Tropomiosina (Tm) é uma das proteínas que compõe o filamento fino (actina, Tm, Troponina) do sistema muscular esquelético e desempenha um importante papel na regulação da contração muscular. Tm é um coiled-coil de 284 resíduos que forma longos homopolímeros lineares através da sobreposição de onze resíduos entre os terminais de Tms adjacentes (Interação cabeça-cauda) em condições de baixa força iônica. A presença de vários resíduos carregados (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) nas extremidades da Tm sugere que contatos intermoleculares eletrostáticos entre estes aminoácidos podem ter um importante papel na estabilidade dos polímeros. Entretanto, a estrutura do complexo cabeça-cauda demonstra que a maioria dos contatos intermoleculares na interface é de natureza hidrofóbica. A fim de analisarmos a contribuição dos grupos carregados para a estabilidade do complexo cabeça-cauda, construímos fragmentos recombinantes correspondentes à metade amino (ASTm1-142 ) e carboxi (Tm143-284(5OHW269)) terminais da proteína contendo mutações pontuais daqueles resíduos para alanina, e adicionalmente H276 para Glu. Medimos a afinidade entre todas as possíveis combinações destes fragmentos na ausência e presença de íons Mg2+, visto que este cátion está sempre presente em condições fisiológicas e é importante para estabilizar a interação entre Tm e actina. Os efeitos das mutações foram analisados por simulações de docking, desnaturações térmicas e ciclos de duplos mutantes. Os resultados demonstram que os aminoácidos K5, K7 e D280 presentes na interface formam contatos intermoleculares essenciais para a estabilidade do complexo. Enquanto, D2, K6, D275 e H276 não participam na formação de contatos intermoleculares, no entanto, contribuem para a estabilidade da interação cabeça- cauda através de suas interações intramoleculares que atuam na estabilidade das hélices individuais. Os aumentos na estabilidade da metade C-terminal da Tm (Tm143-284(5OHW)) induzidos por Mg2+ foram dependentes das mutações neste trecho da proteína sugerindo a presença de um sítio de ligação para este íon na extremidade carboxi terminal da molécula no trecho que forma a interação cabeça- cauda. Construímos um fragmento menor do C-terminal (Tm259-284(W269)) para acompanharmos mudanças no deslocamento químico induzidas pela ligação do íon usando ressonância magnética nuclear. Os resultados obtidos comprovaram nossa hipótese e nos permitiram definir pela primeira vez que a estrutura da Tm tem um ou mais sítios de ligação Mg2+ em uma região próxima ao resíduo H276 que está localizado entre vários resíduos carregados negativamente que participam da interação cabeça-cauda. Por último, estudamos os efeitos de solventes cosmótropicos (TFE e glicerol) nas estabilidades dos fragmentos da Tm, uma vez que a instabilidade (flexibilidade) da extremidade C-terminal é importante para a formação do complexo cabeça-cauda. Observamos que TFE, porém não glicerol, reduziu a afinidade entre os terminais. Ambos os co-solventes induziram aumentos na estabilidade dos fragmentos, no entanto, apenas TFE induziu um aumento no conteúdo de α-hélice e causou uma redução significativa na cooperatividade de desenovelamento das proteínas. Estes resultados indicam que estes compostos orgânicos estabilizam as estruturas dos fragmentos individuais da Tm de maneiras diferentes e que estas diferenças podem estar relacionadas aos diferentes efeitos observados na formação da interação cabeça-cauda. / Tropomyosin (Tm) is a protein component of the skeletal muscle thin filament (actin, Tm, Troponin) which has an important role in the regulation of muscle contraction. Tm is a dimeric coiled-coil (284 aminoacids) which forms long linear homopolymers through the overlap of eleven residues of adjacent Tm termini (Head- to-tail interaction) in low ionic strength conditions. The presence of several charged amino acids (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) in Tm extremities suggests that electrostatic contacts among those residues may have an important role in the stability of the polymers. Nevertheless, the solution structure of the head-to-tail complex demonstrated that most of the contacts in the interface are hydrophobic. In order to study the contribution of these charged residues to the stability of the head- to-tail complex, we built recombinant fragments corresponding to the amino (ASTm1-142) and carboxy (Tm143-284(5OHW269)) termini containing single mutations of those amino acids to alanine, and additionally a substitution of H276 for Glu. We measured the binding affinities among all possible combinations of wild-type and mutant fragments in the absence or presence of Mg2+ ions. This cation is always physiologically present in the muscle and it is known to strengthen the binding of Tm to actin. The effects of the mutations were analyzed by protein-protein docking, thermodynamic cycles and thermal denaturations. The results show that residues K5, K7 and D280 are essential to the stability of the complex. Though D2, K6, D275 and H276 are exposed to the solvent and do not participate in intermolecular contacts in the NMR structure, they may contribute to the complex stability by modulating the stability of the helices at the Tm termini. Mg2+-induced increases in stability of the C- terminal were sensitive to mutations in residues located in the head-to-tail overlap region, suggesting that Mg2+ ions may bind specifically to the carboxy extremity of the protein. We produced a small peptide (Tm259-284(W269)) to follow amide chemical shift perturbations upon Mg2+ binding by nuclear magnetic resonance measurements. The results obtained with this peptide allowed us to define for the first time that the Tm structure has one or more Mg2+ binding sites in a region centered in the vicinity of H276 in which are located several negatively charged residues that participate in the head-to-tail interaction. We also studied the effects of kosmotropic co-solvents (TFE and glycerol) in the stability of Tm fragments, as the instability (flexibility) of the C- terminal region has been pointed as important for the formation of the head-to-tail complex. We observed that TFE, but not glycerol, reduces the affinity between the termini. Both TFE and glycerol increased the stability of the isolated N- and C- terminal fragments; however, only TFE caused an increase in the helical content and a significant reduction in the cooperativity of unfolding of the proteins. Our results show that these two co-solvents stabilize the structures of individual Tm fragments in different manners and that these differences may be related to their different effects on head-to-tail complex formation.

