Les récentes recherches suggèrent que la superovulation de vaches laitières sous une concentration élevée de progestérone permet de meilleurs résultats que la superovulation sous une basse progestéronémie pendant la première vague folliculaire. Nous émettions donc l’hypothèse qu’une basse progestéronémie pendant la phase lutéale, une problématique connue chez la vache laitière haute productrice, compromet le rendement en embryons suite à la superovulation de la deuxième vague folliculaire. Afin de tester cette hypothèse, 18 vaches laitières ont été superovulées à deux reprises avec deux protocoles distincts, dont un atteignant un niveau lutéal de progestérone (>2.5 ng/mL, le corps jaune comme source de progestérone) et l’autre un niveau sublutéal (<2.5 ng/mL, l’implant intravaginal comme unique source de progestérone). Le nombre d’embryons transférables était similaire entre les protocoles. Curieusement, nous avons obtenu un développement accéléré des follicules dans le protocole sublutéal (p = 0,002), un développement embryonnaire plus avancé (p = 0,01) et une qualité améliorée des embryons (p = 0,02) par rapport au protocole lutéal. Ces résultats suggèrent que des facteurs autres qu’une basse progestéronémie peuvent affecter le rendement en embryons. Une pulsatilité augmentée de la LH grâce à une basse progestéronémie pendant la deuxième vague folliculaire pourrait être responsable du développement folliculaire accru ainsi que du développement et de la qualité augmentés des embryons. Ces résultats indiquent que des niveaux sublutéaux de progestérone pendant la phase lutéale ne compromettent pas le résultat d’un traitement de superovulation mais, au contraire, peuvent améliorer certains aspects du rendement en embryons. / Recent research has suggested that superovulation of dairy cows under high levels of progesterone allows for better results than superovulation of cows under low levels during the first follicular wave. We therefore hypothesized that low levels of luteal progesterone, a known problem for high producing dairy cows, impair superovulatory outcome during the second follicular wave. To test this hypothesis, 18 lactating cows were superovulated twice with two different protocols, one creating a luteal level of progesterone (>2.5 ng/mL, corpus luteum as progesterone source) during the superovulation treatment, the other one inducing a subluteal level (<2.5 ng/mL, intravaginal implant as the only progesterone source). The number of transferable embryos was not significantly different between the two protocols. Interestingly, we obtained an accelerated development of follicles in the subluteal protocol (p = 0.002), a more advanced embryo development (p = 0.01) and enhanced embryo quality (p = 0.02) compared to the luteal protocol. These results indicate that factors other than low progesterone levels may determine the outcome of superovulation performed during the first follicular phase. Increased LH pulsatility in response to low levels of progesterone during the second follicular phase may be responsible for enhancing follicular development in our subluteal group, resulting in accelerated embryo development and improved embryo quality. These results indicate that subluteal levels of progesterone during the luteal phase do not impede superovulatory outcome, but may, in contrary, enhance certain aspects of the yield in embryos.

Réduire les usages d’antibiotiques est un des leviers principaux pour contrer l’avancée de l’antibiorésistance qui menace l’efficacité du traitement des maladies bactériennes humaines et animales. En filières bovin laitier et jeunes bovins de boucherie, deux maladies de production sont responsables des principaux usages d’antibiotiques, respectivement les mammites et les maladies respiratoires. L’objectif de la thèse a été d’identifier auprès des acteurs des filières des verrous limitant l’amélioration des pratiques la diminution de l’utilisation d’antibiotiques, puis d’identifier des leviers d’action. En élevage de jeunes bovins de boucherie, des entretiens auprès d’acteurs de la filière (éleveurs et responsables) et des enquêtes auprès d’éleveurs ont permis d’identifier que l’organisation de la filière est un des principaux verrous. Cependant, les caractéristiques des systèmes d’exploitations et les compétences des éleveurs constituaient également une potentielle limite. En élevage bovin laitier, des entretiens ont permis de montrer que les perceptions et connaissances des éleveurs semblaient être un des freins majeurs à l’amélioration des pratiques, le système d’exploitation semblant intervenir à la marge. En élevage bovin allaitant, des leviers permettant d’améliorer la coordination entre les acteurs de la chaîne de valeur ont été identifiés. En élevage laitier, un programme innovant de formation et de conseil a été évalué dans le cadre d’une étude d’intervention, montrant une amélioration des connaissances et perceptions des éleveurs sur la prévention et l’utilisation des antibiotiques. / Reducing antibiotic use is one of the main levers to limit the increase of antimicrobial resistance, which threatens the effectiveness of the treatments of human and animal bacterial diseases. In dairy and young beef bull sectors, antibiotics are mainly used to control two production diseases, respectively mastitis and bovine respiratory diseases (BRD). The objective of the thesis was to identify with sectors’ stakeholders’ limitations for the improvement of antibiotic use practices, then to identify levers of action. In the young beef bulls’ sector, interviews with stakeholders and farmers showed that the organization of the value chain, because of its potential influence on BRD risk factors, was one of the main limitation identified. However, the characteristics of farming systems and farmers’ skills were also a potential limitation. In the dairy sector, interviews have shown that farmers’ perceptions and knowledge seemed to be one of the major limitation to the improvement of the practices. The farming system seemed to have only limited influence. In young beef bulls sector, levers to improve coordination between stakeholders in the value chain have been identified. In dairy farming, an innovative training and advising program was evaluated as part of an intervention study, showing an improvement in the knowledge and perceptions of farmers regarding prevention measures and antibiotic use.

