Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-04-26T12:47:13Z No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-29T11:24:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-29T11:24:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Uma característica do Trypanosoma cruzi são as mudanças morfológicas que ocorrem durante seu ciclo de vida. A amastigogênese é um importante processo no ciclo de vida do parasita onde as formas tripomastigotas infectivas se diferenciam em amastigotas replicativas. A duplicação celular é um processo complexo, onde vários eventos estão envolvidos, dentre eles, a correta segregação das cromátides irmãs após a replicação do DNA, função exercida por um complexo denominado coesina. Neste trabalho, foi proposta caracterização de complexos proteicos de T.cruzi assim como a identificação de proteínas de complexos nucleares, cuja expressão se altera durante a amastigogênese. Por meio da técnica Blue Native PAGE (BN-PAGE) foi possível realizar a separação de complexos proteicos de lisado total das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. Os componentes individuais dos complexos puderam ser visualizados em segunda dimensão após o gel ter sido corado com nitrato de prata. Experimentos de detecção imunológica por western blotting demonstraram a ausência da subunidade SCC1 do complexo coesina em amastigotas gerados por diferenciação in vitro de formas tripomastigotas em cultura axênica em pH 5. Porém, a subunidade SCC1 pode ser detectada em extratos proteicos de formas amastigotas que foram reincubadas por 10 h em meio de cultura com pH ajustado para 7,5, sugerindo que essas formas são capazes de manter suas propriedades replicativas. Por espectrometria de massas do tipo LC-MS/MS, 1.339 proteínas de T. cruzi foram identificadas de amostras provenientes dos ensaios de amastigogênese. Destas, 560 proteínas foram anotadas em bancos de dados como proteínas reguladas, 65 possuíam localização nuclear e 66 foram preditas como pertencentes a complexos proteicos. Na classificação das proteínas identificadas os grupos que correspondem àqueles envolvidos em metabolismo de ácidos nucleicos aparecem como predominantes. Proteínas que se ligam a DNA (9,23%), proteínas de ligação a RNA (13,85%) e proteínas que se ligam a nucleotídeos (18,46%) correspondem juntas a 41,54% do total de proteínas nucleares reguladas, corroborando o fato de que intensa atividade de transcrição e processamento de DNA e RNA ocorre em todas as etapas de diferenciação, além de outros principais grupos como as peptidases (15,38%), proteínas estruturais (13,85%) e atividade de hidrolases (12,31%). Para proteínas reguladas e envolvidas com complexos proteicos durante a amastigogênese os maiores grupos estão envolvidos em processos de transporte (25,58%), processos metabólicos (19,77%), processos metabólicos de compostos contendo nucleotídeos (16,28%), geração de precursores metabólicos e de energia (8,14%). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / A feature of Trypanosoma cruzi is the morphological changes that occur during their life cycle. The amastigogenesisis an important process in the life cycle of the parasite where the infective trypomastigotes differentiate into replicative amastigotes. A cell replication is a complex process, where several events are involved, among them the correct segregation of sister chromatids after DNA replication, function performed by a complex called cohesin. In this work we proposed the characterization of T. cruzi protein complexes and the identification of proteins from nuclear complexes, whose expression is altered during amastigogenesis. Through the technique of Blue Native PAGE (BN-PAGE) it was possible the separation of protein complexes from total lysate of T. cruzi epimastigotes. The individual components of the complexes could be visualized after the second dimensional gel after stainingwith silver nitrate. Immunological detection experiments by western blotting demonstrated the absence of SCC1 subunit of cohesin complex in amastigotes generated by in vitro differentiation of trypomastigotes in axenic culture at pH 5.0. However, the subunit SCC1 was detected in protein extracts of amastigotes that were reincubated for 10 hours in a culture medium adjusted at pH 7.5, suggesting that these forms are able to maintain their replicative properties. By LC-MS/MS mass spectrometry, 1,339 proteins ofT.cruzi were identified in samples from mastigogenesis. Of these, 560 proteins were annotated in databases as regulated proteins, 65 have presented nuclear localization and 66 were predicted as belonging to protein complexes. In the classification of proteins involved in nucleic acid metabolism, this group appears to be predominant. Proteins which bind to DNA (9.23%), RNA-binding proteins (13.85%) and proteins that bind nucleotides (18.46%) correspond together to 41.54% of the total regulated nuclear proteins, confirming that strong transcription activity and DNA and RNA processing occur in all stages of differentiation, and other major groups such as peptidases (15.38%), structural proteins (13.85%) and activity of hydrolases (12.31%). For regulated proteins and protein complexes involved in amastigogenesis the largest groups are involved in transport processes (25.58%), metabolic processes (19.77%), metabolic processes of compounds containing nucleotides (16.28%), generation of metabolic precursors and energy (8.14%).