O iodo em excesso promove o efeito Wolff-Chaikoff. Oligominerais já foram descritos como potenciais reguladores da expressão de proteínas. Tornou-se interessante avaliar se o iodo interferiria com a expressão do mRNA da NIS, em curtos períodos de tempo. Foram realizados, em ratos e células (de 30 min24h), estudos de expressão, comprimento de cauda poli-A e recrutamento para polissomos, do mRNA de NIS. Observou-se, in vivo e in vitro, que o excesso de iodo promoveu diminuição da expressão e do comprimento da cauda poli-A do mRNA de NIS, em todos os períodos estudados, além de promover menor recrutamento deste mRNA para os polissomos. A diminuição da cauda poli-A do mRNA de NIS pode ter aumentado sua instabilidade/degradação e também ter sido responsável por uma menor eficiência de tradução deste transcrito. Conclui-se que: (a) o iodo regula pós-transcricionalmente a expressão gênica da NIS, sendo fundamental nos processos que norteiam o efeito Wolff-Chaikoff e (b) oligoelementos têm relevância na regulação da expressão de proteínas relacionadas ao seu transporte. / Iodide in excess exerts the Wolff-Chaikoff effect. It is described that some minerals can regulate the expression of proteins. This study aimed to investigate if the iodide could modify the expression of NIS mRNA, in short periods of time. Rats and cells, divided in time-groups of 30 min up to 24h, were used in studies of expression, poly-A tale length and polysomal profile of NIS mRNA. Both in vivo and in vitro studies showed that the iodide treatment promoted a reduction in the expression and the poly-A length of NIS mRNA, in all time-groups, and decreased its recruitment to the polysomes. It is possible that the reduction of NIS mRNA poly-A tale length has increased the instability/degradation of this transcript, and impaired the translation efficiency of it. Concluding: a) the iodine exerts a post-transcriptional regulation of NIS mRNA expression, being essencial in the processes that guide the Wollf-Chaikoff effect; b) the oligoelements have an extremely important role in the expression regulation of proteins related to their transport.

Tropomiosina (Tm) é uma das proteínas que compõe o filamento fino (actina, Tm, Troponina) do sistema muscular esquelético e desempenha um importante papel na regulação da contração muscular. Tm é um coiled-coil de 284 resíduos que forma longos homopolímeros lineares através da sobreposição de onze resíduos entre os terminais de Tms adjacentes (Interação cabeça-cauda) em condições de baixa força iônica. A presença de vários resíduos carregados (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) nas extremidades da Tm sugere que contatos intermoleculares eletrostáticos entre estes aminoácidos podem ter um importante papel na estabilidade dos polímeros. Entretanto, a estrutura do complexo cabeça-cauda demonstra que a maioria dos contatos intermoleculares na interface é de natureza hidrofóbica. A fim de analisarmos a contribuição dos grupos carregados para a estabilidade do complexo cabeça-cauda, construímos fragmentos recombinantes correspondentes à metade amino (ASTm1-142 ) e carboxi (Tm143-284(5OHW269)) terminais da proteína contendo mutações pontuais daqueles resíduos para alanina, e adicionalmente H276 para Glu. Medimos a afinidade entre todas as possíveis combinações destes fragmentos na ausência e presença de íons Mg2+, visto que este cátion está sempre presente em condições fisiológicas e é importante para estabilizar a interação entre Tm e actina. Os efeitos das mutações foram analisados por simulações de docking, desnaturações térmicas e ciclos de duplos mutantes. Os resultados demonstram que os aminoácidos K5, K7 e D280 presentes na interface formam contatos intermoleculares essenciais para a estabilidade do complexo. Enquanto, D2, K6, D275 e H276 não participam na formação de contatos intermoleculares, no entanto, contribuem para a estabilidade da interação cabeça- cauda através de suas interações intramoleculares que atuam na estabilidade das hélices individuais. Os aumentos na estabilidade da metade C-terminal da Tm (Tm143-284(5OHW)) induzidos por Mg2+ foram dependentes das mutações neste trecho da proteína sugerindo a presença de um sítio de ligação para este íon na extremidade carboxi terminal da molécula no trecho que forma a interação cabeça- cauda. Construímos um fragmento menor do C-terminal (Tm259-284(W269)) para acompanharmos mudanças no deslocamento químico induzidas pela ligação do íon usando ressonância magnética nuclear. Os resultados obtidos comprovaram nossa hipótese e nos permitiram definir pela primeira vez que a estrutura da Tm tem um ou mais sítios de ligação Mg2+ em uma região próxima ao resíduo H276 que está localizado entre vários resíduos carregados negativamente que participam da interação cabeça-cauda. Por último, estudamos os efeitos de solventes cosmótropicos (TFE e glicerol) nas estabilidades dos fragmentos da Tm, uma vez que a instabilidade (flexibilidade) da extremidade C-terminal é importante para a formação do complexo cabeça-cauda. Observamos que TFE, porém não glicerol, reduziu a afinidade entre os terminais. Ambos os co-solventes induziram aumentos na estabilidade dos fragmentos, no entanto, apenas TFE induziu um aumento no conteúdo de α-hélice e causou uma redução significativa na cooperatividade de desenovelamento das proteínas. Estes resultados indicam que estes compostos orgânicos estabilizam