Em S. cerevisiae, as proteínas de membrana são responsáveis pelo transporte de açúcares através da membrana celular e, portanto, são importantes para os processos fermentativos. Visando melhorar a compreensão do metabolismo de açúcares, estudamos o transporte ativo de açúcares mediado pela permease Agt1p e o processo de inativação catabólica, promovido pela glicose. Para isso, mutantes em resíduos específicos do Agt1p foram gerados por mutagênese e expressados em uma linhagem agt1<font face=\"Symbol\">D. Os resultados obtidos indicam que os aminoácidos Glu-120, Asp-123, Glu-167, Arg-504 e Ile-505 estão envolvidos com o simporte açúcar-H+ realizado pelo Agt1p. Em relação aos resíduos e/ou domínios envolvidos com o processo de inativação catabólica, os resultados demonstram que a região N-terminal do Agt1p, bem como a alça citoplasmática presente entre os TMs 6 e 7, são essenciais para a resposta celular frente a presença de glicose. Finalmente, a fusão do Agt1p com GST permitiu purificar uma proteína de ~67 kDa, condizente com a massa molecular prevista para este transportador. / In S. cerevisiae, membrane proteins are responsible for the transport of different sugars across the cellular membrane and, therefore, are important for fermentation processes. In order to improve our understanding of sugar metabolism, we studied the active sugar transport mediated by Agt1p permease and the catabolite inactivation induced by glucose. Thus, mutants in specific residues of the Agt1p were generated by site direct mutagenesis and expressed in a strain agt1<font face=\"Symbol\">D. The results indicate that the Glu-120, Asp-123, Glu-167, Arg-504 and Ile-505 residues are involved in the sugar-H+ symport mediated by the Agt1p permease. Regarding residues and/or domains involved in the process of catabolite inactivation promoted by glucose, the results indicate that the N-terminal region of Agt1p, and the intracellular loop between TMs 6 and 7, are essential for the cellular response to the presence of glucose. Finally, the fusion of the Agt1p to GST allowed the purification of a ~67 kDa protein, consistent with the predicted molecular weight of this transporter.

Quitosana é um polissacarídeo usado em diversas aplicações biológicas, por exemplo, em liberação controlada de drogas, transfecção, aceleração da cicatrização de feridas e como agente bactericida, entre outras. Em todas essas aplicações, o polímero interage com tecidos e células. Entretanto, embora sua ação seja comprovada, os mecanismos de ação e a interação do polímero com células e biomembranas no nível molecular ainda não são conhecidos. Nesta tese de doutorado, filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett (LB) de lipídios foram usados como modelos de membrana celular para estudar em nanoescala a interação e os efeitos causados pela quitosana. Primeiramente, observou-se que a quitosana, um polieletrólito solúvel em pH ácidos, possui atividade superficial induzida na presença de um filme interfacial de lipídio, demonstrando que o polímero possui interação favorável com membranas. Após adsorver sobre as monocamadas, a quitosana expande as mesmas, o que ocorre apenas até uma determinada concentração de polímero, denominada concentração de saturação. A magnitude dessa expansão é menor para filmes compactos, o que sugere que a quitosana é parcialmente expulsa da interface, localizando-se na subsuperfície. Isso foi comprovado com o uso de filmes LB, que mostraram que filmes mistos com quitosana têm rugosidade cerca de 10 vezes a de filmes puros de ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA). Foi possível confirmar que a quitosana penetra na monocamada, formando agregados com até 150 nm de altura. Além disso, a maior orientação das moléculas de fosfolipídios, sugerida por isotermas de potencial de superfície (V-A) para filmes de Langmuir, também foi comprovada para os filmes LB por medidas de espectroscopia de geração de soma de freqüências (SFG). Filmes mistos de DMPA e colesterol também foram estudados, sendo que o colesterol provoca condensação nos filmes de DMPA a baixas pressões, mas expande as monocamadas em altos estágios de compactação. Quando a quitosana interage com os filmes mistos, ela provoca a mesma expansão para todas as monocamadas independentemente da proporção de colesterol na mistura. Embora esse comportamento possa sugerir um papel inerte do colesterol, ele é explicado pela modulação da penetração da quitosana nos filmes pelo colesterol. Isso ocorre porque há um número fixo de pontos de interações eletrostáticas entre os grupos NH3+ da quitosana e PO2- do DMPA, o que foi comprovado por medidas de espectroscopia de reflexão-absorção na região do infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Com esta técnica para filmes de Langmuir, e espectroscopia SFG para filmes LB, pôde