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-09-29T13:57:27Z No. of bitstreams: 1 2008_CesarMarcosMarcello.pdf: 1454599 bytes, checksum: a756918626271ef79f64ecdf6eae900c (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-02T23:01:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_CesarMarcosMarcello.pdf: 1454599 bytes, checksum: a756918626271ef79f64ecdf6eae900c (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-02T23:01:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_CesarMarcosMarcello.pdf: 1454599 bytes, checksum: a756918626271ef79f64ecdf6eae900c (MD5) Previous issue date: 2008-08 / Espécies do gênero Trichoderma têm sido encontrados atacando uma grande variedade de fungos patogênicos e usados como agente de biocontrole. A maioria das preparações a base de Trichoderma, utilizadas comercialmente para controle biológico, são de Trichoderma atroviride ou Trichoderma harzianum. Entretanto, Trichoderma asperellum, uma espécie pouco estudada, é um efetivo agente de controle biológico contra alguns fungos patogênicos. A interação de T. asperellum com Rhizoctonia solani é característica de micoparasitismo, envolvendo crescimento em direção ao hospedeiro, produção de estruturas semelhantes à apressórios e enrolamento das hifas. A maioria dos fungos fitopatogênicos possui parede celular contendo quitina, organizada em camadas regularmente ordenadas e ß-1,3-glucanas arranjadas como um enchimento de maneira amorfa. Quitinases e ß-1,3-glucanases tem sido diretamente envolvidas nas interações de micoparasitismo entre espécies de Trichoderma e seus hospedeiros. Neste trabalho nós apresentamos a análise da expressão de exo-ß-1,3-glucanases produzidas por T. asperellum durante o crescimento em diferentes fontes de carbono. Também demonstramos que a expressão do gene tag83 ocorre quando o T. asperellum cresce sob simulação de antagonismo contra R. solani. Estudamos a regulação do gene codante da exo-ß-1,3-glucanase extracelular (tag83) produzida pelo micoparasita T. asperellum. Foi detectada atividade enzimática em todas as fontes de carbono avaliadas, com níveis elevados encontrados quando amido e parede celular de R. solani foram utilizados. Estes resultados são apoiados pela presença de uma forte banda com atividade enzimática em gel nãodesnaturante (PAGE). Experimentos utilizando RT-PCR demonstrou que a indução da exo-ß-1,3-glucanase em T. asperellum ocorrem em nível transcricional. Também utilizamos RT-PCR e PCR em tempo real para analisar a expressão do gene tag83 durante ensaio in vivo do T. asperellum contra R. solani. Demonstramos ainda que a expressão de tag83 está significativamente aumentada na presença de R. solani. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Species of the genus Trichoderma have been found to attack a wide range of plant-pathogenic fungi and have been used as biocontrol agents. The majority of Trichoderma preparations used commercially for biological control are Trichoderma atroviride or Trichoderma harzianum. However, Trichoderma asperellum, a less well studied species, is also an effective biological control agent against some phytopathogen fungi. The interaction of T. asperellum with Rhizoctonia solani is characteristically mycoparasitic, involving growth along the host hyphae, production of appressoria-like structures and coiling. Most phytopathogenic fungi have cell wall that contain chitin as a structural backbone arranged in regularly ordered layers and â-1,3-glucan as a filling material arranged in an amorphous manner. Chitinases and â-1,3-glucanases have been found to be directly involved in the mycoparasitism interaction between Trichoderma species and its hosts. In this study, we reported the analysis of expression of the exo-ß-1,3-glucanase encoding gene tag83 produced by T. asperellum during growth in different carbon sources. We also show that expression of tag83 gene occurs when T. asperellum grows under simulated antagonism against R. solani. The regulation of the gene encoding the extracellular exo-â-1,3-glucanase (tag83) produced by the mycoparasite Trichoderma asperellum was studied. Enzyme activity was detected in all carbon sources, but highest levels were found when starch and purified cell walls from Rhizoctonia solani were used. These results are supported by the appearance of one strong band with enzyme activity in non-denaturing PAGE. Experiments using RT-PCR showed that exo-ß-1,3-glucanase induction in T. asperellum occurred at the transcriptional level. We used RT-PCR and real-time PCR analysis to examine the expression of tag83 gene during in vivo assay of T. asperellum against R. solani. We showed that the expression of tag83 is significantly increased by the presence of R. solani.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2006. / Submitted by Luana Patrícia de Oliveira Porto (luana_porto_23@hotmail.com) on 2009-09-29T22:25:03Z No. of bitstreams: 1 2006_HedersonPereiraSantos.pdf: 829940 bytes, checksum: 2a5c9eb3eec94eeac21dfc0bcdb86756 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-10-02T15:12:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_HedersonPereiraSantos.pdf: 829940 bytes, checksum: 2a5c9eb3eec94eeac21dfc0bcdb86756 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-02T15:12:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_HedersonPereiraSantos.pdf: 829940 bytes, checksum: 2a5c9eb3eec94eeac21dfc0bcdb86756 (MD5) Previous issue date: 2006-12-14 / Biologia Computacional é uma área da Ciência da Computação que tem por objetivo o estudo e aplicação de técnicas e ferramentas computacionais aos problemas da Biologia Molecular. Dentre os problemas pesquisados, encontra-se o de evolução molecular, onde são estudados métodos para comparar seqüências de espécies distintas, baseados em eventos mutacionais. Estes métodos geram medidas de distância, que podem ser empregadas