as estruturas dos fragmentos individuais da Tm de maneiras diferentes e que estas diferenças podem estar relacionadas aos diferentes efeitos observados na formação da interação cabeça-cauda. / Tropomyosin (Tm) is a protein component of the skeletal muscle thin filament (actin, Tm, Troponin) which has an important role in the regulation of muscle contraction. Tm is a dimeric coiled-coil (284 aminoacids) which forms long linear homopolymers through the overlap of eleven residues of adjacent Tm termini (Head- to-tail interaction) in low ionic strength conditions. The presence of several charged amino acids (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) in Tm extremities suggests that electrostatic contacts among those residues may have an important role in the stability of the polymers. Nevertheless, the solution structure of the head-to-tail complex demonstrated that most of the contacts in the interface are hydrophobic. In order to study the contribution of these charged residues to the stability of the head- to-tail complex, we built recombinant fragments corresponding to the amino (ASTm1-142) and carboxy (Tm143-284(5OHW269)) termini containing single mutations of those amino acids to alanine, and additionally a substitution of H276 for Glu. We measured the binding affinities among all possible combinations of wild-type and mutant fragments in the absence or presence of Mg2+ ions. This cation is always physiologically present in the muscle and it is known to strengthen the binding of Tm to actin. The effects of the mutations were analyzed by protein-protein docking, thermodynamic cycles and thermal denaturations. The results show that residues K5, K7 and D280 are essential to the stability of the complex. Though D2, K6, D275 and H276 are exposed to the solvent and do not participate in intermolecular contacts in the NMR structure, they may contribute to the complex stability by modulating the stability of the helices at the Tm termini. Mg2+-induced increases in stability of the C- terminal were sensitive to mutations in residues located in the head-to-tail overlap region, suggesting that Mg2+ ions may bind specifically to the carboxy extremity of the protein. We produced a small peptide (Tm259-284(W269)) to follow amide chemical shift perturbations upon Mg2+ binding by nuclear magnetic resonance measurements. The results obtained with this peptide allowed us to define for the first time that the Tm structure has one or more Mg2+ binding sites in a region centered in the vicinity of H276 in which are located several negatively charged residues that participate in the head-to-tail interaction. We also studied the effects of kosmotropic co-solvents (TFE and glycerol) in the stability of Tm fragments, as the instability (flexibility) of the C- terminal region has been pointed as important for the formation of the head-to-tail complex. We observed that TFE, but not glycerol, reduces the affinity between the termini. Both TFE and glycerol increased the stability of the isolated N- and C- terminal fragments; however, only TFE caused an increase in the helical content and a significant reduction in the cooperativity of unfolding of the proteins. Our results show that these two co-solvents stabilize the structures of individual Tm fragments in different manners and that these differences may be related to their different effects on head-to-tail complex formation.

Orientador: Erick da Cruz Castelli / Resumo: O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é um complexo gênico que está intimamente envolvido com a regulação do sistema imune. Esse complexo comporta o sistema de Antígenos Leucocitários Humano (HLA), cuja principal importância está relacionada com o reconhecimento do que é próprio ou não do organismo. HLA-C é o gene polimórfico menos variável dos genes HLA clássicos e o que tem menor expressão nos tecidos, exceto na interface materno-fetal, em que é o único gene clássico expresso. A molécula codificada por esse gene possui significante função na apresentação antigênica e regulação da atividade de células NK, o que permite uma íntima associação com situações fisiológicas, como gestação, e patológicas, como doenças infecciosas, autoimunes, inflamatórias, neoplasias e rejeições a enxertos transplantados. Sua porção gênica mais estudada é a que codifica a fenda de ligação a peptídeos antigênicos, devido sua destacada importância na apresentação de antígenos a células T citotóxicas. No entanto, outras regiões do gene, que são negligenciadas nos estudos de variabilidade, também merecem destaque por influenciarem na sinalização e modulação da citotoxicidade de células efetoras, na ancoragem e estabilidade da molécula na membrana plasmática e na internalização e reciclagem da molécula HLA-C. Desta maneira, nós exploramos a variabilidade dos segmentos que codificam α3 (éxon 4), transmembrana (éxon 5) and cauda citoplasmática (éxon 6 and éxon 7) da molécula HLA-C em uma popu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Major Histocompatibility Complex (MHC) is a gene complex closely involved in the regulation of the immune system. This complex includes the Human Leukocyte Antigen (HLA) system, whose main role is related to the recognition of self/non-self structures of humans. HLA-C is the least variable polymorphic gene of classical HLA genes and has the lowest expression in tissues, except at the maternal-fetal interface, where