Thesis (MTech (Agriculture))--Cape Peninsula University Of Technology, 2016. / Bambara groundnut (Vigna subterranea), a dicotyledonous plant is a legume which has a potential to contribute to food security and nutrition. Protoplasts are naked plant cells lacking cell walls. Viable protoplasts are potentially totipotent. Therefore, when given the correct stimuli, each protoplast is capable, theoretically, of regenerating a new wall and undergoing repeated mitotic division to produce daughter cells from which fertile plants may be regenerated through the tissue culture process. Protoplast systems are valuable and versatile cell based systems that are useful in observing cellular processes and activities. In this study, the isolation of protoplast from the leaves of Bambara groundnut plant was extensively optimised. The factors affecting protoplast isolation considered in this study were ages of plant material, mannitol concentration, combinations and concentrations of enzymes and duration of incubation. Effects of ages of Bambara groundnut plant (4, 6, 8, 10 weeks), molarities of mannitol (0.4 M, 0.5 M. 0.6 M and 0.7 M), concentration and combination of enzymes (1%, 2% and 4% cellulase, 0.5% and 1% macerozyme and, 0.5% and 1% pectinase) at different incubation duration (4, 18, 24, 42 hours) were investigated. Overall, it can be deduced from this study that the optimal protoplast yield (4.6 ± 0.14×105ml-1/gFW) and viability (86.5 ± 2.12%) were achieved by digesting the leaves of four week old Bambara groundnut plant with 2% cellulase and 0.5 % macerozyme with 0.5M mannitol for 18 hours. Freshly isolated protoplasts were then cultured at different densities of 1 × 104 - 2 ×106 protoplasts/ml using MS in three different culture (Liquid, agar and agarose bead) methods. First cell division was observed only in liquid medium. With several attempts, no division was achieved in the agar and agarose bead methods, division also did not progress in the liquid medium and hence, plant regeneration from Bambara groundnut protoplasts could not be achieved in this study. Consequently, a further study is underway to compare the proteomic profiles of freshly isolated protoplasts and cultured protoplasts in order to gain insights into the expression of proteins that could perhaps be contributing to the difficulty in regenerating Bambara groundnut plant through protoplast technology. The present study is novel because it is the first study to optimise the various factors that could affect protoplast isolation from the leaves of Bambara groundnut and thus developed an efficient protocol for protoplasts isolation from leaves of Bambara groundnut for cell manipulation studies.

O objetivo desse estudo foi avaliar a citotoxicidade do alendronato de sódio (ALN), em diferentes concentrações, sobre osteoblastos em cultura celular. Foi utilizado para o experimento meio sem droga (controle) e meio contendo a droga em diferentes concentrações a saber: 0,5; 1; 5; 10; 20 e 40 mg/ml. Para o estudo foi utilizado uma linhagem de osteoblastos de rato (Osteo-1). A viabilidade celular foi inferida a partir da análise da atividade mitocondrial das células através do método da redução do MTT nos tempos experimentais de 0, 24, 48 e 72 horas. Após análise estatística (teste de Mann-Whitney, p<0,05), os resultados mostraram que, com exceção da concentração de 40mg/ml, todos os grupos apresentaram células viáveis, embora todas as concentrações de ALN tenham reduzido a atividade mitocondrial em mais de 50% em relação ao grupo controle, sugerindo que o ALN nessas concentrações estudadas foi citotóxico para os osteoblastos. / The aim of this study was to analyze the cytotoxicity of a bisphosphonate (sodium alendronate) on rat osteoblasts. The experimental groups were GI (control) no sodium alendronate, and GII, GIII, GIV, GV, GVI, and GVII with sodium alendronate at the concentrations of 0.5, 1, 5, 10, 20, and 40mg/ml, respectively. The cell viability was evaluated by MTT assay in experimental times 0, 24, 48, and 72 h. Data were statistically analyzed. Cultures treated with sodium alendronate showed cell viability percentages significantly lower (p < 0.05) than those of the control groups. In GVII, no viable cell was observed in all experimental times. It could be concluded that sodium alendronate, on direct contact with rat osteoblasts, is cytotoxic in all concentrations studied.