para verificar o relacionamento em termos evolutivos entre dois organismos. Uma técnica de computar distância é comparar blocos, formados por um ou mais genes, de genomas de dois organismos. O nosso trabalho pertence à área de Rearranjo de Genomas que, de forma genérica, visa resolver o problema combinatorial de encontrar uma seqüência mínima de eventos de rearranjo (mutações) que transformam um genoma em outro. Estudamos um evento de rearranjo específico – transposição, que move uma porção de genes de um local para outro dentro do mesmo cromossomo. Este evento gera o problema da ordenação por transposições, que consiste em computar e encontrar a menor seqüência de transposições que transformam um genoma em outro. Neste trabalho propusemos dois algoritmos de aproximação baseados no formalismo algébrico de Dias e Meidanis para o problema de ordenação por transposições. Implementamos estes algoritmos utilizando a linguagem Java e comparamos os resultados obtidos com outros encontrados na literatura. Este trabalho visa contribuir para encontrar a complexidade do problema de ordenação por transposições que ainda não é conhecida. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Computational Biology is an area that aims to study and to apply techniques and computational tools to problems of molecular biology. One of these problems is molecular evolution, in which methods are proposed for comparing sequences of distinct species, based on mutational events. These methods generate distance measures that could be employed to verify the evolutionary relationship between two organisms. A technique to compute distance is to compare blocks, composed by one ore more genes, of the genomes of two organisms. This work belongs to the field of genome rearrangement, that has the objective to solve the combinatorial problem of finding a minimum sequence of rearrangement events that transform a genome into another. We studied a particular rearrangement event - transposition, that moves a portion of genes from a local to another inside one chromosome. This event generates the problem of sorting by transpositions, that consists in computing and finding the minimum sequence of transpositions that transform a genome into another. In this work, we proposed two approximation algorithms based on the algebraic formalism of Dias and Meidanis to solve the problem of sorting by transpositions. We implemented these algorithms using the Java language, and compared the results obtained with the results of other algorithms found in the literature. This work aims to contribute to find the complexity of this problem still unknown.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-10-06T12:08:10Z No. of bitstreams: 1 2008_RobertoNascimentoSilva.pdf: 3733422 bytes, checksum: 1da0c1d7f54c836476db5e24188ceeb2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-11-03T17:40:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RobertoNascimentoSilva.pdf: 3733422 bytes, checksum: 1da0c1d7f54c836476db5e24188ceeb2 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-03T17:40:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RobertoNascimentoSilva.pdf: 3733422 bytes, checksum: 1da0c1d7f54c836476db5e24188ceeb2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) é amplamente utilizado na indústria e seu potencial para o uso na agricultura como agente de controle biológico contra fungos fitopatogênicos começou a ser explorado recentemente. O gene gna3 que codifica para uma proteína G subgrupo III, ativadora de adenilato ciclase de T. reesei, foi clonado para o estudo do seu possível papel no controle da expressão de genes codificadores das celulases (cbh1 e cbh2) por celulose e soforose. Bem como, na produção de enzimas que degradam parede celular (EDPCs), durante o antagonismo contra Phytium ultimum. A linhagem mutante de T. reesei que possui uma cópia modificada de gna3 para expressão de uma versão da proteína GNA3 (gna3QL) que se mantém ativada exibiu elevado conteúdo intracelular de AMPc e uma diminuição na esporulação, mas sem afetar a taxa de crescimento vegetativo no escuro e um aumento de 20% dessa taxa em presença de luz. Consistente com o comportamento da linhagem selvagem, nenhuma transcrição de genes de celulase ocorre na ausência de indutor. Entretanto, o mutante mostra um aumento na transcrição de celulase em presença de celulose, mas somente em presença de luz. O nível de transcrição de celulase no escuro é similar o da linhagem parental TU-6. Por outro lado, quando soforose foi utilizada como indutor, transcritos de cbh1 e cbh2 tiveram nível mais alto de transcrição quando as culturas foram mantidas no escuro do que na presença de luz. A transcrição de gna3 é aumentada em presença de luz. Todavia, genes conhecidamente regulados por luz, blr1, blr2 e env1 são igualmente transcritos no mutante gna3QL como no tipo selvagem. Durante o antagonismo contra P. ultimum, o mutante gna3QL, como a linhagem parental TU-6 inibiram o crescimento de P. ultimum no teste de confronto. O mutante gna3QL cresceu mais rápido do que a linhagem parental TU-6 nos primeiros 3 dias, mas cresceu mais devagar que o T. harzianum (ALL42). A microscopia eletrônica de varredura mostrou que o mutante gna3QL promoveu maiores alterações morfológicas na parede celular de P. ultimum do que a linhagem parental TU-6. O mutante gna3QL apresentou uma melhor performance na produção de EDPCs como endoquitinase (0,36 U. mL-1), N-acetil-?-D-glicosaminidase (NAGase) (2,62 U. mL-1) , ?