it is the only classical HLA class I expressed gene. The molecule encoded by this gene has a significant role in the antigen presentation and regulation of NK cells activities, which allows an intimate association with physiological conditions, such as pregnancy, and pathological conditions like infectious, autoimmune, and inflammatory diseases, cancer, and transplantation rejection. The most studied HLA-C portion is that encoding the peptide-binding groove, due to its outstanding importance in presentation of antigens to cytotoxic T cells. However, other regions of the gene, which are neglected in the variability studies, are also important in influencing the signaling and modulation of effector cell cytotoxicity, in the anchorage and stability of the molecule on the cell surface, and in the internalization and recycling of the HLA-C molecule. Here, we explore the variability of the segments encoding the α3 (exon 4), transmembrane (exon 5) and cytoplasmic tail (exon 6 and exon 7) domains of the HLA-C molecule in an admixed population sample from Southeastern B... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / Depression is a complex, chronic and disabling psychiatric disease that carries a high social cost. Among the various classes of antidepressants are the monoamine oxidase A (MAO-A) inhibitors that reduce monoamine metabolism. An important site of MAO-A regulation is the imidazoline-2 binding site (I2). In fact, it was recently shown that 2-imidazoline derivatives, such as 2-(2-benzofuranyl)-2-imidazoline (2- BFI), showed good potency and selectivity in inhibiting in vitro the activity of MAO-A, but the antidepressant potential of this compound and its mechanism of action have not been well defined. Therefore, in this study we investigated the antidepressant-like effect of 2-BFI in mice. For this purpose, we evaluated the effects of 2-BFI in two predictive tests of antidepressant-like activity in animals, the tail suspension test (TST) and forced swimming test (FST). The TSC was utilized after the use of specific antagonists of different receptors involved in depression. 2-BFI (100 and 300 μmol/kg, s.c.) significantly reduced the immobility time on the tail suspension test (TST) without changing locomotion in the open field test. The reduced the immobility time of 2-BFI (100 μmol/kg, s.c.) was confirmed with the forced swimming test (FST). The antidepressant-like effect of 2-BFI (100 μmol/kg, s.c.) in the TST was prevented by pretreatment with idazoxan (0.4 μmol/kg, i.p., a I2 site antagonist), methysergide (4 μmol/kg, i.p., a non-selective serotonergic receptor antagonist) and haloperidol (0.1 μmol/kg, i.p., a non-selective dopaminergic receptor antagonist). The anxiolytic effect of 2-BFI was also evaluated, using the elevated plus-maze test. 2-BFI (300 μmol/kg, s.c.) was able to significantly increase the % of number of entries and the % of time spent in the open arms, indicating that it possesses an anxiolytic effect at high doses. In conclusion, these results suggest that the antidepressant-like effect of 2- BFI might involve serotonergic, dopaminergic and imidazoline systems, and then the imidazoline site could represent a new pharmacological target for the treatment of depression. / A depressão é uma doença psiquiátrica complexa, crônica e incapacitante, que acarreta um alto custo social. Dentre as diversas classes de antidepressivos encontram-se os inibidores da monoamina oxidase-A (MAO-A), que reduzem o metabolismo das monoaminas. Um sítio importante para a regulação da MAO-A é o sítio imidazolínico I2. Recentemente, foi demonstrado que derivados 2- imidazolínicos, como o 2-BFI, mostram boa potência e seletividade em inibir a atividade in vitro da MAO em cérebro de ratos, porém o potencial antidepressivo deste composto e seu mecanismo de ação não foram bem definidos. Com base nisso, o objetivo desse trabalho consiste em investigar o efeito tipo-antidepressivo do 2-BFI em camundongos. Para este propósito, foram avaliados os efeitos do 2-BFI em dois testes preditivos de atividade antidepressiva em animais, o teste de suspensão da cauda (TSC) e o teste do nado forçado (TNF). O TSC também foi empregado após o uso de antagonistas específicos de diferentes receptores envolvidos na depressão. O 2-BFI (100 e 300 μmol/kg, s.c.) reduziu significativamente o tempo de imobilidade no TSC, sem alterar a atividade locomotora no teste de campo aberto. A redução do tempo de imobilidade de 2-BFI (100 μmol/kg, s.c.) foi confirmada com o TNF. O efeito tipo-antidepressivo do 2-BFI (100 μmol/kg, s.c.) no TSC foi prevenido pelo pré-tratamento com idazoxan (0,4 μmol/kg, i.p., um antagonista do sítio I2), metisergida (4 μmol/kg, i.p., um antagonista não-seletivo dos receptores serotoninérgicos) e haloperidol (0,1 μmol/kg, i.p., um antagonista não-seletivo dos receptores dopaminérgicos). O efeito ansiolítico do 2- BFI também foi avaliado, utilizando o teste de labirinto em cruz elevado. O 2-BFI (300 μmol/kg, s.c.) aumentou significativamente a % do número de entradas e a % do tempo gasto nos braços abertos, indicando que ele possui um efeito ansiolítico em altas doses. Em conclusão, estes resultados sugerem que o efeito tipoantidepressivo de 2-BFI pode estar envolvido com os sistemas serotoninérgico, dopaminérgico e imidazolínico, e assim o sítio imidazolínico poderia representar um novo alvo farmacológico para o tratamento da depressão.

