L'efficacité du transfert de gènes non viral est limitée par les barrières physiologiques qui entravent le cheminement de l'ADN jusqu'au noyau des cellules cibles. <br />Ce travail a permis de concevoir et d'étudier trois outils visant à améliorer cette efficacité. <br />Un premier volet concerne le ciblage du noyau cellulaire. Une banque de plasmides comportant une séquence aléatoire a été construite dans le but d'identifier une séquence nucléotidique permettant l'interaction du plasmide avec une protéine karyophile qui pourrait l'escorter jusqu'au noyau cellulaire. Le caractère aléatoire de la banque a été validé mais les séquences recherchées n'ont pas pu être identifiées grâce aux tests que nous avons employés.<br />Le peptide de localisation nucléaire IBB de l'importine a été couplé de façon covalente au squelette d'un plasmide dans le but de promouvoir la fixation du plasmide aux protéines récepteurs d'import nucléaire. La spécificité de l'interaction entre ce plasmide-IBB et les récepteurs cellulaires n'a pas pu être démontrée, les tests employés n'ont pas permis de mettre en évidence un import nucléaire accru de ces plasmides. En revanche le peptide IBB compacte l'ADN, améliorant la lipofection par modification des caractéristiques physico-chimiques du lipoplexe.<br />Le deuxième volet de ce travail concerne le ciblage extracellulaire, envisagé dans le système modèle du récepteur aux asialoglycoprotéines des hépatocytes. Des liposomes cationiques à têtes de ciblage galactosylées ont permis de définir les caractéristiques structurales et physico-chimiques les plus favorables pour l'accessibilité de la tête de ciblage. L'intégration d'un espaceur polyéthylèneglycol au lipide galactosylé a permis de limiter l'internalisation non spécifique des lipoplexes dans les cellules non visées, nous n'avons pas observé de ciblage des hépatocytes.

Le sujet de cette thèse concerne l'élaboration de vecteurs fonctionnels de transfert de gènes destinés à la thérapie génique de tumeurs.<br />Deux familles de vecteurs synthétiques fonctionnels ont été synthétisées afin d'améliorer d'une part la biodisponibilité des vecteurs dans les applications in vivo et d'autre part leur spécificité de ciblage des tissus tumoraux. <br />La première famille de composés est constituée de télomères et de cotélomères « furtifs » issus des réactions de (co)télomérisation. Le design des télomères est basé sur un squelette « diblock » composé d'une partie polyaminée de degré de télomérisation aléatoire et d'une partie hydrophile (polyéthylène glycol). Le design des cotélomères est basé sur un squelette aléatoire de motifs aminés et de structures hydrophiles (tétraéthylène glycol et trishydroxyméthyl). La deuxième famille de vecteurs synthétiques est issue de la synthèse de lipides et polymères cationiques conjugués à un ligand dérivé de l'antagoniste des récepteurs à chimiokines CXCR-4, l'AMD3100 ou bicyclame.<br />Le potentiel des (co)télomères « furtifs » en tant qu'agents de condensation et de transfert de gènes a été évalué in vitro sur des cellules de carcinome pulmonaire humain A549.<br />Le potentiel des conjugués ciblés lipidiques et polymériques à compacter l'ADN et à transfecter de manière spécifique des cellules par la voie récepteur médiée a été évalué à la fois sur des cellules n'exprimant pas le récepteur CXCR-4 (A549, T98G) et sur des cellules l'exprimant (Jurkat).<br />Certains des (co)télomères « furtifs » testés (PEG2000-[NH2]n) ont démontré des efficacités de transfection comparables à des formulations lipidiques de référence (pcTG90/DOPE) tout en étant moins toxiques. Parmi les conjugués ciblés, le cotélomère iBu-[NH]80-[AMD]4 s'est révélé être un agent de transfert de gènes spécifique sur les cellules Jurkat sous certaines conditions de formulations, par rapport aux lipides et polymères conventionnels.<br />Mots clés : thérapie génique, transfert de gènes, lipoplexes, polyplexes, polyéthylène glycol, biodisponibilité, AMD-3100, ciblage, transfection.<br />Discipline : Chimie.