-1,3-glicanase (5 U. mL-1), lipase (2,94 U. mL-1) e fosfatase ácida (11,81 U. mL-1), após 72 horas de incubação em meio líquido contendo parede celular de P. ultimum como fonte de carbono. Entretanto, a linhagem parental TU-6 apresentou uma maior atividade de celulase (10,3 U. mL-1) do que o mutante gna3QL (6,64 U. mL-1) e nenhuma diferença significativa na atividade de protease entre as duas linhagens foi observada. Os resultados mostram que GNA3 está envolvida na regulação da expressão de genes de celulase (cbh1 e cbh2) por celulose e este processo é dependente de luz. Além disso, a produção de algumas EDPCs durante o micoparasitismo por T. reesei contra P. ultimum pode estar associada com a atividade de GNA3 e/ou com o aumento intracelular dos níveis de AMPc. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) is widely used in industry and its potential for use in agriculture as a biocontrol agent against phytopathogenic fungi has just begun to be explored. The adenylate cyclase activating subgroup III Gproteinencoding gene gna3 of T. reesei was cloned to study its possible role in the control of cellulose and sophorose to cellulase (cbh1 and cbh2) gene expression as well in production of cell wall-degrading enzymes (CWDEs) during antagonism against Pythium ultimum. A mutant strain of T. reesei bearing a modified copy of gna3 for expression of a kept activated version of GNA3 protein (gna3QL) exhibits elevated intracellular cAMP levels and decreased sporulation, but was unaffected in its growth rate in dark and an increase in this rate of about 20% in light. Consistent with the behavior of the wild-type strain, no cellulase transcription occurs in this mutant in the absence of an inducer. However, the mutant shows an increase in cellulase transcription in presence of cellulose, but only in the presence of light. Cellulase transcription level in the dark is similar to the parent strain. On the other hand, when sophorose was used as inducer, transcript levels of cbh1 and cbh2 were higher when cultures were kept in the dark than in presence of light. The transcription of gna3 is increased in the presence of light. Nevertheless the light regulatory genes blr1, blr2 and env1 are transcribed similarly in the gna3QL mutant as in the wild-type. During antagonism against P. ultimum, the mutant gna3QL, like the parental TU-6 strain, inhibited the growth of P. ultimum in dual culture assay. The mutant gna3QL grew faster than the parental TU-6 strain within the first 3 days but grew more slowly than the T. harzianum (ALL42). Scanning electron microscopy showed that the mutant gna3QL promoted more morphological alterations of P. ultimum cell wall after interaction than the parental TU- 6 strain. The mutant gna3QL showed a better performance in production of CWDEs such as endochitinase (0.36 U. mL-1), N-Acetyl- _ -D-glucosaminidase (NAGase) (2.62 U. mL-1), _-1,3-glucanase (5 U. mL-1), lipase (2.94 U. mL-1) and acid phosphatase (11.81 U. mL-1), after 72 hours of incubation in liquid medium containing P. ultimum cell wall as the carbon source. However, the parental TU-6 strain showed higher cellulase activity (10.3 U. mL-1) than the mutant gna3QL (6.64 U. mL-1) and no significant difference was observed in protease activity between the two strains. The results showed that GNA3 is involved in light-regulated cellulase gene expression (cbh1 and cbh2) on cellulose. Furthermore, the production of some CWDEs during mycoparasitism by T. reesei against P. ultimum can be associated with GNA3 activity and/or increase in intracellular cAMP levels.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-11-01T17:27:42Z No. of bitstreams: 1 2006_David Neves.pdf: 1665803 bytes, checksum: 120b8a159902f36958452567ba6c8f3a (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-11-10T12:59:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_David Neves.pdf: 1665803 bytes, checksum: 120b8a159902f36958452567ba6c8f3a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-10T12:59:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_David Neves.pdf: 1665803 bytes, checksum: 120b8a159902f36958452567ba6c8f3a (MD5) Previous issue date: 2006 / Esta tese descreve a identificação do gene mtaf (metiltioadenosina fosforilase) de T. cruzi, o qual contém uma fase aberta de leitura de 921 pb, sendo que sua a seqüência traduzida exibe a assinatura da família 2 das purina nucleosídeo fosforilase/MTAP. A seqüência da TcMTAF é 59% e 58% idêntica às seqüências MTAF do Trypanosoma brucei and Leishmania major, respectivamente, mas apresentando apenas 35% de identidade com a seqüência da MTAF humana. Além disso, o gene está representado como cópia única por genoma haplóide do parasita. A TcMTAF recombinante migra como um monômero de 33 kDa em gel de “SDS-PAGE” sob condições redutoras, mas se associa em oligômeros na ausência de agentes redutores. A MTAF nativa é expressa pelas três formas de desenvolvimento do T. cruzi. Apesar da enzima ser ativa em uma ampla faixa de pH e temperatura, ela exibe atividade máxima à 50 °C e um pH ótimo na faixa neutra. Ao contrário da MTAF humana, que degrada apenas MTA, a TcMTAF catalisa a clivagem de MTA, adenosina, deoxiadenosina e guanosina. Devido ao fato da TcMTAF e da MTAF humana possuírem diferentes parâmetros cinéticos e especificidade a substratos, a TcMTAF pode ser explorada como um novo alvo para o desenvolvimento de quimioterapia tripanocída. A rTcMTAP foi submetida a caracterização fisicoquímica. A enzima foi submetida à desnaturação térmica, visualizada por dicroísmo circular, em uma ampla faixa de pH, contudo não se observou uma relação entre a estabilidade da proteína e as condições de ionização do meio. A enzima demonstrou uma considerável resistência à desnaturação térmica, desdobrando-se em temperaturas acima de 79 °C. O conteúdo de estruturas secundárias da enzima é significativamente composto por α-hélices. Contudo, mesmo após a desnaturação térmica, a percentagem das α-hélices exibe pouca variação, principalmente no pH 7.4 e 9.0. Desnaturação química, induzida por hidrocloreto de guanidina e uréia, foi monitorada tanto por dicroísmo circular como por espectroscopia de fluorescência. A enzima suportou concentrações de até 3.6 M de hidrocloreto de guanidina e até 8 M de uréia sem alterar sua estrutura terciária. Os parâmetros termodinâmicos calculados a partir dos experimentos de desnaturação química e térmica demonstraram estar em harmonia. Em pH 6.0 e na presença de CTAB a enzima demonstrou uma resistência ainda maior à desnaturação térmica.