[pt] Valor em Risco -VaR- já é parte das ferramentas habituais que um analista financeiro utiliza para estimar o risco de mercado. Na implementação do VaR é necessário que seja estimados quantis de baixa probabilidade para a distribuição condicional dos retornos dos portfólios. A metodologia tradicional para o cálculo do VaR requer a estimação de um modelo tipo GARCH com distribuição normal. Entretanto, a hipótese de normalidade condicional nem sempre é adequada, principalmente quando se deseja estimar o VaR em períodos atípicos, caracterizados pela ocorrência de eventos extremos. Nesta situações a distribuição condicional deve apresentar excesso de curtose. O uso de distribuições derivadas do Teorema do Valor Extremos -TVE-, conhecidas coletivamente como GEV,associadas aos modelos tipo GARCH, tornou possível o cálculo do VaR nestas situações.Um parâmetro chave nas distribuições da família GEV é o índice de cauda, o qual pode ser estimado através do estimador de Hill. Entretanto este estimador apresenta muita sensibilidade em termos de variância e viés com respeito à fração amostral utilizada na sua estimação. O objetivo principal desta dissertação foi fazer uma comparação entre três métodos de escolha da fração amostral, recentemente sugeridos na literatura: o método bootstrap duplo Danielsson, de Haan, Peng e de Vries 1999, o método threshold Guillou e Hall 2001 e o Hill plot alternativo Drees, de Haan e Resnick 2000. A avaliação dos métodos foi feita através do teste de cobertura condicional de Christoffersen 1998, o qual foi aplicado às séries de retornos dos índices: NASDAQ, NIKKEY,MERVAL e IBOVESPA. Os nossos resultados indicam que os três métodos apresentam aproximadamente o mesmo desempenho, com uma ligeira vantagem dos métodos bootstrap duplo e o threshold sobre o Hill plot alternativo, porque este ultimo tem um componente normativo na determinação do índice de cauda ótimo. / [en] Value at Risk -VaR- is already part of the toolkit of financial analysts assessing market risk. In order to implement VaR it is needed to estimate low quantiles of the portfolio returns distribution. Traditional methodologies combine a normal conditional distribution together with ARCH type models to accomplish this goal. Albeit well succeed in evaluating risk for typical periods, this methodology has not been able to accommodate events that occur with very low probabilities. For these situations one needs conditional distributions with excess of kurtosis. The use of distributions derived from the Extreme Value Theory -EVT-, collectively known as Generalized Extreme Value distribution -GEV-, together with ARCH type models have made it possible to address this problem in a proper framework. A key parameter in the GEV distribution is the tail index, which can be estimated by Hill`s estimator. Hill`s estimator is very sensible, in terms of bias and RMSE, to the sample fraction that is used in its estimation. The objective of this dissertation is to compare three recently suggested methods presented in the statistical literature: the double bootstrap method Danielsson, de Haan, Peng and de Vries 1999,the threshold method Guillou and Hall 2001 and the alternative Hill plot Drees, de Haan and Resnick 2000. The methods have been evaluated with respect to the conditional coverage test of Christoffersen 1998, which has been applied to the following returns series : NASDAQ, NIKKEY, MERVAL e IBOVESPA. Our empirical findings suggests that, overall the three methods have the same performance, with some advantage of the bootstrap and threshold methods over the alternative Hill plot, which has a normative component in the determination of the optimal tail index.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 173.pdf: 1047808 bytes, checksum: 48de5cc0086090a92e066047b4e59660 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Os tripanossomatídeos possuem uma combinação não usual de mecanismos moleculares, e seus processos de regulação de expressão gênica ocorreram a nível pós-transcricional. Acredita-se que essa regulação envolva tanto o controle da estabilidade dos mRNAs, como sua tradução em proteínas, eventos em que atua a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP - Poly-A Binding Protein), uma das principais proteínas de ligação a RNAs em eucariotos. Um grande número destas proteínas está presente nos tripanosomatídeos, se caracterizando por possuírem domínios típicos de ligação a RNA, como o domínio RRM (RNA Recognition Motif). Dentre estas se destacam as proteínas de ligação a sequências ricas em uridina (UBPs), que se mostraram capazes de interagir com homólogos de PABP. Outras proteínas hipotéticas contendo domínios de ligação a RNA foram identificadas em ensaios que buscavam parceiros diferenciais para os três homólogos de PABP de Leishmania. Este trabalho se propôs a contribuir na caracterização funcional das proteínas UBPs e das proteínas hipotéticas, através da otimização de sua expressão de forma heteróloga em L. infantum, fusionadas ao epítopo HA. Para isto, os genes codificantes dos três homólogos de UBPs, e de cinco outras proteínas de ligação a RNA que parecem interagir com PABPs, foram amplificados e clonados em vetor de expressão de Leishmania. As construções geradas foram transfectadas em L. infantum e a expressão de seis destas proteínas avaliada. Os resultados obtidos mostram uma variação no reconhecimento das proteínas geradas com anticorpos comerciais anti-HA, que parecem depender da sequência de aminoácidos da sua extremidade C-terminal. Diferenças significativas nos seus níveis de expressão também foram observadas. Entre os três homólogos de UBP, dois destes se mostraram mais abundantes enquanto que os três são representados por mais de uma banda, indicando possíveis modificações pós-traducionais

