Memoria para optar el título de Bioquímico / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta diciembre de 2015 / La Neumonía Adquirida en la Comunidad (NAC) es una infección aguda del parénquima pulmonar de origen extrahospitalario, causada por virus y bacterias. La gravedad de la NAC sería independiente de la etiología y dependiente de la respuesta inmune del hospedero. Con el objetivo de caracterizar la respuesta inmune celular en adultos con NAC viral y/o por S.pneumoniae de acuerdo a la gravedad se compararon subpoblaciones de linfocitos y células NK, determinadas por hemograma y citometría de flujo en muestras de sangre periférica de 68 adultos con NAC y de 22 adultos asintomáticos. En 58 pacientes con NAC, se identificó S.pneumoniae mediante detección de antígeno urinario y virus respiratorios por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real y por ensayo de inmunofluorescencia. El agente infeccioso con mayor detección fue Rinovirus (35.2%). Se analizaron variables demográficas y clínicas de los pacientes, clasificándose de acuerdo al Índice de Severidad de la Neumonía en casos leves (n=28) y graves (n= 40). Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SigmaPlot, con p<0.05 significativo. Los adultos con NAC tuvieron menores porcentajes de monocitos (5.2% versus 8.8%), linfocitos totales (12.2% versus 26.4%), linfocitos T CD3+/CD8+ (2.5% versus 6.3%), linfocitos T CD3+/CD4+ (3.8% versus 8.9%); linfocitos T FoxP3+ (0.1% versus 0.3%), células NK activadas (CD56+/NKG2D+: 1.6% versus 4.1%) e inactivadas (CD94+/NKG2A+: 0.7% versus 2.5; CD56+/CD158b+: 0.7% versus 1.2%; CD56+/CD161+: 1.0% versus 3.5%) y mayores porcentajes de granulocitos (82.4% versus 64.9%) que los adultos asintomáticos. Los adultos con NAC grave tuvieron menores porcentajes de linfocitos y monocitos (10.5% versus 18.2% y 4.3% versus 6.6%, respectivamente), linfocitos T citotóxicos CD3+/CD8+ (2.1% versus 3.8%), linfocitos T ayudadores CD3+/CD4+ (2.6% versus 5.2%), células NK activadas (CD56+/NKG2D+: 1.5% versus 2.3%) y células NK inactivadas (CD94+/NKG2A+: 0.5% versus 1.3%; CD56+/CD158b+: 0.4% versus 0.9%) y mayores porcentajes de granulocitos (85.1% versus 74.7%) que los pacientes con NAC leve. Todos los parámetros inmunológicos fueron similares entre pacientes con NAC y agente infeccioso detectado respecto a los casos sin agente. En conclusión, la respuesta inmune celular, en cuanto a las proporciones de linfocitos y células NK estaría disminuida en los pacientes con NAC independiente de su etiología, en especial en los pacientes con NAC grave / Community-Acquired Pneumonia (CAP) is an acute infection of the lung parenchyma acquired outside the hospital, caused by viruses and bacteria. Severity of CAP would be independent of the etiology and dependent on the host immune response. For characterizing cellular immune response in adults with viral and/or S.pneumoniae CAP according to severity, subpopulations of lymphocytes and NK cells were compared and determined by blood count and flow cytometry in peripheral blood from 68 adults with CAP and 22 asymptomatic adults. In 58 patients with CAP, S.pneumoniae and/or respiratory viruses were detected by detection of urinary antigen, real-time polymerase chain reaction and immunofluorescence assays, respectively. Rhinovirus was the most frequently detected (35.2%). Demographic and clinical characteristics were analyzed, and patients were classified according to the Pneumonia Severity Index in mild (n=28) and severe cases (n=40). Statistical analyses were performed using SigmaPlot software and p<0.05 was considered significant. Adults with CAP had lower percentages of monocytes (5.2% versus 8.8%), total lymphocytes (12.2% versus 26.4%), T cytotoxic lymphocytes CD3+/CD8+ (2.5% versus 6.3%), T helper lymphocytes CD3+/CD4+ (3.8% versus 8.9%); T regulatory lymphocytes FoxP3+ (0.1% versus 0.3%), activated NK cells (CD56+/NKG2D+: 1.6% versus 4.1%) and inactivated NK cells (CD94+/NKG2A+: 0.7% versus 2.5; CD56+/CD158b+: 0.7% versus 1.2%; CD56+/CD161+: 1.0% versus 3.5%) and higher percentages of granulocytes (82.4% versus 64.9%) than asymptomatic adults. Adults with severe CAP had lower percentages of lymphocytes and monocytes (10.5% versus 18.2% and 4.3% versus 6.6%, respectively), T cytotoxic lymphocytes CD3+/CD8+ (2.1% versus 3.8%), T helper lymphocytes CD3+/CD4+ (2.6% versus 5.2%), activated NK cells (CD56+/NKG2D+: 1.5% versus 2.3%) and inactivated NK cells (CD94+/NKG2A+: 0.5% versus 1.3%; CD56+/CD158b+: 0.4% versus 0.9%) and higher percentages of granulocytes (85.1% vs. 74.7%) than patients with mild CAP. All immunological parameters were similar between CAP patients with detected infectious agent and cases with no identified pathogen. In conclusion, the cellular immune response, in terms of the proportions of lymphocytes and cells NK would be decreased in patients with CAP independent of their etiology, especially in patients with severe CAP

