Com os processos de preservação do sêmen, os espermatozoides sofrem danos devido à indução de alterações estruturais e funcionais na membrana e, aliada a estrutura anatômica do cérvix da ovelha, repercute na redução de fertilidade após a inseminação artificial. Muitos protocolos de congelação e de refrigeração aliados a inúmeros diluentes, vêm sendo estudados, a fim de diminuir os danos causados a essas células e aumentar sua capacidade fertilizante. Para otimizar os processos de congelação e de refrigeração, os objetivos deste estudo foram determinar (1) a influência do método de congelação na motilidade, viabilidade, potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos acrossomais do semen ovino criopreservado e (2) a influência de três diluentes comerciais na motilidade, viabilidade, potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos acrossomais do sêmen ovino refrigerado. Doze ejaculados foram coletados, diluídos e congelados utilizando (A) uma curva manual de congelação (em vapor de nitrogênio liquido) e (B) um congelador programável (CL-8800, Cryologic Freeze Control®). Na curva A, as amostras foram refrigeradas e congeladas à 30°C/min. Na curva B, houve uma redução de temperatura de 20°C até -50°C durante 37min. Imediatamente após as curvas de criopreservação, as amostras foram submersas em nitrogênio líquido (-196ºC). Para o descongelamento, as palhetas foram submetidas à 37°C por 20seg e analisadas. Para os protocolos de refrigeração, o sêmen diluído em Botubov®, Bovimix® e TYB® foi armazenado à 5°C e à 15°C, e avaliado em 0, 24, 48 e 72h pós coleta. As análises de viabilidade e potencial de membrana mitocondrial (MMP) foram realizadas por citometria de fluxo, e a motilidade e os defeitos acrossomais foram avaliados microscopicamente. Motilidade (29%), viabilidade (18%) e MMP (26%) dos espermatozoides criopreservados com o diluente Bovimix® e a curva B foram significativamente (P<0,05) superiores do que todos os outros tratamentos. As amostras refrigeradas e diluídas com o diluente Bovimix® apresentaram resultados superiores, tanto à 5°C quanto à 15°C, para MMP (44% e 51%, respectivamente) e viabilidade (60% e 53%, respectivamente) 72h pós coleta, quando comparado com as amostras diluídas com Botubov® e TYB®. Em conclusão, os protocolos de congelação/descongelação e de refrigeração utilizados nestes experimentos, reduziram a motilidade, viabilidade, MMP e aumentaram os defeitos acrossomais quando comparados com o sêmen fresco. Os protocolos de congelação/descongelação prejudicaram mais a função espermática quando comparado com os protocolos de refrigeração. Por fim, os resultados sugerem que as amostras espermáticas diluídas com o diluente Bovimix® causou menos danos às células espermáticas do que as amostras diluídas com os diluentes Botubov® e TYB®, tanto nos protocolos de congelação, quanto nos protocolos de refrigeração. / The process of sperm preservation damages spermatozoa due to induction of structural and functional changes in the membrane, and allied to the ewe cervix anatomy, reflects the reduction in fertility after artificial insemination. Many semen preservation protocols including freezing and cooling rates coupled with different extenders have been studied in order to reduce sperm cryo-damage, increase the fertilizing capacity and increase the time of storage. To improve freezing and cooling processes, the objectives of this study were to determine (1) the influence of freezing method on sperm motility, viability, mitochondrial membrane potential and defected acrosome of cryopreserved sperm and (2) the influence of three commercial extenders on the motility, viability, mitochondrial membrane potential and defected acrosome of liquid storaged and frozen-thawed sperm. Twelve semen samples were collected from two mature rams, pooled, and diluted in Botubov®, Bovimix® and TYB®, and frozen using (A) a manual freezing method (liquid nitrogen vapor) and (B) an automated programmable freezer (CL-8800, Cryologic Freeze Control®). For curve A, semen samples were maintained at 37°C and then cooled/frozen at 30°C/min. For curve B, the temperature reduced from 20°C to -50°C during 37min. Immediately, after cryopreservation curves, samples were plunged and stored into liquid nitrogen (-196ºC). Then, the straws were thawed at 37°C for 20sec, and analyzed. For cooling studies, pooled ram semen was diluted in Botubov®, Bovimix® and TYB®, stored at 5°C and at 15°C, and evaluated at 0, 24, 48 and 72 h post collection. For viability and mitochondrial membrane potential (MMP) assessments, semen samples were stained and analyzed by flow cytometry. Motility and defected acrosome assessments were analyzed microscopically. Motility (29%), viability (18%) and MMP (26%) of spermatozoa cryopreserved in Bovimix® coupled to curve B were significantly (P<0.05) higher than all other treated groups. Semen samples diluted with Bovimix® and stored at 5°C and at 15°C yielded better MMP (44% and 51%, respectively) than the samples diluted in Botubov® and in TYB®, and also showed higher viability characteristics at 5°C and at 15°C (60% and 53%, respectively) 72h post collection. In conclusion, freezing/thawing and cooling protocols used in these experiments reduced sperm motility, viability, MMP and increased the defects of acrosomes when compared to fresh semen. Freezing/thawing protocols harmed more spermatozoa function than cooling protocols. Furthermore, our results suggest that the semen samples diluted in the extender Bovimix® caused the least cellular injury than the samples diluted in Botubov® and in TYB® on freezing and on cooling protocols.