A fotobioestimulação por laser e LED é uma tendência terapêutica inovadora e não invasiva. Os efeitos fotofísicos e fotoquímicos dessa terapia geram imunomodulação, aceleram a cicatrização e angiogênese, bem como reduzem a dor. Dessa forma tem se buscado o emprego desses estímulos no tecido ósseo, porém ainda inexistem padrões definidos para obter a melhor fotobioestimulação nas células ósseas. O objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade da fotobioestimulação na viabilidade celular e mineralização de células da granulação óssea de ratos (rGO). Células rGO na 6ª passagem foram plaqueadas em placas de 96 poços para os ensaios de viabilidade celular (1x10³) e em placas de 24 poços para os ensaios de cicatrização de feridas in vitro (1x104), mineralização e atividade da fosfatase alcalina (FALC) (4x104). As células receberam DMEM (10% SFB) e irradiações com laser (AlGaAs- 660nm e AlGaInP-810nm) e LED (637±15nm). Os grupos experimentais foram: laser vermelho (3 e 5 J/cm²), laser infravermelho (3 e 5 J/cm²) e LED (3 e 5s), além dos grupos controles, positivo (C+) e negativo (C-, 1%SFB). Para os ensaios de mineralização e atividade de fosfatase alcalina, além do meio convencional, grupos com meio osteogênico e os mesmos tratamentos luminosos foram acrescentados. A viabilidade celular foi avaliada pelos testes do MTT e cristal violeta nos períodos de 24, 48, 72 e 96h. O ensaio de cicatrização de feridas in vitro foi avaliado por meio da porcentagem da área de fechamento da ferida nos períodos de 12, 24, 36, 48h. O teste de mineralização foi feito por meio do teste com vermelho de alizarina nos períodos de 14, 21 e 28 dias enquanto que a atividade da FALC foi medida em 7, 14 e 21 dias. A análise estatística foi realizada através dos testes ANOVA complementados por Tukey (p<0,05). Os resultados mostraram que as terapias com luz de maneira geral aumentaram a viabilidade o fechamento da ferida in vitro, principalmente os grupos laser vermelho e LED5s (p<0,05). Pode-se observar um bom desempenho do grupo LED5s no ensaio de mineralização, onde nos grupos que receberam meio osteogênico houve um efeito somatório com a ação da fotobioestimulação promovendo maior produção de nódulos in vitro. Também, as terapias com luz, estimularam a produção de nódulos mineralizados nos grupos que receberam meio convencional de forma a superar o C+ osteogênico (p<0,05), denotando uma ação de indução osteogênica a partir da fotobioestimulação. A fosfatase alcalina foi estimulada pelos tratamentos com luz no período de 7 dias (p<0,05). Em conclusão, as terapias com laser e LED foram capazes de estimular a viabilidade e migração celular e eventos de mineralização em osteoblastos, sendo que o laser vermelho e LED promoveram os melhores resultados. / Photobiomodulation by laser and LED is a new therapeutic non-invasive trend. Photophysical and photochemical effects occur in immunomodulation, acceleration of wound healing and angiogenesis and reduction of pain. These effects are desired in bone tissue but there are no defined parameters for light irradiation and no consensus for the best effect on osseous cells. The aim of this study was to evaluate photobiomodulation effects on cell viability and mineralization events of rat osseous granulation cells (rGO). Cells in 6th passage were plated in 96-well plates for viability tests (1x10³ cells), and 24-well plates for in vitro wound healing test (1x104 cells), mineralization and alkaline phosphatases (AF) activity (4x104 cells). Cells were cultured in DMEM (10% bovine fetal serum) and irradiation with lasers (AlGaAs-660nm e AlGaInP-810nm) and LED (637±15nm). Experimental groups were red laser (3 and 5 J/cm²), infrared laser (3 and 5 J/cm²), LED (3 and 5s), positive(C+) and negative controls (C-, 1% bovine fetal serum). For mineralization and AF assays, other groups with osteogenic medium and same light treatments were added. Cell viability was evaluated by MTT and crystal violet tests at 24, 48, 72 and 96h. In vitro wound healing test evaluated the percentage of wound closure area by cells migration at 12, 24, 36, 48h. Mineralization test was done by alizarin red at 14, 21 and 28 days. AF activity was measured at 7, 14 and 21 days. Statistical analysis was performed by ANOVA complemented by Tukeys test (p<0,05). Results showed that light therapies in general increased viability and wound healing closure, mostly red laser and LED5s (p<0,05). Best results in mineralization stimulation were observed for LED5s. In groups with osteogenic medium, a synergistic effect of photobiomodulation resulted in higher numbers of mineral nodules. Light groups stimulated higher mineral nodule formation than positive control (p>0.05) even in groups with regular medium, showing an osteogenic induction by light. Increased AF activity was observed at 7 days in light treatment groups (p<0,05). In conclusion, laser and LED photobiostimulation increased viability, cell migration and mineralization events in osteoblasts with best results for red laser and LED.