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El ciclo estral de la hembra canina presenta algunas características únicas al ser comparadas con otras especies de mamíferos domésticos. Sin embargo, poco se conoce de las características del desarrollo folicular en relación a otras especies. El Factor de Crecimiento Diferencial 9 (GDF-9) y la Proteína Morfogenética Ósea 15 (BMP-15), son miembros de la superfamilia de Factores de Crecimiento Transformantes Beta (TGF-β), y han demostrado un rol fundamental en el desarrollo folicular en muchas especies. El objetivo de este estudio fue analizar la presencia de ambas proteínas en células foliculares proveniente de folículos antrales del ovario canino mediante citometría de flujo. Se obtuvieron células de la granulosa y del cúmulo a través de aspiración y raspado de folículos antrales de distintos niveles de desarrollo y en distintas etapas del ciclo estral. Las células se fijaron e incubaron con anticuerpo anti GDF-9 humano y anti BMP-15 de ratón (1:100) y anticuerpos secundarios conjugados con FITC y PerCP (1:500), respectivamente. Al análisis por citometría se hizo un Gate discriminatorio por tamaño y complejidad en el Dot plot inicial y adicionalmente se discriminó con marcadores de CD45 para leucocitos y yoduro de propidio (IP) para eritrocitos y debris en los histogramas correspondientes. Los resultados se analizaron con ANOVA y regresión lineal. La expresión de GDF-9 disminuyó (P<0.05) a medida que avanzó el desarrollo folicular en Anestro y Proestro/Estro, pero aumentó (P<0.05) en Diestro. BMP-15 aumentó (P<0.05) su presencia en folículos antrales más desarrollados en la etapa de Anestro, disminuyendo (P<0.05) en Proestro/Estro al alcanzar un mayor nivel de desarrollo. Estas proteínas por tanto, se expresaron en las células foliculares de caninos en distintas etapas del ciclo estral y de manera diferente durante el desarrollo folicular, donde ambas podrían estar relacionadas con las características particulares. / The estrous cycle of the bitch presents unique features when compared to other domestic mammals, however, little is known about the characteristics of the follicular development compared with other species. The Growth Differential Factor 9 (GDF-9) and Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP-15) are members of the Transforming Growth Factor (TGF-β) superfamily and have demonstrated an important role during the follicular development of many species. The aim of this study was to analyze the presence of both proteins in the follicular cells from canine ovarian antral follicles by flow cytometry. Granulosa and cumulus cells were obtained by aspiration and scraping of antral follicles from different sizes and stages of the estrous cycle. Cells were fixed and incubated with first antibodies against human GDF-9 and mouse BMP-15 (1:100) and second antibodies conjugated with FITC and PerCP (1:500), respectively. A size and complexity discriminatory gate was used for the cytometryc analysis in the initial dot plot and, additionally, a CD45 marker for leukocyte and Iodum Propide for erythrocyte and debris discrimination in the corresponding histograms. The results were analyzed with ANOVA and lineal regression. GDF-9 expression decreased (P<0,05) during follicular development in Anestrous and Proestrous/Estrous, but increased during Diestrous (P<0,05). BMP-15 expression increased (P<0,05) during follicular development in Anestrous, but decreased in roestrous/Estrous (P<0,05) compared to small and medium sizes. Therefore, these proteins are expressed in canine antral follicle cells during different stages of the estrous cycle and at different levels of develop of the antral follicle, where both may be related to the special features of the bitch. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1140658