Depression is a psychiatric disorder that affects 2-15% of the world population. It is a heterogeneous neuropathology, it includes psychological, behavioral and physiological symptoms. Despite having several treatments for depression, they are not as effective and have many undesirable side effects. Therefore, it is necessary the development of new therapeutic strategies to improve current treatments. Therefore, open up doors to the use of plant medicines, which has already been used for thousands of years by various populations for different diseases. The Bauhinia variegata, popularly known as "pata-de-vaca", has beneficial health effects, such as anti-inflammatory activity, antidiabetic, antidiarrheal. In the present study, we investigated the antidepressant-like effect of the crude hydroethanolic extract of leaves of Bauhinia variegata in two predictive tests of antidepressant property, the tail suspension test (TST) and the forced swimming test (FST) in mice. Furthermore, the involvement of monoaminergic system in its antidepressant-like effect was investigated and the effect of extract on monoamine oxidase A (MAO-A) activity was also evaluated. The acute treatment with the extract of Bauhinia variegate (300 mg/kg, p.o.) significantly reduced the immobility time in the TST. Moreover, the repeated administration (once a day for 7 days) of the extract by p.o. route also produced an antidepressant-like effect in the TST (100 and 300 mg/kg) and FST (300 mg/kg).The pretreatment of mice with ketanserin (5 mg/kg, i.p. a preferential 5-HT2A receptor antagonist), prazosin (1 mg/kg, i.p. an α1-adrenoceptor antagonist), yohimbine (1 mg/kg, i.p. an α2-adrenoceptor antagonist), propranolol (2 mg/kg, i.p. a β-adrenoceptor antagonist), SCH23390 (0.05 mg/kg, i.p. a dopamine D1 receptor antagonist) or sulpiride (50 mg/kg, i.p. a dopamine D2 receptor antagonist) was able to reverse the anti-immobility effect of the extract (300 mg/kg, p.o) in TST. The combination of subeffective dose of fluoxetine (5 mg/kg, p.o.), imipramine (5 mg/kg, v.o.) or bupropion (5 mg/kg, v.o.) with a subffective dose of the extract (100 mg/kg) produced a synergistic antidepressant-like effect in the TST. The extract did not cause motor alteration in the open-field test at effective doses in both TST and FST. We also showed that the extract inhibited the MAO-A activity of mice brain in vitro. These results suggest that the extract from Bauhinia variegata present an antidepressanloke potential, which may be dependent on the monoaminergic system and its MAO-A inhibitory properties. / A depressão é um transtorno psiquiátrico que atinge 2-15% da população mundial. É uma neuropatologia heterogênea, pois inclui sintomas psicológicos, comportamentais e fisiológicos. Apesar de possuir diversos tratamentos para depressão, eles ainda não são tão efetivos e possuem muitos efeitos colaterais indesejáveis. Por isso, faz-se necessário o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas a fim de aperfeiçoar os tratamentos atuais. Diante disso, abrem-se possibilidades para o uso de plantas medicinas, uma vez que estas vem sendo utilizadas há milhares de anos por muitas populações para tratar diversas enfermidades. A Bauhinia variegata, conhecida popularmente como pata-de-vaca , possui efeitos benéficos à saúde, como: atividade anti-inflamatória, antidiabética, antidiarréica, entre outras. No presente estudo, foi investigado o efeito tipo-antidepressivo do extrato hidroetanólico bruto de folhas de Bauhinia variegata em dois testes preditivos de propriedade antidepressiva, o teste de suspensão pela cauda (TSC) e do teste do nado forçado (TNF) em camundongos machos adultos. Além disso, foi investigado o envolvimento do sistema monoaminérgico no efeito do extrato e sua atividade sobre a monoamina-oxidase A (MAO-A). O extrato bruto hidroetanólico foi administrado por via oral (vo) por gavagem. O tratamento agudo com o extrato de Bauhinia variegata (300 mg/kg) reduziu o tempo de imobilidade no TST. Além disso, a administração repetida (uma vez por dia durante 7 dias) do extrato também produziu um efeito tipo-antidepressivo no TSC (100 e 300 mg/kg) e TNF (300 mg/kg). O pré-tratamento de camundongos com cetanserina (5 mg/kg, ip, antagonista do receptor serotoninérgico 5-HT2A), prazosina (1 mg/kg, ip, antagonista α1-adrenérgico), ioimbina (1 mg/kg, ip, antagonista α2-adrenérgico), propranolol (2 mg/kg, ip, antagonista β-adrenérgico), SCH23390 (0,05 mg/kg, ip, antagonista do receptor dopaminérgico D1) ou sulpirida (50 mg/kg, ip, antagonista do receptor dopaminérgico D2) reverteu o efeito anti-imobilidade do extrato (300 mg/kg) no TSC. A combinação de doses sub-efetivas dos antidepressivos clássicos, fluoxetina (5 mg/kg, vo), imipramina (5 mg/kg vo) ou bupropiona (5 mg/kg, vo) com uma dose sub-efetiva do extrato (100 mg/kg) produziu um efeito antidepressivo sinérgico no TSC. O extrato não causou alteração locomotora no teste de campo aberto em doses eficazes, tanto no TSC como no TNF. Além disso, o extrato inibiu a atividade da MAO-A em preparações de mitocôndria encefálicas in vitro. Estes resultados sugerem que o extrato hidroetanólico bruto de folhas de Bauhinia variegata apresenta um potencial efeito tipo-antidepressivo, que pode ser dependente do sistema monoaminérgico.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-05-31T20:39:36Z No. of bitstreams: 1 IrisUcellaDeMedeiros_TESE.pdf: 1627038 bytes, checksum: abacbae1a6fa2f0ce88c897b540dedc4 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-06-03T00:28:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 IrisUcellaDeMedeiros_TESE.pdf: 1627038 bytes, checksum: abacbae1a6fa2f0ce88c897b540dedc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-03T00:28:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IrisUcellaDeMedeiros_TESE.pdf: 1627038 bytes, checksum: abacbae1a6fa2f0ce88c897b540dedc4 (MD5) Previous issue date: 2015-08-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Durante as ?ltimas d?cadas t?m sido demonstrado que existe uma rela??o entre a depress?o maior e a ativa??o do sistema imunol?gico. Nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) ? o ligante natural do receptor acoplado ? prote?na Gi chamado NOP, ambos constituem um sistema pept?dico que est? envolvido na regula??o do humor e de respostas inflamat?rias. Considerando essas a??es, a presente tese teve como objetivo investigar as consequ?ncias do bloqueio da sinaliza??o do receptor NOP nos comportamentos doentio e do tipo depressivo induzidos pela administra??o de lipopolissacar?deo (LPS) em camundongos. A administra??o sist?mica de doses de LPS, que n?o causam sepse, induzem altera??es nos comportamentos de camundongos relacionadas com a atividade das citocinas pr?