Die Arbeit hatte zum Ziel, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Durchfallerreger Cryptosporidium parvum zu optimieren und dahingehend zu testen, ob es für eine quantitative Beurteilung der Infektiosität von Kryptosporidienoozysten eingesetzt werden kann. Die verwendeten Oozysten wurden zuvor im Zuge einer Passagierung im Kalb vermehrt, aus dem Kot isoliert, aufgereinigt und zur Infektion einer humanen ileocaecalen Adenokarzinomzelllinie (HCT-8) verwendet Die Kultivierung erfolgte über 48 Stunden in Mikrotiterplatten mit jeweils 24 Kavitäten. Die DNA infizierter Zellen und nichtinfizierter Kontrollen wurde anschließend isoliert und die parasitenspezifische DNA in der real-time PCR quantifiziert. Die gewählten Primer-Sonden-Kombinationen erlaubten eine spezifische Amplifikation der Erreger-DNA. In der Optimierung wurden das Brilliant®QPCR Core Reagent Kit, der ABsoluteTMQPCR sowie zwei verschiedene Oligonukleotidkombinationen untersucht. Durch die Klonierung einer Sequenz im Target-Gen und die Herstellung einer Titrationsreihe aus dieser klonierten DNA gelang es, den für die Vergleichbarkeit unerlässlichen homogenen Standard zu gewinnen. Der In-vitro-Vitalitätsassay wurde außerdem auf seine praktische Anwendbarkeit hin geprüft. Es wurde einerseits eine Desinfektionsmittelprüfung mit Chlorokresol (Neopredisan®135-E), andererseits ein Versuch zur thermischen Inaktivierung, beide unter Nutzung dreier verschiedener C. parvum-Chargen (LE-06-Cp-05/0, LE-07-Cp-05/2 vom Isolat A, LE-06-Cp-05/2 vom Isolat B), vollzogen. Die Überbewertung der Infektiosität der Oozysten durch die Betrachtung der Exzystierung konnte anhand der parallel zur DNA-Quantifizierung ermittelten Exzystierungsraten gezeigt werden. Die Exzystierungshemmung lag in jedem Versuch deutlich unter den in der real-time PCR berechneten Inaktivierungsraten. Je nach verwendeter Oozystencharge lieferte die Desinfektion mit 4 % Neopredisan®135-E Inaktivierungsraten, die zwischen 90 und 100 % bei einstündiger Einwirkzeit lagen. Mit steigender Dauer der Inkubation stieg erwartungsgemäß auch der Grad der Inaktivierung. Die Anwendung der 1 %igen Verdünnung resultierte in einer deutlich gesteigerten Exzystierungsrate gegenüber der unbehandelten Kontrolle sowie in stark variierenden Inaktivierungsraten (24 - 91,5 %). Es konnte gezeigt werden, dass mit Neopredisan®135-E unter den gewählten Inkubationsbedingungen zwar eine gute, aber keine vollständige Inaktivierung der C. parvum-Oozysten erfolgt. Eine suboptimale Wirkung zeigte sich in einer hohen Varianz der Einzelmesswerte. Die Vitalitätsraten betrugen nach einstündiger Inkubation der Oozysten bei 38°C noch 100 %, nach 24 Stunden waren diese bereits auf 5 - 23 % abgesunken. Es scheint, als würden mesophile Verhältnisse die Exzystierung der Sporozoiten anregen und bei längerer Konditionierung eine Erschöpfung des Stoffwechsels der Entwicklungsstadien herbeiführen. Die Inaktivierungsrate bei 55°C lag zwischen 96 und 100 %. Bei thermophiler Konditionierung wurde in drei von sieben Fällen, nach der Inkubation in Neopredisan®135-E nur in einer der sieben Untersuchungen ein vollständiger Vitalitätsverlust beobachtet. Die vorgestellte Methode erwies sich als gut reproduzierbar, sensitiv und schnell. Die In-vitro-Kultivierung des Erregers C. parvum ließ sich mit der real-time PCR, welche eine absolute Quantifizierung erlaubte, gut in Einklang bringen. Die Verwendung der In-vitro-Kultur als lebendes System ließ eine gewisse Variabilität der Ergebnisse zwischen einzelnen Untersuchungen erwarten, die sich aber in einem akzeptablen Bereich bewegten. Eine weitere Optimierung im Sinne einer Sensitivitätssteigerung bei akzeptabler Störanfälligkeit und Variabilität ist anzustreben.

