Direkte zelluläre Reprogrammierung wird durch den Einsatz von Transkriptionsfaktoren (TFs) erreicht, die das Zellschicksal induzieren und die Umwandlung in einen gewünschten Zelltyp direkt einleiten. Die Fähigkeit der TFs, die Identität von Zelltypen umzuprogrammieren, wird jedoch durch den zellulären Kontext bestimmt und ist durch hemmende Mechanismen eingeschränkt. Diese hemmenden Mechanismen schützen und erhalten das Zellschicksal und wirken daher als Barrieren für die Reprogrammierung. Ein Faktor, der als Barriere der Reprogrammierung fungiert, ist das Histon-Chaperon FACT. Es ist jedoch nicht bekannt, wie FACT das Zellschicksal sichert. Dieses Projekt entschlüsselt die zugrundeliegenden Reprogrammierungsmechanismen bei der Deletion von FACT in C. elegans. Das Aurora-Kinase B kodierende Gen air-2 wurde als Promotor der Reprogrammierung identifiziert. Aurora-Kinase B fördert die Umwandlungdes Zellschicksals, indem sie das Chromatin durch Phosphorylierung von H3S10-Resten umgestaltet. Darüber hinaus identifiziere ich die Histon-Acetyltransferase CBP-1 als Promotor der Reprogrammierung durch die Acetylierung von H3K18 und H3K27. Die Deletion des Cytochrom c-Oxidase - 1 kodierenden Gens cco-1, einer Untereinheit des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes, ermöglicht eine von CBP-1 abhängige Reprogrammierung von Darmzellen zu Neuronen. Diese Beobachtung wirft ein neues Licht auf die Art und Weise, wie zelluläre Störungen, die in verschiedenen Kompartimenten durch die Deletion zellulärer Schutzmechanismen entstehen, zu ähnlichen Effekten bei der Reorganisation des Chromatins führen können, welche die Reprogrammierung vorantreiben. Darüber hinaus beschreibe ich eine mögliche Rolle der mitochondrialen Funktion bei der durch FACT-Deletion vermittelten Reprogrammierung durch die Induktion des mitochondrialen Chaperons HSP60. Schließlich kläre ich auf, wie FACT zelluläre Schicksale schützt, indem es die Integrität des Chromatins während der Transkription bewahrt. / Direct cellular reprogramming is achieved by using cell fate-inducing transcription factors (TFs) that directly induce conversion to a desired cell type. However, the ability of TFs to reprogram cells is defined by cellular context and is usually restricted by inhibitory mechanisms. Studying barriers of cellular reprogramming in vivo is a crucial step to attaining its therapeutic potential and provides important insights into the basic biology of cell fate regulation. One factor that acts as a barrier of reprogramming is the histone chaperone FACT. However, how FACT safeguards cellular fate is not yet known. Here, we unravel the underlying reprogramming mechanisms upon FACT depletion in C. elegans. To this end, an enhancer/suppressor screen with epigenetic regulators was performed. This screen identified the kinase Aurora B encoding gene air-2 as a promotor of reprogramming, promoting cell fate conversion by remodelling chromatin through the phosphorylation of H3S10. Additionally, I identify the histone acetyltransferase CBP-1 as a promotor of cell fate conversion through the acetylation of H3K18 and H3K27. Moreover, I characterize another reprogramming event where CBP-1 promotes reprogramming. Depleting the cytochrome c oxidase – 1 encoding gene cco-1, a subunit of the mitochondrial respiratory chain complex, allows for gut-to neuron reprogramming that is dependent on CBP-1. FACT and cco-1-depletion-mediated reprogramming show an overlap in reprogramming pathways. This observation sheds new light on how cellular perturbations originating in different compartments through depletion of cellular safeguards can produce similar effects on chromatin reorganization that drive reprogramming. I describe a potential role for mitochondrial function in FACT-depletion-mediated reprogramming through the induction of the mitochondrial chaperone HSP60. Lastly, I elucidate how FACT protects cellular fates through its role as a safeguard of chromatin integrity during transcription.