O titânio é considerado um biomaterial (material biocompatível) pela baixa reatividade e pela grande estabilidade da sua camada de óxido superficial. Pelas suas propriedades mecânicas ele é usualmente utilizado na fabricação de substitutos ósseos e implantes dentários. Visando contribuir para o desenvolvimento de novas superfícies osteointegráveis, neste trabalho foram estudadas duas superfícies de titânio modificadas com implantação iônica de P e BF2 com energia de 30 e 77keV, respectivamente. As superfícies foram submetidas a ensaios in vitro de cultura celular de células osteoblásticas (MG-63) e os resultados foram comparados com duas superfícies comerciais: poliestireno tratado para meio de cultura celular (PC) e titânio comum utilizado em implante dentário (TI). A atividade enzimática da fosfatase alcalina (FA) associadas à formação de biofilme mineralizado pelas células diferenciadas foram avaliadas. Concentrações de cálcio e fósforo no biofilme foram determinadas por espectroscopia de raios-X induzida por prótons, PIXE. Imagens superficiais com microscopia eletrônica de varredura serviram para verificar a homogeneidade e integridade dos biofilmes formados. Medidas de ângulo de contato foram realizadas para determinar o caráter hidrofílico das superfícies e do biofilme formado. As superfícies PC e TI se apresentaram hidrofílicas com formação de biofilme menos homogêneo que as apresentadas pelas superfícies PT e BFT, ambas hidrofóbicas. As concentrações de FA medidas no meio de cultura indicaram consumo maior que a secreção em PC e TI. Em PT e BFT foram observados acúmulos de FA no meio de cultura. Concentrações maiores de cálcio e fósforo foram observadas em PC e TI. Destas observações, as quatro superfícies podem ser consideradas biocompatíveis (não citotóxicas) pela formação de biofilme mineralizado e pelas medidas de atividade enzimática. / Titanium is considered a biomaterial (biocompatible material) due to its low reactivity and the great stability of its surface native oxide layer. With excellent mechanical properties, titanium is widely used as bone substitutes and dental implants. Aiming to contribute for the development of new surfaces to promote osteoblastic cell grow, two ion-beam-modified titanium samples were compared with two commercially available surfaces: polystyrene treated for cellular cultures (PC), and regular titanium used in dental implants (TI). The modified titanium samples were ion beam implanted with 30 and 77 keV phosphorous and BF2, respectively. All surfaces were employed for in vitro assays using cultures of osteoblastic cells (MG-63). The Phosphatase Alkaline Enzymatic Activity (ALP) was measured and associated with the mineralized bio-film formed by the differentiated cells. The concentration of calcium and phosphorus in the mineralized bio-film was measured by Proton Induced X-ray Emission, PIXE. Scanning Electron Microscope images were used to access the bio-film homogeneity and integrity. Contact angle measurements were used to characterize the wettability of the surfaces and the resulting bio-film. In spite of being more hydrophilic, the surfaces PC and TI formed of a less homogeneous bio-film than the PT and BFT surfaces, which were less hydrophilic. The ALP in the cell culture medium indicated greater consumption than secretion for PC and TI, while for PT and BFT accumulation of ALP was observed. Concentrations of calcium and phosphorus were greater for PC and TI samples. The four surfaces can be considered biocompatible (not cytotoxic) due to mineral bio-film formation and enzymatic activity measurements.

Pouco se conhece a respeito da incidência ou prevalência da infecção pelo vírus da raiva em morcegos, ou ainda sobre a distribuição do vírus em tecidos e órgãos não nervosos. Os objetivos deste trabalho foram: i) verificar as espécies de morcegos mais freqüentemente envolvidas com a raiva no Estado de São Paulo, Sudeste do Brasil; ii) estudar a distribuição do vírus da raiva em tecidos e órgãos não nervosos de morcegos; iii) estudar os períodos de mortalidade das amostras de vírus da raiva encontradas nos cérebros e glândulas salivares de morcegos, após inoculação intracerebral em camundongos, e iv) comparação do isolamento do vírus da raiva no sistema camundongo e cultura de células de neuroblastoma (N2A). Entre abril de 2002 a novembro de 2003, 4.393 morcegos capturados de diferentes municípios do Estado de São Paulo foram enviados à Seção de Diagnóstico da Raiva do Instituto Pasteur de São Paulo. Destes, 82 (1,87%) foram positivos para raiva pela técnica de imunofluorescência aplicada aos materiais do cérebro e 33 morcegos pertenciam ao gênero Artibeus sp; 15 Myotis sp; 10 Epitesicus sp; 5 Lasiurus sp; 4 Nyctinomops sp; 4 Tadarida sp; 3 Histiotus sp; 1 Molossus sp; 1 Eumops sp e 6 vampiros Desmodus rotundus. A distribuição do vírus em diferentes órgãos foi examinada pela inoculação de camundongos e células N2A com suspensões a 20% preparadas a partir de fragmentos do cérebro, glândula salivar submandibular, pulmão, língua, coração, bexiga urinária, rins, gordura interescapular, músculo peitoral, trato genital (testículos ou ovários e útero) e estômago. O vírus foi prontamente recuperado de tecidos e órgãos não nervosos com diferentes graus de sensibilidade, tanto em camundongos como em células N2A, e os órgãos mais apropriados para o isolamento viral foram os cérebros e glândulas salivares. Os períodos máximos de mortalidade observados para os vírus presentes nos cérebros usualmente foram mais curtos que os das glândulas salivares, a média do período máximo &plusmn; desvio padrão calculado para os cérebros de morcegos hematófagos foi de 15,33 &plusmn; 2,08 dias e para as glândulas salivares, 11,33 &plusmn; 2,30 dias; para os morcegos insetívoros, 16,45 &plusmn; 4,48 dias para