O Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP) produz kits de diagnóstico para o Sistema Único de Saúde (SUS), que consistem em testes moleculares, realizados por reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction - PCR). Essa reação ocorre pela atividade da enzima Taq DNA Polimerase (Taq). O IBMP fabrica a Taq a partir do cultivo de células bacterianas, em conformidade às Boas Práticas de Fabricação (BPF) e pretende produzi-la a partir de um banco de células provindas de um mesmo clone visando o aumento da homogeneidade e reprodutibilidade do processo produtivo. O objetivo do presente trabalho é estabelecer um banco de células de trabalho (BCT) e avaliar sua estabilidade para a produção da enzima Taq, partindo de um banco de células mestre (BCM) estabelecido em Bio-Manguinhos. O estabelecimento do BCT consiste em cultivar colônias do BCM, caracterizá-las, avaliar desempenho, e eleger células adequadas para compor o BCT. O estudo da estabilidade contempla testes para comprovar que as células retêm a capacidade de produzir a Taq ao longo do tempo (i.e., viabilidade celular, estabilidade plasmídica, cinética de crescimento, indução da expressão, extração e dosagem do DNA plasmidial, análise de restrição e avaliação plasmidial). O critério decisivo para a seleção de um dos clones para compor o BCT foi o resultado da cinética de crescimento. A estabilidade foi estudada em 10 avaliações realizadas mês a mês. Nelas, a viabilidade celular foi superior a 1,0 x 106 UFC/mL, mostrando que as células permanecem com capacidade de realizar seu metabolismo e reprodução. O crescimento até a fase exponencial se deu entre 6 e 7 horas de cultivo, com taxa específica de crescimento superior a 0,4 min-1 . Os cultivos acrescidos de 1 mM de IPTG expressaram a enzima Taq DNA Polimerase, revelando a qualificação das células para o fim proposto. A estabilidade plasmídica foi superior a 90%, indicando que o plasmídeo pBioMTaq se mantém estável e com boa capacidade de replicação. A concentração plasmidial média foi de 338 ng/μL, e em todos os meses foi maior que 100 ng/μL. Na análise de restrição os plasmídeos foram corretamente clivados e na avaliação plasmidial houve adequada amplificação do fragmento de 500 pb, demonstrando que o plasmídeo se mantém íntegro e estável, com sequências compatíveis com sua construção. O BCT foi testado como substrato para um processo fabril típico do IBMP de produção da Taq DNA polimerase, se apresentando satisfatório em todas as etapas em que foi avaliado. Esses resultados indicam que o banco estabelecido se manteve estável ao longo de 10 meses e está apto a ser utilizado como protótipo para um BCT em conformidade às BPF. / The Molecular Biology Institute of Paraná (Instituto de Biologia Molecular do Paraná - IBMP) produces diagnostic kits for the Brazilian Unified National Health System (Sistema Único de Saúde - SUS), that consist in molecular tests, carried out by polymerase chain reaction (PCR). This reaction is performed by the enzyme Taq DNA Polymerase (Taq). The IBMP manufactures Taq from bacterial cell culture in accordance with Good Manufacturing Practices (GMP) and intends to produce it from a cell bank using cells from the same clone in order to increase the homogeneity and reproducibility of the production process. The objective of the present work is to establish a working cell bank (WCB) and to evaluate its stability for the production of the Taq enzyme, starting from a master cell bank (MCB) established in BioManguinhos. The WCB establishment consists of cultivating MCB colonies, characterizing them, evaluating performance, and electing proper cells to compose the WCT. The stability study contemplates tests to prove that cells retain the ability to produce Taq over time (i.e., cell viability, plasmid stability, growth kinetics, expression induction, plasmid DNA extraction and dosage, restriction analysis and plasmid evaluation). The decisive discretion for the selection of one of the clones to compose BCT was the result of growth kinetics. Stability was studied in 10 month-to-month evaluations. In them, cell viability was higher than 1,0 x 106 CFU/mL, showing that the cells remain capable of performing their metabolism and reproduction. Growth to the exponential phase occurred between 6 and 7 hours of culture, with a specific growth rate greater than 0.4 min-1 . The cultures with 1 mM IPTG expressed Taq DNA polymerase enzyme, revealing the qualification of the cells to the intended purpose. The plasmid stability was greater than 90%, indicating that the plasmid pBioMTaq remains stable and has good replication ability. The mean plasmid concentration was 338 ng/μL, and in all months it was greater than 100 ng/μL. In the restriction analysis the plasmids were correctly cleaved and in the plasmid evaluation there was adequate amplification of the 500 bp fragment, demonstrating that the plasmid remains intact and stable, with compatible sequences with its construction. The WCB was tested as substrate for a typical IBMP production process of Taq DNA polymerase, presenting satisfactory in all the stages in which it was evaluated. These results indicate that the established bank remained stable over 10 months and is apt to be used as a prototype for a WCB in compliance with GMP.