Dans une situation de forte vulnérabilité induite par les crises laitières de 2009 et 2014-2016, de nombreux éleveurs laitiers se convertissent à l’AB qui semble une alternative prometteuse. Mais la conversion à l’AB est une période de changements de pratiques agricoles, d'interlocuteurs de conseil, etc. sources d’incertitudes sans valorisation immédiate du lait au prix du lait AB avant 1 an ½ à 2 ans. Ce choix de conversion pose la question de la vulnérabilité des exploitations laitières, c’est à dire de leur capacité à faire face, à s’adapter ou à se remettre des effets de divers aléas avant, pendant et à l’issue de la conversion à l’AB. Ma thèse visait à évaluer si la conversion à l’AB est un moyen de réduire la vulnérabilité des exploitations laitières. Pour ce faire, je me suis appuyée sur trois dispositifs de suivis d’éleveurs laitiers à différents moments de leur conversion à l’AB. Au plan de la production de connaissances, ce travail montre que la conversion à l’AB peut être un levier important pour la réduction de la vulnérabilité des exploitations agricoles à condition de s’orienter vers un système à dominante herbagère. Au plan méthodologique, la principale originalité de mon travail réside dans le développement d’une méthode d’évaluation intégrée et dynamique de la vulnérabilité. / In a situation of high vulnerability induced by the 2009 and 2014-2016 milk crises, many dairy farmers convert to organic farming, which seems a promising alternative. But the conversion to organic farming is a period of changes in farming practices, farm consultants, etc. sources of uncertainties without immediate valuation of the milk at the organic price before 1 ½ to 2 years. This conversion decision raises the question of the vulnerability of dairy farms, i.e. their ability to cope with, adapt to or recover from the effects of various hazards before, during and after the conversion. My PhD project aimed to assess whether the conversion to organic farming is a way to reduce the vulnerability of dairy farms. To that end, my work relied on three research set-ups based on surveys with dairy farmers at different stages of their conversion to organic farming. In terms of knowledge production, this work shows that conversion to organic farming can be an important lever to reduce farms vulnerability, as long as they move towards pasture-based system. In terms of methodological production, the main originality of my work lies in the development of an integrated and dynamic method for vulnerability assessment.

Lors de la fécondation, le sperme et l'ovule s'unissent pour former un zygote totipotent. Initialement, le zygote est transcriptionnellement inactif. Au cours des premiers clivages a lieu la mise en route du génome embryonnaire (EGA) et le développement passe alors sous le contrôle de l’information embryonnaire (au stade 8-16-cellules chez le bovin). Cette transition d’un contrôle maternel à un contrôle embryonnaire est appelée « maternal to embryonic transition (MET) ». De la même façon, lors du transfert nucléaire (clonage), un noyau de cellule somatique placé dans un ovocyte énucléé devient totipotent. Ce processus est appelé «reprogrammation nucléaire somatique?». En fait, la reprogrammation nucléaire lors du clonage est équivalente à la MET, toutefois, le clonage est très peu efficace. Les objectifs de cette étude chez les bovins sont a) d'explorer le processus de reprogrammation lors de la MET dans des embryons fécondés in vitro (FIV) et b) d’estimer l'efficacité de la reprogrammation génique après le transfert nucléaire lors du clonage. Nous émettons l'hypothèse que l'acquisition d'un profil d'expression génique correct pourrait être prédictif d’un potentiel de développement à terme de l'embryon, et pourrait être évalué dès juste après l'activation du génome embryonnaire (EGA) chez les bovins. Nous avons développé notre travail selon deux axes a) des analyses globales d'expression génique utilisant une puce dédiée à l’EGA et b) l’analyse du profil d'expression de gènes candidats par qRT-PCR dans les embryons fécondés et clonés. Dans un premier temps nous avons optimisé le protocole d'amplification d'ARNm pour l'analyse du transcriptome de matériels rares. Puis nous avons fait l'analyse du transcriptome avant et après EGA d’embryons issus d’ovocytes prélevés sur des vaches phénotypées comme « bonnes » ou « mauvaises » donneuses d’embryons. En outre, ces ovocytes ont été maturés soit in vivo soit in vitro. Nos analyses montrent que l'effet individuel est plus important que l'effet « bonne ou mauvaise donneuse » ou même que l’effet « conditions de maturation ». Nous avons ensuite analysé les expressions géniques de 5 types d'embryons clonés ayant différents potentiels de développement à terme en fonction de la lignée cellulaire utilisée comme source de cellules donneuses. Globalement, leur expression génique est proche de celle de morulae FIV, mais quelques gènes présentent une expression différente. Ces gènes varient avec la lignée de cellules donneuses