ser traçado um panorama dos efeitos da inserção de colesterol na membrana de DMPA, seguido da interação da quitosana com a membrana mista. A adição do colesterol ao filme de fosfolipídio acarreta em diminuição da ordem das cadeias de DMPA, detectado por variações nas bandas de s(CH2) e ass(PO2-) do fosfolipídio no espectro de PM-IRRAS, e pela razão s(CH3)/s(CH2) nos espectros de SFG. Por outro lado, a interação da quitosana com esse filme misto causa recuperação da orientação das caudas polares do fosfolipídio, verificada pela análise das mesmas bandas de PM-IRRAS e pela razão s(CH3)/s(CH2), que diminui de 6,62 para 4,58 com a adição de colesterol, mas volta a 5,97 após a interação com o polímero. De forma geral, a ação da quitosana sobre biomembranas é governada principalmente por interações eletrostáticas com lipídios carregados negativamente, na superfície externa das mesmas. Dentre os principais efeitos causados pelo polímero, destaca-se a diminuição da elasticidade da membrana e o aumento da orientação das moléculas de lipídio, que podem ter importantes implicações biológicas. A observação de uma concentração de saturação dos efeitos, na maioria dos casos, sugere que a dosagem e a estrutura química da quitosana devem ser bem controladas para alcançar o efeito biológico desejado. / Chitosan is a polyssaccharide with many biological applications, as in drug delivery, transfection, wound healing and as bactericidal agent, for instance. In all these applications the polymer interacts with tissues and cells. The efficacy of chitosan has been proven, but the mechanisms of action and the interactions with cells and biomembranes are still unknown. In this thesis, Langmuir and Langmuir-Blodgett (LB) films made of lipids were employed as cell membrane models, in order to investigate the interactions and modulations caused by chitosan at the molecular level. Firstly, the soluble polyelectrolyte chitosan was found to induce surface activity when a lipid monolayer is at the air/water interface, demonstrating that the interaction of chitosan with membranes is favorable. Upon chitosan adsorption, the monolayers were increasingly expanded with increasing chitosan concentration in the subphase up to a saturation concentration. The extension of this expansion was lower for highly packed films, suggesting that chitosan was partially expelled from the interface after the compression, being located at the sub-monolayer region. This was confirmed by the 10-fold increase in film roughness observed for the areas without aggregates in LB films. Also, we could observe aggregates as high as 150 nm on the film surface, thus confirming chitosan penetration in the dimyristoyl phosphatidic acid (DMPA) monolayer. Mixed DMPA-cholesterol Langmuir monolayers were also produced, with cholesterol inducing condensation of the DMPA films at low pressures, and film expansion at high pressures. Regardless of the cholesterol proportion in the film, chitosan always induced the same degree of expansion on the DMPA mixed monolayers as for a neat DMPA monolayer. Although this behaviour may suggest an inert role for cholesterol, it can only be explained if the sterol is assumed to regulate the extension of chitosan penetration into the monolayer. This occurs because there is a fixed number of sites for electrostatic interactions between NH3+ groups from chitosan and PO2- from DMPA, probed by infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS) measurements. Indeed, with PM-IRRAS measurements for Langmuir monolayers and sum-frequency generation spectroscopy (SFG) measurements for LB films, we could establish an overview of the effects from cholesterol on DMPA films upon interaction with chitosan. The addition of cholesterol to the DMPA monolayer caused a decrease in the chain order, which was detected by changes in the s(CH2) and ass(PO2-) bands from the phospholipid in the PM-IRRAS spectrum, and by the s(CH3)/s(CH2) intensity ratio in SFG measurements. On the other hand, the interaction of chitosan with these mixed monolayers restored chain order, as observed from the analysis of PM-IRRAS bands and the s(CH3)/s(CH2) in SFG. The latter dropped from 6.62 to 4.58 with cholesterol addition, but further increased to 5.97 with the chitosan interaction. Overall, the chitosan action on biomembranes is mainly governed by electrostatic interactions with negatively charged lipids at the external leaflet of the membrane. The main effects from chitosan to the membrane models are the decrease in membrane elasticity and the increase in molecular ordering, which can lead to important biological implications. Moreover, the existence of the so-called concentration of saturation for most systems suggests that the dosage and chemical structure of chitosan must be well controlled to obtain the desired biological effect.