Cryptosporidium parvum is an obligatory intracellular parasitic protist that belongs to the phylum Apicomplexa. Cryptosporidiosis is an infection for which no satisfactory efficient curative treatment is known, especially in immunocompromised individuals. Furthermore, the parasite oocysts show considerable tenacity in the environment. Therefore, new potent drugs along with a simple and reliable experimental model for evaluation of anticryptosporidial measures are urgently needed. The present studies were undertaken to establish a combined cell culture and quantitative PCR assay (cc-qPCR) to assess efficacy of pharmacological compounds against C. parvum. Human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8) were selected for culture of C. parvum. Oocysts were excysted directly on confluent monolayers for infection. After 3 h of incubation the non invasive parasite remains were removed by washing. At the end of the incubation period the cells were harvested and subjected to DNA extraction. Real time PCR was performed to quantify the target parasite DNA (fragments of 70 kDa heat shock protein gene) copy numbers. Each reaction was run in triplicate. A standard curve calculated on the basis of serial dilutions of plasmid DNA or infected control culture DNA was run in each experiment. A series of oocyst suspensions were applied to cell cultures to determine the sensitivity of the cc-qPCR assay and also to generate a calibration curve to calculate the infectivity of oocysts. A dilution series of heat inactivated oocysts (70°C for 1 h) were used to determine the size of the oocyst inoculum at which complete elimination of extracellular parasite material by washing is reliably achieved. The results obtained by the assays were reproducible and the method sensitive with a detection limit of infection with 10 oocysts 48 h post infection (p.i.) and with 100 oocysts 24 h p.i. Percent effects of drugs and disinfectants were enumerated by comparing DNA copies between treated and non treated samples. The suitability of cc-qPCR for screening of pharmacological compounds was validated by confirming the in vitro efficacy of monensin (98.15% ± 1.09 at 0.144 µM) and halofuginone (98.05% ± 0.59 at 25 µM) over the entire incubation period with a dose dependent reduction of parasite multiplication demonstrated 27 h p.i. The inhibition of parasite proliferation by 0.144 µM monensin in the period from 3 h p.i (time defined to represent the initial level of parasite development before drug application) to 27 h p.i. or 45 h p.i. was 97 and 99% respectively, and by 25 µM halofuginone 99% (27 h p.i.). Hexadecylphosphocholine (miltefosine), a new anti-leishmanial compound, was tested against cryptosporidia and provided a maximum of 98% reduction of parasite multiplication at 45 h p.i. The potential activity of curcumin (extract from the herb Curcuma longa) against C. parvum was also evaluated by cc-qPCR. Curcumin appeared to be sensitive to degradation after prolonged incubation and the observed inhibition of multiplication of C. parvum was significantly increased when medium was replaced by fresh medicated medium after 12 h of exposure. The effects on parasite multiplication (>95% inhibition with IC50 value of 13 µM) and on sporozoite invasion (assessed 3 h p.i.; 65% inhibition at 200 µM) suggest that further exploration of anticryptosporidial efficacy of curcumin may be rewarding. The cc-qPCR was further optimized to analyse inactivation measures directed against oocysts of C. parvum. The suitability of the assay for assessment of inactivation measures was confirmed by the reproducible demonstration of effectiveness of cresolic disinfectants at the recommended concentration of 4% and incubation period of 2 h (Neopredisan® 135-1, Menno Chemie, Norderstedt, Germany: 99.91% ± 0.08; Aldecoc® TGE, EWABO Chemikalien GmbH & Co. KG, Wietmarschen, Germany: 99.91± 0.05) and by using thermally inactivated oocysts (complete inactivation by 56°C and 70°C for 20 min). Based on the in vitro results and previously obtained data from the chicken infection model 99.5% inactivation is proposed as a suitable threshold value