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:13:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mauricio Spagnolo Adames.pdf: 2594661 bytes, checksum: 4bbc4710428addfb51d141108a994f72 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the effects of fructose as a modulator of sperm movement on the optimization of the sperm: oocyte in artificial reproduction procedures with the use of cryopreserved semen in Rhamdia quelen. Through the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) were evaluated in four replicas the motility rates, speed and time of sperm activation of the cryopreserved semen after thawing (10 seconds after activation) into six activating solutions containing fructose, concentrated at 0.0; 0.9; 1.8; 2.7; 3.6 and 4.5%. For the testing of fertilization an factorial experimental design (5 x 6) composed of five sperm:oocyte ratio (1x104, 3x104, 5x104, 7x104 e 9x104), six activating solutions containing fructose (0.0; 0.9; 1.8; 2.7; 3.6 and 4.5%) and three replicas or experimental blocks ("pools" of oocytes from three female groups). The effects were evaluated over variable rates of fertilization, hatching and larval normality. In the evaluation of sperm variables a regression analysis showed effect (p<0,05) of the solutions in motility, speed and duration of sperm activation. It was also verified effect (p<0,05) in the index obtained from clustering of such variables called index of sperm movement, with results of theoretical peak performance when 2.85% of fructose in solutions was employed. In the fertilization assay the analysis of response surface showed interactive effect (p<0.05) between sperm:oocyte ratio and fructose concentrations in activating solutions, on the fertilization and hatching rates and of the clustering index of two variables called index of reproductive success. According to the statistical model, sperm:oocyte ratio can be reduced keeping up the rates of fertilization and hatching. The inclusion of fructose in activating solutions has promoted similar theoretical maximum levels for fertilization and hatching when compared to fertilization only in distilled water, however with a saving of 17.77% of mobile spermatozoa: oocyte. The larval normality showed effect (p<0.05) just for the block. It is concluded that the sperm:oocyte ratio can be reduced through the employment of fructose-based activating solutions, without affecting the fertilization, hatching rates and larval normality. / O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da frutose como modulador do movimento espermático sobre a otimização da relação espermatozoide:ovócito em procedimentos de reprodução artificial com o uso do sêmen do Rhamdia quelen criopreservado. Através do Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) foram avaliadas em quatro réplicas a motilidade, a velocidade e o tempo de duração da ativação espermática do sêmen criopreservado após o descongelamento (10 segundos após a ativação) em seis soluções ativadoras contendo frutose na concentração de 0,0; 0,9; 1,8; 2,7; 3,6 e 4,5%. Para o ensaio de fertilização foi aplicado um delineamento experimental em esquema fatorial (5 x 6) composto de cinco relações espermatozoides:ovocito (1x104, 3x104, 5x104, 7x104 e 9x104), seis soluções ativadoras contendo frutose (0; 0,9; 1,8; 2,7; 3,6 e 4,5%) e três replicas ou blocos experimentais ( pools de ovócitos provenientes de três grupos fêmeas). Os efeitos foram avaliados sobre as taxas de fertilização, eclosão e normalidade larval. Na avaliação das variáveis espermáticas, a análise de regressão mostrou efeito (p<0,05) das soluções na motilidade, velocidade e tempo de duração da ativação espermática. Também foi verificado efeito (p<0,05) no índice obtido pelo agrupamento destas variáveis, denominado de índice de movimento espermático, com resultados de máximo desempenho teórico quando empregado 2,85% de frutose na solução ativadora. No ensaio de fertilização a analise de superfície de resposta mostrou efeito interativo (p<0,05) entre a relação espermatozoides:ovócito e as concentrações de