Asbestos é um termo geral usado comercialmente para descrever minerais fibrosos de silicato. A fibra mais utilizada até hoje é denominada crisotila, com uso considerado seguro. Embora, fragmentos menores podem permanecer por longo tempo em tecidos pulmonares. As fibras de crisotila, assim como as demais fibras de asbestos, possuem sílica na sua composição e podem ser fagocitadas com a participação de receptores scavenger. Este trabalho teve como objetivo o estudo de mecanismos de interação e de internalização das pequenas fibras de crisotila em duas linhagens celulares. Uma análise por microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de transmissão foi realizada e observou-se que ambas as linhagens são capazes de internalizar fibras, que apresentavam livres ou envoltas pela membrana plasmática. A presença de elementos do citoesqueleto próximos às fibras de crisotila foi verificada, assim como alterações no nível de expressão de alguns desses elementos. Dentro deste contexto, a participação de receptores no processo de internalização de fibras de crisotila também foi estudada e verificamos que esses receptores podem estar envolvidos de alguma forma com o processo de internalização de fibras de crisotila. / Asbestos is a term used commercially to describe silicate minerals. Chrysotile is the most used fiber until today and it is considered safe. However, smaller fragments can be found in lung tissues for a long period of time. Chrysotile fibers, as other asbestos fibers, are composed by silica and may be phagocyted with the participation of scavenger receptors. This studys goal was to study the interaction an internalization mechanisms of small chrysotile fibers in two cell lineages. Confocal laser scan microscopy analysis and electronic microscopy transmission analysis were conducted in both lineages, that showed capable of internalize fibers, that were involved or not by cell membrane. Cytoeskeleton elements presence near the fibers was verified and there were also changes in expression levels these elements. In this context, the participation of scavenger receptors in the internalization process of chrysotile fibers was also studied, and we verified that these receptors may be associated to the internalization process of chrysotile fibers.