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Em 2006, Takahashi e colaboradores demonstraram ser possível a obtenção de células-tronco pluripotentes por indução gênica (induced pluripotent stem cells ou iPSCs). Desde o surgimento desta tecnologia diversos modelos animais foram gerados, ampliando as possibilidades de seu uso na pesquisa, como por exemplo, na criação de modelos para doenças genéticas humanas como esclerose lateral amiotrófica, autismo, esquizofrenia, doença de Parkinson e Alzheimer, além do aprimoramento de características relevantes para produção animal. O modelo suíno é considerado vantajoso sobre os outros modelos animais principalmente pela criação já bem estabelecida e similaridades fisiológicas com os humanos. O intuito deste projeto foi reprogramar fibroblastos embrionários suínos através do sistema integrativo à iPSCs, para então diferenciá-las em células progenitoras neurais (neural progenitor cells, NPCs). Para isso, os fibroblastos foram transduzidos com vetores contendo sequencias humanas ou murinas dos genes OCT4, SOX2, c-Myc e KLF4 (hOSKM ou mOSKM) para formação das iPSCs. Estas foram caracterizadas quanto a morfologia, presença de fosfatase alcalina, a expressão dos genes exógenos e endógenos (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) através de imunofluorescência e RT-qPCR e formação de corpos embrióides. Então foram submetidas durante 14 dias ao meio de indução neural sob matriz extracelular comercial, gerando células potencialmente similares às NPCs. Estas foram caracterizadas morfologicamente, por imunofluorescência das proteínas NESTINA, BETA TUBULINA III e VIMENTINA, além da expressão de NESTINA e GFAP por RT-qPCR. Foram produzidas com sucesso 3 linhagens de iPSC em diferentes estágios de reprogramação e células positivas para todos os marcadores neurais testados. Os resultados apresentados deverão contribuir para a utilização do modelo suíno em futuros estudos voltados à medicina regenerativa e translacional. / In 2006, Takahashi and collaborators reported the induction into pluripotency of somatic cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs). Since then, this technique has much been developed; many animal models have been created opening a new series of opportunities in research. They enable the creation of models for human genetic diseases, for example, amyotrophic lateral sclerosis, autism, schizophrenia, Parkinson´s disease, Alzheimer´s disease and the enhancement of relevant characteristics in agriculture. The swine model is considered to present many advantages over others, including the well-known production and maintenance and physiological similarities to humans. The aim of this project was to reprogram porcine embryonic fibroblasts (pEF) into iPSCs using the lentiviral integrative system, followed by its differentiation into neural progenitor cells (NPCs). The cells were reprogrammed using vector containing either the human sequences (hOSKM) or the mouse sequences (mOSKM) for the OCT4, SOX2, c-Myc and KLF4 genes to form the iPSCs. They were characterized regarding the presence of the Alkaline Phosphatase enzyme, expression of exogenous and endogenous genes (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) through immunofluorescence and RT-qPCR, and embryoid body formation. Then, the cells were cultured with neural induction media for 14 days in commercial extracellular matrix, generating cells potentially like NPCs. Those were characterized regarding their morphology, immunofluorescence for NESTINA, BETA TUBULIN III and VIMENTINA and gene expression of NESTINA and GFAP. iPSCs were successfully reprogramed, generating 3 cell lines at different stages of reprograming and cells positive for all the neural markers tested were produced. The results shown will contribute to the use of the porcine model in future regenerative and translational medicine research.

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear e extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga. Uma série de estudos, porem, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Esta proposta teve como objetivo gerar células bovinas pluripotentes através da reprogramação direta e utilizá-las na transferência de núcleo para a produção animal visando o aumento da eficiência da reprogramação celular. Para tal, foi analisada a capacidade de indução e manutenção da pluripotência em células somáticas bovinas comparando-as com células humanas e equinas (células pluripotentes induzidas - iPSC), assim como a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos através da combinação das técnicas em bovinos. As células iPS derivadas neste estudo foram produzidas mediante transdução lentiviral de fatores de transcrição (OSKM) murinos, caracterizadas e utilizadas como doadoras de núcleo na clonagem. Resumidamente, oócitos bovinos obtidos de ovários provenientes de abatedouros foram maturados in vitro por 18h, enucleados e reconstruídos com células iPS (n=203 ou fibroblastos fetais bovinos (bFF, n=153), em cinco repetições. Após reconstrução os embriões foram ativados com ionomicina e 6-DMAP e cultivados in vitro até o estágio de blastocisto. Foram avaliadas as taxas de fusão, clivagem (48h após ativação) e desenvolvimento a blastocisto (192h após ativação) e os resultados foram submetidos ao teste de Qui-quadrado a 5% de significância. Foi possível a produção de embriões a partir de biPS, entretanto, este estudo evidenciou a necessidade de otimização da sincronização do ciclo celular em células iPS. Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à capacidade de produção a blastocisto ou clivagem, porém o grupo reconstruído com células iPS apresentou uma menor taxa de fusão. Com a finalidade de entender a influência de fatores de transcrição específicos na reprogramação nuclear, bFF expressando OCT4 humano (hOCT4) e hSOX2 combinados com as proteínas repórteres fluorescentes vexGFP e mCitrine, respectivamente, foram submetidas à separação celular por citometria de fluxo e utilizados como doadores de núcleo. Foram utilizados bFF expressando OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicata), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicata) ou células controle (não transduzidas, n=178 e n=149, em quadruplicata para grupos OCT4 e SOX2, respectivamente). Não foram encontradas diferenças entre os grupos nas características de capacidade de desenvolvimento in vitro estudadas. Em conclusão, este estudo relata a possibilidade de produção de células bovinas reprogramadas, além de também mostrar que a transferência de núcleo utilizando células expressando hSOX2 ou hOCT4, ou já reprogramadas, resulta em taxas similares de produção embrionária quando comparadas à utilização de células controle. O conhecimento da contribuição de cada fator utilizado na