os cérebros e para as glândulas salivares, 18,91 &plusmn; 6,12 dias; e para os morcegos frugívoros, as suspensões cerebrais apresentaram período máximo médio 12,60 &plusmn; 2,13 dias e para as glândulas salivares, 15,67 &plusmn; 4,82 dias. O teste de ANOVA indicou existir diferenças significantes entre os períodos de mortalidade correspondentes às suspensões preparadas a partir dos cérebros de morcegos insetívoros (período mínimo) e glândulas salivares de morcegos insetívoros (período máximo) e entre glândulas salivares de morcegos insetívoros (período máximo) e cérebros de morcegos frugívoros (período mínimo), com p<0.001. O uso de células N2A para o primo-isolamento do vírus da raiva a partir de tecidos e órgãos não nervosos de morcegos, diferente de cérebros, não mostraram resultados consistentes, especialmente devido à contaminação bacteriana e fator toxicidade / Little is known about the incidence of infection or the prevalence rate of rabies in bats, or the distribution of virus in non-nervous tissues and organs. The aim of this work was to study: i) the most frequent species of bats involved with rabies virus infection in the State of São Paulo, Southeast Brazil; ii) the distribution of rabies virus in tissues and non-nervous organs of bats; iii) the mortality periods of virus found in brains and salivary glands of bats after intracerebral inoculation of mice, and iv) comparison of virus isolation in mice and N2A neuroblastoma cell culture. From April 2002 to November 2003, 4,393 bats captured from different municipalities of the State of São Paulo were sent to Rabies Diagnostic Section of the Instituto Pasteur de São Paulo - SP. Among these, 82 (1.87%) were found positive by the immunofluorescence technique applied to brain specimens and 33 bats were of the genus Artibeus sp; 15 Myotis sp; 10 Epitesicus sp, 5 Lasiurus sp, 4 Nyctinomops sp, 4 Tadarida sp, 3 Histiotus sp; 1 Molossus sp, 1 Eumops sp, and 6 vampires Desmodus rotundus. The distribution of virus in the organs was examined by inoculating mice and N2A cells with the 20% suspensions prepared from brain, submaxillary salivary gland, lungs, tongue, heart, urinary bladder, kidneys, brown fat, pectoral muscle, genital tract (testicles or ovaries and uterus), and stomach. The virus was promptly recovered from tissues and non-nervous organs at different degrees of sensitivity in both mice and N2A cells, and the most appropriate organs for the virus isolation were the brains and salivary glands. The maximum mortality periods found for the brain specimens usually were shorter than the salivary glands, the maximum mean perio &plusmn; standard deviation calculated for the brains taken from the vampire bats was 15.33 &plusmn; 2.08 days and for salivary glands, 11.33 &plusmn; 2.30 days; for the insectivorous bats the maximum for the brain suspensions was 16.45 &plusmn; 4.48 days and for the salivary glands, 18.91 &plusmn; 6.12; and for the frugivorous bats, the brain suspensions showed the maximum of 12.60 &plusmn; 2.13 days and the salivary glands, the mean maximum period of 15.67 &plusmn; 4.82 days. The ANOVA test indicated that the most significant differences in the mortality periods were between the suspensions prepared by the brains of insectivorous bats (minimum period) and salivary glands of insectivorous bats (maximum period); salivary glands of insectivorous bats (minimum period) and brains of frugivorous bats (minimum period) with p<0.001. The use of N2A cells for the prime isolation of rabies virus from tissues and non-nervous organs other than brains of bats did not show consistent results, especially due to bacterial contamination and toxicity factor

S. pneumoniae é um importante patógeno humano que afeta sobretudo crianças. Vacinas são a principal estratégia de combate e o polissacarídeo (PS) da cápsula é o antígeno. Dentre os sorotipos do patógeno, o tipo 1 é prevalente em crianças e o PS1 componente obrigatório das vacinas. Neste trabalho objetivou-se: estabelecer um método de dosagem do PS1, selecionar a melhor cepa produtora de PS1, avaliar 3 peptonas, investigar 4 componentes do meio de cultura em planejamento experimental (PE) em reator e propor um novo meio e estratégia de cultivo. A cepa ST595/01 foi selecionada e o Phytone (Phy) foi a peptona com maior produção de PS1, 298mg/L, medido por m-hidroxidifenil com sulfamato. O PE 24-1 com extrato de levedura (EL), Phy, Asn e Gln mostrou os maiores efeitos positivos do Phy para produção de biomassa (Cx) e PS1. EL foi positivo para Cx, Asn não apresentou efeitos e Gln menor efeito positivo para PS1. Assim, testou-se o novo meio com Phy 15g/L e EL 2g/L sob duas estratégias: a batelada alimentada superou a batelada simples em 2x para Cx e 2,5x para PS1. / S. pneumoniae is an important human pathogen that affects mainly children. Vaccines are the main strategy to fight the disease and capsular polysaccharide (PS) is the antigen. Among pneumococcal serotypes, type 1 is prevalent in children. The aims of this work were: establish a method to measure PS1, screen strains for the best PS1 producer, evaluate 3 peptones, investigate the effects of 4 medium components by a design of experiment (DoE) and propose a new medium/strategy for cultivation. The strain ST595/01 was selected. Phytone (Phy) was the peptone with the highest PS1 production (298mg/L, measured by m-hydroxydiphenyl + sulfamate method). DoE 24-1 was carried out to assess the effects of yeast extract (YE), Phy, Asn and Gln. Phy showed the major positive effects for biomass (Cx) and PS1. YE demonstrated effects for Cx. Gln showed minor effect on PS1 production and Asn did not present effects. A new medium based on 15g/L Phy and 2g/L YE was evaluated by 2 strategies: fed-batch showed Cx production 2-fold higher and PS1 2.5-fold higher than simple batch.