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Kelly Marques (pereira.kelly@gmail.com) on 2009-11-03T18:29:13Z No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO.pdf: 9729892 bytes, checksum: 86dc32db2bd0d4bbddc8a4764a79ab08 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:40:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO.pdf: 9729892 bytes, checksum: 86dc32db2bd0d4bbddc8a4764a79ab08 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:40:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO.pdf: 9729892 bytes, checksum: 86dc32db2bd0d4bbddc8a4764a79ab08 (MD5) Previous issue date: 2008-02 / α-Amilases têm aplicações nas indústrias de processamento do amido, produção de álcool, têxtil e outras. Na busca por fontes de amilases na biodiversidade do cerrado, uma levedura foi isolada e classificada como Cryptococcus flavus. Embora esta levedura seja capaz de metabolizar amido, ela não pode ser usada na indústria por não possuir status GRAS. Por outro lado, S. cerevisiae, amplamente utilizada na indústria de etanol, não é capaz de degradar amido para produzir açúcares fermentescíveis, sendo necessária a clonagem e expressão heteróloga de enzimas amilolíticas nesse microrganismo. Neste trabalho, o gene da amilase de C. flavus (AMY1) codificando uma amilase extracelular foi clonado e expresso com sucesso em S. cerevisiae. A seqüência de nucleotídeos do cDNA revelou uma ORF de 1896 pb codificando uma cadeia polipeptídica de 631 aminoácidos apresentando uma homologia (97%) com a amilase da levedura Cryptococcus sp S-2. A presença das quatro regiões conservadas, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 e (IV) 327FLENQD332 classificou essa enzima na família 13 das glicosil hidrolases (G13). A cinética de produção da amilase recombinante alcançou a atividade amilolítica máxima (3,93 U/mL) em 60 horas de cultivo. A proteína recombinante apresentou uma massa molecular similar a amilase nativa (~ 67 kDa), parte devido à N-glicosilação. Além disso, a amilase recombinante foi caracterizada bioquimicamente apresentando um pH ótimo de 5,5, temperatura ótima de 60 °C e Km= 0,37 mg/mL para o amido. Com o objetivo de desenvolver uma cepa de S. cerevisiae capaz de degradar o amido de forma mais eficiente, o gene da glicoamilase de Aspergillus awamori foi clonado no vetor YEp352-PGK para co-expressão com o gene da amilase de C. flavus, clonado previamente no vetor YEp351-PGK. O clone de S. cerevisiae expressando as duas enzimas foi capaz de crescer em meio contendo amido como única fonte de carbono. Dados preliminares de fermentação em frasco mostraram que esse clone é capaz de produzir 116 g de ethanol/L durante 120 horas de cultivo. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / α-Amylases have applications in starch processing, alcohol production, textile and others industries. On screening for amylolytic yeasts in the Brazilian Cearrado, a yeast was isolated and classified as Cryptococcus flavus. Although C. flavus is able to metabolize starch, it cannot be used in industry because it does not possess GRAS status. On the other hand, S. cerevisiae, which is widely used in ethanol industry, cannot degrade starch to fermentable sugars, requiring for that the cloning and heterologous expression of amylolytic enzymes from other microrganisms. In this work, a C. flavus α-amylase gene (AMY1) encoding an extracelullar α-amylase has been cloned and successfully expressed in S. cerevisiae. The nucleotide sequence of the cDNA revealed an ORF of 1896 pb coding for a 631 amino acid polypeptide with high identity (97%) to a homologous protein isolated from Cryptococcus sp S-2. The presence of four conserved regions, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 and (IV) 327FLENQD332, places the enzyme in the GH13 α-amylase family. The assessment of the time course of amylase secretion in S. cerevisiae revealed a maximal extracellular amylolytic activity (3.93 U/mL) at 60 hours of incubation. The recombinant protein had an apparent molecular mass similar to the native enzyme (~67 kDa), part of which was due to N-glycosylation. On further characterization it was found that the recombinant amylase has optimal activity on pH 5.5 at 60 °C. Its for starch is Km= 0.37 mg/mL . In order to develop a S. cerevisiae strain able to degrade starch more efficiently, the Aspergillus awamori glucoamylase gene was cloned into the YEp352-PGK vector with a view to co-expression with the C. flavus α-amylase gene, previously cloned into YEp351-PGK. This new strain expressing both enzymes was able to grow in medium containg starch as sole carbon source. Preliminary data of flask fermentation suggest that this strain is able to produce 116g ethanol/L in 120 h of incubation.