O uso dos dados de posicionamento a partir do telefone celular tem impactado de maneira positiva os estudos sobre os deslocamentos humanos. O grande volume e a regularidade na obtenção dos dados são facilitadores das análises de posicionamento em múltiplos dias. Utilizando-os como fonte dos dados, o presente estudo focou em realizar uma análise dos deslocamentos cotidianos de moradores de assentamentos precários pela cidade de São Paulo em diferentes períodos do dia para definir origens e destinos com a finalidade de analisar as distâncias, os deslocamentos por transporte público e inferir um perfil de uso do solo nos locais de estadia frequente usando métodos utilizados em estudos internacionais de análise dos dados de telefonia móvel, combinados com métodos de análise espacial e geoprocessamento. Os resultados mostraram dados importantes para entender a mobilidade dos moradores de favela dentro da cidade de São Paulo, os quais, em média, estão mais distantes de casa no horário comercial dos dias úteis quando comparados com outros moradores da cidade. Foi possível observar mudanças nos perfis de uso do solo dos locais de estadia frequente que podem ser utilizados como indicadores na análise das atividades e também se inferiu possíveis trajetórias por transporte público entre as origens e destinos frequentes. Os métodos de análise de deslocamento humano a partir dos CDRs usados internacionalmente se mostraram totalmente adaptáveis para realidade brasileira e a utilização para análise de deslocamentos dos moradores de assentamentos precários mostrou-se útil para auxiliar nos estudos de mobilidade dessa população carente. / The use of position data from mobile phones have impacted in a positive way the researches about human mobility. The very large quantity and regularity on the way how this database is collected improve the capacity of a multi-day\'s positioning analyse. Using this data source, the present study was focus in analyse the commute of residents in poor settlements (like slums) inside the city of São Paulo- Brazil, in different time periods for define origins and destinations to analyse the distance using public transport and land use in frequents stay points using methods used in international studies of mobile data analysis, combined with spatial analysis methods. The results showed important data to understand the mobility of favela residents within the city of São Paulo, who, on average, are more distant from home during working day business hours when compared to other residents of the city. It was possible to observe changes in the land use profiles of the frequent places of stay that can be used as indicators in the analysis of activities and inferred possible trajectories by public transport between the frequent origins and destinations. The methods of analysis of human commute using CDR data were fully adaptable for Brazilian reality and the use for analysis of commute from residents of precarious settlements proved useful to assist in the mobility studies of this poor population.

O Vírus Respiratório Sincicial Humano (HRSV) é um dos patógenos mais importantes do trato respiratório. Analisamos as interações das proteínas virais nucleoproteína (N), fosfoproteína (P) e matriz (M) em células HEK-293T. N interage com as proteínas celulares Hsp70, PRMT5 e WDR77; P com Hsp70 e Tropomiosina; e M com Nucleofosmina e Tropomiosina. Cada gene celular foi co-expresso em bactérias com um gene viral possibilitando a co-precipitação das proteínas. Analisamos a interação entre Hsp70 e N ou P, confirmando sua ocorrência em bactérias. Com um conjunto de proteínas mutantes, definimos que as interações são através dos amino terminais de N e P, ou do carboxi terminal de P, e do domínio amino terminal de Hsp70. Superexpressão de Hsp70 por transfecção provocou efeito de estímulo sobre a replicação de HRSV. Imunizações em camundongos com vacinas de DNA para N e P mostraram a indução de resposta celular e humoral. Ensaios de desafio resultaram em redução da carga viral após imunização com N, indicando potencial para sua aplicação em formulação vacinal. / Human respiratory syncytial virus (HRSV) is one of the most important pathogens of the respiratory tract. We analyzed the interactions of viral nucleoprotein (N), phosphoprotein (P) and matrix (M) in HEK-293T. N interacts with the cellular proteins Hsp70, PRMT5 and WDR77; P interacts with Hsp70 and Tropomyosin; and M with Nucleophosmin and Tropomyosin. Each cellular gene was co-expressed with a viral gene in bacteria allowing co-precipitation of proteins. Hsp70 co-expression with N or P proteins confirmed that these interactions also occur in bacteria. Using a set of mutants we found that the N and P amino terminus, P carboxy terminus, and Hsp70 amino terminal domain participate in the interactions. The overexpression of Hsp70 by transfection resulted in stimulation of HRSV replication. Mice immunization with N and P showed that DNA vaccines were capable of inducing humoral and cellular response. In challenge assays it was possible to detect significant virus titer reduction in animals immunized with N, indicating its potential for a vaccine formulation.