frutose das soluções ativadoras, sobre as taxas de fertilização e de eclosão e do índice de agrupamento das duas variáveis denominado índice de sucesso reprodutivo. De acordo com o modelo estatístico a relação espermatozoides:ovócito foi reduzida mantendo-se as taxas de fertilização e eclosão. A inclusão de frutose nas soluções ativadoras promoveu níveis máximos teóricos semelhantes para fertilização e eclosão quando comparada à fertilização apenas em água destilada, porém com uma economia de 17,77% de espermatozoides móveis. A normalidade larval apresentou efeito (p<0,05) apenas do bloco. Conclui-se que a relação espermatozóides:ovócito pode ser reduzida através do emprego de soluções ativadoras a base de frutose, sem causar prejuízos ás taxas de fertilização e eclosão e normalidade larval.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_liziane_vianna.pdf: 321138 bytes, checksum: e8e76002b27c6cb6d710d3cd63a4c088 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / The objective of this study was to evaluate alternative methods to the gradient of Percoll® for sperm selection used in bovine in vitro production systems. We evaluated the following parameters: sperm quality, embryo development, the viability after cryopreservation and sex ratio of bovine embryos produced in vitro. Four treatments were performed: percoll group (90 and 45%) 4 mL, centrifuged at 700xg for 20 min; minipercoll group (90 and 45%) 800 &#956;L, centrifuged at 700xg for 5 min; miniisolate group (90 and 45%) 800 &#956;L, centrifuged at 700xg for 5 min; and minioptiprep group (30,28 and 26%) 1,2 mL, centrifuged at 900xg for 15 min. Different gradients did not affect the semen characteristics compared with the evaluation immediately after thawing (P>0,05). It was only observed a decrease in total motility in minioptiprep group (P<0,05). The cleavage rates were similar among the percoll and miniisolate groups (P>0,05). Minipercoll and minioptiprep groups were lower to percoll (P<0,05) and similar to isolate (P>0,05). At Day 7 the developmental rates were higher in miniisolate group than other groups (P<0,05). But at D8 the developmental rates of minigradients were similar to percoll (P>0,05). Among the minigradientes, the miniisolate was higher to minipercoll and minioptiprep (P<0,05). The treatments did not affect the sex ratio expected of 50:50% (P.0,05) and there was no difference among the four groups (P>0,05). Also, there was no difference in survival rates after vitrification (P>0,05). In conclusion, the miniisolate and the minioptiprep groups, in the concentration and volume used in our experiment, reached similar results to the percoll group. So, they are alternatives to the gradient of Percoll® in the routine of IVP bovine embryos. / O objetivo do presente estudo foi avaliar possíveis alternativas ao gradiente de Percoll®, para seleção espermática, no sistema de produção in vitro de embriões bovinos. Foram avaliados os seguintes parâmetros: qualidade espermática, desenvolvimento embrionário, viabilidade após a criopreservação e a proporção sexual dos embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados quatro tratamentos: grupo percoll (90 e 45%) - 4 mL, centrifugado 700xg por 20 min; grupo minipercoll (90 e 45%) 800 &#956;L, centrifugado a 700xg por 5 min; gupo miniisolate (90 e 45%) 800 &#956;L, centrifugado a 700xg por 5 min; e grupo minioptiprep (30, 28 e 26%) - 1,2 mL, centrifugado a 900xg por 15 min. A passagem pelos gradientes não afetou as características do sêmen em comparação com a avaliação realizada logo após o descongelamento (P>0,05), sendo somente observada uma diminuição da motilidade total para o grupo minioptiprep (P<0,05). Quanto a produção in vitro de embriões, não foi observada diferença na taxa de clivagem entre os grupos percoll e miniisolate (P>0,05), sendo o minipercoll e o minioptiprep inferiores ao percoll (P<0,05) e semelhantes ao miniisolate (P>0,05). No desenvolvimento embrionário, o miniisolate foi superior aos demais grupos em D7 (P<0,05). Em D8, os três minigradientes foram semelhantes ao percoll (P>0,05). Entre os minigradientes, o miniisolate foi superior ao minipercoll e ao minioptiprep (P<0,05). A passagem pelos gradientes não afetou a proporção sexual esperada de 50:50%, além disso, não houve diferença entre os grupos (P>0,05). Não houve diferença quanto à taxa de sobrevivência a vitrificação nos quatro grupos em 48 h (P>0,05). Concluímos que o miniisolate e o minioptiprep, nas concentrações e volumes estudados neste trabalho, atingiram resultados semelhantes ao percoll. Portanto, são alternativas a utilização do gradiente de Percoll®, na rotina de produção de embriões bovinos in vitro.