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-11-04T19:05:14Z No. of bitstreams: 1 Luanne Helena Augusto Lima.pdf: 4097968 bytes, checksum: 43f9433dc99c32e4ca8fd6528811bb0b (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:45:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Luanne Helena Augusto Lima.pdf: 4097968 bytes, checksum: 43f9433dc99c32e4ca8fd6528811bb0b (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:45:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luanne Helena Augusto Lima.pdf: 4097968 bytes, checksum: 43f9433dc99c32e4ca8fd6528811bb0b (MD5) Previous issue date: 2006-03 / O xilitol é um adoçante natural, anticariostático, utilizado principalmente na indústria de alimentos, com consumo anual estimado em 500.000 toneladas. O seu valor econômico, aliado a suas diversas aplicações, impulsionam pesquisas biotecnológicas para aumentar sua produção. A Candida guilliermondii FTI 20037 é uma das mais promissoras leveduras para produção de xilitol com rendimento acima de 0,5 g/Lh. Além disso, é capaz de produzir xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de diversos resíduos agrícolas. A partir do seqüenciamento de regiões do DNA ribossômico de C. guilliermondii FTI 20037 foi demonstrado que esta levedura deve ser re-classificada como Candida tropicalis. O presente estudo representa uma das primeiras iniciativas para se desenvolver um sistema que permita a transformação genética de C. tropicalis com a finalidade de potencializar a produção de xilitol através da manipulação dos genes XYL1 (xilose redutase) e XYL2 (xilitol desidrogenase). Estes genes foram clonados e suas seqüências analisadas. O gene XYL2 por não ter sido ainda caracterizado, foi objeto de estudos mais detalhados. XYL2 é representado por uma ORF (open reading frame) de 1092 pb, que potencialmente codifica um polipeptídeo de 364 resíduos de aminoácidos, com ~40 kDa. XYL2 não possui íntrons, apresenta-se em única cópia no genoma de C. tropicalis e é controlado em nível transcricional pela presença de xilose. A seqüência primária da ORF XYL2 é idêntica à publicada no projeto genoma de C. tropicalis. Estudos de modelagem molecular demonstraram que a proteína Xyl2 pertence à família MDR (medium chain alcohol dehydrogenase) contendo sítios para ligação a zinco e NAD+. Para demonstrar sua funcionalidade, os genes XYL1 e XYL2 foram expressos com sucesso em S. cerevisiae. Visando o estabelecimento de um sistema de transformação para espécies de Candida um gene sintético (ZeoCan) que confere resistência a zeocina foi desenvolvido com o codon preferencial de C. tropicalis. Todavia, os resultados de transformação mostraram que a resistência a zeocina não é indicada como marca de seleção para C. tropicalis uma vez que esta levedura deve possuir mecanismos genéticos para anular o efeito do antibiótico. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Xylitol is a natural sweetener mainly used in the food industry with an annual estimated consumption of 500.000 tons. The high ecomonic value of xylitol together with its multiple applications have driven many biotechnological studies in order to improve its production. The Candida guilliermondii FTI 20037 is one of the most promising yeast of xilitol production with yields over 0.5 g/Lh. In addition, it is capable of producing xylitol from hemicellulosic hydrolysate derived from several raw materials. From the sequencing of ribossomal DNA regions from C. guilliermondii FTI 20037 we have shown that this yeast should be re-classified as Candida tropicalis. The present work represents one of the first initiatives towards the development of a system which would allow the genetic transformation of C. tropicalis with the goal of improving xylitol production through the manipulation of the genes XYL1 (xylose reductase) and XYL2 (xylitol dehydrogenase). These genes were cloned and the sequences were analyzed. Since XYL2 had not yet been characterized it was the focus of more detailed studies. XYL2 is represented by a 1092 pb open reading frame which potentially codes for a 364 residues polypeptide with ~40 kDa. XYL2 does not have introns, it is present as a single copy in the C. tropicalis genome and is controlled at the transcriptional level by the presence of xylose. The primary sequence of the XYL2 ORF is identical to the published sequence from the C. tropicalis genome project. Molecular modeling studies showed that the Xyl2 protein belongs to the MDR (medium chain alcohol dehydrogenase) family containing binding sites for zinc and NAD+. In order to functionally analyze the cloned genes, XYL1 and XYL2 were successfully expressed in S. cerevisiae. In order to establish a transformation system for Candida species a synthetic gene (ZeoCan) which confers zeocin resistance was developed with the C. tropicalis codon usage. However, the results from transformation experiments showed that the zeocin resistance gene should not be employed as selective marker in C. tropicalis since this yeast must display genetic mechanisms to counteract the effects the antibody.