O apelo pela conservação ambiental e o significativo aumento no número de organismos cultivados de alto valor genético demandam tecnologias que permitam conservar sua genética, mesmo após a morte do animal. A criopreservação de gametas possibilita a preservação da genética de espécies ameaçadas e de interesse comercial, prolongando sua vida reprodutiva evitando assim a perda de material genético por doenças, catástrofes, transferência de animais ou perda do habitat natural. A criopreservação tem sido aplicada à conservação de ovários e tecido ovariano, no entanto, há muitas controvérsias acerca de qual seria o melhor protocolo a ser utilizado. Tendo isso em vista, o presente estudo teve como objetivo avaliar a morfologia do tecido ovariano de zebrafish criopreservado em cápsula de metal com o uso de diferentes soluções crioprotetoras. As soluções crioprotetoras utilizadas foram: 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol (SC1); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO (SC2); 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol + 0,5 M sacarose (SC3); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose (SC4). Após o descongelamento a integridade de cinco estágios de desenvolvimento folicular foi avaliada em cada grupo. A morfologia celular foi observada através de análise histológica. A análise dos dados mostrou que os folículos em estágio I e II foram os melhores criopreservados em todos os grupos experimentais. Sendo que, os grupos SC4 e SC2 foram os que apresentaram os melhores resultados, respectivamente com 88,26% e 84,2% de folículos sem alterações morfológicas. Já os estágios foliculares mais avançados de desenvolvimento (estágios IV e V) apresentaram-se com alterações em todos os grupos. Portanto, apesar do sucesso na criopreservação dos estágios foliculares mais iniciais (I e II) foi possível identificar alterações morfológicas em todos os grupos avaliados. Dentre as principais alterações identificadas estão a aglutinação do citoplasma e enrugamento e ruptura da membrana do envelope celular. Ao avaliar os resultados pode-se concluir que apesar do uso da capsula de metal em associação com as soluções SC4 e SC2 apresentarem os melhores resultados, as soluções SC1 e SC3 também foram eficientes na manutenção da integridade morfológica de folículos imaturos, e portanto essa metodologia pode ser utilizada com sucesso na criopreservação de folículos imaturos. / The appeal for environmental conservation and the significant increase in the number of farmed organisms with high genetic value demand technologies to allow preserving their genetics, even after the death. Cryopreservation of gametes allows the preservation of genetics of the endangered and commercial species, prolonging their reproductive life. Furthermore, this technology prevents the loss of genetic material caused by diseases, disasters, transfer of animals or loss of natural habitat. Cryopreservation has been applied to the conservation of ovaries and ovarian tissue, however, there are many controversies regarding what would be the best protocol to use. Thus, the aim of this study was to evaluate the morphology of cryopreserved zebrafish ovarian tissue using a metal capsule with four different cryoprotectant solutions. The cryoprotectant solutions used were: 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol (CS1); 1.5M methanol + 5.5 M Me2SO (CS2); 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose (CS3); Methanol + 1.5 M 5.5 M 0.5 M sucrose + Me2SO (CS4). After heating the integrity of the five stages of follicular development was assessed in each group. Cell morphology was observed by histological analysis. The thermal gradient inside the capsule and the sample was verified by a thermistor Pt500, model Keithley 2001A. The data analysis shows that the follicles at stage I and II were better cryopreserved among all experimental groups. The treatments CS4 and CS2 showed the best results, respectively with 88.26% and 84.2% of follicles without morphological changes in stage I. The most advanced follicular development stages (stages IV and V) showed changes in all treatments. Therefore, despite the successful cryopreservation of earlier follicular stages (I and II), it was possible to identify morphological changes in all the groups. Among the main changes identified, agglutination of cytoplasm and rupture of cell and wrinkling of the egg envelope could be observed. Despite the use of the metal capsule in association with the CS4 and CS2 solutions showed the best results, CS1 and CS3 solutions were also effective in maintaining the morphological integrity of immature follicles, therefore this method can be successfully used in the cryopreservation of immature follicles.

