mammals, insects and crustaceans. Much is known about the physiological and pharmacological properties of these polypeptides, including their mode of action on ions channels, anti-malary, anti-microbial, phospholipasic and insecticidal activities. The main objective of this work is the purification and characterization of biologically active peptides present in the venom of the scorpion Tityus fasciolatus, an endemic species from cerrado region. The animals were collected in Distrito Federal, and the venom was obtained by gentle electric stimulation next to the producing glandule of the specimen. The peptides were purified in two steps: gel filtration (Superdex 75 HR 10/30) using ammonium formiate buffer, followed by RP-HPLC cromatography (Vydac C18 218TP54). The elution was performed by means of an acetonitrile gradient. The obtained peptides were reduced and alkylated using 4-vinylpyridine and their molecular masses were determined using mass spectrometry analysis (MALDI-TOF MS). The primary structures of these peptides were determined by Edman degradation and several assays were done in order to determine the biological activity of these peptides. Three highly pure and abundant peptides had their primary structures determined: Tf14, with a molecular mass of 14 kDa seems to be an homodimer holded by disulphide bridges; Tf3.5 should act blocking potassium channels since it shares high structural similarities to other scorpion peptides of this nature; and Tf2.7, a linear peptide of 25 amino acids residues with a molecular mass of 2.75 kDa. This peptide exhibits a bradykinin-like activity and is also able of blocking ion fluxes in voltage-dependent potassium channels.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-04-24T13:15:00Z No. of bitstreams: 0 / Rejected by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com), reason: on 2013-04-24T13:18:59Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-04-24T13:32:17Z No. of bitstreams: 1 2011_MarianaHallwass_Parcial.pdf: 1786257 bytes, checksum: 77d79c88b2c676722e4667d89e92ac9d (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-24T13:40:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MarianaHallwass_Parcial.pdf: 1786257 bytes, checksum: 77d79c88b2c676722e4667d89e92ac9d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-24T13:40:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MarianaHallwass_Parcial.pdf: 1786257 bytes, checksum: 77d79c88b2c676722e4667d89e92ac9d (MD5) / Espécies do gênero Tospovirus têm sido relatadas como agentes causais de doenças em diferentes culturas, no mundo, sendo transmitidos por diferentes espécies de tripes. O Tomato spotted wilt virus (TSWV) é a espécie-tipo do gênero Tospovirus e possui uma ampla gama de hospedeiros quando comparado com outros vírus do gênero. A partícula viral é envelopada e contém três segmentos de RNA designados S, M e L, que codificam duas proteínas não-estruturais (NSM e NSS) e três proteínas estruturais (L, N e o precursor das glicoproteínas GN e GC). A proteína NSM está envolvida no movimento do vírus célula-a-célula, enquanto que a NSS está envolvida na supressão de silenciamento gênico em plantas, demonstrado para o TSWV e para outro tospovírus, o Groundnut bud necrosis virus (GBNV) e também está relacionada com a expressão de sintomas nos tecidos foliares. Visando minimizar os danos causados por tospovírus, principalmente em cultivos de olerícolas, genes de resistência têm sido incorporados em variedades comerciais como o Tsw em pimentão e o Sw-5 em tomate. O entendimento dos processos de interação desses genes de resistência com genes virais constitui estratégia importante na durabilidade e estabilidade da resistência a esses patógenos. Este trabalho teve como objetivo geral estudar a interação entre tospovírus e plantas e foi dividido em três capítulos, sendo que no primeiro capítulo, foram determinadas as sequências completas de nucleotídeos do gene NSS de dois tospovírus relatados no Brasil, Groundnut ring spot virus (GRSV) e do Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV). As sequências foram comparadas com outras sequências NSS de tospovírus, disponíveis no banco de dados, permitindo a construção de árvores filogenéticas. Verificou-se que a NSs do GRSV e do ZLCV apresentou o mesmo tamanho, 1.404 nucleotídeos. A comparação das sequências de aminoácidos de GRSV com ZLCV mostrou uma identidade de 69,6%. Análises filogenéticas foram realizadas com base nas sequências NSS, depositadas no banco de dados, confirmando que as espécies estudadas pertencem ao grupo americano. O segundo capítulo foi dedicado ao estudo da interação entre TSWV e uma cultivar de pimenta resistente à infecção. No Brasil e no mundo, o estudo e o entendimento da morte celular programada (PCD) em células vegetais, induzida por infecções causada por fitopatógenos, ainda é incipiente. Resultados preliminares de ocorrência de PCD foram obtidos, utilizando o patossistema TSWV em Capsicum chinense PI 159236. Com o objetivo de estudar os domínios da proteína do nucleocapsídeo (N) de TSWV, responsável pela indução de reação de hipersensibilidade (RH) em genótipos de pimenta, foram construídas quimeras com troca de fragmentos genômicos do gene N de TSWV e Tomato chlorotic spot virus (TCSV) (responsável por causar infecção sistêmica em alguns genótipos de pimenta), usando como ferramenta o vetor de expressão transiente pGreenII 62-K. Agroinfiltrações com as construções e um controle negativo, que consistiu da bactéria mais o meio de indução, foram realizadas em plantas de C. chinense. Sintomas de necrose foram observados nas folhas com 10 a 12 dias após a infiltração. O sintoma de necrose ocorreu devido à incompatibilidade da interação agrobactéria GV3101/C. chinense, sendo necessário, em uma próxima etapa do trabalho, utilizar outra cepa de Agrobacterium mais adequada a este tipo de avaliação e que não induza, precocemente, o sintoma de necrose foliar. O terceiro capítulo consistiu do aprofundamento dos estudos da interação entre TSW V e um gene de