reprogramação induzida, aliado a estudos de comparação com a capacidade de desenvolvimento in vitro de organismos derivados de células reprogramadas deverá contribuir para o aumento da eficiência da clonagem e produção animal in vitro como para a medicina regenerativa. / Nuclear transfer and induced reprogramming are technologies usually used for the induction of somatic cells into an embryonic-like pluripotent status. The knowledgment of nuclear reprogramming process is highly desirable, leading to important contributions for both basic and applied sciences; for example, resulting in the increase in the efficiency of several animal biotechnologies, or else enabling autologous cellular therapy for medical purposes. However, basic studies are still needed in order to enable such applications, once the mechanisms controlling in vitro reprogramming are yet to be unraveled. This study aims to generate induced pluripotent bovine stem cells through direct reprogramming and its use in nuclear transfer in order to enhance the cellular reprogramming efficiency, For that, the potential of pluripotency induction and maintenance was analyzed in bovine somatic cells, comparing those with human and equine cells, as well as the potential of embryonic development after combining direct and nuclear reprogramming. iPS cells derived in this study were produced trought lentivirus transduction of mouse transcription factors (OSKM), further characterized and used as nuclei donors for cloning. In summary, bovine oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries, in vitro matured for 18h, enucleated and reconstructed with iPS cells (n=203) or fetal fibroblasts (bFF, n=153), in five replicates. Embryos were reconstructed, chemically activated with ionomycin and 6-DMAP and cultured in vitro until blastocyst stage. Fusion, cleavage (48h post activation) and blastocyst developmental rates (192h post activation) were analyzed and result submitted to Chi-square test at 5% significance. biPS enabled embryo production, however further optimization on cell cycle synchronization still needs to be accomplished. No difference was observed between groups regarding cleavage or blastocyst developmental rates, however iPS group presented a reduced fusion rate when compared to control. For a better understanding on how reprogramming associated transcription factors could influence on nuclear reprogramming, bFF expressing human OCT4 (hOCT4) or hSOX2 combined with the fluorescent protein reporters vexGFP and mCitrine, respectively, were submitted to flow citometry cell sorting and used as nuclei donors. bFF expressing OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicate), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicate) or control cells (non transduced, n=178 and n=149, in quadruplicate for OCT4 and SOX2, respectively) were used. No difference was observed between groups regarding the in vitro developmental potential rates. In conclusion, the present study reports the generation of reprogrammed bovine cells, and its use the nuclear transfer. Donor cells expressing hOCT4, hSOX2 or reprogrammed cells resulted in similar developmental in vitro rates when compared to controls. The knowledge of each reprogramming factor influence on in vitro reprogramming, together with comparison studies on in vitro developmental potential of organisms derived from reprogrammed cells should help enhancing not only the cloning efficiency and in vitro animal production, but also the regenerative medicine.

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear e extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga. Uma série de estudos, porem, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Esta proposta teve como objetivo gerar células bovinas pluripotentes através da reprogramação direta e utilizá-las na transferência de núcleo para a produção animal visando o aumento da eficiência da reprogramação celular. Para tal, foi analisada a capacidade de indução e manutenção da pluripotência em células somáticas bovinas comparando-as com células humanas e equinas (células pluripotentes induzidas - iPSC), assim como a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos através da combinação das técnicas em bovinos. As células iPS derivadas neste estudo foram produzidas mediante transdução lentiviral de fatores de transcrição (OSKM) murinos, caracterizadas e utilizadas como doadoras de núcleo na clonagem. Resumidamente, oócitos bovinos obtidos de ovários provenientes de abatedouros foram maturados in vitro por 18h, enucleados e reconstruídos com células iPS (n=203 ou fibroblastos fetais bovinos (bFF, n=153), em cinco repetições. Após reconstrução os embriões foram ativados com ionomicina e 6-DMAP e cultivados in vitro até o estágio de blastocisto. Foram avaliadas as taxas de fusão, clivagem (48h após ativação) e desenvolvimento a blastocisto (192h após ativação) e os resultados foram submetidos ao teste de Qui-quadrado a 5% de significância. Foi possível a produção de embriões a partir de biPS, entretanto, este estudo evidenciou a necessidade de otimização da sincronização do ciclo celular em células iPS. Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à capacidade de produção a blastocisto ou clivagem, porém o grupo reconstruído com células iPS apresentou uma menor taxa de fusão. Com a finalidade de entender a influência de fatores de transcrição específicos na reprogramação nuclear, bFF expressando OCT4 humano (hOCT4) e hSOX2 combinados com as proteínas repórteres fluorescentes vexGFP e mCitrine, respectivamente, foram submetidas à separação celular por citometria de fluxo e utilizados como doadores de núcleo. Foram utilizados bFF expressando OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicata), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicata) ou células controle (não transduzidas, n=178 e n=149, em quadruplicata para grupos OCT4 e SOX2, respectivamente). Não foram encontradas diferenças entre os grupos nas características de capacidade de desenvolvimento in vitro estudadas. Em conclusão, este estudo relata a possibilidade de produção de células bovinas reprogramadas, além de também mostrar que a transferência de núcleo utilizando células expressando hSOX2 ou hOCT4, ou já reprogramadas, resulta em taxas similares de produção embrionária quando comparadas à utilização de células controle. O conhecimento da contribuição de cada fator utilizado na reprogramação induzida, aliado a estudos de comparação com a capacidade de desenvolvimento in vitro de organismos derivados de células reprogramadas deverá contribuir para o aumento da eficiência da clonagem e produção animal in vitro como para a medicina regenerativa. / Nuclear transfer and induced reprogramming are technologies usually used for the induction of somatic cells into