that needs to be consistently exceeded by a product to be considered efficient. Application of Neopredisan® 135- 1 and Aldecoc® TGE (4% for 2h) consistently inactivated more than 99.5% of oocysts while other disinfectants that are not certified as anticoccidial products like Aldecoc® XD (EWABO Chemikalien GmbH & Co. KG, Wietmarschen, Germany) and IGAVET® FF spezial (COS OHLSEN Chemie & Gerätevertrieb GmbH, Geltorf-Esprehm, Germany) and bleach (sodium hypochlorite) did not. It can be concluded that the cc-qPCR method is suited to easily and reliably assess anticryptosporidials in vitro. The method demonstrated that miltefosine and curcumin display anticryptosporidial efficacy under the applied conditions. The cc-qPCR is a highly standardized method supposedly appropriate to replace the chicken infection model for Eimeria tenella as currently practised for certification of anticoccidial disinfectants according to the guidelines of DVG (German Veterinary Society).

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Das Vorkommen von Kryptosporidien bei Kälbern in Deutschland während der ersten drei Lebenswochen, sowie der Einfluss von C. parvum, auch im Kontext von Koinfektionen auf das Erkrankungsgeschehen wurde bewertet. Um einen Überblick über die hierzulande verbreiteten Subgenotypen zu erhalten, wurden die aus Milchviehbetrieben in Deutschland gewonnenen C. parvum-Feldisolate mittels Sequenzanalysen am GP60-Lokus molekulargenetisch untersucht.

The protozoan Cryptosporidium parvum is one of the major causative pathogens of diarrhoea in young ruminants; therefore, it causes economic losses and impairs animal welfare. Besides C. parvum, there are many other non-infectious and infectious factors, such as rotavirus, Escherichia coli, and Giardia duodenalis, which may lead to diarrhoeic disease in young livestock. Often, more than one infectious agent is detected in affected animals. Little is known about the interactions bet-ween simultaneously occurring pathogens and their potential effects on the course of disease. In this review, a brief overview about pathogens associated with diarrhoea in young ruminants is presented. Furthermore, information about coinfections involving Cryptosporidium is provided.

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MSc (Microbiology) / Department of Microbiology / See the attached abstract below

[ES] La Agenda 2030 para el Desarrollo Sostenible establece una serie de retos ambiciosos para la comunidad mundial denominados Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS). Entre ellos se encuentran retos específicos como el acceso al agua potable y al saneamiento y una mejor planificación de los recursos hídricos, además de objetivos dirigidos con el fin de combatir las desigualdades y la discriminación, entre los cuales se incluyen los siguientes objetivos generales "no dejar a nadie atrás" y "llegar primero a los más rezagados". Hasta la fecha, se ha demostrado que estos retos son difíciles de cumplir, en parte porque son complejos, pero también debido a la inercia política. Por otra parte, las potabilizadoras son capaces de suministrar agua segura para el consumo humano, sin embargo, es posible que su calidad se vea deteriorada a lo largo de su recorrido por el sistema de distribución antes su llegada al consumidor; si el abastecimiento de agua se ve restringido, las posibilidades de degradación de la calidad física, química y, sobre todo, microbiológica a nivel doméstico se incrementan, por ese motivo, para garantizar la calidad del agua se debe asegurar la integridad física, química y cualitativa del agua. Al aplicar los métodos de análisis de riesgos a los sistemas de agua potable para el consumo humano, se está desarrollando como una importante técnica de gestión preventiva, que ya está ofreciendo resultados muy significativos a la hora de anticiparse a eventuales situaciones de peligro, lo que permite intervenir con rapidez y evitar el impacto de los eventos de origen natural contra las infraestructuras y el agua para el consumo humano. En esta tesis se aborda la problemática de la seguridad del agua destinada al