A Doxorrubicina (DOX) é um dos antineoplásicos mais utilizados no tratamento de tumores sólidos, como os de pele. Sua baixa penetração cutânea e instabilidade frente aos tecidos biológicos impedem, no entanto, sua aplicação tópica e localizada. Dentro deste contexto, o objetivo deste trabalho foi direcionar e aumentar a penetração cutânea da DOX, além de protegê-la contra eventuais degradações na pele, através do desenvolvimento de nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo DOX e da aplicação da iontoforese. As NLS foram obtidas pelo método da Microemulsão (ME), vertendo-as em excesso de água gelada e agitando o sistema vigorosamente. Foram obtidas NLS com cargas superficiais negativas (NLS-N) e NLS com cargas superficiais positivas (NLS-P). As NLS-N eram compostas por ácido esteárico, lecitina de soja, taurodeoxicolato de sódio e água. E as NLS-P por um derivado do colesterol e/ou ácido esteárico, poloxamer, cloreto de cetilpiridínio e água. As NLS com tamanho de partícula, polidispersividade e potencial zeta adequados para os estudos de permeação cutânea e celular foram definidas a partir de um planejamento fatorial completo (32). NLS-N e NLS-P selecionadas foram incorporadas com 8% de DOX e utilizadas nos estudos de permeação e citotoxicidade. O tamanho médio da NLS-N foi de 175 nm (PdI 0,278) e da NLS-P 278 nm (PdI 0,357). A eficiência de encapsulação foi de 90 e 61% para as NLS-N e NLS-P, respectivamente. Estudos de localização celular foram realizados e observou-se que as NLS-N permitiram a penetração da DOX tanto no citoplasma quanto no núcleo das células, assim como as NLS-P que também permitiram a penetração da DOX em um maior número de células tumorais. Estudos de estabilidade mostraram que a DOX encapsulada nas NLS foi estável a 4º C por até 48 h, sendo que as NLS liofilizadas foram estáveis por pelo menos 30 dias. Nos estudos de liberação da DOX das NLS observou-se que estas sustentaram a liberação da DOX. Porém, as NLS-P liberaram a DOX mais rapidamente do que as NLS-N, 40 e 25% em 72 horas, respectivamente. Nos estudos de permeação cutânea, observou-se que as NLS aumentaram significativamente a quantidade de DOX na solução receptora e na epiderme viável quando comparada com soluções de DOX. As NLS parecem penetrar/fundir na pele carregando o fármaco para camadas profundas da pele, diminuindo sua interação com o estrato córneo. A aplicação da corrente elétrica na dispersão de NLS aumentou a penetração das partículas na pele e, conseqüentemente, a penetração da DOX. As cargas superficiais das NLS positivas e negativas não influenciaram na sua penetração por iontoforese. Estudos de determinação do fluxo eletrosmótico com paracetamol mostraram que o principal mecanismo para a entrada das partículas na pele é o eletrosmótico e não o eletrorrepulsivo (proveniente das cargas). As NLS-P diminuíram o fluxo eletrosmótico significativamente, neutralizando as cargas negativas da pele e evidenciando a penetração das partículas neste tecido. Foram realizados estudos de citotoxicidade da DOX em diferentes formulações, em células B16F10 e em A431, e foi observado que a DOX encapsulada nas NLS-N é significativamente mais citotóxica do que as outras formulações, atingindo uma citotoxicidade de 100% quando em contato com as células de melanoma após apenas 6 h de incubação em concentrações superiores a 20 ng/mL. A aplicação de corrente elétrica em cultura de células aumentou também a penetração do fármaco nas células tumorais e, conseqüentemente, sua citotoxicidade. A indução dos tumores in vivo não se mostrou viável para o modelo de camundongos sem pêlo utilizado, porém o tratamento iontoforético demonstrou-se viável. / Doxorubicin (DOX) is one of the most used antineoplastic drug to treat solid tumors, such as skin cancer. Its low penetration into the skin and its instability in biological tissues, however, difficult topical and localized application. Within this context, the aim of this work was to increase DOX penetration into the skin, and to protect the drug against possible skin degradation, through the development of solid lipid nanoparticles (SLN) and the application of iontophoresis. The standardization and validation of two methodologies for the DOX quantification was performed: one of them using an UV/Vis spectrophotometer and the other using the HPLC. Both methods showed suitable linearity, sensibility, selectively, precision and accuracy, according to the in vigor specifications. SLN was obtained by microemulsion (ME) method spilling them into an excess of water with vigorously shaking. SLN were obtained with negative surface charge (SLN-N) and SLN with positive surface charge (SLN-P). SLN-N contained stearic acid, soy lecithin, sodium taurodeoxicolate, water and SLN-P containing compritol and / or stearic acid, poloxamer, sodium chloride, water. Particle size, polydispersity and zeta potential suitable for studies of skin permeation and cell were defined from a complete factorial design (32). The average size of the SLN-N was 175 nm (PdI 0.278) and the SLN-P 278 nm (PdI 0.357). The encapsulation efficiency