et leur nombre n’est pas lié à l’aptitude au développement à terme. L’analyse d’un lien éventuel entre leur nature et cette aptitude devra être poursuivie. Dans un deuxième temps, nous avons analysé les profils d'expression spatio-temporelle des transcrits et des protéines des gènes de pluripotence (OCT4, SOX2 et NANOG) et les niveaux d'ARNm de certains de leurs cibles dans les ovocytes et les embryons précoces chez le bovin. Les profils d'expression de ces gènes ont aussi été analysés dans des embryons clonés présentant différents potentiels de développement à terme. Nos résultats montrent que (1) la triade de gènes de pluripotence n'est probablement pas impliquée dans l’EGA bovine. (2) les transcrits et protéines de SOX2 et de NANOG sont restreints au lignage pluripotent plus tôt que ceux de OCT4, (3) les embryons à faible taux de développement à terme ont un taux de transcription plus élevé, néanmoins, l’équilibre précaire entre les gènes de pluripotence est maintenue. Cet équilibre pourrait permettre un développement normal in vitro, mais le taux de transcription plus élevé pourrait avoir des conséquences délétères sur le développement ultérieur. / In natural fertilization, sperm and ovum unite to form a totipotent zygote. Initially, the zygote is transcriptionally inactive and after few cleavages (8-16-cell stage in bovine) embryonic genome activation (EGA) takes place and embryo shifts from maternal to embryonic control, the process called maternal to embryonic transition (MET). Likewise, in nuclear transplantation (cloning) a somatic cell nucleus achieves totipotency when placed in an enucleated oocyte, the process called “nuclear reprogramming”. In fact, nuclear reprogramming in cloning experiments is equivalent to MET; however, this process is afflicted with low efficiency. The objectives of this study in bovine were a) to explore the process of MET reprogramming of in vitro fertilized (IVF) embryos and b) to estimate the efficiency of gene reprogramming after nuclear transfer in animal cloning. We hypothesized that the acquisition of a proper gene expression pattern could herald development potential of the embryos, which could be assessed as early as morula stage or after embryonic genome activation (EGA) in bovine. Here, we opted for a study plan consisting of two axes a) global gene expression analysis using an EGA-dedicated microarray and b) candidate gene expression profiling through qRT-PCR in the fertilized and cloned bovine embryos. Firstly, we optimized the protocol of mRNA amplification for transcriptome analysis which generates antisens-RNA (aRNA). Then we did transcriptomic analysis of the 4-cell and morulae derived from two genotypes having better and two genotypes having poorer in vitro embryonic development potentials. In addition, these oocytes were either matured in vivo or in vitro. We observed that the effect of individual genotype was more important than the effect of the phenotypic category (poorer or better) or conditions of oocyte maturation. Furthermore, we explored the expression patterns of 5 types of cloned embryos having different full term developmental potentials depending upon the donor cell line used. Their genes expression patterns closely resembled to the IVF morulae, except for few genes which present differences. These genes vary with the cell line used as somatic cell donor for SCNT and the number of these deregulated genes did not increase with the poorer developmental potential of the cloned embryos. The analysis of an eventual correlation between the potential for embryonic development to term and nature of the deregulated genes should be addressed. Secondly, we charted quantitative and/or qualitative spatio-temporal expression patterns of transcripts and proteins of pluripotency genes (OCT4, SOX2 and NANOG) and mRNA levels of some of their downstream targets in bovine oocytes and early embryos. Furthermore, to correlate expression patterns of these genes with term developmental potential, we used cloned embryos, instead of gene ablation, having similar in vitro but different full term development rates. We chose these genes to be analysed since pluripotency genes are implicated in mouse embryonic genome activation (EGA) and pluripotent lineage specification. Moreover, their expression levels have been correlated with embryonic term development. Our findings affirm: first, the core triad of pluripotency genes probably is not implicated in bovine EGA since their proteins were not detected during pre-EGA phase, despite the transcripts for OCT4 and SOX2 were present. Second, an earlier ICM specification of SOX2 and NANOG makes them better candidates of bovine pluripotent lineage specification than OCT4. Third, embryos with low term development potential have higher transcription rates; nevertheless, precarious balance between pluripotency genes is maintained. This balance presages normal in vitro development but, probably higher transcription rate disturbs it at later stage that abrogates term development.