El estudio de la viabilidad espermática se basa en el análisis de la integridad de la membrana plasmática del espermatozoide y se desconoce el efecto de la criopreservación en este parámetro. Por lo tanto, el objetivo fue determinar el porcentaje de viabilidad en espermatozoides epididimarios de alpaca antes y después del proceso de criopreservación mediante citometría de flujo. Se recolectaron 46 testículos de alpaca obtenidos del Camal Municipal de Ninacaca, Pasco. Solo se trabajaron 41 muestras con motilidad ≥ 30% y una concentración espermática ≥ 50x106 espermatozoides/mL. Los espermatozoides fueron recuperados de la cola del epidídimo con 1mL de dilutor a base de leche descremada, separándose luego en 2 alícuotas de 500µL. La primera alícuota se utilizó para la lectura inmediata en el citómetro y la segunda alícuota se congeló utilizando un sistema automático de congelamiento Cryobath, manteniéndose en nitrógeno líquido hasta su evaluación. Para la evaluación de viabilidad espermática se utilizaron los fluorocromos SYBR–14 y Ioduro de Propidio. Se tomaron 100µL del alícuota luego se agregó 0.5µL de SYBR–14 (100nM) y 0.5µL de Ioduro de Propidio (12µM), incubándose por 10 minutos a 38°C. La evaluación de viabilidad espermática se realizó mediante citometría de flujo con analizador de imágenes. Los espermatozoides viables con membrana intacta emitieron fluorescencia verde (SYBR– 14) y los espermatozoides no viables con membrana dañada emitieron fluorescencia roja (Ioduro de Propidio). Mediante un análisis de T–student pareado se encontró que la viabilidad espermática inicial (48.97 ± 11.47%) fue significativamente mayor (p<0.05) que la viabilidad espermática luego del descongelamiento (32.30 ± 9.57%); adicionalmente también se encontró que la correlación entre viabilidad y motilidad espermática fue r = 0.6737. Por lo tanto, el proceso de criopreservación disminuye significativamente la viabilidad en espermatozoides epididimarios de alpaca estando este parámetro relacionado con la motilidad. / Tesis

Determina el efecto de la criopreservación sobre la integridad acrosomal de los espermatozoides viables de alpaca recuperados del epidídimo, determinado mediante citometría de flujo. Se procesaron muestras de 46 testículos de alpaca obtenidos de Camal Municipal de Ninacaca, Pasco, que presentaron una motilidad ≥ 30% y concentración espermática ≥ 50x106 espermatozoides/mL, en promedio 46.6% y 61x106 espermatozoides/mL, respectivamente del total de las muestras obtenidas. Los espermatozoides se recuperaron de la cola del epidídimo con 1mL de dilutor a base de leche descremada, yema de huevo, fructuosa y DMA; separándose luego en 2 alícuotas de 500 μL. La primera alícuota se utilizó para la evaluación de la viabilidad e integridad acrosomal inicial y la segunda alícuota se congeló en pajillas mediante un sistema automático de criopreservación, para luego almacenarse en nitrógeno líquido hasta el día de su evaluación. Todas las muestras, frescas y descongeladas fueron lavadas 2 veces por centrifugación con solución PBS para retirar el dilutor. Para la evaluación de viabilidad e integridad acrosomal, 100μL de cada muestra fue incubada con 2.5μL de FITC-PSA (100 μg/mL) y 0.5μL de Ioduro de Propidio (PI, 2.4 nM) por 10 minutos a 38°C, obteniendo finalmente una concentración de 2.5 μg/mL y 12 μM, respectivamente. Inmediatamente después las muestras se evaluaron por citometría de flujo con analizador de imágenes, adquiriéndose diez mil eventos compatibles con espermatozoides por muestra. FITC-PSA y PI fueron excitados con el láser de 488 nm, mientras que la emisión de fluorescencia fue detectada utilizando los canales Ch02 (505-560 nm) para FITC-PSA y Ch05 (642-740nm) para PI. Se seleccionó la población de espermatozoides viables (PI negativos), que en promedio fue el 75% del semen fresco y un 42% del semen descongelado, para de ellos determinar el porcentaje de integridad acrosomal (FITC-PSA negativos) y de reacción acrosomal (FITC-PSA positivos). Se realizó un análisis de T-student pareado para determinar como la criopreservación afecta la integridad acrosomal en los espermatozoides viables. Se encontró que la integridad acrosomal de los espermatozoides viables inicial (98.25 ± 5.40%) fue similar (p>0.05) a la integridad acrosomal de los espermatozoides viables post descongelamiento (98.75 ± 2.17%). Se concluye que si bien la criopreservación disminuye la cantidad de espermatozoides viables, la estructura acrosomal no se altera en los espermatozoides de alpaca que sobreviven a este proceso. / Trabajo de suficiencia profesional