-inflamat?rias fator de necrose tumoral-? (TNF-?) e interleucinas 6 (IL-6) e 1? (IL- 1 ?). Ap?s 2 a 6 h e 24 h da inje??o intraperitoneal, camundongos tratados com LPS apresentam, respectivamente, o comportamento doentio e o comportamento do tipo depressivo. No presente trabalho, a administra??o de LPS (0,8 mg/kg, ip) induziu sinais de doen?a em camundongos Swiss e CD-1, como perda de peso, redu??o transit?ria da temperatura retal e diminui??o da ingest?o de ra??o e ?gua. Al?m disso, nas 24 h ap?s a inje??o de LPS, essas mesmas linhagens de camundongos mostraram aumento no tempo de imobilidade durante os 6 min que foram submetidos ao teste de suspens?o pela cauda (TSC). O tratamento com nortriptilina (30 mg/kg, ip, 60 minutos antes do TSC) reduziu o tempo de imobilidade dos camundongos controle e tratados com LPS, e foi utilizado como antidepressivo padr?o. A administra??o pr?via ao LPS do antagonista do receptor NOP SB-612111 (10 mg/kg, ip), n?o alterou os comportamento doentio e do tipo depressivo induzidos pelatoxina. No entanto, quando injetado 24 h ap?s o tratamento com LPS, SB-612111 (ip, 30 minutos antes do TSC), como tamb?m o antagonista pept?dico do receptor NOP UFP-101 (10 nmol/2ul, icv, 5 min antes do TSC), inverteram significativamente os efeitos da toxina. O protocolo de indu??o do comportamento do tipo depressivo pela administra??o intraperitoneal de LPS tamb?m foi testado em camundongos nocautes para o receptor NOP (NOP(-/-)) e seus respectivos wild types (NOP(+/+)). O tratamento com LPS provocou altera??es significativas, como a redu??o tempor?ria da temperatura retal nos camundongos NOP(-/-) e perda de peso corporal e redu??o no consumo de ra??o e ?gua em ambos os camundongos NOP(+/+) e NOP(-/-). O consumo de ?gua foi significativamente diferente entre os gen?tipos. A inje??o de LPS induziu altera??es transit?rias nas citocinas pr?-inflamat?rias. Nas 6 horas ap?s o tratamento com LPS, os n?veis s?ricos de TNF-? mostraram-se aumentados significativamente nos camundongos NOP (+/+) e NOP (-/-), j? os n?veis de IL-6 mostraram-se significativamente aumentados apenas no soro dos camundongos NOP (+/+). Nas 24 horas ap?s a inje??o de LPS, os n?veis s?ricos das citocinas pr?-inflamat?rias retornaram ? linha de base. O tratamento com LPS provocou efeitos de tipo depressivo nos camundongos NOP (+/+), mas foi ineficaz nos camundongos NOP (-/-). Os dados obtidos nesta tese mostram que o bloqueio farmacol?gico e gen?tico da sinaliza??o mediada pelo receptor NOP n?o previne os comportamentos doentio e do tipo depressivo induzidos por LPS, no entanto revertem o comportamento do tipo depressivo. Em conclus?o, esses resultados evidenciam o envolvimento do sistema pept?dico N/OFQ - receptor NOP na modula??o dos comportamentos relacionados ao humor e ? ativa??o do sistema imunol?gico. / During the last decades, it has been established that there is a relationship between major depression and activation of immune system. Nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) is the natural ligand of a Gi-protein coupled receptor named NOP, both compose the peptidergic system wich is involved in the regulation of mood states and inflammatory responses. Considering these actions, the present thesis aimed to investigate the consequences of blocking NOP signaling in lipopolysaccharide (LPS)-induced sickness and depressive-like behaviors in mice. Systemic administration of LPS doses, that do not cause sepsis in mice, induce changes in their behaviors related with activity of pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-? (TNF-?) and interleukins 6 (IL-6) and 1? (IL-1 ?). At the time points of 2 to 6 h and 24 h after intraperitoneal injection, mice treated with LPS displayed, respectively, sickness and depressive-like behaviors. In the present work the administration of LPS 0.8 mg/kg (ip) significantly induced sickness signs in Swiss and CD-1 mice, such as weight loss, transient reduction in rectal temperature and decrease of food and water intake. Moreover at 24 h after LPS injection these same mice strains displayed significantly increased immobility time on the tail suspension test (TST) when compared with control mice, this alteration was not related with possible locomotion impairments as verified on the open field test. Treatment with Nortriptyline 30 mg/kg (ip, 60 min prior the TST) reduced the immobility time of control and LPS-treated mice and was used as standard antidepressant. The NOP receptor antagonist SB-612111 (10 mg/kg, ip), 30 min prior LPS, did not modify LPS-induced sickness signs and depressive-like behavior. However, when injected 24 h after LPS treatment, SB-612111 (ip, 30 min prior the TST) as well as the peptidergic NOP receptor antagonist UFP-101 (10 nmol/2?L, icv, 5 min prior the TST) significantly reversed the toxin effects. The protocol of LPS-induced depressive-like states was also tested in NOP receptor knockout mice (NOP(-/-)) and their respective wild types (NOP(+/+)). LPS evoked transient rectal temperature reduction in NOP(-/-) mice and loss of body weight, food and water intake reduction in both NOP(+/+) and NOP(-/-) mice. The consumption of water was significantly different due to the genotype. LPS injection induced transient changes in pro-inflammatory cytokines. At 6 h after LPS injection, serum levels of TNF-? were significantly increased in NOP(+/+) and NOP(-/-) mice, as the IL-6 levels were significantly increased just in NOP(+/+) serum. At 24 h after LPS treatment the pro-inflammatory cytokines had returned to the baseline levels in both genotypes. LPS treatment elicited depressive-like effects in NOP(+/+) but not in NOP(-/-) mice. The data obtained during the execution of this doctoral thesis reveal that pharmacological and genetic blockade of NOP signaling does not affect LPS evoked sickness signs while reversing depressive-like behavior. In conclusion, these results highlight the involvement of the peptidergic system N/OFQ - NOP receptor in the modulation of behaviors related to mood and activation of the immune system.