Enteric caliciviruses were detected in humans and animals incoming into food chain such as porcine and bovine species. Caliciviruses have a single stranded, positive, polyadenylated RNA genome. They share properties of high environmental stability, high excretion load and high genetic variation linked to point mutations and recombination. These properties have allowed the formulation of hypothesis about zoonotic transmission or animal reservoir for human strains. The aim of the thesis, composed of four studies, was to investigate the zoonotic risk associated to animal enteric caliciviruses. In a first study, circulation of both sapoviruses and noroviruses was evidenced by molecular detection in Belgian pig farms. They were detected in both asymptomatic animals or in piglets showing clinical signs of enteritis. In a second study, bovine noroviruses were molecularly detected in Belgian cattle. Strains phylogenetically related to those of the genotype 2 were predominant. In the same study, seroprevalence against bovine norovirus infection in cattle was investigated by indirect ELISA. Antigens included in the ELISA were virus-like particules obtained in the baculovirus system by expressing the capsid protein of a strain isolated by the laboratory during a previous study. Apparent seroprevalence was high (93.2%), confirming previous results about apparent molecular prevalence in diarrheic calves (7.5%). In a third study about molecular detection of bovine noroviruses, diagnostic strategy was revised in order to improve the detection of genotype 1 strains and to deal with opportunity of recombination events. Bovine norovirus recombinant strains and also, surprisingly, some sequences genetically related to bovine kobuviruses were detected. In a fourth study, attachment factors and internalization pathways for genotype 2 bovine noroviruses were studied with an original quantitative method based on flow cytometry analysis. Along with a galactosyl residue that seems to be essential, a sialic acid residue was also showed to be implied in the binding of genotype 2 bovine noroviruses or in a posterior step. Internalisation pathways related to lipid rafts and to macropinocytosis were found. Together the results have contributed to the analysis of the zoonotic risk associated to enteric animal caliciviruses in the Belgian epidemiological situation. According to these results, the zoonotic risk seems to be low as no sequences genetically related to the human ones were detected. However, some results suggest to maintain a certain degree of vigilance. Indeed, molecular detection showed the co circulation of both bovine and porcine noroviruses in Belgian farms, implicating that hazard exposition exists and could be high in the Belgian epidemiological situation. Morevover, circulation of recombinant strains in the overall population of the bovine norovirus strains implies that this phenomenon was included in the risk assessment. Infection pressures and high prevalences for human and animal strains in a closed epidemiological context as the Belgian one could increase the risk of interspecific recombination. Finally, the sialic acid residue, possibly involved in the binding of genotype 2 bovine noroviruses, and a poorly specific internalisation pathway as macropinocytosis could also favor interspecies barrier crossing. In the current knowledge, zoonotic risk associated to animal enteric caliciviruses can be communicated as low but a degree of vigilance has to be retained, associated for example to observation of genetic evolution in the populations of human and animal strains.

Le microbiote du rumen bovin est un écosystème très diversifié et efficace pour la dégradation de substrats complexes, notamment issus de la biomasse végétale. Composé majoritairement de microorganismes non cultivés, il constitue un réservoir très riche de nouvelles enzymes d’intérêt potentiel pour les biotechnologies industrielles, en particulier les bioraffineries et la bioremédiation. Dans le cadre de cette thèse, nous avons mis en œuvre une approche de criblage fonctionnel du métagenome ruminal pour accélérer la découverte d’enzymes de dégradation des lignocelluloses, mais aussi de divers polluants synthétiques. En particulier, de nouvelles estérases capables de dégrader un insecticide de la famille des carbamates, le fenobucarb, ainsi qu’un polyuréthane commercial, l’Impranil DLN, ont pu être identifiées. De plus, le développement d’une nouvelle stratégie de criblage d’oxydoréductases nous a permis d’isoler trois enzymes bactériennes originales, très polyspécifiques, ne requérant ni cuivre ni manganèse pour dégrader différents substrats polycycliques tels que des polluants majeurs de l’industrie textile, mais aussi des dérivés de lignine. Enfin, le criblage de deux banques issues d’enrichissements in vivo et in vitro du microbiome du rumen sur paille de blé a permis d’isoler des cocktails d’enzymes lignocellulolytiques au profil fonctionnel