an embryonic-like pluripotent status. The knowledgment of nuclear reprogramming process is highly desirable, leading to important contributions for both basic and applied sciences; for example, resulting in the increase in the efficiency of several animal biotechnologies, or else enabling autologous cellular therapy for medical purposes. However, basic studies are still needed in order to enable such applications, once the mechanisms controlling in vitro reprogramming are yet to be unraveled. This study aims to generate induced pluripotent bovine stem cells through direct reprogramming and its use in nuclear transfer in order to enhance the cellular reprogramming efficiency, For that, the potential of pluripotency induction and maintenance was analyzed in bovine somatic cells, comparing those with human and equine cells, as well as the potential of embryonic development after combining direct and nuclear reprogramming. iPS cells derived in this study were produced trought lentivirus transduction of mouse transcription factors (OSKM), further characterized and used as nuclei donors for cloning. In summary, bovine oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries, in vitro matured for 18h, enucleated and reconstructed with iPS cells (n=203) or fetal fibroblasts (bFF, n=153), in five replicates. Embryos were reconstructed, chemically activated with ionomycin and 6-DMAP and cultured in vitro until blastocyst stage. Fusion, cleavage (48h post activation) and blastocyst developmental rates (192h post activation) were analyzed and result submitted to Chi-square test at 5% significance. biPS enabled embryo production, however further optimization on cell cycle synchronization still needs to be accomplished. No difference was observed between groups regarding cleavage or blastocyst developmental rates, however iPS group presented a reduced fusion rate when compared to control. For a better understanding on how reprogramming associated transcription factors could influence on nuclear reprogramming, bFF expressing human OCT4 (hOCT4) or hSOX2 combined with the fluorescent protein reporters vexGFP and mCitrine, respectively, were submitted to flow citometry cell sorting and used as nuclei donors. bFF expressing OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicate), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicate) or control cells (non transduced, n=178 and n=149, in quadruplicate for OCT4 and SOX2, respectively) were used. No difference was observed between groups regarding the in vitro developmental potential rates. In conclusion, the present study reports the generation of reprogrammed bovine cells, and its use the nuclear transfer. Donor cells expressing hOCT4, hSOX2 or reprogrammed cells resulted in similar developmental in vitro rates when compared to controls. The knowledge of each reprogramming factor influence on in vitro reprogramming, together with comparison studies on in vitro developmental potential of organisms derived from reprogrammed cells should help enhancing not only the cloning efficiency and in vitro animal production, but also the regenerative medicine.

Les microglies sont les cellules immunitaires du système nerveux central. Elles sont essentielles pour son bon fonctionnement et son homéostasie. Avec l’âge, elles adoptent une morphologie dystrophique accompagnée d’un dérèglement de leurs fonctions homéostatiques. Le dysfonctionnement microglial associé au vieillissement est soupçonné de contribuer à la progression de maladies neurodégénératives. Cependant, la cause de ces changements phénotypiques est peu connue, d’autant plus chez l’humain compte tenu du manque d’accessibilité des microglies humaines âgées vivantes pour le travail moléculaire in vitro. Les travaux présentés dans ce mémoire visent donc le développement d’un modèle cellulaire qui permettrait d’étudier l’impact du vieillissement cellulaire sur la microglie humaine. Dans ce mémoire, nous formulons l’hypothèse que l’induction chimique de la sénescence dans les microglies humaines induira rapidement des caractéristiques associées au vieillissement cellulaire alors que la reprogrammation microgliale directe à partir de cellules de peau d’individus âgés maintiendra la signature associée au vieillissement cellulaire de manière physiologique. Les résultats démontrent que les microglies dans lesquelles la sénescence est chimiquement induite présentent des caractéristiques phénotypiques de vieillissement cellulaire et un dérèglement de leurs fonctions homéostatiques. De plus, les produits cellulaires obtenus par la reprogrammation microgliale directe adoptent plusieurs caractéristiques clés de la microglie, mais certaines conditions de reprogrammation directe doivent encore être déterminées afin d’obtenir un produit cellulaire authentique. Ces techniques fourniront une source renouvelable de microglies humaines âgées pouvant être dérivée de patients, afin d’étudier l’impact du vieillissement sur leurs fonctions physiologiques et sur leur interaction avec les cellules du cerveau dans les maladies neurodégénératives. / Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS). They are essential for brain functioning and cerebral homeostasis. With age, they adopt a dystrophic morphology and a disruption of their homeostatic functions occurs. Microglial dysfunction associated with aging is believed to contribute to the progression of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. However, how aging confers to microglia this change in phenotype is still unknown, especially in human given the lack of accessibility of live human aged microglia for in vitro molecular work. As such, the work presented in this Master’s thesis aims the development of a cellular model in which the effect of aging on microglial function can be studied in human microglia. In this paper, we formulate the hypothesis that chemical induction of senescence in human microglia rapidly induces phenotypic characteristics of cellular aging, whereas direct microglial reprogramming from fibroblasts of elderly individuals will maintain the aging signature following cellular conversion. The results obtained show that microglia in which senescence is chemically induced show phenotypic characteristics of cellular aging as well as disruption of their homeostatic functions. On the other hand, cellular product obtained from microglial reprogramming adopt several key features of human microglia, but some direct microglial reprogramming conditions still need to be determined in order to obtain a cell product closely resembling human microglia. These two methods will provide a renewable source of patient-derived aged microglia to study the impact of aging on their physiological functions and on their interaction with other CNS cells in neurodegenerative diseases.