A inseminação artificial é utilizada como uma importante ferramenta para o melhoramento reprodutivo, tanto com sêmen resfriado ou congelado. O primeiro experimento teve como objetivo identificar um tampão de pH para resfriamento de sêmen de pôneis por 48 horas a 5°C e 15°C. O efeito de cinco tampões (TES (ácido N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoetanosulfônico), PIPES (ácido piperaxín-N,N'-bis(2-etanosulfônico)), BES (ácido N,N-Bis(2-18hidroxietil)-2-aminoetanosulfônico), MES (ácido 4-morfolinoetanosulfônico) e HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfônico)) foi avaliado em um diluente composto de leite em pó desnatado e glicose. Os testes do diluente com os tampões BES, MES e TES foram conduzidos com o sêmen fresco de oito pôneis e no sêmen resfriado por 48 h a 15°C. Uma amostra de cada grupo foi utilizada para análise da motilidade, pH, osmolaridade, teste hiposmótico, atividade mitocondrial (MTT) e integridade de membrana através das sondas fluorescentes. O pH e a osmolaridade dos diluentes sem o sêmen também foram avaliados. Os dados foram analisados por análise de variância e pelo teste de Tukey, quando P < 0.05 foi significante. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm e TES 350 ± 12.96 mOsm. O pH do sêmen após diluição nos respectivos diluentes variou entre as horas avaliadas (P < 0.05) e não variou com o passar do tempo o que evidencia o efeito tamponante dos diluentes. A osmolaridade dos diluentes foi similar entre os tampões BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) ou TES (371 ± 5.47 mOsm) a fresco e sem adição de sêmen. Já o pH variou (P < 0.05) de acordo com o tampão. No experimento a 5°C ocorreu decréscimo na porcentagem de motilidade total, progressiva e local do sêmen resfriado após 24 h e 48 h comparado a avaliação a fresco em todos os grupos. No entanto, a porcentagem de espermatozoides móveis a fresco, 24 h e 48 h a 5°C entre tratamentos foi similar. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, e com atividade mitocondrial não diferiu entre tratamentos. No experimento a 15°C o vigor e motilidade total, progressiva e local foram similares entre os tampões BES, MES e TES em cada período avaliado. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm e TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Devido as características individuais de cada tampão o pH do sêmen diluído variou entre os diluentes com os tampões utilizados. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, com atividade mitocondrial e membrana intacta observada com CFDA e PI não diferiu entre tratamentos. Evidenciou-se que tanto BES, MES ou TES podem ser utilizados no armazenamento e transporte do sêmen de pôneis durante 48 h a 5°C ou 15°C. O segundo experimento teve como objetivo foi avaliar a influência da suplementação de ácidos graxos poli-insaturados sobre a qualidade de sêmen de pôneis da raça Brasileira a fresco e após congelamento. Oito pôneis receberam sua dieta convencional não suplementada (grupo controle) ou dieta convencional e 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA (grupo PUFA). O efeito da Vitamina E (1 mM, DL-α-tocoferol), adicionada ao diluente de congelamento para sêmen também foi avaliado sobre a qualidade seminal, antes e após o congelamento do sêmen. O sêmen foi coletado a cada 15 dias durante 60 dias. Os garanhões tratados passaram a controle e vice-versa após um intervalo de sessenta dias. O sêmen foi avaliado a fresco e após o congelamento. Motilidade e vigor foram avaliados a fresco. Após o descongelamento motilidade, funcionalidade de membrana, integridade de membrana e análise computadorizada da motilidade foram avaliados. Os valores médios para os parâmetros avaliados a fresco no grupo PUFA e controle foram similares. Os valores médios da motilidade total, progressiva e local, hiposmótico, CFDA/PI e análise computadorizada de sêmen suplementados com DHA e o grupo controle pós-descongelamento não diferiram. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente não potencializou a capacidade antioxidante do diluente durante o congelamento. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente resultou em diminuição da motilidade total e progressiva comparada ao grupo não suplementado (controle). A suplementação de 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA e ou a inclusão de 1 mM de vitamina E ao diluente de congelamento de sêmen em pôneis da raça Brasileira não foi eficiente para promover melhoria na viabilidade seminal após a coleta ou mesmo após o congelamento. / Artificial insemination with cooled and frozen semen is an important tool for breeding industry. The first experiment aimed to identify a pH buffer for cooling semen of ponies for 48 h at 5°C and 15°C. The effect of five buffers (TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), PIPES (piperaxin-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid)), BES (N, N-Bis (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)) was evaluated in a extender composed of skimm milk powder and glucose. Analysis with the BES, MES and TES buffers were performed in fresh semen of eight ponies and in cooled semen for 48 h at 15°C. A sample from each group was used for analysis of motility, pH, osmolarity, hyposmotic test, mitochondrial activity (MTT) and membrane integrity through fluorescent probes. The pH and osmolarity of the extenders without semen were also evaluated. Data were assessed by analysis of variance and Tukey's test, when P <0.05 was considered significant. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm and TES 350 ± 12.96 mOsm. The pH of the semen after dilution in the respective extenders varied between the hours (P <0.05) and did not change over time as evidenced by the buffering effect of the extenders. Extender osmolarity was similar between BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) or TES (371 ± 5.47 mOsm) buffers after dilution and without addition of semen. The pH varied (P <0.05) according to the buffer. In the experiment at 5°C all treatments showed a decrease in the percentage of total, progressive and local motility of the cooled semen after 24 h and 48 h compared to the fresh. However, in the percentage of motile sperm to fresh, 24 h and 48 h at 5°C between treatments was similar. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, and with mitochondrial activity did not differ between treatments. In the experiment at 15°C total, progressive and local vigor and motility were similar between BES, MES and TES buffers in each period. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm and TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Due to the individual characteristics of each buffer, diluted semen pH varied between the extenders with the buffers used. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, with mitochondrial activity and intact membrane observed with CFDA and PI did not differ between treatments. We concluded that BES, MES or TES can be used in the storage and transport of ponies semen for 48 h at 5°C or 15°C. The second experiment aimed to evaluate the influence of polyunsaturated fatty acid supplementation in the fresh and after freezing semen of Brazilian ponies. Eight ponies received their conventional diet (control group) or conventional diet and 70 g of DHA-rich Schizochytrium sp algae meal (PUFA group). The effect of Vitamin E (1 mM, DL-α-tocopherol) added to the freezing diluent for semen was also evaluated on seminal quality, before and after freezing. Semen was collected every 15 days during 60 days. Stallions were reversed in treatments after an interval of sixty days. Semen was evaluated fresh and after freezing. Motility and vigor were estimated in the fresh semen. After thawing motility, membrane functionality, membrane integrity and computed motility analysis were evaluated. Mean values for fresh parameters evaluated in the PUFA and control groups were similar. Mean values of total, progressive and local motility, hyposmotic, CFDA/PI and computerized analysis of semen supplemented with DHA and post-thaw control group did not differ. The combination of DHA and Vitamin E supplementation added to the diluent did not potentiate the antioxidant capacity of the diluent during freezing and resulted in decreased total and progressive motility compared to the non-supplemented group. Supplementation of 70 g of DHA-rich microalgae Schizochytrium sp and the addition of 1 mM vitamin E to the semen freezing diluent in Brazilian ponies was not efficient to promote improvement in seminal viability after collection or even after freezing.