et d’origine taxonomique différents, constitués de glycoside-hydrolases, estérases et oxydoréductases. Quinze nouveaux modules CAZy, correspondant à des familles enzymatiques jamais caractérisées, ont été identifiés. L’ensemble de ces résultats met en lumière l’immense potentiel d’innovation biotechnologique contenu dans les écosystèmes microbiens, en particulier dans le microbiote du rumen bovin / Bovine rumen microbiota is a highly diverse and efficient ecosystem for the degradation of complex substrates, especially those issued from plant biomass. Predominantly composed of uncultivated microorganisms, it constitutes a rich reservoir of new enzymes of potential interest for industrial biotechnologies, especially biorefineries and bioremediation. As part of this thesis, we used the functional screening of the ruminal metagenome to increase the discovery of enzymes able to degrade lignocelluloses, as well as different synthetic pollutants. In particular, new esterases able to degrade a carbamate insecticide, fenoucarb, and a commercial polyurethane, Impranil DLN, have been identified. Moreover, the development of a new screening strategy for oxidoreductases allowed the isolation of three original bacterial enzymes that are very polyspecific, and do not need copper nor manganese to degrade different polycyclic substrates, like major pollutants of the textile industry, as well as lignin derivatives. Finally, the screening of two libraries from in vivo and in vitro enrichments of the ruminal microbiome on wheat straw allowed the isolation of lignocellulolytic enzymatic cocktails, with different functional profiles and taxonomical origins, comprising glycoside-hydrolases, esterases and oxidoreductases. Fifteen novel CAZy modules, related to enzymatic families never characterized, were identified. All these results highlight the vast potential of microbial ecosystems, in particular the bovine rumen microbiota, for biotechnological innovation

Anaplasma phagocytophilum est une alpha-protéobactérie à multiplication intracellulaire stricte transmise par les tiques du genre Ixodes sp. Responsable notamment des anaplasmoses granulocytaires bovine et humaine, elle peut également infecter de nombreux mammifères, tels les ruminants sauvages ou les rongeurs. En Europe, plusieurs cycles, encore mal connus, semblent coexister et impliquer des hôtes (réservoirs et victimes) différents. Cela semble être en particulier le cas pour les souches bovines et humaines, conduisant à supposer que les souches bovines ne seraient pas zoonotiques. Du fait de sa localisation intracellulaire in vivo, et plus particulièrement au sein des polynucléaires neutrophiles des hôtes vertébrés, la culture d’A. phagocytophilum au laboratoire expose à d’importantes difficultés méthodologiques. De ce fait, la compréhension des relations entre la bactérie et ses hôtes (mammifères et tiques vectrices) n’a conduit à ce jour qu’à un nombre restreint de publications. Cette thèse s’intéresse à ces interactions, que j’ai abordées sciemment à différents niveaux. Dans un premier temps, l’étude épidémiologique menée en troupeau bovin nous a permis de mettre en évidence une diversité génétique importante parmi les souches y circulant, et nous a amenés à formuler l’hypothèse que les bovins pourraient jouer un rôle en tant que réservoirs de l’infection. Différents mécanismes, notamment l’échappement à la réponse immunitaire de l’hôte, l’absence de protection croisée entre souches et peut-être la sanctuarisation de l’infection dans des cellules niches, permettraient d’expliquer ce rôle de réservoir. L’étude de l’infection des cellules endothéliales, effectuée afin d’explorer leur rôle en tant que cellules niches d’une part et leur implication dans la barrière d’espèce d’autre part, a conduit à envisager que ces cellules pourraient permettre le passage des bactéries vers le courant sanguin, mais a priori pas leur multiplication. Afin d’amorcer l’exploration de la réponse transcriptomique d’A. phagocytophilum lors du changement d’hôte (vertébré vs invertébré), nous avons soumis des cultures de cellules de tiques infectées à un choc thermique, ce qui nous a permis de suggérer qu’un nombre restreint de mécanismes transcriptomiques est mis en jeu en réponse au choc thermique induit par le changement d’hôte vertébré/invertébré. Néanmoins, la capacité d’A. phagocytophilum à répondre à un stress thermique plus important est bien maintenue. Les protéines que nous avons identifiées comme les plus différentiellement exprimées au cours de cette étude pourraient s’avérer jouer un rôle préférentiel dans l’infection du vecteur ou du mammifère. La technique du double-hybride en système de levure, expérimentée dans la dernière partie de ce travail, et qui nous a permis de mettre en évidence trois interacteurs pour APH_0032, protéine de la membrane vacuolaire, pourrait s’avérer intéressante pour étudier les interactions de ces protéines vis-à-vis des banques d’ADNc de vertébré