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs accessibles à la lumière. Elle repose sur l'action combinée d'un photosensibilisateur qui, en présence d'oxygène et sous l'effet d'une irradiation lumineuse, induit la synthèse d'espèces réactives de l'oxygène cytotoxiques. L'effet tumoricide de la PDT se traduit par des dommages directs sur les cellules ainsi que des dommages indirects de la néovascularisation tumorale et une activation du système immunitaire. Dans cette étude, nous avons démontré dans une première partie l'intérêt de se baser sur la distribution intratumorale de la mTHPC et non pas sur les études de biodistribution pour l'optimisation des conditions de traitement par PDT et en particulier de l'intervalle drogue-lumière (IDL). Un co-ciblage des vaisseaux et du parenchyme tumoral via un fractionnement de l'administration de la mTHPC a permis d'obtenir un taux de guérisons de 100%. Cette efficacité a été corrélée à la potentialisation de la mort des cellules par apoptose et valorisée par son association à des dommages secondaires cutanés restreints. La stratégie de fractionnement de l'administration s'avère donc être très prometteuse dans un contexte clinique. Dans la seconde partie de cette étude, nous avons établi la redistribution de la mTHPC in vivo dans le modèle de la membrane chorioallantoïdienne de poulet (CAM) à partir de formulations liposomales (Foslip®, Fospeg®) et son impact sur les dommages vasculaires photoinduits par la PDT.

Cette thèse s'intéresse à étudier la politique de ciblage de l'inflation compte tenu des caractéristiques économiques et financières des économies émergentes. Depuis sa première adoption en adoption en 1990, la politique de ciblage de l'inflation a montré son efficacité en limitant la flambée des prix et en favorisant la croissance économique. Cependant, pour les marchés émergents, l'amélioration de leur performance économique reste faible par rapport aux économies développées. Ce résultat est du principalement aux caractéristiques de ces économies et à leur vulnérabilité économique et financière. Ce travail explore l'impact de deux importantes caractéristiques des marchés émergents, sur le choix de la politique monétaire. Il s'agit de la dépendance commerciale et de la dépendance financière. L'approche théorique de cette thèse montre que la Banque Centrale des économies émergentes a intérêt à adopter la politique de ciblage de l'inflation qui limite la transmission de l'inflation importée vers le niveau des prix domestiques. La thèse propose également une approche empirique qui cherche à identifier, d'une part, l'efficacité de la politique de ciblage de l'inflation et d'autre part, les facteurs qui peuvent influencer la volatilité des prix. Les résultats montrent, dans un premier temps, qu'il y a une amélioration de la performance des pays adoptant la politique de ciblage de l'inflation mais dans des proportions relativement faibles. Puis dans un deuxième temps, qu'un système monétaire, financier et budgétaire sain favorise la maîtrise de l'inflation.

Les Quantum Dots (QDs) sont des nanocristaux de semiconducteurs qui possèdent des propriétés optiques hors du commun. Leur utilisation comme sondes en biologie nécessite leur solubilisation dans l'eau, grâce à une chimie de surface adaptée, qui influence la taille finale du QD, ses propriétés optiques et son interaction avec l'environnement biologique. Nous avons développé un nouveau ligand, l'acide dihydrolipoïque-sulfobétaïne (DHLA-SB), qui permet d'obtenir des QDs à la fois petits, stables dans une vaste gamme de pH, dans des solutions saturées en sel et dans le temps, et avec une très faible adsorption non spécifique sur les cellules. Nous avons observé et caractérisé le comportement intracellulaire des QDs DHLA-SB au cours du temps et nous l'avons comparé à celui de deux autres classes de QDs : cette étude a clairement montré l'influence de la chimie de surface sur le devenir intracellulaire des nanoparticules et a révélé une stabilité accrue des QDs DHLA-SB. Nous nous sommes également intéressés à la fonctionnalisation des QDs avec la streptavidine (SA) ou la biotine afin de marquer spécifiquement des cellules vivantes ou fixées. Les QDs-SA DHLA-SB obtenus ont permis de suivre un récepteur membranaire ou encore de marquer de façon spécifique une protéine biotinylée à l'intérieur de cellules vivantes, bien plus efficacement qu'avec les QDs-SA commerciaux (Invitrogen). Enfin, nous avons proposé d'utiliser les QDs DHLA-SB pour améliorer une technique de microscopie à illumination structurée, la microscopie HiLo bicouleur, et obtenir une coupe optique (type image confocale) d'échantillons biologiques épais en une seule image.