O zebrafish (Danio rerio) tem se destacado na pesquisa biomédica por sua homologia fisiológica e genética aos humanos. No entanto, há poucos relatos sobre a criopreservação ovariana desta espécie. Assim, pesquisamos a utilização de um recipiente de metal na vitrificação de tecido ovariano de zebrafish. O objetivo foi avaliar a sobrevivência e o desenvolvimento in vitro de folículos de zebrafish após a vitrificação de fragmentos ou ovários inteiros usando a cápsula de metal. Primeiro, testamos quatro soluções de vitrificação (VS1 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol; VS2 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO; VS3 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol + 0,5 M sacarose; VS4 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose) e cinco estágios de desenvolvimento folicular utilizando o teste de coloração supravital iodeto de propídio combinado com diacetato de fluoresceína. Estes resultados mostraram que os folículos em estágio I, imaturos, apresentaram as maiores taxas de sobrevivência celular e que VS1 foi a melhor solução em termos de viabiidade. No Experimento 2, utilizou-se VS1 para vitrificar o tecido ovariano em diferentes dimensões (fragmentos ou ovários inteiros) e em dois diferentes recipientes (palheta de plástico ou cápsula de metal). Para avaliar a sobrevivência e o crescimento folicular dos folículos em estádio I, o diâmetro dos folículos foi mensurado antes e depois de cultivo in vitro por 24 horas. A morfologia folicular foi analisada por microscopia de luz após vitrificação utilizando a cápsula de metal. Os dados mostraram que a morfologia de folículos imaturos foi bem preservada após a criopreservação. A taxa de sobrevivência folicular foi maior (P <0,05) em fragmentos vitrificados, quando comparados com a vitrificação de ovários inteiros. Não houve diferenças significativas na sobrevivência e crescimento folicular entre os dois recipientes de vitrificação, palheta de plástico ou cápsula de metal. No entanto, a cápsula de metal diminui os riscos de contaminação, pois é hermeticamente fechada evitando contato com nitrogênio líquido e poder ser esterilizada, em vista que é manufaturada em aço inoxidável. Por essas razões, acreditamos que a cápsula de metal tem um uso potencial em reprodução humana para a vitrificação em grau clínico de tecido ovariano. / Zebrafish (Danio rerio) has excelled in biomedical research for its physiological and genetic homology to humans. However, there are few reports on ovarian cryopreservation of this specie. Thus, we studied the use of a metal capsule to vitrify zebrafish ovarian tissue. The aim of this study was to assess the survival and in vitro development of zebrafish follicles after vitrification of fragmented or whole ovaries using the metal capsule. First, we tested four vitrification solutions (VS1 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol; VS2 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO; VS3 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose; VS4 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO + 0.5 M sucrose) and five follicular developmental stages using fluorescein diacetate and propidium iodide supravital staining test. These results showed that immature follicles, stage one, presented the highest survival rates and VS1 the best vitrification solution in terms of viability. In Experiment 2, we used VS1 to vitrify ovarian tissue in different dimensions (fragments or whole ovaries) and tested two different carriers (plastic straw or metal capsule). To evaluate follicular survival and growth of stage I, we measured follicle diameter before and after twenty-four-hour in vitro culture. The follicular morphology was analyzed by light microscopy after vitrification using the metal capsule. Data showed that the immature follicles morphology was well preserved after cryopreservation. Follicular survival rate was higher (P<0.05) on vitrified fragments, when compared to whole ovaries. There were no significant differences on follicular survival and growth between the two vitrification devices, plastic straw or metal capsule. However, the metal capsule being tightly sealed and manufactured in stainless steel avoids contact with liquid nitrogen and can be sterilized reducing contamination risk. These reasons lead us to believe that the metal capsule has a potential use in human reproduction for the clinical grade vitrification of ovarian tissue.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:23:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:40Z : No. of bitstreams: 1 000852682_20160620.pdf: 79700 bytes, checksum: 3cf603415213794e29627e720a92e128 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-06-20T12:14:14Z: 000852682_20160620.