consumidor, identificando los fundamentos de la buena gobernanza y proponiendo un nuevo enfoque para llevar a cabo un análisis del riesgo a lo largo de la cadena del agua, integrando la modelización predictiva y las técnicas de árbol de eventos y de fallos. El estudio ha demostrado la gran capacidad del nuevo enfoque para reproducir escenarios reales y evaluar los niveles de ooquistes después del tratamiento, teniendo en cuenta la heterogeneidad de los aportes resultantes de diferentes niveles de ooquistes contenidos en las aguas superficiales, la eficiencia del tratamiento, los controles del proceso y los aportes de agua. El nuevo planteamiento también puede utilizarse para la evaluación de la exposición de otros agentes patógenos en el agua, y en todas las etapas de la cadena del agua, con el fin de evaluar el impacto real de las desviaciones o los fallos en las condiciones del proceso y los controles de seguridad sobre el riesgo para los consumidores provocado por los agentes patógenos. / [CA] L'Agenda 2030 per al desenvolupament Sostenible estableix una sèrie de reptes ambiciosos per a la comunitat mundial denominat Objectius de Desenvolupament Sostenible (ODS). Aquests inclouen reptes com l'accés a l'aigua, el sanejament segur i una millor gestió de l'aigua, igual que objectius per a afrontar la desigualtat i la discriminació incloent propòsits generals per a "no deixar a ningú arrere" i "arribar primer als més ressagats". Fins hui, s'ha demostrat que aquests reptes són difícils de complir, en part perquè són complexos però també a causa de la inèrcia política. D'altra banda, les plantes de tractament d'aigua potable poden proveir aigua segura per al consum humà, però la seua qualitat es pot alternar durant el pas pel Sistema de Distribució d'Aigua abans d'arribar al consumidor; si el proveïment d'aigua és restringit, la possibilitat de deterioració de la qualitat física, química i principalment microbiològica a nivell intradomiciliària s'incrementa havent-se de protegir la integritat física, hidràulica i de qualitat de l'aigua per a garantir l'assegurament del subministrament de l'aigua potable. L'aplicació dels mètodes d'anàlisi de risc aplicats als serveis d'aigua i sanejament s'està convertint en una estratègia imprescindible en la gestió preventiva, que comença a mostrar resultats importants en l'anticipació oportuna de desastres potencials, facilitant les accions anticipades per a enfrontar les amenaces previsibles per a mitigar els impactes dels esdeveniments naturals en la infraestructura d'aigua i sanejament. En aquesta tesi s'aborda la problemàtica de la seguretat de l'aigua destinada al consumidor, identificant els fonaments de la bona governança i proposant un nou enfocament per a dur a terme una anàlisi de risc al llarg de la cadena de l'aigua, integrant la modelització predictiva i les tècniques d'arbre d'esdeveniments i de fallades. L'estudi ha demostrat la gran capacitat del nou enfocament per a reproduir escenaris reals i avaluar els nivells d'ooquistes després del tractament, tenint en compte l'heterogeneïtat de les aportacions resultants de diferents nivells d'ooquistes continguts en les aigües superficials, l'eficiència del tractament, els controls del procés. L'eficiència de la planta, l'eficiència del tractament, els controls del procés i les aportacions d'aigua. El nou plantejament també pot utilitzar-se per a l'avaluació de l'exposició d'altres agents patògens en l'aigua i en totes les etapes de la cadena de l'aigua, amb la finalitat d'avaluar l'impacte real de les desviacions o les fallades en les condicions del procés i els controls de seguretat sobre el risc per als consumidors provocat per agents patògens. / [EN] The 2030 Agenda for Sustainable Development sets out a series of ambitious challenges for the global community. These Sustainable Development Goals (SDGs) include targets for access to safe water and sanitation and improved water management, as well as goals to tackle inequality and discrimination, including overarching proposals to "leave no one behind" and "reach the most disadvantaged first". To date, these are challenges that have proved difficult