Ce travail est consacré à l'évaluation des performances de ciblage et à l'analyse d'impact de trois projets. La première étude porte sur l'accès à l'eau courante en République du Congo ; et l'auto-ciblage pratiqué à travers une tarification spécifique ne bénéficie qu'aux ménages connectés qui sont plutôt non pauvres. L'auto-ciblage fonctionne mieux pour le projet des travaux publics au Libéria ; la proportion de pauvres qui participent à ces travaux est élevée. En fait ce projet n'a aucune barrière à l'entrée, ce qui explique en partie ce bon résultat. Le ciblage du programme de modernisation agricole en RDC n'est pas très efficace non plus, les bénéficiaires n'étant souvent pas pauvres. L'impact en termes de réduction de la pauvreté est important dans les deux projets concernés par ce type d'analyse (modernisation agricole en RDC et travaux publics au Libéria), tout au moins pour les populations bénéficiaires. Le cas du projet de modernisation agricole en RDC montre néanmoins qu'il est important de prendre en compte d'autres facteurs pour obtenir un impact important, comme lever les contraintes liées au marché du crédit et à l'accès aux infrastructures

L'objectif de cette thèse a été d'optimiser la réponse immunitaire anti-tumorale induite par les cellules dendritiques (DC) et les cellules iNKTs, en réponse à la prise en charge du KRN7000 (a-galactosyl-céramide) par la molécule CD1d située sur les DCs. Le premier axe de travail visait à synthétiser de nouveaux analogues du KRN7000, en fonctionnalisant la position C6 du sucre et en greffant un groupement phényl sur l'une des chaînes grasses. Les études in vitro ont montré que les modifications apportées par rapport au KRN7000 n'ont pas altéré la prise en charge des molécules obtenues par les DCs. Dans tous les cas, une sécrétion de cytokines a pu être observée. Des études complémentaires visant à décrire le profil cytokinique in vivo sont en cours. Le second axe a consisté en la mise au point d'une stratégie de vectorisation du KRN7000 afin de favoriser sa présentation aux DCs, en l'associant à des molécules d'intérêt comme un peptide spécifique d'une tumeur, une molécule de ciblage des DCs ou des ligands des TLRs. Dans les conditions utilisées, le phénomène d'anergie induit classiquement par l'administration répétée du KRN7000 n'a pas pu être levé. Cependant, nous avons montré d'une part que le KRN7000 vectorisé dans les liposomes est toujours pris en charge par les cellules dendritiques, et d'autre part qu'une réponse immunitaire se traduisant par la production de cytokines par les cellules iNKTs est induite.