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-20T12:14:51Z : No. of bitstreams: 1 000852682.pdf: 1984663 bytes, checksum: 5c39404e9531f1892485e096eb8f1752 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A congelação e refrigeração são biotecnologias muito utilizadas na reprodução equina, entretanto um significativo número de garanhões possuem baixa qualidade seminal após a criopreservação. Diversos autores descreveram a importância da composição e lipídica das membranas espermáticas sobre a resistência à criopreservação. Desta forma, este estudo teve como objetivo analisar a relação do perfil lipídico das membranas espermáticas com a raça e a resistência espermática à congelação e refrigeração. No experimento 1 foram verificadas as diferenças do perfil de fosfolipídios das membranas espermáticas de garanhões das raças Mangalarga Marchador e Quarto de Milhaa e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 728,6; 741,5 e 744,5 nos Mangalarga Marchador. No experimento 2 foram avaliados os fosfolipídios das membranas espermáticas entre garanhões com espermatozoides sensíveis ou resistentes à danos decorrentes da congelação e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 703,5; 728,6; 781,5; 808,5 e 836,6 nos animais sensíveis à congelação. No experimento 3 comparou-se os fosfolipídios das membranas espermáticas dos garanhões com a resistencia à refrigeração e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 772,5 e 774,6 nos animais resistentes à refrigeração. No experimento 4 observou-se não serem os mesmo lipídios que conferem resistência espermática à congelação e à refrigeração. Como os resultados do presente estudo, pode-se concluir que existe diferença no perfil lipídico das membranas espermáticas entre animais Quarto de Milha e Mangalarga Marchado, entre animais sensíveis e resistentes à congelação, entre animais sensíveis e resistentes à refrigeração. Além disso não há relação do perfil lipídicos que confere resistência espermática à congelação e à refrigeração / The freezing and refrigeration are biotechnology very used in equine reprodution, although a significant number of stallion have low seminal quality after cryopreservation. Many authors described the importance of lipid composition of spermatic membrane in crypreservation resistance.The aim of this study is to analisy the lipid profile with MALDI-MS of plasmatic membrane of stallion sperm, checking its relation with breed and with spermatic resistance to freezing and refrigeration. Four experiments were done. The experiment 1 verified the diference of phospholipid spermatic membrane in stallions of Mangalarga Marchador and Quarter horse breeds, which was observed bigger relative abundance of ions m/z 728,6; 741,5 e 744,5 in Mangalarga Marchador. The experiment 2 evaluated the spermatic phospholipid membrane between stallions with weak and resistant to the damage of freezing and was observed bigger relative abundance of ions m/z 703,5; 728,6; 782,5; 808,5 and 836, 6 in the animals weaks to freezing. The experiment 3 compared the phospholipids of stallions spermatic membranes with sperm weaks or resistant to the damage of refrigeration and was observed bigger relative abundance of ions m/z 772,5 e 774,6 in animals resistants to refrigeration. The experiment 4 showed that not the same lipids offer spermatic resistance to freezing and refrigeration.The results of this study demonstrate tha there is a diference in lipid profile of spermatic membrane between Quarter Horse and Mangalarga Marchador breeds, between animals weak and resistant to freezing and between animals weak and resistant to refrigeration. Besides there is no relation of lipid profile that offer spermatic resistance to freezing and refrigeration / FAPESP: 2012/24843-4

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-05-25Bitstream added on 2014-06-13T20:05:47Z : No. of bitstreams: 1 marques_ma_dr_jabo_prot.pdf: 467698 bytes, checksum: e31b751e758e7554b3d188b4c1760ea2 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Este trabalho foi conduzido com duas espécies arbóreas do gênero Anadenanthera (Mimosaceae): A. peregrina var. falcata (angico-do-cerrado) e A. colubrina var. cebil (angico-vermelho), com os objetivos de (a) confirmar a classificação das sementes quanto ao comportamento fisiológico no armazenamento e quanto à longevidade; (b) conservar a qualidade fisiológica das sementes a médio prazo; (c) testar métodos de secagem para reduzir, com segurança, o teor de água das sementes a baixos níveis; (d) armazenar as sementes desidratadas em temperatura inferior a zero, visando à conservação a longo prazo. As sementes foram desidratadas sobre soluções salinas saturadas, sobre sílica gel e por liofilização. As sementes desidratadas foram armazenadas por diferentes períodos nos ambientes de sala de laboratório, câmara seca, câmara fria, freezer, ultra-freezer e nitrogênio líquido fase vapor. Foram avaliados o teor de água, a capacidade germinativa e o vigor das sementes. As duas espécies são ortodoxas e de curta longevidade quando armazenadas na sala de laboratório. Os três métodos de secagem foram eficientes para reduzir o teor de água das sementes. As sementes conservaram sua qualidade fisiológica a médio prazo quando (a) acondicionadas em embalagem permeável e armazenadas em câmara seca; (b) acondicionadas em embalagem impermeável e armazenadas em câmara fria; (c) liofilizadas, acondicionadas em embalagem impermeável e armazenadas em sala de laboratório. As sementes desidratadas suportaram o armazenamento em temperaturas baixa e ultra-baixa, demonstrando possibilidades de serem conservadas a longo prazo. / This work was carried out with two brazilian tree species of the Anadenanthera genus (Mimosaceae): A. peregrina var. falcata and A. colubrina var. cebil , with the objectives of (a) to confirm the seed classification concerning both to the physiological behaviour during storage and to the longevity; (b) to conserve the seed physiological quality in medium-term storage; (c) to test drying methods for reduce safely to low values the seed moisture content; (d) to store dried seeds at sub-zero temperatures for a long-term storage. The seeds were dried over saturated salt solutions, over silica gel and by freeze-drying methods. Dried seeds were stored during different periods at room temperature, dry chamber, cold chamber, freezer, ultra-freezer and liquid nitrogen vapour phase. During storage, seed moisture content, germinability and vigour were evaluated. Seeds of both species showed orthodox behaviour and short longevity when stored at room temperature. The three drying methods were effective to reduce safely the seed moisture content. In medium-term storage, seeds maintained their physiological quality when (a) packaged into permeable container and stored at dry chamber; (b) packaged into impermeable container and stored at cold chamber; (c) freeze-dried, packaged into impermeable container and stored at room temperature. Dried seeds tolerated both low and ultra-low storage temperatures, showing possibility for long-term storage.