No estudo de sistemas complexos interessa capturar a evolução do seu comportamento emergente segundo um conjunto de regras cujas soluções descrevem o seu estado ao longo do tempo. Uma classe particular de modelos matemáticos e computacionais que permite realizar essa investigação são os autômatos celulares. O comportamento global deles é definido apenas por regras locais, o que os tornam um modelo exemplar para estudos de sistemas complexos. Estamos interessados em um tipo especial de autômato celular: os classificadores de densidade unidimensionais. Este tipo de autômato celular está relacionado com o problema da maioria que consiste em fazer convergir uma cadeia de símbolos aleatoriamente distribuídos em um reticulado, para uma cadeia homogênea com um único símbolo final (consenso global), aquele de maioria inicial. Este consenso deve ser obtido exclusivamente a partir de interações locais entre os sítios sem a instância de um controle central. Nesta pesquisa, realizamos alguns experimentos para caracterizar um autômato celular classificador de quatro estados proposto em Gács, Kurdyumov e Levin (1978). Embora seja um classificador imperfeito, este autômato celular é significativamente tolerante a falhas quando o submetemos a níveis de ruídos não nulos. Os resultados corroboram com outros estudos que investigam a robustez deste tipo de autômato celular e lançam luz sobre o entendimento da origem da coordenação global de sistemas que exibem as características aqui descritas / In the study of complex systems we are interested in capturing their evolution of its emergent behavior under a set of rules whose solutions describe the state of the system over time. A particular class of mathematical and computational model to perform this kind of research is the cellular automaton (CA). Its global behavior is defined by local rules, which makes it an exemplary model to study complex systems. Here, we are interested in a particular type of CA: one-dimensional CA that classifies densities. This kind of CA is related to the problem of the majority task that consists of converging an array of symbols, initially randomly distributed, to a single symbol, the more frequent one in the initial configuration of the array (global consensus). This consensus must be obtained solely out of local interactions, without the instance of a central control. In this research, we conducted some experiments to characterize a four-state CA classifier proposed in Gács, Kurdyumov e Levin (1978). While it is an imperfect classifier, this CA is significantly fault tolerant when submitted to the levels of non-zero noise. Our results corroborate other studies that had investigated the robustness of this type of CA, and shed light on the understanding of the origin of global coordinated systems that exhibit the characteristics described here

O presente trabalho se debruça sobre os elementos da cultura digital de nossos dias, que têm se tornado objetos presentes em toda a vida social, em suas mais diferentes esferas os telefones celulares. O intuito é descrever e analisar alguns dos fenômenos imbricados na construção desta cadeia de conectividade da qual celulares e todos nós, enquanto usuários, fazemos parte. Para tanto, o esforço empreendido foi o de compreender como estes objetos se inserem e compõem um amplo arranjo sociotécnico no qual circulam discursos, saberes, práticas, relações, circustâncias e eventos, envolvendo o mercado, os produtores, as inovações tencológicas de um lado e, consumidores e suas diversas práticas de uso e formas de vida, de outro. Demonstra-se como que toda esta rede não escapa aos eixos do mercado, pelo contrário, engloba-os e os faz crescer e os celulares constituem elementos agenciadores deste processo à medida em que fazem as próprias vidas de seus usuários circular pelas infovias, alterando os regimes de relações que envolvem o contato com o outros, as formas de ser estar no mundo, as formas de controle e os regimes de subjetivação. A principal contribuição deste estudo é, assim, mostrar que se está diante de novos vetores de poder que incidem diretamente sobre a gestão das vidas de cada um, às formas de uso do tempo, constituição de afetos, contribuindo, igualmente para dar novos contornos aos processos de geração de valor, cada vez mais atrelados aos momentos de consumo. Em suma, entender quais novas roupagens de questões, caras à teoria social, tais como governamentalidade e sociedade do controle entram em jogo, a partir do momento em que este objeto torna-se onipresente nas práticas sociais e de que forma estas questões se atualizam, é o que consistiu na tarefa primordial deste trabalho / This thesis focuses on one representative element of the current digital culture, which has become present in all social life in its different spheres the mobile phone. Our aim is to describe and analyze some of the overlapping phenomena in the construction