Les facteurs de croissance endothéliaux (VEGFs) sont produits par les tumeurs qui sont hypoxiques. Principaux responsables de la néo-vascularisation pathologique, ils régulent le stroma tumoral. Les nouvelles stratégies qui ciblent et inhibent le VEGF ouvrent vers la thérapie anti-cancéreuse moderne. Elles ont pour but de contrôler l'angiogenèse tumorale plutôt que la détruire. Le défi est donc de piéger sélectivement le VEGF produit en excès, dans le microenvironnement tumoral, sous l'effet de l'hypoxie. La thèse présentée dans ce manuscrit est consacrée à la réalisation d'une nouvelle stratégie ciblante par l'intermédiaire de cellules, aussi appelée " Cheval de Troie ". Elle combine dans la même entité, une unité de ciblage et un système de délivrance spécifique d'un gène/molécule thérapeutique. Dans le but d'adresser la thérapie aux cellules cancéreuses sans affecter les cellules saines, un modèle de cellules endothéliales de type précurseur (CEPs) a été utilisé comme cellules ciblantes capables d'atteindre spécifiquement le site tumoral. Les CEPs ont été " armées " pour exprimer un gène thérapeutique chargé d'inhiber le VEGF. La neutralisation a été obtenue par la production d'une forme soluble du récepteur-2 du VEGF (VEGFR2 soluble), agissant comme inhibiteur. Caractéristique des tumeurs solides se développant, l'hypoxie a été choisie pour déclencher/éteindre l'expression et la sécrétion du VEGFR2 soluble, en introduisant, en amont du gène thérapeutique, une séquence régulatrice : HRE. Adressé au site tumoral par les CEPs, le régulateur de l'angiogenèse qu'est la forme soluble du VEGFR2, est exprimé de manière conditionnée et réversible, à l'hypoxie. Ceci ouvre à de nouvelles stratégies de normalisation contrôlée et stable des vaisseaux tumoraux en vue de l'utilisation de thérapies combinées.

Les éléments LINE-1 (L1) sont les seuls éléments transposables autonomes et actifs, constituant 20% de notre ADN. Ils prolifèrent via un intermédiaire ARN dans un processus appelé rétrotransposition. Les L1s encodent deux protéines, ORF1p et ORF2p, qui s’associent avec l’ARN du L1 pour former une particule ribonucléoprotéique (RNP), constituant l’intermédiaire fonctionnel de la rétrotransposition. Les L1s « sautent » activement dans les cellules germinales, les cellules souches embryonnaires et dans l’embryon précoce, conduisant occasionnellement à des maladies génétiques. Ils sont également exprimés et mobiles dans un certain nombre de cancers. Les sites d’intégration des L1s sont généralement considérés comme aléatoires, les déterminants moléculaires de leur insertion demeurant mal connus. Afin d’éclaircir ce processus, nous avons d’abord exploré les propriétés biochimiques des RNPs du L1, en mesurant leur activité transcriptase inverse in vitro sur une collection variée de substrats d’ADN. Nous avons observé que des substrats, qui diffèrent par leur séquence ou leur structure, ne sont pas tous utilisés efficacement par les RNPs du L1 pour amorcer la transcription inverse. Notre travail suggère que la spécificité et la flexibilité de l’initiation de la transcription inverse du L1 participe aux choix du site d’insertion. Dans un second temps, nous avons recherché des partenaires cellulaires de la RNP du L1 qui pourraient contribuer à la rétrotransposition et/ou la réguler, par des cribles double-hybride chez la levure. Nous avons découvert que la protéine ORF2p interagit avec un groupe de récepteurs nucléaires. Ces derniers possèdent un domaine de liaison à l’ADN qui reconnaît des séquences d’ADN spécifiques réparties dans le génome, et un domaine de liaison du ligand, qui permet d’activer la transcription des gènes cibles. Nos données suggèrent que ces facteurs participent à la rétrotransposition des L1s, possiblement en ciblant leurs RNPs dans certaines régions du génome. Dans leur ensemble, nos travaux ont contribué à améliorer notre compréhension de la relation entre éléments transposables et génome hôte, et de leur impact sur la plasticité du génome humain. / LINE-1 (L1) elements are mobile genetic elements, comprising up to 20% of the contemporary human genome, in which they are the only autonomously active element. They replicate through an RNA intermediate in a process named retrotransposition. Replication-competent L1 copies code for two proteins, ORF1p and ORF2p, that associate in cis with their own RNA to form a ribonucleoprotein complex (RNP), the functional intermediate of retrotransposition. L1s « jump » actively in germ cells, embryonic stem cells and in the early embryo, leading occasionally to genetic diseases. These elements are also expressed and mobile in a number of cancers. L1 insertion sites are generally considered as random. The molecular determinants of L1 insertion, as well as many steps of the retrotransposition cycle, remain uncertain. To get further insight in the molecular mechanisms of L1 retrotransposition, we first explored the biochemical properties of the L1 RNP, by measuring their reverse transcriptase activity in vitro on various DNA substrates. Using this approach, we observed that L1 RNPs do not equally extend DNA substrates, which differ in sequence or structure, to initiate cDNA synthesis. Our work suggests that the specificity and flexibility of L1 reverse transcription priming contribute to the choice of target sites. In a second approach, we performed yeast two-hybrid screens in order to discover cellular partners of the L1 RNP, which could contribute and/or regulate retrotransposition, We found that ORF2p interacts with a group of nuclear receptors. These proteins contain a DNA binding domain, which recognizes specific DNA sequences spread in the genome, and a ligand binding domain, driving transcriptional regulation of target genes. Our data suggest that these factors participate to L1 retrotransposition, potentially by tethering L1 RNPs to specific genomic regions. Altogether, this work has contributed to a better understanding of the relationship between mobile genetic elements and their host genome, and their impact on human genome plasticity.