was 90, and 61% for SLN-N and SLN -P, respectively. Studies of cellular location were made and showed that the SLN -N allowed the penetration of DOX in the cytoplasm and the nucleus of cells, as well as SLN -P that also allowed the penetration of DOX in a larger number of tumor cells. Encapsulated DOX in the SLN was stable at 4° C for 48 hours, and freeze-dried SLN are stable for at least 30 days. In release studies with DOX-SLN was observed that they control DOX release. However, SLN-P DOX release more quickly than SLN-N, 40 and 25% in 72 hours, respectively. In skin permeation studies, it is observed that SLN significantly increase the amount of DOX in the receiver compartment and in the epidermis. It seems that SLN penetrate / merge the skin carrying the drug to the deep skin layers, reducing its interaction with the stratum corneum. The application of an electrical current increased DOX permeation into the skin, and consequently, DOX penetration. SLN superficial charges do not influence DOX permeatation with iontophoresis. Electrosmotic flow studies showed DOX permeates into the skin mostly for eletrosmose mechanism. Cytotoxicity studies were performed with DOX in different formulations in B16F10 and A431 cells, and it was observed that DOX encapsulated in the SLN-N is significantly more cytotoxic than the other formulations, achieving 100% of cytotoxicity when in contact with the melanoma cells after 6 hours of incubation at concentrations above 20 ng/mL. The application of an electrical current in cell culture also increased the penetration of the drug in tumor cells and, consequently, its cytotoxicity. The induction of tumors in vivo was not feasible for hairless mice, but the iontophoretic treatment demonstrated to be feasible.

A técnica do enxerto de granulação óssea tem demonstrado bons resultados na recuperação do periodonto e na melhora dos parâmetros clínicos dos dentes com comprometimento periodontal. Pouco se sabe porém, a respeito de qual tipo de tratamento de superfície radicular se faz mais condizente com o emprego dessa técnica. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a proliferação de células de granulação óssea sobre fragmentos radiculares com os seguintes tratamentos de superfície: Controle - somente raspagem, EDTA, terapia fotodinâmica (PDT- laser InGaAIP - 30mW, 30s, 45J/cm², 660nm + azul de toluidina), e ácido cítrico com tetraciclina. Todos os grupos teste receberam previamente tratamento com raspagem e alisamento com 20 golpes de cureta. Células de granulação óssea foram cultivadas em quadruplicata sobre os fragmentos por um período de 24, 48 e 72 horas. Após esse período de cultivo os fragmentos foram fixados para análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV). Cinco campos por fragmento foram usados para a visualização e contagem de células aderidas a superfície radicular (centro, campo superior direito e esquerdo e campo inferior direito e esquerdo). A análise da calibração do examinador foi feita através de uma combinação de testes estatísticos como erro casual de Dahlberg, erro sistemático e correlação de Pearson (p<0,05). A análise da amostra foi realizada através do ANOVA de medidas repetidas complementado por Tukey, com nível de significância de 5% (p<0,05). Os resultados demostraram diferenças estatisticamente significantes, quanto ao numero de células, para as superfícies tratadas com terapia fotodinâmica no período de 72 h (p<0,05). Através de nossos resultados concluímos que o tratamento radicular com terapia fotodinâmica favorece a proliferação de células de granulação óssea humanas in vitro. / The osseous granulation graft has been demonstrating good results on the periodontal healing, resulting the improvement of clinical periodontal parameters. There are very few knowledge about what kind of dental surface would be more proper for the application of this technique. The aim of this study was to evaluate the proliferation of osseous granulation cells on human root fragments treated by different techniques as scaling and root planning (control), citric acid plus tetracycline, EDTA and photodynamic therapy (PDT InGaAIP, 45J/cm², 30mW, 30s, 660nm, toluidine blue O). All test groups were previously treated which 20 curette strikes. Osseous granulation cells was culture in quadruplicate on these fragments for 24h, 48h and 72h. After that, all fragments were fixed and prepared for analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). Aiming to counting the cells adhered on the roots, we obtained electron micrographs of 5 areas (center, upper right and left field, lower right and left field). The examiner calibration was analyzed by Dahlberg Casual Error measurement, systematic error test and Pearson correlation test (p<0.05). Statistical analysis was performed by ANOVA, followed by Tukey test, with a 5% level of significance (p<0.05). There were significant differences in cell number after 72h culture in favor of PDT group (p<0,05). We can conclude that the surface treatment of roots which PDT favor the proliferation of osseous granulation cells in vitro.