of this connectivity chain to which mobile phones and we, as users, belong. To this end, the effort undertaken was to understand how these artifacts are inserted and comprise a broad socio-technical arrangement in which discourses, knowledge, practices, relationships, circumstances and events flow, involving the market, the producers, the technological innovations on one side and the consumers, and their various daily use practices and life habits on the other. We try to show how this whole network does not escape to the axes of the market, by contrast, it embraces and makes them grow and how the mobile phones are important elements of this process because they made the lives of its users move through the networks flows, changing, by this way, the relationships that involve the contact with the other, the ways of being in the world, the control practices and the regimes of subjectivity. The main contribution of this study is thus to show that one is facing new vectors of power that directly affect the management of each other\'s lives, the time use forms, the constitution of affects, contributing also to give new dimensions to processes of value creation, which are increasingly tied to consumption occasions. In short, to understand how new social issues, come into play, from the time that this artifacts become ubiquitous in social practices and how these are updated in terms of governmentality and social control is the primary task of this work

O fator IX (FIX) da coagulação sanguínea é uma proteína dependente de vitamina K de grande valor farmacêutico no tratamento da Hemofilia B, o qual é baseado na administração do fator de coagulação derivado de plasma humano ou da proteína recombinante produzida em células murinas. A terapia baseada nestas abordagens apresenta alto custo e está associada às contaminações com vírus e príons, além do desenvolvimento de inibidores de FIX. Esses efeitos aumentam o risco de morbidade e mortalidade relacionadas às hemorragias. Neste trabalho, clonamos o cDNA do FIX em um vetor lentiviral e avaliamos a expressão da proteína recombinante em duas linhagens celulares humanas. A clonagem do cDNA do FIXh no vetor de expressão lentiviral 1054 foi confirmada através da análise com enzimas de restrição específicas obtendo-se as bandas esperadas de 1407 pb e 10054 pb visualizadas em gel de agarose. As linhagens celulares 293T e SK-Hep-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral 1054-FIX gerado em nosso laboratório e as células que apresentaram maior expressão de EGFP foram selecionadas e separadas por citometria de fluxo. A quantificação da expressão de FIXrh foi realizada por ensaios de ELISA e cromogênico. A quantificação de FIXrh total foi de 500 ng/106 células para a linhagem 293T e 803 ng/106 células para a linhagem SK-Hep-1. A atividade biológica específica de FIXh nas células 293T e SK-Hep-1 foi 0,047 UI/106 células e 0,186 UI/106 células, respectivamente. Com o intuito de avaliar o perfil de produção de FIXrh ativo ao longo do tempo, foi realizado um acompanhamento de 180 dias, no qual foi observado que a linhagem SK-Hep-1 cessou a expressão de FIX, enquanto as células 293T mantiveram a expressão durante o período. O FIXrh foi caracterizado por western blot confirmando a presença de uma banda imunoreativa esperada de 57 kDa. As linhagens 293T e SK-Hep-1 apresentaram 7,67 e 17 cópias do vetor inserido/célula, respectivamente. Considerando a importância do processo de ?-carboxilação, foi realizada uma análise da expressão gênica dos genes envolvidos neste processo, tais como o VKORC1, ?-carboxilase e o inibidor calumenina, nas linhagens celulares. Os resultados demonstraram razões elevadas entre os genes VKORC1 e calumenina e VKORC1 e ?-carboxilase nas duas linhagens. A cinética de crescimento das células foi realizada por um período de 7 dias apresentando diferenças significativas entre as células SK-Hep-1 transduzidas e não transduzidas, enquanto que as células 293T não presentaram diferenças estatísticas no crescimento celular. A suplementação do meio de cultura com íons Ca+2 e Mg+2 foi testada para avaliar sua influência na expressão de FIXrh ativo. As células 293T apresentaram melhor desempenho nas concentrações de 0,5 mmol/L de Ca+2 e 1,0 mmol/L de Mg+2 e as células SK-Hep-1 no meio de cultura não suplementado. Nossos dados indicam que a linhagem hepática SK-Hep-1 é a melhor produtora de FIXrh funcional e as comparações realizadas entre os dois tipos celulares são importantes na caracterização do comportamento de linhagens geneticamente modificadas voltadas para a expressão de proteínas recombinantes heterólogas e abre novos caminhos para futuros estudos que visam o melhoramento da produção desse tipo de proteína. / Blood coagulation factor IX is a vitamin K-dependent protein, and it has become a valuable pharmaceutical in the treatment of Hemophilia B which is based on the plasma-derived