et de tique, mais aussi pour explorer le tropisme tissulaire des souches, puisque notre équipe a précédemment mis en évidence le fait qu’un allèle particulier d’APH_0032 est associé aux avortements bovins. . Ces approches complémentaires posent la question des fondements d’une telle variabilité génétique et d’une telle diversité d’hôtes chez une bactérie intracellulaire obligatoire et ouvrent un grand champ de perspectives / Anaplasma phagocytophilum is an obligate intracellular alphaproteobacterium, mainly transmitted by Ixodes ticks. It is the causative agent of bovine and human granulocytic anaplasmosis and can infect various mammalian species, including rodents and wild ruminants. Several epidemiological cycles may coexist in Europe. In particular, human and bovine strains seem to belong to distinct cycles, which leads to the hypothesis that cattle strain are not zoonotic. Due to its intracellular location in vivo inside granulocyte neutrophils, A. phagocytophilum culture is challenging and leads to several methodological difficulties. This explains why few studies have so far been performed in order to explore the interactions between this bacterium and its host species (mammals and ticks). In order to investigate these interactions at different levels, I performed four complementary studies. First, our epidemiological study in cattle herd highlighted the genetic diversity of strains circulating in the herds and challenges the role of cattle as a reservoir for A. phagocytophilum. The infections of endothelial cells that we performed to study the role of these cells as niche cells and/or determinants of species barrier during A. phagocytophilum infection led us to consider that endothelial cells could host A. phagocytophilum during their transmission from dermis to blood, without allowing their multiplication. For studying A. phagocytophilum transcriptomic reactions during the transmission from tick to vertebrate host, we submitted infected tick cells to heat shocks. Our results suggest that few transcriptomic events are induced during this transmission. Nevertheless, A. phagocytophilum is able to respond to non-physiological heat stress. We identified differentially expressed proteins, which could play an important role during tick or mammal infection. The yeast two hybrid analysis allowed us to detect three host cell interactors to APH_0032, an A. phagocytophilum vacuolar membrane protein. This technique could be applied for studying the molecular interactions involving proteins that where differentially expressed during heat shock, for example. Finally, our four complementary studies raise the question of the basis for such genetic variability and host diversity within an obligate intracellular bacterium and open up a wide field of perspectives

Einleitung: Humanisierte Mausmodelle werden in der humanmedizinischen Forschung bereits vielseitig eingesetzt und haben zu zahlreichen wissenschaftlichen Erkenntnissen im Zusammenhang mit zum Beispiel humanen Vorläuferzellen oder in Bezug auf humane Infektionskrankheiten beigetragen. Orientierung für die vorliegende Arbeit bot eine der zahlreichen Methoden zur Humanisierung von Mäusen, bei der immundefizienten Mäusen hämatopoetische Vorläuferzellen transplantiert werden. Ziele der Untersuchungen: Das etablierte Modell der humanisierten Maus sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit auf die Spezies Rind übertragen werden, um sogenannte bovinisierte Mäuse zu entwickeln und somit die Grundlage für ein vielversprechendes Modell des Immunsystems des Rindes zu schaffen. Es sollten zweckmäßige Transplantationsmethoden etabliert werden, die zu einer nachweisbaren Bovinisierung immundefizienter Mäuse führen. Tiere, Material und Methoden: Aus bovinem Nabelschnurblut (NSB) und bovinem peripheren Blut (pB) wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation die jeweiligen mononukleären Zellen gewonnen (bCBMC (bovine cord blood mononuclear cells) aus NSB; bPBMC (bovine peripheral blood mononuclear cells) aus pB). Hierfür wurde methodisch die Durchführung unter Anwendung eines Mediums mit einer Dichte von 1,077 g/ml etabliert. Zur Isolierung boviner hämatopoetischer Vorläuferzellen aus den genannten Zellfraktionen kamen verschiedene magnetische Separationsmethoden zum Einsatz. Mittels positiver Separation wurden aus den bCBMC zum einen CD34-positive (CD34+) und zum anderen c-kit-positive (c-kit+) Zellen isoliert, welche jeweils neugeborenen NSG™ Mäusen (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl) transplantiert wurden (Versuchsgruppe A: CD34+: n = 1 und c-kit+: n = 4). Darüber hinaus wurden mittels negativer Separation die T-Lymphozyten aus den bCBMC und bPBMC depletiert um die Stammzell-enthaltenden Fraktionen (SeF) zu gewinnen. Zur Depletion boviner T-Lymphozyten kamen zeitgleich drei Antikörper gegen bovine Oberflächenmarker dieses Zelltyps zum Einsatz: WC1, CD4 und CD8. Die isolierten SeF wurden in der Versuchsgruppe B ebenfalls