Les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) régulent une multitude de processus cellulaires, incluant la prolifération, la survie et la différenciation. Ces kinases représentent l’élément terminal de la voie ERK/MAPK, laquelle est activée dans près de 30% de tous les cancers humains et donc généralement perçue comme étant un effecteur critique de la progression tumorale. Cependant, une accumulation d’observations suggèrent que les kinases ERK pourraient également induire la suppression tumorale. Le but premier de cette thèse est de démontrer comment la signalisation par ERK peut contribuer à la suppression tumorale et de concilier les mécanismes impliqués avec son rôle dans la progression du cancer. Puisque nos travaux ont une incidence sur les bénéfices attendus de certaines thérapies actuellement en développement, le deuxième objectif de la thèse est de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre le cancer. Nous avons démontré qu’une hyperactivation des kinases ERK induit la sénescence cellulaire. Le mécanisme implique la dégradation sélective et dépendante du protéasome de nombreuses protéines, ce que nous avons nommé le SAPD (Senescence-Associated Protein Degradation). Ce processus cible des protéines requises pour différentes fonctions cellulaires, incluant la progression du cycle cellulaire, les fonctions mitochondriales et la biogenèse des ribosomes. Ensuite, nos résultats montrent qu’en plus d’inhiber l’établissement de la sénescence, une diminution de la signalisation par les kinases ERK favorise la reprogrammation cellulaire, laquelle permet aux cellules précancéreuses de développer leur tumorigénicité et aux cellules cancéreuses d’acquérir des propriétés attribuables aux cellules souches. Ces observations suggèrent que les mécanismes qui inhibent la voie ERK/MAPK pourraient favoriser l’initiation du cancer, la formation de métastases et la résistance à diverses thérapies. Enfin, nous avons démontré que la metformine, utilisée pour le traitement du diabète, inhibe le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier joue un rôle central dans la reprogrammation cellulaire et dans la production de cytokines pro-inflammatoires nocives par les cellules sénescentes. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la metformine pourrait être utilisée en combinaison avec certaines thérapies afin d’éviter les effets secondaires tant d’une inhibition des kinases ERK que d’une hyperactivation. Globalement, les résultats présentés démontrent que l’effet de la voie ERK/MAPK dépend de la force de son activation. Alors qu’une activation modérée peut contribuer à la prolifération de la plupart des cellules, une forte activation induit la sénescence tandis qu’au contraire, une faible activation favorise la reprogrammation des cellules cancéreuses et donc une augmentation de l’agressivité de la tumeur. Cette polyvalence de la voie suggère une certaine prudence face à l’usage des inhibiteurs de la voie ERK/MAPK. Cependant, elle nous motive à travailler au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, lesquelles pourraient inclure la metformine. / The Extracellular Signal-Regulated Kinases (ERK1/2) regulate multiple cellular processes such as proliferation, survival and differentiation. These kinases are the last component of the ERK/MAPK pathway, which is activated in about 30% of all human cancers. Therefore, current thinking proposes that the ERK/MAPK pathway is a critical mediator of tumor progression. However, a steadily growing number of observations suggest that ERK kinases could trigger tumor suppression as well. The first aim of this thesis is to determine how ERK signaling triggers tumor suppression and to try to reconcile these mechanisms with its putative contribution to tumor progression. Since our work has a profound impact on the value of some therapies currently in development, the second aim of the thesis is to propose new strategies to fight cancer. We found that hyperactivation of the ERK kinases induces cellular senescence. Mechanistically, this involves selective proteasome-dependent protein degradation. This “Senescence-Associated Protein Degradation” (SAPD) targets proteins required for several cellular functions, including cell cycle progression, mitochondrial functions and ribosome biogenesis. Furthermore, our results showed that downregulation of ERK signaling not only inhibits the establishment of senescence but promotes cellular reprogramming, thereby allowing precancerous cells to gain tumorigenicity and cancer cells to acquire stem cell-like properties. These results suggest that mechanisms downregulating the ERK/MAPK pathway could promote cancer initiation, metastasis and resistance to multiple therapies. Finally, we demonstrated that the antidiabetic drug metformin targets the transcription factor NF-kB. The latter plays a central role in reprogramming, but also in the generation of deleterious pro-inflammatory cytokines by senescent cells. Hence, we suggest that metformin could be used in combination with other therapies to avoid the side effects of either downregulating or overactivating ERK signaling. Taken together, the results presented in this thesis demonstrate that the outcome of the ERK/MAPK pathway activity depends on signaling strength. While a moderate activation of the pathway may contribute to cell proliferation, a strong activation induces senescence and, conversely, a low activation promotes cancer cell reprogramming. This versatility of the pathway suggests caution with the use of ERK/MAPK pathway inhibitors, but motivates us to develop new therapeutic strategies, which could include metformin.

As doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade a nível mundial. Desde o conhecimento da importância da mitocôndria no metabolismo do cardiomiócito, alterações no funcionamento desta organela têm sido associadas a um dos principais causadores do infarto do miocárdio e consequente morte celular. O cofator de transcrição PGC-1alfa tem sido alvo de diversos estudos relacionados com o metabolismo celular devido à sua forte participação na biogênese mitocondrial. Considerando a limitação de material biológico para o estudo de doenças cardíacas, muito se tem investido no estudo de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Esta tese teve como principal objetivo a avaliação dos efeitos da variação da expressão de PGC-1alfa em iPSCs e na sua diferenciação em cardiomiócitos. Após estabelecimento de um protocolo de reprogramação celular, em que ocorre geração de iPSCs a partir de fibroblastos humanos, induzimos a inibição da expressão de PGC-1alfa em 50% e 70% pelo uso de vetores lentivirais, e analisamos o estado de pluripotência através da avaliação de expressão genica e proteica dos principais marcadores - SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA-1-81. Não observamos diferenças significativas no conteúdo destes marcadores entre os clones de iPSC controle e inibidos. Estabelecemos um protocolo de diferenciação de iPSCs em cardiomiócitos com elevada taxa de reprodutibilidade, através da adaptação de protocolos descritos na literatura, e submetemos estas iPSCs à diferenciação. As células geradas pela diferenciação do clone controle apresentaram características típicas de cardiomiócito: contratilidade e alta expressão molecular de troponina T e troponina I. Em contraste, as células com 70% de inibição de PGC-1alfa se mostraram incapazes de contrair e com baixa expressão de troponina. Através de uma análise dos níveis de expressão genica e proteica de diversos marcadores expressos durante o processo de diferenciação (T, NKX2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), observamos que o clone com maior inibição de PGC-1alfa apresentou sempre níveis de expressão diminuídos em relação aos clones controle. Em conclusão, podemos afirmar que o PGC-1alfa não interfere com as características de auto-renovação e pluripotência das iPSCs mas possui um papel essencial na diferenciação de células-tronco pluriotentes induzidas em cardiomiócitos. Os resultados obtidos contribuem para informações preliminares acerca do desenvolvimento de iPSCs com inibição da expressão de PGC-1alfa durante a diferenciação cardíaca, mas estudos relativos ao potencial papel deste cofator durante o desenvolvimento cardíaco in vivo ainda precisam ser aprofundados, utilizando outros modelos de estudo / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Since the knowledge of the importance of mitochondria in the cardiomyocyte metabolism, changes in the functioning of this organelle has been associated with one of the main causes of myocardial infarction and subsequent cell death. The transcriptional cofactor PGC-1alpha has been subjected to several studies related to cell metabolism due to its strong involvement in mitochondrial biogenesis. Considering the limitations of biological material in the study of heart disease, there has been a lot of investment in the study of induced pluripotent stem cells (iPSCs). The main objective of this thesis was to evaluate the effects of the variation in expression of PGC-1alpha in iPSCs and it\'s differentiation in cardiomyocytes. After the estabilshment of a cellular reprogramming protocol, where iPSCs is generated from human fibroblasts, the expression of PGC-1alpha was induced by 50% and 70% with the use of lentiviral vectors and the state of pluripotency was determined by analyzing the gene and protein expression of the main markers - SSEA4, TRA- 1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA- 1- 81. There were no significant differences observed in the content of these markers between the iPSC clones control and inhibited. A protocol for the differentiation of iPSCs into cardyomyocites was established with a high reproducibility rate, by adapting existing protocols in the general literature, submiting these iPSCs into diferentiation. The cells generated from the differentiation of the control clone showed typical characteristis of cardiomyocytes: contractility and high molecular expression of troponin T and troponin I. In contrast, the cells with 70% inhibition PGC-1alpha were unable to contract and had low troponin expression. Through an analysis of gene expression and protein levels of several markers expressed during the differentiation process (T, Nkx2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), the clone with greater inhibition of PGC-1alpha always showed decreased expression levels compared to control clones. In conclusion, we can say that the PGC-1alpha does not interfere with the characteristics of self-renewal and pluripotency of iPSCs but has an essential role in the differentiation of pluripotent stem cells induced into cardiomyocytes. These results were obtained thanks an original approche based on iPSC technology enabling genetic modifications of the cells and controled differentiation into cardiomyocytes, but the potential role of PGC-1alpha on in vivo cardiac development or cardiomyocytes maturation remaisn to be evaluated using other models

As doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade a nível mundial. Desde o conhecimento da importância da mitocôndria no metabolismo do cardiomiócito, alterações no funcionamento desta organela têm sido associadas a um dos principais causadores do infarto do miocárdio e consequente morte celular. O cofator de transcrição PGC-1alfa tem sido alvo de diversos estudos relacionados com o metabolismo celular devido à sua forte participação na biogênese mitocondrial. Considerando a limitação de material biológico para o estudo de doenças cardíacas, muito se tem investido no estudo de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Esta tese teve como principal objetivo a avaliação dos efeitos da variação da expressão de PGC-1alfa em iPSCs e na sua diferenciação em cardiomiócitos. Após estabelecimento de um protocolo de reprogramação celular, em que ocorre geração de iPSCs a partir de fibroblastos humanos, induzimos a inibição da expressão de PGC-1alfa em 50% e 70% pelo uso de vetores lentivirais, e analisamos o estado de pluripotência através da avaliação de