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:06:42Z : No. of bitstreams: 1 borges_jc_dr_jabo.pdf: 527084 bytes, checksum: 74a9732f86335b470c5edaba6623feba (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Efeitos deletérios dos radicais livres causam a lipoperoxidação da membrana plasmática dos gametas feminino e masculino e dos embriões cultivados in vitro, sendo responsável por perda da produção in vitro de embriões e redução da fertilidade in vivo. O estudo foi realizado com objetivo de investigar o efeito protetor do diluidor de sêmen contendo antioxidante submetido à criopreservação e avaliado por testes complementares (teste de termo resistência, hiposmótico e fluorescência), pela inseminação artificial e fertilização in vitro. Ejaculados de cinco touros foram agrupados nos seguintes tratamentos: 1 – Diluidor Tris – gema (controle – Dil C); 2 – Diluidor Tris –gema + Trolox 200mM (antioxidante-Dil T). Amostras com os diluidores com concentração final de 25 x 106 espermatozóides/ palheta foram envasadas em palhetas de 0,25 mL. Em uma fazenda localizada no Mato Grosso do Sul – MS, foram inseminadas 300 novilhas Nelore, e para cada touro realizou-se 60 inseminações artificiais (palhetas descongeladas em 35°C por 20 seg). Oócitos com citoplasma homogêneo e cumulus compacto de ovário de vacas de abatedouro foram selecionados e maturados em grupos de 25 por gota em 100μl de meio TCM 199 com SFB, FSH, hCG e estradiol, piruvato de sódio e amicacina, por 24 horas, sob óleo mineral, e foram cultivados com 5% CO2 e 95% umidade em ar, a 38,5ºC. Depois da maturação, os oócitos foram colocados em gotas com TALP contendo BSA, PHE e 10μg/ml de heparina com 1x 106 espermatozóides móveis por ml. Quatro palhetas (duas – DC e duas – DT) do mesmo touro e ejaculado foram descongeladas e cada palheta foi processada por um método de separação espermática para recuperação do sobrenadante: método de lavagem (duas centrifugações de 36xg por 5 min em 2ml de TL-sêmen) e gradiente de Percoll (45 e 90%, submetido a centrifugação a 500xg por 30 min)... / Deleterious effects of free radicals cause lipoperoxidation of the plasmatic membrane of female and male gametes and in vitro cultured embryos, being responsible for losses in in vitro production of embryos and reduction in in vivo fertility. The objective of this study was to investigate the protective effects of semen extender containing antioxidant submitted to cryopreservation and evaluated by artificial insemination, in vitro fertilization and complementary tests (hyposmotic, fluorescence, and thermal resistance tests). Ejaculates from 5 bulls were treated with Tris egg yolk extender (control-CE) alone or supplemented with 200ml Trolox in the extender (antioxidant-AE). The samples with the extenders with a final concentration of 25 x 106 spermatozoa/ml were placed into 0.25 ml straws. Three hundred Nelore heifers from a cattle farm in Mato Grosso do Sul - MS, were separated into 5 groups of 60 animals. For artificial insemination, the straws were thawed at 35°C for 20 sec and the females in each group were inseminated with semen of the same bull, using 30 female for each semen extender treatment. For in vitro fertilization, oocytes with homogeneous cytoplasm and compact cumulus, collected from ovaries of slaughtered cows were selected and maturated in groups of 25 in droplets of 100μl TCM 199 medium with FCS, FSH, hCG and estradiol, sodium pyruvate and amicacin, for 24 hours, under mineral oil, in atmosphere of 5% CO2 and 95% humidity in air, at 38.5ºC. After maturation, the oocytes were placed in droplets with TALP containing BSA, PHE and 10μg/ml of heparin with 1x 106 motile spermatozoa/ml...(Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-17Bitstream added on 2015-05-14T16:59:09Z : No. of bitstreams: 1 000829407.pdf: 3139564 bytes, checksum: ac15cce43cb3520f922ab5d6b73802ab (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho teve como objetivo geral averiguar o efeito da BL-I e da ROS em bloquear temporariamente a retomada da meiose, atuando sobre os fatores que controlam o ciclo celular meiótico de oócitos bovinos e a expansão das células do cumulus oophoros. No Experimento I, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6, 12 e 24 h na presença de duas concentrações de ROS (12,5 μM e 25 μM) ou na presença de BL-I (50 μ e 100 μM) ou na presença da associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) e em seguida foram cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h, 12 h ou 24 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos por 6 ou 12 h foram fertilizados e cultivados in vitro. O tratamento com ROS e BL-I não resultou em atraso na quebra da vesícula germinativa em relação ao