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-11-05T16:42:33Z No. of bitstreams: 2 Dissert_parte 1.pdf: 2027028 bytes, checksum: 2de2c0ec869fc7c7bcafac412263bd7e (MD5) Dissert_parte 2.pdf: 60749499 bytes, checksum: 07b759b83e942f4c06914a40d377bce1 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2011-01-31T13:32:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissert_parte 1.pdf: 2027028 bytes, checksum: 2de2c0ec869fc7c7bcafac412263bd7e (MD5) Dissert_parte 2.pdf: 60749499 bytes, checksum: 07b759b83e942f4c06914a40d377bce1 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-31T13:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissert_parte 1.pdf: 2027028 bytes, checksum: 2de2c0ec869fc7c7bcafac412263bd7e (MD5) Dissert_parte 2.pdf: 60749499 bytes, checksum: 07b759b83e942f4c06914a40d377bce1 (MD5) Previous issue date: 2006 / A família Calliphoridae é o principal grupo de Diptera relacionado à decomposição de cadáveres, sendo as subfamílias Chrysomyinae e Calliphorinae as mais importantes, representadas por oito gêneros e 22 espécies no Brasil. As larvas destas subfamílias são utilizadas para estimar o intervalo post-mortem (IPM) através do seu tempo de desenvolvimento na Entomologia Forense. A identificação de larvas constitui o primeiro passo para a prática forense e a estimativa do IPM. As descrições de larvas possuem uma grande variação de características utilizadas dificultando a identificação. Neste trabalho, objetiva-se redescrever larvas de terceiro ínstar de cinco espécies pertencentes às subfamílias Chrysomyinae e Calliphorinae utilizando microscopia ótica e eletrônica de varredura: Chrysomya albiceps (Wiedemann, 1819), Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794), Paralucilia fulvinota (Bigot, 1877), Phaenicia cuprina (Wiedemann, 1830) e Phaenicia eximia (Wiedemann, 1819) por serem as mais comumentes encontradas em cadáveres em decomposição e por facilitar a identificação em perícia criminal. As principais estruturas e características morfológicas que podem contribuir para uma identificação precisa são: espiráculo posterior, tipo e bandas de espinhos dorsais do primeiro segmento torácico (T1) e segundo segmento abdominal (A2), disposição dos tubérculos do oitavo segmento abdominal (A8) e região anal. ____________________________________________________________________________ ABSTRACT / The family Calliphoridae is the main group of the Diptera associated with carrion decomposition, and the Chrysomyinae and Calliphorinae are the most important subfamilies, represented for eight genus and 22 species in Brazil. The larvae of these subfamilies are used, in Forensic Entomology, to estimate the post-mortem interval (IPM) through their development time. The identification of larvae constitutes the first initial step for forensic practice and estimate of the IPM. The descriptions of larvae present a great variation of used features which hinders the identification. This paper aims to redescribe larvae of third instar, of five species belonging to the subfamilies Chrysomyinae and Calliphorinae using light and scanning electron microscopy: Chrysomya albiceps (Wiedemann, 1819), Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794), Paralucilia fulvinota (Bigot, 1877), Phaenicia cuprina (Wiedemann, 1830) e Phaenicia eximia (Wiedemann, 1819) most often found associated with corpses in decomposition and that contribute to an easy identification in criminal investigation. The essential morphological structures and features that may contribute for accurate identification are: posterior spiracles, tip and bands of dorsal spines of first thoracic segment (T1) and second abdominal segment (A2), arrangement of tubercles of eighth abdominal segment (A8) and anal region.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-11-19T11:34:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sergio Martin Aguiar.pdf: 2193468 bytes, checksum: 73f83e8b2ee3cc21959b2170c65029ec (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-02-04T16:25:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sergio Martin Aguiar.pdf: 2193468 bytes, checksum: 73f83e8b2ee3cc21959b2170c65029ec (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-04T16:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sergio Martin Aguiar.pdf: 2193468 bytes, checksum: 73f83e8b2ee3cc21959b2170c65029ec (MD5) Previous issue date: 2006 / O pH ambiental desempenha um papel importante na fisiologia de inúmeros microrganismos, determinando níveis de transcrição de genes cujos produtos funcionam na fronteira celular ou em seu exterior. Na adaptação de Aspergillus nidulans a diferentes valores de pH o fator transcricional PacC tem um papel importante, sendo ativado por uma via de treansdução de sinal em respsta a pH neutro/básico. Homólogos ao gene pacC foram isolados em diversos outros fungos. Em fungos como a Candida albicans e Fusarium oxysporum, foi demonstrado que PacC está envolvido em mecanismos de patogenicidade. Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico, endêmico na América Latina, podendo provocar severa micose sistêmica em humanos. No presente trabalho foi isolado e seqüenciado um gene de P. brasiliensis ortólogo ao pacC de A. nidulans. A seqüência obtida foi avaliada, in silico, quanto a sua organização estrutural. O gene apresenta 2837 nucleotídeos e quatro íntrons. A proteína predita é composta de 676 resíduos de aminoácidos, possuindo massa molecular de aproximadamente 72,4 kDa. Foi demonstrado que a proteína predita a partir do gene em estudo possui regiões conservadas presentes na maioria das seqüências orólogas já descritas na literatura científica, apresentando maior identidade com a proteína de Trichophyton rubrum (50,2%). O perfil de expressão do gene pacC após crescimento de P. brasiliensis em meios de cultura com pH ácido, neutro e básico, revelou a presença do transcrito nas três condições de cultivo., por meio de experimento de RT-PCR. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Environmental pH is important for several microorganisms physiology, intervening at the transcriptional level of gene products which act at the cellular surface or outside the cell. In the ascomycete Aspergillus nidulans, cellular adaptation to different pH values is provided by the PacC transcriptional factor, which is activated by a signal transduction pathway triggered by neutral or basic pH. Homologues to the pacC gene were isolated from different fungi. In Candida albicans and Fusarium oxysporum, the PacC factor is related to pathogenicity mechanisms. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus, endemic in Latin America, and cause a severe systemic mycosis in humans. In this work, a P. brasiliensis gene, homologous to A. nidulans pacC, was isolated and sequenced. DNA sequence was evaluated, in silico, concerning its structural organization. P. brasiliensis pacC gene presents 2937 nucleotides and four introns. The predicted protein is composed of 676 amino acid residues, with a molecular mass of 72.4 kDa. The putative PacC protein presents motifs conserved in the majority of the published homologous sequences. The highest identity is with Trichophyton rubrum PacC (50.2%). Expression analyses of P. brasiliensis pacC gene, after fungal growth in acidic, neutral and alkaline pH, demonstrated that it is transcribed in all the conditions assayed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-25T16:14:58Z No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-01-14T19:06:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-14T19:06:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) Previous issue date: 2006 / As proteínas recombinantes de interesse terapêutico vêm ganhando cada vez mais espaço na indústria farmacêutica e atualmente já movimentam um mercado anual de cerca de 50 a 60 bilhões de dólares em todo o mundo. As células de mamíferos são as hospedeiras de expressão preferencialmente escolhidas no caso de proteínas que requerem um grau sofisticado de processamento pós-traducional, sendo crescente a iniciativa de identificação de novas linhagens de células, especialmente humanas, como sistemas alternativos de expressão às células utilizadas. Nosso grupo de pesquisa tem interesse na produção de antígenos para seleção de anticorpos com potencial neutralizante, especialmente os antígenos de superfície do envelope viral de HIV-1, agente etiológico da pandemia mundial de AIDS, que atualmente apresenta mais de 40 milhões de infectados. O presente trabalho teve por objetivo a avaliação preliminar das células de ducto de glândula submandibular humana (HSG) como sistema de expressão heteróloga alternativo às células de ovário de hamster chinês (CHO-K1). Comparativamente, foi avaliada a eficiência de transfecção, assim como a de expressão transiente do anticorpo quimérico anti-Z-DNA Z22, na forma recombinante de fragmento FvFc pelas duas linhagens celulares. Outro objetivo foi a produção de versões recombinantes das glicoproteínas virais de HIV-1. Os resultados apontaram as células HSG como um bom sistema alternativo para a produção de proteínas heterólogas secretadas, especialmente quando transfectadas por co-precipitação com fosfato de cálcio, sendo ainda necessários alguns ajustes, uma vez que os choques osmóticos com glicerol e DMSO, considerados pontencializadores da transfecção, mostraram-se tóxicos da forma como foram executados. Foram amplificados e clonados em vetor de expressão para células de mamíferos os segmentos gênicos correspondentes a quatro versões recombinantes das glicoproteínas do envelope viral de HIV-1 (gp160, gp140, gp120 e gp41+PS), subtipo C que, de acordo com as nossas análises, utiliza CCR5 como co-receptor. Até o presente momento, não foi possível a detecção das glicoproteínas recombinantes, expressas de forma transiente em células CHO-K1, sendo necessários ajustes, principalmente na etapa de transfecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Recombinant therapeutic proteins have become more and more important in the pharmaceutical industry, and nowadays they are responsible for an injection of about 50 to 60 million dollar a year into the worldwide market. Animal cell cultures are the preferential expression systems for those proteins which require extensive posttranslational modifications. In this view, the identification of alternative expression systems is an issue of increasing concern, specially considering human cell lines. Our research group has been interested in the production of antigens to be used for the selection of neutralizing antibodies, particularly those antigens derived from the envelope surface of HIV-1, the etiologic agent of the pandemic infection of AIDS, which nowadays affects more than 40 million people. This work aimed the preliminary evaluation of the human salivary gland duct cells (HSG) as a heterologous expression system alternative to the Chinese hamster ovary cells (CHO-K1). The transfection efficiency for both cell lines was comparatively evaluated, as well as the transient expression of the anti-Z-DNA Z22 chimeric antibody, as a recombinant FvFc fragment. Another objective was the production of recombinant versions of HIV-1 glycoproteins. Our results pointed out to the HSG cells as a good alternative system for the production of secreted heterologous proteins, specially when transfected by co-precipitation with calcium phosphate. Some adjusts are still needed, considering that the glycerol and DMSO osmotic shocks, generally considered as transfection pontentializers, proved to be toxic in the employed protocol. The genic fragments corresponding to four recombinant versions of the HIV-1 envelope glycoproteins (gp160, gp140 gp120 and gp41+PS), subtype C, were amplified and cloned in a mammal cells expression vector. According to our analysis, this virus subtype uses CCR5 as co-receptor. So far, it was not possible to detect the recombinant glycoproteins expressed in a transient form in the CHO-K1 cells. In order to achieve this objective, some adjustments are still necessary, specially concerning the transfection protocol.