expressão genica e proteica dos principais marcadores - SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA-1-81. Não observamos diferenças significativas no conteúdo destes marcadores entre os clones de iPSC controle e inibidos. Estabelecemos um protocolo de diferenciação de iPSCs em cardiomiócitos com elevada taxa de reprodutibilidade, através da adaptação de protocolos descritos na literatura, e submetemos estas iPSCs à diferenciação. As células geradas pela diferenciação do clone controle apresentaram características típicas de cardiomiócito: contratilidade e alta expressão molecular de troponina T e troponina I. Em contraste, as células com 70% de inibição de PGC-1alfa se mostraram incapazes de contrair e com baixa expressão de troponina. Através de uma análise dos níveis de expressão genica e proteica de diversos marcadores expressos durante o processo de diferenciação (T, NKX2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), observamos que o clone com maior inibição de PGC-1alfa apresentou sempre níveis de expressão diminuídos em relação aos clones controle. Em conclusão, podemos afirmar que o PGC-1alfa não interfere com as características de auto-renovação e pluripotência das iPSCs mas possui um papel essencial na diferenciação de células-tronco pluriotentes induzidas em cardiomiócitos. Os resultados obtidos contribuem para informações preliminares acerca do desenvolvimento de iPSCs com inibição da expressão de PGC-1alfa durante a diferenciação cardíaca, mas estudos relativos ao potencial papel deste cofator durante o desenvolvimento cardíaco in vivo ainda precisam ser aprofundados, utilizando outros modelos de estudo / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Since the knowledge of the importance of mitochondria in the cardiomyocyte metabolism, changes in the functioning of this organelle has been associated with one of the main causes of myocardial infarction and subsequent cell death. The transcriptional cofactor PGC-1alpha has been subjected to several studies related to cell metabolism due to its strong involvement in mitochondrial biogenesis. Considering the limitations of biological material in the study of heart disease, there has been a lot of investment in the study of induced pluripotent stem cells (iPSCs). The main objective of this thesis was to evaluate the effects of the variation in expression of PGC-1alpha in iPSCs and it\'s differentiation in cardiomyocytes. After the estabilshment of a cellular reprogramming protocol, where iPSCs is generated from human fibroblasts, the expression of PGC-1alpha was induced by 50% and 70% with the use of lentiviral vectors and the state of pluripotency was determined by analyzing the gene and protein expression of the main markers - SSEA4, TRA- 1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA- 1- 81. There were no significant differences observed in the content of these markers between the iPSC clones control and inhibited. A protocol for the differentiation of iPSCs into cardyomyocites was established with a high reproducibility rate, by adapting existing protocols in the general literature, submiting these iPSCs into diferentiation. The cells generated from the differentiation of the control clone showed typical characteristis of cardiomyocytes: contractility and high molecular expression of troponin T and troponin I. In contrast, the cells with 70% inhibition PGC-1alpha were unable to contract and had low troponin expression. Through an analysis of gene expression and protein levels of several markers expressed during the differentiation process (T, Nkx2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), the clone with greater inhibition of PGC-1alpha always showed decreased expression levels compared to control clones. In conclusion, we can say that the PGC-1alpha does not interfere with the characteristics of self-renewal and pluripotency of iPSCs but has an essential role in the differentiation of pluripotent stem cells induced into cardiomyocytes. These results were obtained thanks an original approche based on iPSC technology enabling genetic modifications of the cells and controled differentiation into cardiomyocytes, but the potential role of PGC-1alpha on in vivo cardiac development or cardiomyocytes maturation remaisn to be evaluated using other models

A cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito (CAVD) tem origem genética e é caracterizada pela substituição de células miocárdicas por tecido fibroadiposo. A doença tem uma prevalência aproximada de 1:3500, sendo mais frequentemente diagnosticada em indivíduos jovens, atletas e do sexo masculino. Atualmente, várias alterações genéticas associadas a CAVD foram descritas em 12 genes diferentes. No entanto, existem poucos estudos na literatura que descrevem o espectro mutacional da doença usando um painel abrangente de genes potencialmente causais, em populações diferentes das coortes descendentes de europeus. O sequenciamento de nova geração (NGS) como ferramenta para o diagnóstico molecular da doença, permite um avanço na correlação entre alterações genotípicas e fenotípicas e tem aportado potenciais benefícios que crescem juntamente com os desafios na sua interpretação. Além disso, o uso de hiPSCs como modelo in vitro de determinadas doenças cardíacas, permite avaliar especificamente a relação do genótipo com as diferentes consequências fenotípicas celulares da CAVD. Entretanto, os mecanismos moleculares da doença ainda são pouco esclarecidos e não há na literatura estudos que englobem ao mesmo tempo o perfil mutacional (com um painel extenso de genes) e estudo funcional das alterações encontradas com o uso de hiPSC-CMs. Esta tese teve como objetivo descrever a prevalência de variantes causais em genes associados à CAVD na população brasileira, e caracterizar, do ponto de vista funcional, os cardiomiócitos derivados de hiPSC (hiPSC-CMs) de pacientes com mutações identificadas, a fim de associar o perfil mutacional e a expressão fenotípica celular. Quarenta e sete indivíduos, não aparentados, sendo 38 (80,85%) pacientes do sexo masculino, idade média 40,2 ± 15,56 anos, com diagnóstico clínico de CAVD, foram submetidos ao sequenciamento de um painel genético relacionado à cardiomiopatias hereditárias, compreendendo os 12 genes previamente descritos como causadores de CAVD, utilizando sequenciamento de nova geração (NGS). As variantes foram interpretadas e classificadas de acordo com os critérios da