resistência derivado do tomateiro. Interações entre plantas e vírus são complexas e envolvem vários tipos de respostas que podem ou não causar doenças no hospedeiro. A RH é um mecanismo utilizado pelas plantas para impedir a disseminação do patógeno para as células vizinhas. Para identificar o gene do TSWV isolado BR-01, responsável por desencadear uma resposta do tipo RH em plantas de Nicotiana benthamiana transgênica (expressando o gene de resistência derivada do tomateiro: Sw-5b), os genes das proteínas N, NSM e NSS foram clonados, individualmente, no vetor binário pGR107 (pPVX - Potato virus X ) e no vetor de expressão transiente pEAQ-HT Gateway, que também recebeu os genes GN e GC e o precursor da glicoproteína. Plantas de N. benthamiana (Sw-5b) foram agroinfiltradas com as construções obtidas em pGR107 e pEAQ-HT GW. Lesões necróticas do tipo RH foram observadas apenas nas plantas inoculadas com a construção pGR107 + NSM, diferindo dos sintomas causados pelas construções pGR107 + N e pGR107 + NSS. Entretanto, em inoculações realizadas com o vetor pEAQ, não foram observados sintomas do tipo RH nas agroinfiltrações realizadas com a construção pEAQ-HT GW + NSM. Verificou-se que a proteína NSM apresentou-se fragmentada em duas bandas quando detectada por Western blot, podendo ser esta a causa do não aparecimento da resposta do tipo RH com a inoculação dessa construção. Outra hipótese seria a necessidade de translocação da proteína NSM para a indução da RH, fato que poderia ser propiciado pelo vetor PVX, porém não ocorreria com o vetor de expressão pEAQ-HT GW. Visando a elucidação dessas hipóteses os trabalhos serão continuados. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The species type Tomato spotted wilt virus (TSW V) of the genus Tospovirus, has a broad host range if compared with other viruses of the genus. The viral particle is enveloped and contains three ssRNA segments denoted S, M and L, encoding two non-structural proteins (NSM e NSS) and three structural proteins (L, N, and the glycoprotein precursor of GN and GC). The NSM protein is involved in the cell-to-cell movement, whereas NSS acts as silencing suppressor in the affectedplants. This role was demonstrated for both TSWV and Groundnut bud necrosis virus (GBNV). The NSS is also related to the symptoms expression in plants. Strategies to minimizing the damages caused by tospoviruses, mainly in horticultural crops have been implemented based on resistance genes as Tsw in sweet-pepper and Sw-5 in tomato. Understanding the interactions between resistance and viral genes are essential to generate stable and durable resistance to these pathogens. This work had the general aim to study the interaction of tospoviruses and plants and it was divided into three chapters. In the first chapter, the complete nucleotide sequence of NSS gene of two tospoviruses Groundnut ring spot virus (GRSV) and Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) were determined. The NSs sequence of GRSV and ZLCV was both 1,404 nucleotides-long. Pairwise comparison showed that the NSs amino acid sequence of GRSV shared 69.6% identity with that of ZLCV. The sequences were compared with other NSS sequences of tospovírus available in the database. Phylogenetic analysis based on NSs sequences confirmed that these species cluster in the American clade. The second chapter was devoted to study the interaction between TSWV and a pepper cultivar resistant to the infection. The understanding of programmed cell death (PCD) in plants, induced by pathogens, is still incipient. Previous results about the PCD occurrence were obtained by using the pathosystem TSWV/ Capsicum chinense In order to study the nucleocapsid protein (N) domains of TSW V, responsible to cause a hypersensitive response (HR) in pepper genotypes, chimeras were constructed with genomic fragments of TSWV and Tomato chlorotic spot virus (TCSV) (responsible for causing systemic infection in some sweet pepper genotypes) was cloned into the pGreenII 62-K, a transient expression vector. Agroinfiltration was carried out in C. chinense plants with the pGreenII constructs and the negative control (just the Agrobacterium in the medium). Necrotic symptoms were observed 10 to 12 days after infiltration. The necrosis occurred dueto the interaction incompatibility between Agrobacterium GV 3101 and C. chinense plants. It was concluded that a different Agrobacterium strain that does not induce necrotic symptoms in the leaf must be used to enable this study, in a next step of this work. In the third chapter the interaction between TSW V and the resistance gene Sw-5 from tomato was studied. Interactions between plant and viruses are complex and involve several types of responses that may or may not cause disease to the host. The HR is a mechanism used by plants to prevent the spread of the pathogen to the neighboring cells. In order to identify the TSW V isolate BR-01 gene, responsible for triggering the HR in the transgenic Nicotiana benthamiana plants (Sw-5b), the N, NSM and NSSgenes were cloned individually in frame into the vector pGR107 (pPVX Potato virus X) and into the transient expression vector pEAQ-HT Gateway. The GN, GC and Glycoprotein precursor were cloned to into the pEAQ-HT GW vector. The constructs were agroinfiltrated in the transgenic N. benthamiana (Sw-5). HR-like necrotic lesions were seen only in leaves inoculated with the construct pGR107 + NSM, which differed significantly with symptoms caused by pGR107 + N and pGR107 + NSS. HR-like symptoms were not observed with pEAQ-HT GW + NSM. It was observed that the NSMprotein was not intact since two bands were detected by Western blot, suggesting that this could be the cause of the absence of the HR symptom in the inoculated plants. Another explanation would be the necessity of the NSM protein to move cell-to-cell to induce HR. This movement could be provided by the PVX vector, however does not occur when the pEAQ-HT GW was used. To elucidate these possible hypotheses, these studies will still be continued.