NSG™ Mäusen transplantiert, jedoch, im Unterschied zur Versuchsgruppe A, neugeboren und auch adult (Versuchsgruppe B: neugeb. NSB: n = 10; neugeb. pB: n = 7; adult NSB: n = 2). Beide Versuchsgruppen bestanden aus mehreren unterschiedlich großen Untergruppen, welches auf die Größe der jeweils selektierten Zellpopulationen zurückzuführen war. Transplantationsverlauf und -erfolg innerhalb der Versuchsgruppen wurden mittels klinischem Scoring und Gewichtsbestimmung, wiederholter Blutbildanalyse sowie mittels durchflusszytometrischer Analysen des Blutes im laufenden Versuch und Analysen von Blut und Organsuspensionen aus Milz und Knochenmark zum Zeitpunkt des Versuchsendes untersucht. Für die durchflusszytometrischen Analysen des peripheren Blutes der Mäuse kamen verschiedene bovine Antikörper zum Einsatz, wobei dem Pan-Leukozytenmarker anti-CD45 die größte Bedeutung zukam. Durch den Einsatz muriner und boviner anti-CD45-Antikörper gelang die Unterscheidung zwischen originären murinen Leukozyten und den nach der Transplantation im Organismus der Maus sich etablierten bovinen Leukozyten. Statistische Analysen zwischen den Untergruppen waren aufgrund der unterschiedlichen Gruppengrößen nur eingeschränkt möglich. Es wurde mittels Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung untersucht. Je nach Anzahl der zu vergleichenden Grundgesamtheiten wurden die Daten anschließend entweder mittels t-Test für unabhängige Stichproben beziehungsweise mittels Mann-Whitney-U-Test (n = 2) oder mittels nicht parametrischer, einfaktorieller Varianzanalyse (Kruskal-Wallis-Test, wenn n ≥ 3) ausgewertet. Das Signifikanzniveau wurde jeweils auf p = 0,05 festgesetzt. Ergebnisse: Bei den Tieren der Untergruppe neugeb. pB der Versuchsgruppe B wurden nach der Transplantation während des Versuchszeitraumes von 18 Wochen keine klinischen Auffälligkeiten festgestellt. Das gleiche galt für die Tiere beider Untergruppen der Versuchsgruppe A. Aus den anderen beiden Untergruppen der Versuchsgruppe B, neugeb. NSB und adult NSB, mussten hingegen aufgrund des eingetretenen starken Gewichtsverlustes und der Verschlechterung des klinischen Zustandes Tiere vorzeitig getötet werden. In der Untergruppe neugeb. NSB der Versuchsgruppe B handelte es sich um 3 von 10 Tieren (30 %), in der Untergruppe adult NSB um 1 von 2 Tieren (50 %). In allen Versuchsgruppen konnten im Laufe des Experimentes im peripheren Blut der Mäuse durchflusszytometrisch bovine CD45-positive Zellen nachgewiesen werden. Im Falle der Versuchsgruppe A wurden während des gesamten Versuches im peripheren Blut der Tiere der Untergruppe c-kit+ im Mittel höhere Anteile boviner CD45-positiver Zellen an der Gesamtleukozytenzahl nachgewiesen als im Blut der Tiere der Untergruppe CD34+ (c-kit+: 11,5 %; CD34+: 0,733 %). Im Vergleich zu den genannten Ergebnissen der Versuchsgruppe A wurde bei den neugeboren transplantierten Tieren der Versuchsgruppe B durchschnittlich eine größere Zahl boviner CD45-positiver Zellen im peripheren Blut nachgewiesen (neugeb. NSB: 13,5 % und neugeb. pB: 16,0 %). Es konnte kein signifikanter Unterschied zur Untergruppe c-kit+ der Versuchsgruppe A festgestellt werden (Kruskal-Wallis-Test). Im peripheren Blut der adult transplantierten Mäuse der Versuchsgruppe B wurden während des Versuchszeitraumes im Mittel 2,89 % bovine CD45-positive Zellen nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, ein Modell bovinisierter Mäuse zu entwickeln. Unter Berücksichtigung der klinischen Parameter erwies sich die Transplantation von T-Zell-depletierten mononukleären Zellen aus bovinem peripherem Blut in neugeborene NSG™ Mäuse als am vielversprechendsten, auch wenn aufgrund der begrenzten Tierzahlen statistische Analysen nur eingeschränkt auswertbar waren. Daran anknüpfend können die dargelegten Untersuchungen fortgesetzt und bovinisierte Mausmodelle ausgewählter Infektionserreger des Rindes etabliert werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden eine Grundlage, um weitere Anwendungen zur Immunologie in der Rindermedizin zu etablieren.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Immunsystem 2.2 Besonderheiten des bovinen Immunsystems 2.3 Humanisierte Mausmodelle 2.3.1 Humanes Nabelschnurblut 2.3.2 Marker humaner hämatopoetischer Vorläuferzellen 2.4 Bovine Mausmodelle 2.4.1 Transplantation boviner Leukozyten 2.4.2 Transplantation bovinen Gewebes 2.4.3 Infektionsversuche mit bovinen Infektionserregern 2.5 Bovines Nabelschnurblut 2.6 Marker boviner hämatopoetischer Vorläuferzellen 2.7 Ziele der vorliegenden Arbeit 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Verbrauchsmaterialien 3.2 Laborgeräte 3.3 Software 3.4 Gewinnung bovinen Materials 3.4.1 Gewinnung von Nabelschnurblut 3.4.2 Gewinnung von peripherem Blut 3.5 Aufarbeiten des bovinen Materials 3.5.1 Dichtegradientenzentrifugation 3.5.2 Stammzellisolierung 3.5.2.1 Positive Separation 3.5.2.2 T-Zell-Depletion 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Versuchstiere 3.6.2 