coagulation factors or recombinant protein produced in murine cells. Coagulation therapy based on these approaches has high costs and is closely associated with prion and virus contamination besides the FIX inhibitors development. These effects increase the risk for bleeding-related morbidity and mortality. The purpose of this study was to clone hFIX into a lentiviral vector and evaluate the expression of the recombinant protein in two human cell lines. The cloning of the hFIX cDNA into 1054 lentiviral expression vector was confirmed by enzymatic restriction obtaining the expected 1407 bp and 10054 bp bands in agarose gel. The 293T and SK-Hep-1 cell lines have been stable transduced with 1054-FIX lentiviral vector generated in our laboratory and the cells with higher expression of EGFP were selected and separated by flow cytometry. The quantification of the expression of rhFIX was performed by ELISA and chromogenic assays. The concentration of total rhFIX was 500 ng/106 cells in 293T cell line and 803 ng/106 cells in SK-Hep-1 cell line. The biological activity of FIX secreted by 293T and SK-Hep-1 was 0,047 UI/106 cells and 0,186 UI/106 cells, respectively. In order to evaluate the active rhFIX production profile over time, we conducted a monitoring of 180 days, which was noted that the SK-Hep-1 cell line ceased FIX expression, while 293T cells maintained the expression during this period. rhFIX was characterized by western blot analysis confirming the presence of a expected 57 kDa immunereactive band. The 293T and SK-Hep-1 cell lines showed 7.67 and 17 integrated vector copies/cell, respectively. Considering the importance of the ?-carboxylation process, we performed a gene expression analysis of genes involved in this process, such as VKORC1, ?-carboxylase and calumenin, in cell lines. The results showed high ratios among the genes VKORC1 and calumenin and among VKORC1 and ?-carboxylase in both cell lines. The cell growth kinetics was performed by a 7-day period, showed significant differences between SK-Hep-1 transduced cells and non-transduced cells, whereas 293T cells showed no difference in cell growth. Enrichment of culture medium with Ca +2 and Mg +2 ions was tested to evaluate its influence on the expression of active FIX. 293T cells showed better performance in 0.5 mmol/L Ca+2 and 1.0 mmol/L Mg +2 concentrations and SK-Hep-1 cells in culture medium control. Our data indicate that transduced SK-Hep-1 cells are the best producer of functional rhFIX, and comparisons between these two cell lines are important in characterizing the behavior of genetically modified cell lines focused on the heterologous expression of recombinant proteins and opens new avenues for future studies aimed at improving the production of this type of protein.

Receptores ativados por protease (PARs) pertencem à família de GPCRs. Desses, PAR-1, PAR-3 e PAR-4 são ativados por trombina, e PAR-2 por tripsina. Como as proteases, peptídeos sintéticos (PARs-AP) também ativam esses receptores. Estudamos o papel dos PARs na reatividade vascular de Wistar e SHR. In vitro, PAR-1 AP, promoveu maior vasoconstrição em aorta com endotélio (E+) de SHR vs Wistar. PAR-2 AP promoveu vasodilatação similar em aorta E+ de SHR e Wistar, enquanto PAR-4 AP e peptídeos reversos não causaram efeito. In vivo/in situ PAR-1 e PAR-2 AP mostraram intensa vasomotilidade em arteríolas mesentéricas. A expressão gênica de PAR-1 está aumentada em aorta e arteríolas de SHR, mas a expressão protéica está aumentada apenas em arteríolas. Demonstramos ainda que a vasoconstrição induzida por PAR-1 AP, é dependente de Ca++ e da liberação de Ang II, ET-1 e O2- pelo endotélio. Assim, sugerimos que PAR-1 pode ser um alvo terapêutico para novos antihipertensivos com efeito antitrombótico, já que este receptor também tem sido envolvido em eventos romboembólicos. / Protease activated receptors are a new GPCRs family. The PAR-1, PAR-3 and PAR-4 are activated by thrombin and PAR-2 by tripsin. Like proteases, synthetic peptides (PARs-AP) can also activate those receptors. We studied the role of PARs in vascular reactivity of Wistar and SHR. In vitro, PAR-1 promoted higher vasoconstriction to PAR-1 AP in SHR aorta with endothelium (E+) than the Wistar ones. PAR-2 AP produced similar vasodilation in Wistar and SHR aorta E+, while neither PAR-4 nor reverse peptides presented any effect. In vivo/in situ PAR-1 and PAR-2 showed an intensive vasomotion in mesenteric vessels. PAR-1 gene expression was increased in SHR aorta and arterioles, while the protein expression was increased only in the arterioles. We have also shown that the vasoconstriction induced by PAR-1 AP, is Ca++-dependent and Ang II, ET-1 and O2- release from endothelium. Thus, we suggest that PAR-1 might represent a therapeutic target to new antihypertensive drugs with antithrombotic effect, since this receptor has been involved in thromboembolics events.