to meet, partly because they are complex, but also because of political inertia. On the other hand, drinking water treatment plants can provide safe water for human consumption, but its quality can be altered during its passage through the water distribution system before it reaches the consumer; if the water sup-ply is restricted, the possibility of physical, chemical and mainly microbiological quality detection at the household level increases, and the physical, hydraulic and quality integrity of the water must be protected to ensure the safety of the drinking water supply. The application of risk analysis methods applied to water and sanitation ser-vices is becoming an important preventive management strategy, which is be-ginning to show significant results in the timely anticipation of potential disas-ters, facilitating anticipatory actions to address foreseeable hazards and to mit-igate the impacts of natural events on water and sanitation infrastructure. This thesis addresses the issue of consumer water safety by identifying the fundamentals of good governance and proposing a new approach for conduct-ing risk analysis along the water chain, integrating predictive modelling and event and fault tree techniques. The study has demonstrated the high capacity of the new approach to reproduce real scenarios and to evaluate the levels of oocysts after treatment, taking into account the heterogeneity of the inputs resulting from different levels of oocysts contained in the surface water, the efficiency of the treatment, the process controls and the water in-puts. The new approach can also be used for exposure assessment of other pathogens in water, and at all stages of the water chain, to assess the real im-pact of deviations or failures in process conditions and safety controls on the risk to consumers from pathogens. / Kombo Mpindou, GOM. (2023). Aportación a la implantación del análisis de riesgo en los sistemas de distribución del agua: caso del Cryptosporidium para distintos niveles de desarrollo tecnológico en la potabilizadora [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193340

Cryptosporidium spp. est un protozoaire parasite du système gastro-intestinal largement répandu chez les vertébrés et causant la cryptosporidiose, une zoonose occasionnant des troubles digestifs sévères pouvant entrainer la mort chez les individus immunodéficients. Au Canada, la déclaration de cette maladie est obligatoire depuis l’an 2000. Ainsi, il est pertinent de mieux comprendre l’infection chez les animaux de compagnie, puisqu’ils sont potentiellement un réservoir du parasite. Durant l’année 2008, des échantillons fécaux provenant de 1 202 chats (n = 371) et chiens (n = 831) de la province du Québec ont été analysés par comptage des ookystes de Cryptosporidium spp. au moyen de la technique de centrifugation en solution de sulfate de zinc. Dans cette étude,la prévalence de Cryptosporidium spp. chez les chats (28/371 : 7,55 %) et chez les chiens(88/831 : 10,59 %) de compagnie confirme leur potentiel en tant que réservoir du parasite. Au Québec, de par leur nombre, les chats sont potentiellement un réservoir zoonotique du parasite plus important que celui des chiens, bien qu’il n’existe pas de différence significative entre la prévalence du parasite chez le chat et le chien pour l’année 2008. L’âge (p = 0,0001) et l’infection concomitante par Giardia spp. (p = 0,0001) se sont avérés être des facteurs associés avec la présence de Cryptosporidium spp. chez le chien. Parmi l’ensemble des variables testées chez le chat (l’âge, le sexe, la saison et l’infection concomitante par Giardia spp.), aucune n’a été associée de manière significative à la présence du parasite chez le chat. Ceci peut être dû au nombre limité d’individus testés pour cette espèce. Un suivi de l’excrétion des ookystes de Cryptosporidium spp. chez deux chats suggère que l’excrétion des ookystes peut se faire sur une période de sept mois et que le taux d’excrétion varie dans le temps. Le diagnostic moléculaire des espèces et génotypes de Cryptosporidium spp. isolés à partir des échantillons de matières fécales devait être réalisé