Los acidos biliares son esteroides biosintetizados en el higado que actuan como tensoactivos, facilitando la digestion de los lipidos. Para ello, circulan y se reutilizan en un movimiento conocido como circulacion enterohepatica, un proceso muy complejo en el que no todas las etapas estan perfectamente entendidas. Con el proposito de estudiar algunos aspectos relacionados con la circulacion enterohepatica, en la presente Tesis Doctoral se planteo preparar derivados fotoactivos de acidos biliares para estudiar su comportamiento con modelos celulares para detectar efectos colestasicos de farmacos; y por otra parte, estudiar las interacciones con albumina serica humana, el transportador mayoritario de los acidos biliares en la ultima etapa de la circulacion enterohepatica. La sintesis de derivados fluorescentes de acidos biliares, principalmente acido colico, se baso en la condensacion del acido biliar mediante union covalente con diversos fluoroforos, en concreto aminofluoresceina, nitrobenzofurazano, dansilo, carprofeno, aminoftalimida y bimano. La aminofluoresceina se conjugo con el acido colico por el grupo carboxilico mientras que el resto de los fluoroforos mencionados se conjugaron por un grupo amino del acido colico, previamente obtenido de forma estereoselectiva a partir del correspondiente hidroxilo. Una vez preparados los analogos de los acidos biliares, se llevo a cabo su caracterizacion fotofisica. En concreto, los derivados de aminofluoresceina, nitrobenzofurazano y dansilo se han caracterizado completamente; asi se ha determinado sus espectros absorcion y emision, tiempos de vida y energias de singlete, asi como rendimientos cuanticos. Los estados excitados singlete mostraron ser sensibles al medio. Para el resto de los compuestos se han establecido sus propiedades fotofisicas mas importantes del estado singlete. A continuacion, los derivados de nitrobenzofurazano y dansilo se elegieron para examinar sus interacciones con albumina serica humana. / Rohacova ., J. (2010). Síntesis de Derivados Fotoactivos de Ácidos Biliares para Aplicaciones Biológicas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8411

En la siguiente tesis se obtuvieron los siguientes resultados. La adición de plasma seminal a los espermatozoides altamente diluidos ejerce un efecto beneficioso variable dependiendo de la fuente de plasma seminal. El heterodímero PSP-I/PSP-II ejerce un efecto beneficioso sobre los espermatozoides altamente diluidos mediante su adhesión al acrosoma. La incubación produce la migración del heterodímero a la región post-acrosomal, siendo eliminado de la superficie espermática. La adición del heterodímero a los medios de cocultivo entre gametos disminuye significativamente la capacidad fecundante de los espermatozoides. La preincubación de los espermatozoides de verraco tanto frescos como congelados preserva la viabilidad y motilidad espermáticas no afecta a la capacidad fecundante de los espermatozoides frescos de verraco y disminuye la capacidad fecundante de los espermatozoides congelados, la cual puede ser restaurada parcialmente mediante un lavado a través de un gradiente de Percoll. / The addition of 10% of seminal plasma from certain boars maintains or enhances the viability of largely extended boar spermatozoa in vitro. The protective effect of the PSP-I/PSP-II heterodimer on highly-extended boar spermatozoa could be related to the adhesion of the heterodimer to the acrosome. Exposures of the gametes to the heterodimer during in vitro gamete co-incubation significantly decrease the sperm penetration rates and number of spermatozoa per oocytes in denuded oocytes. The effect could be mediated by exposed ZP receptors. Exposure of fresh or frozen-thawed boar spermatozoa to PSP-I/PSP-II preserves sperm viability and motility. Although there is no obvious influence of the heterodimer on the capability of fresh diluted boar spermatozoa to penetrate homologous oocytes, PSP-I/II exerts a deleterious effect when frozen-thawed spermatozoa are used to penetrate IVM-oocytes. A subsequent washing through a Percoll gradient estored sperm function in some of the cells.