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-08-09T23:00:00Z No. of bitstreams: 1 VirginieD'hour_TESE.pdf: 8753386 bytes, checksum: 2e3e6a55a73239c9eeac2c8def85eb39 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-08-13T00:23:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VirginieD'hour_TESE.pdf: 8753386 bytes, checksum: 2e3e6a55a73239c9eeac2c8def85eb39 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-13T00:23:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VirginieD'hour_TESE.pdf: 8753386 bytes, checksum: 2e3e6a55a73239c9eeac2c8def85eb39 (MD5) Previous issue date: 2015-09-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / Nesta tese s?o apresentados e discutidos os resultados de correla??o do ru?do s?smico em dois contextos: regi?o intraplaca e Dorsal Meso-oce?nica. O m?todo de interferometria de cauda de onda (coda wave interferometry?CWI) tamb?m foi utilizado para os dados da regi?o intraplaca. A correla??o do ru?do permite recuperar a fun??o de Green emp?rica entre dois receptores , como se uma das esta??es atuasse como uma fonte (virtual). Esta t?cnica ?amplamente utilizado em sismologia para a imagem do subsolo e para monitorar mudan?as estruturais associadas principalmente com erup??es vulc?nicas e terremotos grandes (mb > 6.0). No estudo da regi?o intraplaca, fomos capazes de detectar mudan?as estruturais localizadas relacionadas com esta pequena sequ?ncia de terremotos, cujo evento principal ? de mR 3.7, no Nordeste do Brasil. N?s tamb?m mostramos que a normaliza??o de 1-bit de e o branqueamento spectral provoca perdas de detalhes na forma de onda e que a auto- correla??o de fase, que ? pouco sens?vel ? amplitude , parece ser mais sens?vel e robusta para a nossa an?lise. A an?lise de 6 meses de dados usando correla??es cruzadas detecta claramente altera??es do meio logo ap?s do evento principal, enquanto que as auto- correla??es essencialmente detectam altera??es ap?s 1 m?s. Estas mudan?as na correla??o cruzada e na auto-correla??o podem serexplicadas pela redistribui??o da press?o do fluido ocasionadas mudan?as hidromec?nicas e novos caminhos preferenciais para difus?o de press?o e fuidos , devido a terramotos que ocorrem mais tarde. No estudo da Dorsal Meso-oce?nica, investigamos as mudan?as estruturais associadas a um terremoto de mb 4,9 aolongo da falha transformante de S?o Paulo. Os dados foram registrados por a ?nica esta??o s?smica localizada a menos de 200 km da Dorsal Meso-oce?nica. Os resultados da auto-correla??o de fase por um per?odo de 5 meses, mostram uma forte mudan?a de meio co-s?smica seguido por uma recupera??o p?s-s?smica relativamente r?pida. Esta mudan?a do meio provavelmente est? relacionada aos danos causados pelo terremoto de mb 4.9. O processo de cicatriza??o (enchimento das novas fissuras) que durou 60 dias pode ser decomposto em duas fases, uma recupera??o r?pida na fase p?s-s?smica (de 70% em ~ 30 dias) precoce e uma recupera??o relativamente lenta depois (de 30% em ~ 30 dias) No estudo de interferometria de cauda de onda, monitoramos mudan?as temporais da subsuperf?cie causada pela sequ?ncia de pequenos terremotos intraplaca mencionado anteriormente. O m?todo foi validado com dados sint?ticos. Fomos capazes de detectar uma mudan?a da fonte de 2.5% e uma redu??o de 15% da quantidade dos espalhadores. A partir dos dados reais, observamos uma r?pida diminui??o da correla??o da cauda da onda ap?s do evento s?smico mR 3.7. Isso indica uma mudan?a r?pida do subsolo na regi?o da falha induzida pelo terremoto. / This thesis presents and discusses the results of ambient seismic noise correlation for two different environments: intraplate and Mid-Atlantic Ridge. The coda wave interferometry method has also been tested for the intraplate data. Ambient noise correlation is a method that allows to retrieve the structural response between two receivers from ambient noise records, as if one of the station was a virtual source. It has been largely used in seismology to image the subsurface and to monitor structural changes associated mostly with volcanic eruptions and large earthquakes. In the intraplate study, we were able to detect localized structural changes related to a small earthquake swarm, which main event is mR 3.7, North-East of Brazil. We also showed that the 1-bit normalization and spectral whitening result on the loss of waveform details and that the phase auto-correlation, which is amplitude unbiased, seems to be more sensitive and robust for our analysis of a small earthquake swarm. The analysis of 6 months of data using cross-correlations detect clear medium changes soon after the main event while the auto-correlations detect changes essentially after 1 month. It could be explained by fluid pressure redistribution which can be initiated by hydromechanical changes and opened path ways to shallower depth levels due to later occurring earthquakes. In the Mid-Atlantic Ridge study, we investigate structural changes associated with a mb 4.9 earthquake in the region of the Saint Paul transform fault. The data have been recorded by a single broadband seismic station located at less than 200 km from the Mid-Atlantic ridge. The results of the phase auto-correlation for a 5-month period, show a strong co-seismic medium change followed by a relatively fast post-seismic recovery. This medium change is likely related to the damages caused by the earthquake?s ground shaking. The healing process (filling of the new cracks) that lasted 60 days can be decomposed in two phases, a fast recovery (70% in ~30 days) in the early post-seismic stage and a relatively slow recovery later (30% in ~30 days). In the coda wave interferometry study, we monitor temporal changes of the subsurface caused by the small intraplate earthquake swarm mentioned previously. The method was first validated with synthetics data. We were able to detect a change of 2.5% in the source position and a 15% decrease of the scatterers? amount. Then, from the real data, we observed a rapid decorrelation of the seismic coda after the mR 3.7 seismic event. This indicates a rapid change of the subsurface in the fault?s region induced by the earthquake.