Submitted by Michele Mologni (mologni@unoeste.br) on 2018-08-30T12:23:36Z No. of bitstreams: 1 Alan Brunholi Giroto.pdf: 1342184 bytes, checksum: eec4738d5199b553c1a6ae446589328b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-30T12:23:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alan Brunholi Giroto.pdf: 1342184 bytes, checksum: eec4738d5199b553c1a6ae446589328b (MD5) Previous issue date: 2018-05-25 / In this study we aimed to evaluate how PAPP-A addition during in vitro maturation affected the IGF-1 quantification, transcript abundance related to cumulus oocyte complexes (COCs) and blastocysts quality, embryonic yield, as well as post-warming survival. We matured COCs through a 24 h treatment of TCM199 serum-free medium, either with PAPP-A supplementation (100 ng/mL; PAPP-A group) or without (control). Maturation medium was collected for IGF-1 quantification, and matured COCs were used for in vitro fertilization and culturing. The PAPP-A group exhibited 1.27 times higher IGF-1 concentrations than control. A comparison of in vitro embryo production across the groups found no difference in cleavage rate, embryonic yield, and survival, 3 and 24 h post-cryopreservation. In PAPP-A oocytes, only TXNRD1 was up-regulated. However, in PAPP-A cumulus cells, VNN1 and HDAC2 were up-regulated, while AGPAT1, AGPAT9, FASN, CASP3, EGFR, HAS2, IMPDH1, and MTIF3 were down-regulated. Finally, in PAPP-A blastocysts, CPT2, CASP9, DNMT3A, TFAM, and KRT8 were up-regulated, while ATF4, CASP3, and IFITM3 were down-regulated. We concluded that PAPP-A addition increased IGF-1 but did not influence embryonic yield and survival. Nevertheless, elevated IGF-1 could improve embryo competence through modulating expression of genes involved with lipid metabolism, oocyte competence and apoptosis in COCs and blastocysts. / A protéina sérica associada à prenhez (PAPP-A) é capaz de modular a biodisponibilidade do IGF-1 (fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1) pela quebra das ligação com as proteínas de ligação do IGF (IGFBPs). O objetivo foi avaliar como a adição da PAPP-A durante a maturação in vitro (MIV) afetou a biodisponibilidade de IGF-1, a abundância de transcritos nos oócitos e células do cumulus e blastocistos, a produção embrionária e a sobrevivência pós aquecimento. Foi realizada a MIV de 24 h em complexos cumulus oócitos (CCOs – 20/grupo) oriundos de abatedouro, em meio TCM199 livre de soro, com adição de PAPP-A (100 ng/mL; grupo PAPP-A) ou sem (controle). O IGF-1 foi quantificado no meio de maturação e os CCOs maturados foram utilizados na fertilização e cultivo in vitro. Oócitos e células do cúmulus foram separados; e blastocistos foram congelados para a realização da expressão gênica. Taxa de clivagem e produção de blastocistos foram calculados como porcentagem e transformados para arco seno. Dados de expressão gênica foram normalizados com a média do grupo de controle. Os resultados foram analisados por test t, porém a criopreservação embrionária foi testada por Qui-quadrado (JMP software, SAS). Diferenças foram consideradas significativas quando p ≤ 0,05. O grupo PAPP-A apresentou 27% mais concentração de IGF-1 biodisponível. Na produção in vitro de embriões, não encontrou-se diferença na taxa de clivagem, produção e sobrevivência embrionária. Apenas o gene TXNRD1 mostrou maior expressão nos oócitos do grupo PAPP-A. No entanto, nas células do cumulus PAPP-A, o VNN1 e HDAC2 apresentaram maior expressão, enquanto os genes AGPAT1, AGPAT9, FASN, CASP3, EGFR, HAS2, IMPDH1 e MTIF3 apresentaram menor expressão. Nos blastocistos PAPP-A, os genes CPT2, CASP9, DNMT3A, TFAM e KRT8 apresentaram maior expressão, enquanto os genes ATF4, CASP3 e IFITM3 apresentaram menor expressão. Em conclusão, a adição de PAPP-A durante a MIV aumentou o IGF-1 biodisponível, mas não influenciou a produção e a sobrevivência embrionária após desvitrificação. No entanto, o aumento do IGF-1 biodisponível pode melhorar a competência embrionária através da modulação da expressão gênica em oócitos, células do cúmulus e blastocistos.