Os radicais livres são formados constantemente em nosso organismo, e em quantidades controladas desempenham alguns papéis fisiológicos. Entretanto, sua presença em quantidades acima daquelas aceitáveis passa a ser um fator de risco para funcionamento adequado do organismo. Muitas doenças crônicas degenerativas têm sua origem no desequilíbrio do estado redox. Apesar de possuir um sistema de proteção antioxidante endógeno, o organismo pode ser beneficiado pela presença de compostos antioxidantes exógenos, como os compostos fenólicos encontrados em alguns alimentos. A romã (Punica granatum, L) é uma fruta que apresenta elevados conteúdos destes compostos. Foram obtidos os extratos e as frações de ácidos fenólicos da polpa e das sementes da fruta, e avaliou-se a capacidade antioxidante através de três métodos in vitro: o de co-oxidação de substratos (&#946;- caroteno e ácido linoléico), o do radical DPPH&#8226; e o ORAC. Em todos os testes foram obtidos resultados que indicaram uma elevada atividade antioxidante, principalmente para a fração de ácidos fenólicos livres (AFL) da polpa. Frente a estes dados, a fração foi submetida a um ensaio de transporte celular, o qual foi possível verificar que os diferentes ácidos fenólicos ali encontrados foram capazes de atravessar a membrana celular. A fração AFL da polpa propiciou uma redução na produção de espécies reativas intracelulares e efeitos sobre a proliferação e a viabilidade em células das linhagens Caco-2, HeLa e MDCK. Por fim, o ensaio in vivo avaliou, sob condições fisiológicas normais, o efeito do extrato aquoso e da fração AFL sobre a oxidação lipídica e na atividade do sistema enzimático de defesa antioxidante. O tecido cerebral apresentou uma redução significativa nos níveis de lipoperoxidação. A atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase apresentou resultados bastante díspares e sugerem que as respostas não seguem um padrão único e podem variar de acordo com o órgão analisado, respondendo com o aumento ou a diminuição da atividade enzimática de acordo com suas funções fisiológicas. / Free radicals are continuosly formed in our organism, and under suitable amounts they play physiological roles. However, when there´s a higher presence in their levels than the acceptable ones, they turn into a risk factor to the adequate work of the organism. Most of the degenerative illness are originated from the redox state desequilibrium. Although the organism has an endogenous antioxidant defence system, it may be beneficiated by the presence of antioxidant compounds of exogenous origen, as the phenolic compounds that are found in some kinds of food. The pomegranate (Punica grantum, L.) is a high phenolic compound fruit. The extracts and phenolic fractions both from the pulp and seeds of the fruit were obtained and their antioxidant activity was obtained using three in vitro methods: the co-oxidation of substrates (&#946;-carotene and linoleic acid), the DPPH&#8226; radical and the ORAC. For all of them the results have showed a great antioxidant activity, higher than those of the free phenolics acids´fraction (FPA) of the pulp. Face to these data, the fraction was taken to a cellular transport assay, which was possible to verify that the different phenolic acids present at FPA were able to cross the cellular membrane. The FPA pulp´s fraction provocated a down in production of the the intracelular reactive species and had effects into the cellular proliferation and viability of the Caco-2, HeLa and MDCK cells. Finally, the in vivo tryout was made using rats submitted to normal physiologic conditions and the effects of the aquous extract and FPA fraction over the lipidic oxidation and the activity of the enzymatic system of antioxidant defence were avaliated. The brain tissue showed a significant reduction about the lipoperoxidation levels. The results about the activity of the enzymes superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase were so different between themselves, which suggests that the enzymes don´t follow an only standard of response, and the reply can vary in accordance with the analyzed organ. The increase or the reduction of the enzymatic activity can occur by the physiologic conditions that the organ is able to do.