ACMG. Variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas foram encontradas em dezoito probandos (38,3%), com maior número de ocorrências no gene PKP2 (38,8%). Entre os 18 casos positivos, treze variantes diferentes foram encontradas, quatro delas novas variantes em genes desmossomais, sem descrição prévia na literatura. Variantes de significado incerto (VSI) foram encontradas em 16 pacientes. A presença de uma variante causal ocorreu em todos os probandos assintomáticos e foi significativamente associada a probandos com histórico familiar de morte súbita cardíaca abaixo de 35 anos. Para a modelagem celular da CAVD, foram geradas hiPSCs de dois pacientes a partir de células progenitoras de urina (UPCs) e fibroblastos, por transfecção episomal. O primeiro paciente possuía alteração missense no gene PKP2 e o segundo, uma inserção no gene DSC2. As hiPSCs foram caracterizadas quanto ao seu potencial de pluripotência e posteriormente diferenciadas em cardiomiócitos (hiPSC-CMs). Nossos resultados demonstraram diferenças fenotípicas significativas entre os CAVD-CMs comparados com os controle-CMs, como: reduções significativas de expressão das proteínas desmossomais e desmossomos estruturalmente alterados; presença de marcadores do acúmulo de gotículas lipídicas e regulação aumentada do fator de transcrição proadipogênico PPAR-gama; aumento de duração do potencial de campo (FPD) e do potencial de ação em 90% de repolarização (APD90); velocidade de condução mais lenta e uma força de contração menor. Em conclusão, este é o primeiro trabalho a caracterizar o perfil genético da CAVD, abrangendo todos os genes descritos até o momento relacionados à doença, na população brasileira. Os dados obtidos neste trabalho sugerem que, pacientes com história familiar de MSC ( < 35 anos) têm maior probabilidade de portar uma variante causal. Além disso, nossos achados sugerem que pacientes com alteração causal no gene PKP2 têm uma maior gravidade da apresentação fenotípica de arritmia. Nosso modelo celular, que contemplou células paciente-específicas com diferentes alterações das estudadas até o presente momento,sugere ser possível o estudo do efeito das alterações genéticas na CAVD e pode ser um acréscimo às ferramentas disponíveis para estudar o mecanismo desta doença complexa / Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) has a genetic origin and is mainly characterized by the replacement of myocardial cells with fibroadipose tissue. The disease has a prevalence of approximately 1: 3.500, being more frequently diagnosed in young individuals, athletes and males. Currently, several mutations associated with ARVC have been described in 12 different genes. However, there are few studies in the literature that describe the mutational spectrum of the disease using a comprehensive panel of potentially causal genes in populations other than European-descent cohorts. Next Generation Sequencing (NGS) as a tool for molecular diagnosis of the disease allows an advance in the correlation between genotypic and clinical phenotypic aspects and has potential benefits that grow along with the challenges in its interpretation. In addition, the use of hiPSCs as an in vitro model of certain heart diseases, allows to specifically evaluate the relationship of the genotype with the different cellular phenotypic consequences of ARVC. However, the molecular mechanisms of the disease are still poorly understood and there are no studies in the literature that include both the mutational profile (with an extensive panel of genes) and functional study of different causal variants, with the use of hiPSC-CMs. The aim of this thesis was to describe the prevalence of causal variants in ARVC-associated genes in the Brazilian population, and to characterize, from a functional point of view, cardiomyocytes derived from hiPSC (hiPSC-CMs) from patients with identified mutations, in order to associate the mutational profile and cellular phenotypic expression. Forty-seven unrelated probands, 38 (80.85%) male, mean age 40.2 ± 15.56 years, with clinical diagnosis of ARVC, were submitted to a cardiomyopathy-related gene panel sequencing, comprising 12 genes, using next-generation sequencing (NGS). Variants were interpreted and classified according to the ACMG criteria. Pathogenic or Likely Pathogenic variants were found in eighteen probands (38.3%), with the largest number of occurrences in the PKP2 gene (38.8%). Among the 18 positive cases, thirteen different variants were found, four of them novel mutations in desmosomal genes, without previous description in the literature. Variants of uncertain significance (VUS) were found in 16 patients. The presence of a causal variant was present in all asymptomatic probands and was significantly associated with probands who have a family history of sudden cardiac death under 35 years. For the cellular modeling, from urinary progenitor cells (UPCs) and fibroblasts, hiPSCs from two patients were generated by episomal transfection. The first patient had a missense variant in the PKP2 gene, while the second had an insertion in the DSC2 gene. The hiPSCs were characterized for its pluripotency potential and subsequently differentiated into cardiomyocytes (hiPSC-CMs). Our results demonstrated significant phenotypic differences between the ARVC-CMs compared to the control-CMs, such as: significant reductions in the expression of desmosomal proteins and structurally altered desmosomes; presence of lipid droplet accumulation markers and increased regulation of the proadipogenic transcription factor PPAR-gamma; prolonged field potential duration (FPD) and action potential in 90% repolarization (APD90); slower conduction velocity and a lower active contraction force. In conclusion, this is the first work to characterize the genetic profile of ARVC, covering all genes described to date related to the disease, in the Brazilian population. The data obtained in this study suggests that patients with a family history of sudden cardiac death ( < 35 years) are more likely to carry a causal variant. In addition, our findings suggest that patients with causal variant in the PKP2 gene have a greater severity of the phenotypic presentation of arrhythmia. Our cellular model, which contemplated patient-specific cells with different causal variants of the previous studies, suggests that it is possible to study the effect of the genetic changes in ARVC, and may be an addition to the tools available to study the mechanism of this complex disease