Linhagens celulares humanas têm atraído grande interesse devido a sua capacidade de glicosilar proteínas de maneira mais semelhante às proteínas nativas humanas, reduzindo o potencial de respostas imunológicas contra epítopos não humanos. No entanto, por se tratar de uma aplicação recente, essas células ainda não foram extensamente caracterizadas e cultivadas em condições reprodutíveis da escala industrial, ou seja, em suspensão e em meios de cultura livres de soro fetal bovino (SFB). Em função disso, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer culturas livres de SFB e em suspensão para as linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HepG2 e HKB-11, que têm despertado grande interesse devido ao potencial de produção de proteínas recombinantes. Para isso, quatro formulações comerciais livres de SFB foram avaliadas. As células que apresentaram bons resultados na adaptação aos meios realizada em garrafas estáticas foram então adaptadas para crescimento em suspensão. Foi possível realizar a adaptação satisfatória da célula HKB-11 ao meio FreeStyle e da célula SK-Hep-1 ao meio SFMII bem como a criopreservação das mesmas também em condições livres de SFB. A caracterização cinética das células adaptadas mostrou que a célula HKB-11 apresentou concentração celular quatro vezes superior a da célula SK-Hep-1 (8,6x106 e 1,9x106 células/mL, respectivamente) e apresentou crescimento celular durante 18 dias em cultura. A velocidade específica de crescimento máxima (?max) foi semelhante nas duas células (0,0159 h-1 para a HKB-11 e 0,0186 h-1 para SK-Hep-1). A limitação do crescimento das células adaptadas não parece estar associada à exaustão de glicose e glutamina, tampouco à formação de lactato em concentrações inibitórias. Todavia, para ambos os casos, foi observada produção de amônia em concentrações consideradas inibitórias (2 - 5 mM). De maneira geral, foi possível estabelecer culturas celulares em condições compatíveis com o desenvolvimento de um bioprocesso reprodutível, seguro e em concordância com as boas práticas de fabricação. / Human cell lines have attracted great interest since they are capable of producing glycosylated proteins in a more similar way to native human proteins, reducing the potential for immune responses against non-human epitopes. However, these human cell lines have not been extensively characterized and cultured in large scale and in serum-free suspension conditions. As a result, the main objective of this work was to adapt three human cell lines: SK-Hep-1, HepG2 and HKB-11 to serum-free suspension cultures, since they are promising systems of recombinant protein expression. For this task, four commercial serum-free media were tested. Adapted cell lines in T-flasks were further adapted to suspension cultures. Results showed that both HKB-11 and SK-Hep-1 were adapted to serum-free suspension cultures in FreeStyle and SFMII, respectively and were cryopreservated in serum-free formulations. Kinetic characterization showed that HKB-11 cell concentration was four times higher than SK-Hep-1 cell (8,6x106 and 1,9x106 cells/ml, respectively) and showed cell growth in culture over 18 days. The maximum specific growth rate (?max) was similar for both cell lines (0,0159 h-1 to HKB-11 and 0,0186h-1 to SK-Hep-1). Growth limitation of adapted human cell lines does not seem to be associated with depletion of glucose and glutamine, nor with the formation of lactate in inhibitory concentrations. However, in both cases, ammonia production achieved inhibitory concentrations (2 - 5 mM). In general, it was possible to establish human cell cultures that are compatible with reproducible and safe bioprocess conditions and in compliance with good manufacturing practices.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-05-05T11:17:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ProducaoInvitroEmbrioes.PDF: 1935608 bytes, checksum: 2cd63044454d30a88b39d3bc30f867e4 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-05-09T17:24:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ProducaoInvitroEmbrioes.PDF: 1935608 bytes, checksum: 2cd63044454d30a88b39d3bc30f867e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-09T17:24:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ProducaoInvitroEmbrioes.PDF: 1935608 bytes, checksum: 2cd63044454d30a88b39d3bc30f867e4 (MD5) Previous issue date: 2014-06-13 / Trata-se da aplicação de biotecnicas de reprodução