Este trabalho descreve o estudo do metabolismo secundário em folhas diferenciadas e em suspensões celulares de Piper crassinervium (Piperaceae). Este estudo foi monitorado pela análise do extrato de folhas por CLAE, assim como pela comparação entre os diferentes tecidos desta espécie (folhas, caule e raízes). Do extrato das folhas foram isoladas duas flavanonas, duas hidroquinonas preniladas e uma hidroquinona com um endoperóxido na cadeia lateral. A análise do óleo volátil das folhas através de CG e CG-EM, revelou a presença de trinta e seis componentes, sendo majoritários o germacreno-D (10,05%) seguido por &#946;-cariofileno (9,91 %) e 6-metil-5-hepten-2-ona (7,47%). Todas as substâncias isoladas foram submetidas ao ensaio antifúngico bioautográfico contra Cladosporium sphaerospermun, sendo que as flavanonas, as duas hidroquinonas e o óleo volátil mostraram-se ativos. As suspensões celulares foram desenvolvidas a partir de calos, iniciados a partir de ápices, em meio B5 modificado, contendo ácido naftalenoacético (ANA) e 6-benzilamino purina (BAP) como reguladores de crescimento. As células não produziram flavonóides, mas alcalóides do tipo aristolactamas, que são parcialmente excretados para o meio de cultura. A curva de crescimento estabelecida para as células foi analisada quanto à atividade específica da fenilalanina amônia-liase (PAL), à variação do pH e o acúmulo dos alcalóides. Alguns experimentos de eliciação demonstraram respostas positivas face ao uso de luz UV, adição de L-fenilalanina e uso de extratos de levedura. / The present work studies the secondary metabolism in leaves of Piper crassinervium (Piperaceae) and in its cell suspension culture as well. The profile of secondary compounds in differenciatted and undifferenciated tissues were evaluated by HPLC. The aerial parts of Piper crassinervium yielded two flavanones and three prenylated hydroquinones, one having an endoperoxide group in the side chain. The analysis of the volatile oil of Piper crassinervium by GC-MS allowed the identification of 36 compounds, germacrene-D (10,05%), &#946;-cariofilene (9,91 %) and 6-methyl-5-heptene-2-one (7,47%) being detected as the major ones. Ali isolated substances were evaluated using a bioautography technique against the fungus Cladosporium sphaerospermun. The isolated flavanones, two hydroquinones and the essential oil were found to be active against the fungus. The cell suspensions had their growth curve established on basis of the dry weight and pH variations. The cells were showed to accumulate several aristolactams alkaloids instead. Determinations of these alkaloids by HLPC indicated that the cells excreted them partially to the culture media. Determinations of specific activity of PAL and concentration of alkaloids during the growth cycle were further performed. Additional experiments revealed that UV light and the addition of either phenylalanine or yeast extract cause elicitation response with increased production of alkaloids.