par la technique de PCR emboîtée des fragments des gènes ARNr 18S et HSP70 et du séquençage des produits de PCR. Aucun résultat positif n’a toutefois été obtenu. Afin d’augmenter la puissance statistique des analyses épidémiologiques sur la prévalence de Cryptosporidium spp., il serait nécessaire à l’avenir de travailler sur un nombre d’animaux beaucoup plus important. / Cryptosporidium spp. is a protozoan parasite from the gastro-intestinal tract with a large range of vertebrate hosts causing cryptosporidiosis, a zoonotic disease which may lead to severe digestive troubles and sometimes death for immunocompromised people. It is a noticeable disease in Canada since 2000. It is thus relevant to study the infection in cats and dogs as they may represent an important zoonotic reservoir for the parasite. A total of 1,202 stool samples from cats (n = 371) and dogs (n = 831) from the province of Quebec were examined during the year 2008 for this research. The prevalence of Cryptosporidium spp. was calculated using coprology tests using centrifugation in a zinc sulfate solution. The prevalence in cats (28/371: 7,55 %) and dogs (88/831: 10,59%) corroborates that pets living in the province of Quebec may be a reservoir for Cryptosporidium spp. While we did not find a significant difference in the prevalence of Cryptosporidium spp. between cats and dogs, cats may represent a larger reservoir as they represent a larger population within the province. We identified age (p = 0,0001) and concomitant infection with Giardia spp. (p =0,0001) as risk factors for dogs. Among all the variables tested on cats (age, sex, season, concomitant infection with Giardia spp.), none were significantly associated with the presence of the parasite in cats. This may be caused in part by the small number that was analyzed. A follow-up study with two cats showed the excretion of oocysts can last for a minimum of seven months and varies in intensity through time. The molecular diagnostic of species and genotypes of Cryptosporidium spp. isolated from fecal samples should have been done by using the amplification of the gene fragments ARNr 18S and HSP70 nested PCR reactions and the sequencing of PCR products. Although this technique was attempted in this study, no positive result was obtained. It is recommended to work on larger animal populations to increase the statistical power of epidemiological analysis of the prevalence of Cryptosporidium spp.

La multichimiorésistance est caractérisée par une résistance simultanée à des agents chimiothérapeutiques de structures diverses, induite notamment par l'efflux des substances actives hors des cellules. Les transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) sont des protéines transmembranaires impliquées dans cet efflux et qui participent à l'échec du traitement de certains cancers. Par ailleurs, ce mécanisme d'efflux a également été évoqué dans le cadre de la résistance de certains microorganismes aux antimicrobiens. Dans cette étude, nous avons conçu et synthétisé des dérivés susceptibles d'inhiber certains transporteurs ABC, en particulier, la glycoprotéine-P (Pgp) impliquée dans la multichimiorésistance des tumeurs humaines, et CpABC3, rencontré chez le parasite Cryptosporidium parvum. Dans un premier temps, nous avons synthétisé trois dérivés de type 4-alkyl-imidazo[4,5-b]pyridin-7-one, hétérocycles destinés à se fixer sur le site à ATP des transporteurs ABC. L'activité de ces composés a été évaluée vis-à-vis d'un fragment recombinant (H6-NBD1) de CpABC3, et un de ceux-ci a montré une liaison (faible) à ce fragment. Nous avons ensuite préparé dix-sept dérivés bivalents susceptibles d'inhiber la Pgp, constitués d'une molécule d'adénine (ciblant le site à ATP) reliée à la progestérone (ciblant le site aux stéroïdes) par un bras de géométrie variable. Ces dérivés ont été testés sur des lignées cellulaires K562/R7 surexprimant la Pgp, et un de ceux-ci a montré une activité supérieure à celle de la progestérone. Enfin, nous avons mis au point une synthèse de chaînes de type oligocyclohexylidène, qui sont de bons candidats pour constituer des bras espaceurs rigides