na espécie Pecari tajacu para melhorar seu potencial para a criação em cativeiro visando sua produção, conservação e multiplicação de recursos genéticos. Para determinar o tempo de maturação in vitro foram utilizados 48 fêmeas, foram selecionados 69 CCOs e divididos em 4 grupos por idade e tempo de MIV, e então submetidos a ativação partenogenética em Ionomicina e 6-DMAP. Para análise da progressão meiótica 165 oócitos foram divididos em 4 grupos conforme a suplementação de hormônios na MIV e tempo de maturação. Na criopreservação foram utilizados espermatozoides epididimários de 9 machos, diluídos em Tris-frutose e ACP-120 e divididos em grupos de refrigeração a 4ºC e congelamento a -196ºC e presença da glutationa (GSH), foram avaliados os parâmetros motilidade, vigor e viabilidade após a diluição a fresco e criopreservação. Para a produção de embriões, 97 oócitos após MIV de 36 horas foram divididos grupos de ativação partenogenética, FIV e ICSI. Através da ativação partenogenética obteve-se taxas de clivagens (47%) para os oócitos de fêmeas com menos de 2 anos submetidos a MIV em 36 horas, em todos os grupos observaram-se clivagens porém não houve diferenças significativas (P>0,05) entre os grupos analisados, observou-se taxa de blastocisto (15,4%) somente no grupo de oócitos ativados após MIV de 44 horas. Na analise da progressão meiótica, em todos os tempos analisados foram encontrados oócitos em MII. Na criopreservação dos espermatozoides observaram-se queda nos parâmetros analisados nos dois diluidores em todos os grupos, a presença da glutationa não interferiu significativamente nos parâmetros analisados. No resfriamento, as taxas de motilidade e viabilidade foram superiores no ACP-120 (> 50%) e no congelamento em tris-frutose (33% e 18%). A produção de embriões in vitro foi bem sucedida na ativação partenogenética (62,9%) e na ICSI (52,6%), na FIV as taxas foram baixas (7%), a produção de blastocisto ocorreu somente nos embriões partenotos (4,5%). Os resultados mostraram a viabilidade de biotecnicas reprodutivas como conservação de gametas, e produção in vitro de embriões na espécie Pecari tajacu. / This work considers the application of reproduction biotechniques on species Pecari tajacu designed to improve its potential for upbringing in captivity and aiming its production, conservation and the multiplication of genetical resources. To determine the maturation time in vitro, 48 females were utilized. An amount of 69 CCOs were selected and divided in 4 groups, per age and per time of MIV. They were then submitted to parthenogenetic activation in ionomycin and 6-DMAP. For the meiotic progression analysis, 165 oocytes were divided in 4 groups according to supplementation of hormones in MIV and time of maturation. For the cryopreservation, epididymal sperm of 9 males were utilized, diluted in Tris-fructose and ACP-120 and divided in groups of refrigeration at 4°C and freezing at -196 °C in the presence of glutathione (GSH), where the parameters of motility, vigor and viable sperm were evaluated, after fresh dilution and cryopreservation. For the embryo production, 97 oocytes after MIV of 36 hours were divided in groups of parthenogenetic activation, IVF and ICSI. Through parthenogenetic activation the rates of cleavages were obtained (47%) for the oocytes of females with less than 2 years of age, submitted to MIV in 36 hours. In all groups cleavages were observed, but with no significant difference (P>0,05) among the groups analysed. One blastocyst rate of 15,4% was observed only in the group of oocytes activated after MIV of 44 hours. In the meiotic progression analysis, in all times analyzed oocytes were found in MII. In the cryopreservation of the spermatozoa it was observed a drop of the parameters analyzed in the two extenders in all groups. The presence of glutathione did not interfere significantly in the parameters analyzed. In the freezing, the rates of motility and viable sperm were superior in ACP-120 (> 50%) and in the freezing in tris-fructose, 33% and 18%. The production of embryos in vitro was well succeeded in the parthenogenetic activation (62,9%) and in ICSI (52,6%). In IVF the rates were low (7%). The production of blastocyst occurred only in the partenotes embryos (4,5%). The results of this work showed the feasibility of reproductives biotechniques, such gametes conservation and in vitro production of embryos of the species Pecari tajacu.