Materiais poliméricos têm sido usados em um vasto número de aplicações médicas e farmacêuticas, caracterizando-se como biomateriais. Antes do uso humano, se faz necessário uma criteriosa programação de testes que permitam investigação da segurança do material e avaliação da eficácia e assim, avaliar sua biocompatibilidade. Essa atenção também tem sido aplicada a materiais nanoparticulados, inclusive de constituição polimérica. Sendo assim, antes da liberação destes materiais para uso humano, testes preliminares são feitos in vitro e in vivo, neste caso com experimentação animal. Paralelamente à crescente busca em se manter a segurança biológica, a ciência tem procurado metodologias alternativas para se obter resultados seguros e que possam substituir os obtidos in vivo. Neste contexto, surge grande interesse no uso de culturas celulares, primeiramente em monocamadas e posteriormente, o desenvolvimento de culturas celulares em estrutura tridimensional, mimetizando de maneira mais próxima o que ocorre in vivo. Considerando as diversas vantagens obtidas no estudo de culturas tridimensionais, este estudo teve como objetivo desenvolver tal modelo, visando simular sistemas de avaliação para biocompatibilidade de materiais poliméricos, testando nanopartículas de polibutilcianoacrilato. Foram cultivadas células de fibroblasto e melanócito humanos e células de melanoma (SK-Mel-103) em monocamada e em matriz tridimensional de colágeno tipo I e avaliada a citotoxicidade em 24, 48 e 72 horas das nanopartículas utilizando os testes de Exclusão Azul de Tripan e MTT. Os resultados indicam que as nanopartículas de polibutilcianoacrilato são mais citotóxicas com o aumento da concentração da amostra, assim como o IC50 foi decrescente ao longo dos dias, demonstrando a intensificação da resposta biológica no decorrer do tempo e foram mais citotóxicas para as células de melanoma. Este perfil de aumento de citotoxicidade com o passar do tempo também foi observado no ensaio clonogênico, onde as células foram cultivadas em monocamada e incubadas com a amostra até 14 dias. Os testes de viabilidade celular em cultura tridimensional evidenciaram faixa de IC50 um pouco maior do que em monocamada, demonstrando uma pequena redução na citotoxicidade quando avaliada no ambiente 3D. Foram feitos testes de caracterização do tipo de morte utilizando citometria de fluxo, confirmando os dados dos testes de viabilidade que indicam aumento de morte com o aumento da concentração de teste. A morte acontece por apoptose tardia. Nas concentrações próximas ao IC50, há indicação que as nanopartículas de polibutilcianoacrilato inibem a autofagia em fibroblastos e células de melanomas cultivados em monocamada, característica que é anulada quando o comportamento é avaliado em ambiente tridimensional. Os resultados indicam que nanopartículas de polibutilcianoacrilato podem levar a modificação da resposta celular dependendo da concentração empregada e do ambiente de cultivo das células, mostrando serem promissores o estudo e o emprego de ambiente tridimensional na avaliação de citotoxicidade de nanopartículas poliméricas. / Polymeric materials have been widely used as biomaterials in medical and pharmaceutical applications. Before their use in humans, a number of tests is necessary to investigate the safety and effectiveness of the biomaterial in order to determine its biocompatibility. This attention has been given to nanoparticulate materials, including those of polymeric composition. Thus, in vitro and in vivo preliminary tests are done before these materials are released for human use. In parallel with the concern with biological safety studies, there has been a continuous effort in finding alternative methods to replace the current in vivo animal tests and provide reliable results regarding safety. In this context, great interest arises in the use of cell culture, firstly as monolayer and secondly as three-dimensional cell culture systems that mimic more closely the in vivo morphology. Taking into account all the advantages of three-dimensional cell culture studies, the aim of this work is to develop a three-dimensional model that can effectively evaluate polymeric biomaterials biocompatibility using polybutylcyanoacrylate nanoparticles. Cell culture of human fibroblasts, melanocytes and melanoma cells (SK-Mel-103) were cultured in monolayer and on type I collagen matrix. Polybutylcyanoacrylate nanoparticles cytotoxicity was evaluated in 24, 48 and 72 hours using Tripan Blue and MTT assays and the results found were dose and time-dependent to all cell types. Moreover, melanoma cells were significantly more sensitive to the nanoparticles toxicity. The same profile of cytotoxic response was observed in the clonogenic assay, where cells were cultured in low-density monolayer and incubated with the nanoparticles for 14 days. Cell viability assays in 3D culture had a slightly higher IC50 range when compared to the monolayer results, which suggests a reduction in the nanoparticle cytotoxicity in the 3D environment. Cell death analysis using flow cytometry confirmed the dose-dependent response obtained by cell viability assays. Cell death occurred mostly via late apoptosis. There is suggestive evidence that treatment with polybutylcyanoacrylate nanoparticles in concentrations close to the IC50 inhibits autophagy in fibroblasts and melanoma cells when cultured in monolayers, but this response could not be observed in the 3D environment. Our results showed that polybutylcyanoacrylate nanoparticles can modify cell response depending on the concentration used and the conditions of cell culture. We conclude that the 3D cell culture is a promising method for the evaluation of polymeric nanoparticles cytotoxicity.