La toxoplasmose est un problème majeur de Santé Publique et notamment en médecine humaine. Le développement de vaccins est donc d’une grande priorité. L’efficacité de la stratégie vaccinale contre Toxoplasma gondii dépend de l’induction des réponses immunitaires muqueuse et systémique Th1. Les cellules dendritiques (CDs) ont un rôle essentiel dans l'orchestration de l’immunité innée et l’induction de l’immunité adaptative spécifique à Toxoplasma gondii. Dans cette étude, nous explorons une stratégie de vaccination originale qui consiste en l’administration par voie systémique et muqueuse de protéines de fusion capables de cibler l’antigène de surface SAG1 aux CDs, en utilisant un fragment d'anticorps de type scFv dirigé contre le récepteur d'endocytose DEC205. Nos résultats montrent que le ciblage de SAG1 aux DCs par le fragment scFv via la voie intranasale et sous-cutanée, réduit dramatiquement la charge parasitaire cérébrale par rapport à l’antigène non ciblé et est plus efficace que l’immunisation par la voie intranasale ou la voie sous-cutanée seule. Le ciblage des DCs potentialise la réponse immunitaire vers un profil Th1 par la production d’IFN-γ, d’IL-2, d’IgG2a sériques, tout en favorisant la production IgA muqueuses spécifiques. Parallèlement, nous avons montré qu’il était possible de conférer une reconnaissance par la protéine L à toutes les chaînes légères kappa, ce qui permettra dans l’avenir de purifier plus efficacement les antigènes ciblés par chromatographie d’affinité avec la protéine L. / Toxoplasmosis is a major public health problem and the development of a human vaccine is of high priority. Efficient vaccination against Toxoplasma gondii (T. gondii) requires both a mucosal and systemic Th1 immune response. Moreover, dendritic cells (DCs) play a critical role in orchestrating the innate immune functions and driving specific adaptive immunity to T. gondii. In this study, we explore an original vaccination strategy that combines administration via mucosal and systemic routes of fusion proteins able to target the major T. gondii surface antigen SAG1 to DCs using an antibody fragment scFv directed against DEC205 endocytic receptor. Our results show that SAG1 targeting to DCs by scFv via intranasal and subcutaneous administration improved protection against chronic T. gondii infection. A marked reduction in brain parasite burden is observed when compared with the intranasal or the subcutaneous route alone. DC targeting improved both local and systemic humoral and cellular immune responses and potentiated more specifically the Th1 response profile by more efficient production of IFN-γ, IL-2, IgG2a and nasal IgA. In parallel, we found a strategy to confer PpL recognition to all kappa chains. Therefore, affinity chromatography on protein L (PpL) matrix could be used to get easily highly purified targeted proteins.