controle. Entretanto, quando utilizados por 24 h, elevadas taxas de degeneração oocitária foram encontradas. Quando estes fármacos foram utilizados por 12 h com reversão por mais 12 h, verificamos uma menor taxa produção de blastocistos em relação ao grupo controle. No entanto, após a retirada do bloqueio por 6 h e maturação por 18 h um maior número de oócitos tratados tanto com ROS, como BL-I encontraram-se em MII. Da mesma forma, ao reduzirmos a dose e o tempo de inibição, os grupos tratados por 6 h de inibição meiótica e reversão por 18 h apresentaram taxas de produção embrionária similares ao grupo controle. No Experimento II, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6h na presença de 12,5 μM de ROS ou na presença de 50 μM de BL-I ou com a associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) sendo em seguida cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos foram fertilizados, cultivados in vitro e os embriões produzidos foram submetidos a vitrificação. Os grupos BI-I e ROS + BL-I apresentaram superioridade de produção embrionária, tanto em relação ao grupo ROS como o controle. O grupo ... / This work had as main objective to investigate the effect of BL-I and ROS in temporarily blocking the resumption of meiosis, acting on the factors that control the meiotic cell cycle of bovine oocytes and expansion of cumulus oophoros cells. In Experiment I, the oocytes remained in IVM mediafor 6, 12 and 24h in the presence of two concentrations of ROS (12.5 μM and 25 μM) or in the presence of BL-I (50 μ to 100 mM) or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in a drug-free IVM media for 18, 12 or 24 h. After this time, the inhibited oocytes by 6 or 12 h were fertilized and cultured in vitro. Treatment with ROS and BL-I did not resulted in delay in germinal vesicle breakdown in relation to control. However, when used for 24 h, higher rates of oocyte degeneration were found. When these drugs were used for 12 h with reversion for more than 12 h, a lower blastocyst production rate compared to the control group was verified. However, after removal of the blockage for 6 h and maturation for 18 h, a higher number of oocytes treated with both ROS and BL-I were found in MII. Similarly, when the dose and duration of inhibition were reduced, the groups treated for 6 h of meiotic inhibition and reversion for 18 h showed similar embryo production rates to the control group. In Experiment II, oocytes remained in IVM mediafor 6 h in the presence of 12.5 μM of ROS or the presence of 50 μM of BL-I or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in drug-free IVM media for 18 h. After this time, the inhibited oocytes were fertilized in vitro and the produced embryos were submitted to vitrification. The BI-I and ROS + BL-I groups showed superiority in embryo production, both in relation to the control as ROS group. The ROS + BL-I group showed higher rate of re-expansion after vitrification. Additionally, embryos from BL-I and BL-I + ROS showed lower number of apoptotic cells when compared to ... / FAPESP: 2010/18994-4

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-28Bitstream added on 2015-05-14T16:59:08Z : No. of bitstreams: 1 000823842_20160728.pdf: 48543 bytes, checksum: 0a0e4c6e3217335eb5c3eedceb8b2a73 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-29T12:53:53Z: 000823842_20160728.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-29T12:54:47Z : No. of bitstreams: 1 000823842.pdf: 2103625 bytes, checksum: bf645c43dd091bc121630fa032a1e708 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivou-se com este estudo comparar os efeitos da congelação lenta vs vitrificação sobre a viabilidade, ultraestrutura e expressão gênica de blastocistos caninos produzidos in vivo. A coleta dos embriões foi realizada por lavagem uterina 12 dias após a primeira IA. A congelação lenta foi realizada em máquina programável e a vitrificação pela técnica do cryotop. O cultivo in vitro (CIV) foi realizado por 24 horas, em meio SOFaa acrescido de 20% de soro fetal bovino. A reexpansão embrionária foi avaliada 24 horas após a CIV e a viabilidade embrionária avaliada com o uso das sondas Hoscht 33342 e Iodeto de propídeo. A extração e amplificação do RNA foram realizadas segundo recomendações do fabricante. Foram utilizados 70 blastocistos separados nos grupos Co, Co24, Cg, Cg24, Vi e Vi24. No experimento I foram utilizados 34 embriões. Não foi evidenciada reexpansão da blastocele após 24 horas de CIV nos grupos Cg24 e Vi24, já no grupo Co24, 100% dos embriões reexpandiram. Não foi verificada diferença na intensidade da fluorescência do Hoescht entre os grupos Co, Cg e Vi, em ambos os momentos de avaliação, 0 e 24 horas. Quando comparada a intensidade do iodeto de propídeo (IP) foi observada diferença significativa entre o grupo Co em relação aos grupos Cg e Vi, independente da metodologia de criopreservação. Observou-se uma redução na quantidade de gotas lipídicas após 24 horas de CIV comparando-se os grupos Co e Co24. No grupo Vi foram observadas mitocôndrias alongadas, integridade da membrana dos blastômeros e nuclear, reticulo endoplasmático liso, vesículas de digestão, microvilosidades, junções do tipo tight e desmossomas. No Experimento II, foram utilizados 36 embriões para a avaliação da expressão gênica. Todos os genes estudados, com excessão do LIF, foram expressos. Entretanto, não houve diferença na expressão dos genes BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 e ... / The purpose of this study was to compare the effects