La separación espermática por citometría de flujo de los espermatozoides X e Y, es actualmente el único método eficaz para la obtención de descendencia de sexo deseado. En porcino, la selección del sexo de las camadas incrementaría notablemente los beneficios productivos de las explotaciones productoras de animales de alto valor genético al poder manejar los esquemas de selección, desviándolos hacia un sexo u otro según las necesidades de cada explotación. Recientemente, se han realizado avances importantes en la separación espermática mediante esta técnica en porcino. Sin embargo, es necesario un mayor conocimiento de diferentes aspectos relacionados con la eficiencia del proceso, con el efecto del procedimiento sobre la viabilidad y la capacidad fecundante de estos espermatozoides, así como del posible efecto perjudicial del propio proceso de separación sobre el ADN de los espermatozoides de verraco. Esta tesis recoge resultados derivados de experiencias destinadas a estudiar estos aspectos. / Flow cytometric sorting technology based on differential DNA content between X- and Y- spermatozoa is the only effective procedure for achieving offspring of the desired sex. In swine production the application of this method could improve significantly the productive benefits by planning the insemination to produce a specific sex. A detailed knowledge of aspects related to the efficiency of the sperm sorting technique and to aspects related with effects of sorting procedure on the viability and penetration ability of pig oocytes of flow sorted boar spermatozoa, and of the potential damaging effect of the procedure on sperm DNA is necessary to obtain optimal results. This thesis presents the results of experiences about, the usefulness and efficiency of this technology, followed by the analysis of sorted boar spermatozoa motility, viability, penetration ability. Results of mutagenic effect of Hoechst 33342 staining and sorting on sorted boar spermatozoa are also included.

El objetivo de este trabajo ha sido evaluar la capacitación y reacción acrosómica de espermatozoides de verraco eyaculados lavados a través de un gradiente de percoll y no lavados e incubados en medio de fecundación M199 suplementado con progesterona o con complejos cumulus-ovocito así como la penetración espermática de estos con ovocitos homólogos madurados in vitro. La determinación de la capacitación se realizó mediante el uso de lectinas (PNA, SJA y ECA) y citometría de flujo. Los resultados mostraron que la progesterona posee efecto protector sobre la vitalidad espermática y los mayores porcentajes de reacción acrosómica ocurren ente los 45-90 minutos de incubación, En cuanto a la penetración espermática no hubo diferencias entre espermatozoides lavados y no lavados. / The purpose of the present study was to evaluate the sperm capacitation and acrosome reaction of spermatozoa washed in Percoll and unwashed undergo in an in vitro incubation system with progesterone or cumulus-oocyte and the penetration rate in homologous oocytes matured in vitro. The evaluation was done with lectin (PNA, SJA and ECA) and flow cytometry. The results shown that progesterone had a protective effect on sperm vitality and the highest percentages of acrosome reaction were obtained between 45-90 minutes of incubation. The penetration rate was similar between washed and unwashed spermatozoa.

El NFAT5 es un factor de transcripción de la familia Rel, la cual incluye a los NFATc y los NF-[kappa]B. Hasta ahora, el NFAT5 había sido caracterizado principalmente como un factor de respuesta a estrés osmótico ya que regula la expresión de genes osmoprotectores y citoquinas en respuesta a hipertonicidad. En este trabajo hemos identificado y caracterizado una nueva función del NFAT5, la regulación de genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activados por la vía de los receptores de tipo Toll (TLR), importantes para la respuesta inmunitaria innata y adaptativa a una amplia variedad de estímulos patogénicos. Nuestros resultados muestran que el NFAT5 es un regulador importante en la ruta de los TLR, jugando un papel en la actividad de varios miembros de esta familia de receptores, tal y como lo hacen los factores de transcripción NF[kappa]B e IRF5. / NFAT5 is a transcription factor of the Rel family, which includes NFATc and NF-[kappa]B. NFAT5 has been mainly characterized as a hypertonicity responsive factor, since it regulates the expression of osmoprotective genes and cytokines in response to osmotic stress. In this work we have identified and characterized a novel role for NFAT5, the regulation of genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activated by the Toll-like receptor pathway (TLR), important for innate and adaptive immunity responses to a wide variety of pathogenic molecules. Our results show that NFAT5 is an important transcription factor of the TLR pathway, playing a role in the activity of several members of this receptor family, like other transcription factors such as NF-[kappa]B and IRF5.