Präkonditionierung durch Bestrahlung 3.6.3 Markierung der Tiere 3.6.4 Transplantation und Versuchsgruppen 3.6.5 Scoring 3.6.6 Blutentnahme 3.6.7 Finale Präparation 3.7 Erfassung des Blutbildes 3.8 Durchflusszytometrische Analysen 3.8.1 Erfassung und Auswertung der Daten 3.8.2 Verwendete Antikörper 3.8.3 In vivo-Analysen 4 Ergebnisse 4.1 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen 4.1.1 Dichtegradientenzentrifugation 4.2 Stammzellisolierung 4.2.1 Positive Separation 4.2.2 T-Zell-Depletion 4.3 Transplantationsverlauf 4.3.1 Versuchsgruppe A - CD34+/ c-kit+ 4.3.1.1 Scoring 4.3.1.2 Blutbild 4.3.1.3 Durchflusszytometrische Analysen 4.3.2 Versuchsgruppe B - T-Zell-Depletion 4.3.2.1 Scoring 4.3.2.2 Blutbild 4.3.2.3 Durchflusszytometrische Analysen 4.3.3 Zusammenfassung des Transplantationsverlaufes 5 Diskussion 5.1 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen 5.2 Stammzellisolierung 5.2.1 Positive Separation 5.2.2 T-Zell-Depletion 5.3 Transplantationsverlauf 5.3.1 Versuchsgruppe A – CD34+/ c-kit+ 5.3.2 Versuchsgruppe B – T-Zell-Depletion 5.4 Bewertung und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis A Anhang A.0.1 Tätowierschema A.0.2 Mittels T-Zell-Depletion isolierte Zellfraktionen A.0.3 Versuchsgruppe A - Blutbild A.0.4 Versuchsgruppe B - Blutbild Danksagung

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus. / During pregnancy, steroid hormones have essential roles in regulating key physiological events such as maternal recognition, endometrial receptivity, early embryonic development, and maintenance of pregnancy. However, very little is known about the production of these hormones nor about the principal factors and intracellular pathways implicated in the steroidogenic process in bovine placenta, during early and advanced pregnancy. In addition, placental abnormalities in cattle following an improper steroid production in bovine placenta have not been yet demonstrated. The aims of this thesis were to: 1) determine the occurrence and localization of the principal steroidogenic proteins in bovine placenta from day 50 to day 120 of pregnancy; 2) compare the placental expression of a series of steroidogenic genes and proteins between somatic cell nuclear transfer (SCNT) pregnancies and non-SCNT gestations; 3) investigate the impact of trophic hormone, and second messengers on steroidogenesis in bovine placenta at 140 +10 days of gestation. Using immunohistochemistry, western blot and qPCR techniques, we evaluated the presence of a wide range of steroidogenic genes (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SCARB1), that participate in the cholesterol transport and in the production of different types of steroids. In this thesis, we demonstrated the capability of the early bovine placenta to initiate steroidogenesis, and we also determined the principal cells implicated in this process. We found that maternal tissue expresses the principal steroidogenic markers suggesting it has a greater steroidogenic capacity compared to fetal tissue. Moreover, a complementary pattern of steroidogenic protein expression between the caruncle and the cotyledon were found, indicating that placental steroidogenesis requires cell to cell communication between the maternal and fetal cells. Having shown the principal cells involved in the synthesis of steroid hormones in bovine placenta during early pregnancies, we then studied possible alterations in steroidogenesis in cotyledonary tissue in SCNT at 40 days of pregnancy. We identified significant alterations in the expression of STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SULT1E1 transcripts. Therefore, we postulate that reduced expression of steroidogenic genes may cause an insufficient local biosynthesis of steroid hormones, which might contribute to the abnormal placental and fetal development in SCNT gestations at short or long term. Finally, we developed an efficient placentome explants culture model that allowed us to explore the specific mechanisms underlying placental steroidogenesis. We explored the stimulatory effect of trophic hormones and different second messengers on the expression of various steroidogenic proteins and the progesterone levels in placentome explants. By RIA and qPCR techniques, we found that although LH-like hormones (hCG), had a stimulatory effect on multiple steroidogenic genes, the calcium ionophore was the principal modulator in the synthesis of progesterone. These results suggest that in bovine placenta, the synthesis of progesterone is modulated principally by intracellular calcium influx, and cyclic nucleotides do not seem to be controlling this process. In conclusion, these studies significantly contribute to a better understanding of the driving mechanisms of placental steroid synthesis in early gestations and also provide new insights into the importance of placental steroids in the regulation of placental and fetal development.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.