of slow freezing versus vitrification in canine embryo produced in vitro: viability, ultra structure and gene expression. Embryos collection was performed using uterus flush technique 12 days after the first AI. For slow freezing protocol we used a programmed machine and vitrification was performed using cryotop. In vitro culture (IVC) was conducted for 24 hours using SOFaa added with 20% of fetal bovine serum. Embryo expansion was evaluated 24 hours after in vitro culture (IVC) and embryo viability was evaluated using Hoscht 33342 and iodine propidium (PI). Extraction and amplification of the RNA was performed according to manufacturer recommendations. We used 70 blastocysts divided in groups: Co, Co24, Cg24, Vi and Vi24. In experiment I 34 embryos were used. No blastocoele expansion was observed after 24 hr of IVC in groups Cg24 and Vi24, however 100% of embryos expanded in Co24. No difference was observed in Hoescht staining intensity between Co, Cg and Vi groups, which were observed at the 0 and 24 hr periods. The iodine propidium (PI) intensity in Co was different when compared to Cg and Vi, independent of the cryopreservation method used. A reduction in the quantity of lipid drops was observed after 24 hr of IVC when comparing groups Co and Co24. In group Vi, elongated mitochondria, membrane and nuclear integrity of blastomere, smooth endoplasmic reticulum, vesicle digestion, microvilli, tight junctions and types of desmosomes were observed. In experiment II, 36 dog embryos were used for gene expression evaluation. All studied genes, except LIF were expressed. However no difference between gene expression of BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 and LIFr were observed at 0 and 24h in all groups. We concluded that the vitrification technique was the best method to cryopreserve canine embryo when we observe ultrastructure. However, it was not possible ... / FAPESP: 11/08798-6

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-10. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:21Z : No. of bitstreams: 1 000831319.pdf: 1267209 bytes, checksum: c23ca8ee7c298aed36bdf625fb1e71a9 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplicação, o que as tornam muito atrativas para a terapia celular, tanto na medicina humana como na medicina veterinária . Quando cultivadas in vitro são capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. Atualmente há uma grande tendência para a utilização de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cordão umbilical (CU) e sangue do cordão umbilical (SCU), podendo ser obtidas no momento do parto por uma técnica não invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA, CU e SCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e em abatedouro. As células foram recuperadas por meio de digestão enzimática tecidual, realizada com solução de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e CU no momento do parto (n=6) e de MA e CU no terço inicial de gestação (n=6), bem como de SCU no terço médio de gestação em abatedouro (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e diferenciações in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e criopreservação. Além disso, foram criopreservadas e analisadas por citometria de fluxo para observação da viabilidade celular. Todas as amostras dos diferentes períodos gestacionais demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marcação para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marcação para CD44, ausência de marcação para CD34 e baixa expressão de MHC II. Apresentaram também capacidade de diferenciação in vitro nas três linhagens mesodermais e quando analisadas ... / Stem cells are undifferentiated cells with a high proliferation potential. These cells can be characterized by their in vivo ability to self-renew and to differentiate into specialized cell lines. The most used stem cell type, in both human and veterinary field, is the mesenchymal stem cells (MSC). Nowadays, there is a great tendency to use stem cells derived from fetal tissues, such as amniotic membrane (AM), extravascular matrix of umbilical cord (EMUC) and umbilical cord blood (UCB), which can be obtained non-invasively at delivery time. Thus, the aim of this study was to isolate, characterize and differentiate. MSC derived from bovine fetal annexes cow dairy neonates after assisted delivery and of fetus obtained in slaughterhouse. Cells were isolated by enzymatic digestion of the tissue fragments with 0,1% collagenase solution. Six samples of AM and EMUC at delivery time, six samples of AM and EMUC at first third of pregnancy and six samples of UCB at secondary third of pregnancy were subjected to morphology evaluation, immunocytochemistry, flow cytometry and in vitro osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation. Moreover, sample were cryopresrved and evaluated for viability by flow citometri. All samples showed adherence to plastic and fibroblast-like morphology. Immunocytochemistry revealed expression of CD 44, NANOG and OCT-4 and lack of expression of MHC II in MSC from all samples. Flow cytometry demonstrated that cells from all samples expressed CD 44, lacked CD 34 expression and showed low expression of MHC II. They were also capable of trilineage mesenchymal differentiation and showed 80-90% viability after cryopreservation. According to the results, AM, EMUC and UCB, either obtained at delivery time or from slaughterhouse, are a painless and non-invasive source of MSC and can be used for stem cell bank creation