Linhagens celulares humanas têm atraído grande interesse devido a sua capacidade de glicosilar proteínas de maneira mais semelhante às proteínas nativas humanas, reduzindo o potencial de respostas imunológicas contra epítopos não humanos. No entanto, por se tratar de uma aplicação recente, essas células ainda não foram extensamente caracterizadas e cultivadas em condições reprodutíveis da escala industrial, ou seja, em suspensão e em meios de cultura livres de soro fetal bovino (SFB). Em função disso, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer culturas livres de SFB e em suspensão para as linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HepG2 e HKB-11, que têm despertado grande interesse devido ao potencial de produção de proteínas recombinantes. Para isso, quatro formulações comerciais livres de SFB foram avaliadas. As células que apresentaram bons resultados na adaptação aos meios realizada em garrafas estáticas foram então adaptadas para crescimento em suspensão. Foi possível realizar a adaptação satisfatória da célula HKB-11 ao meio FreeStyle e da célula SK-Hep-1 ao meio SFMII bem como a criopreservação das mesmas também em condições livres de SFB. A caracterização cinética das células adaptadas mostrou que a célula HKB-11 apresentou concentração celular quatro vezes superior a da célula SK-Hep-1 (8,6x106 e 1,9x106 células/mL, respectivamente) e apresentou crescimento celular durante 18 dias em cultura. A velocidade específica de crescimento máxima (?max) foi semelhante nas duas células (0,0159 h-1 para a HKB-11 e 0,0186 h-1 para SK-Hep-1). A limitação do crescimento das células adaptadas não parece estar associada à exaustão de glicose e glutamina, tampouco à formação de lactato em concentrações inibitórias. Todavia, para ambos os casos, foi observada produção de amônia em concentrações consideradas inibitórias (2 - 5 mM). De maneira geral, foi possível estabelecer culturas celulares em condições compatíveis com o desenvolvimento de um bioprocesso reprodutível, seguro e em concordância com as boas práticas de fabricação. / Human cell lines have attracted great interest since they are capable of producing glycosylated proteins in a more similar way to native human proteins, reducing the potential for immune responses against non-human epitopes. However, these human cell lines have not been extensively characterized and cultured in large scale and in serum-free suspension conditions. As a result, the main objective of this work was to adapt three human cell lines: SK-Hep-1, HepG2 and HKB-11 to serum-free suspension cultures, since they are promising systems of recombinant protein expression. For this task, four commercial serum-free media were tested. Adapted cell lines in T-flasks were further adapted to suspension cultures. Results showed that both HKB-11 and SK-Hep-1 were adapted to serum-free suspension cultures in FreeStyle and SFMII, respectively and were cryopreservated in serum-free formulations. Kinetic characterization showed that HKB-11 cell concentration was four times higher than SK-Hep-1 cell (8,6x106 and 1,9x106 cells/ml, respectively) and showed cell growth in culture over 18 days. The maximum specific growth rate (?max) was similar for both cell lines (0,0159 h-1 to HKB-11 and 0,0186h-1 to SK-Hep-1). Growth limitation of adapted human cell lines does not seem to be associated with depletion of glucose and glutamine, nor with the formation of lactate in inhibitory concentrations. However, in both cases, ammonia production achieved inhibitory concentrations (2 - 5 mM). In general, it was possible to establish human cell cultures that are compatible with reproducible and safe bioprocess conditions and in compliance with good manufacturing practices.