Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MichelVazde_M.pdf: 1365391 bytes, checksum: a8c1dd22f85ed3c7df93982f678f95f7 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os mioblastos que formam o músculo esquelético são derivados de regiões do miótomo dos somitos. No processo de miogênese ocorre transição de estado proliferativo para um estado de diferenciação que se caracteriza por interrupção do ciclo celular, expressão de genes músculo-específico, reconhecimento célula-célula e formação de miotubos multinucleados. Para o estudo de diferenciação miogênica in vitro a linhagem celular C2C12 é um modelo bem estabelecido. Quando os mitógenos são retirados do meio de cultura (privação de soro fetal bovino), fatores de transcrição específicos são ativados, levando à diferenciação em miotubos. Na progressão do estado proliferativo para o de diferenciação participam diversas proteínas sinalizadoras. Em estudos anteriores demonstramos que a modulação da atividade da FAK tem papel crítico no processo de miogênese de células C2C12. Níveis relativamente elevados de atividade da FAK determinam a manutenção do estado proliferativo (indiferenciado) através de ativação de ciclinas. Também demonstramos que redução transitória da atividade da FAK é essencial para que as mioblastos C2C12 iniciem o processo de diferenciação terminal em miotubos. No presente estudo foi avaliada a hipótese de que a ação da tirosino-fosfatase SHP-2 determina a redução transitória da quinase de adesão focal (FAK) na transição do estado proliferativo para o estado de diferenciação no modelo de miogênese em células C2C12. A privação do soro fetal bovino induziu uma redução transiente (cerca de 80 % por ~2 horas) da fosforilação da FAK no resíduo de Tyr-397, detectada através de anticorpo fosfoespecífico anti-FAK-pY397. Não foi observada mudança na expressão da proteína FAK durante o período experimental. Experimentos de co-imunoprecipitação foram realizados para avaliar se a redução do nível de fosforilação da FAK é acompanhada de sua associação com SHP-2. Observou-se aumento de cerca de 2 vezes na associação entre FAK e SHP-2 no período coincidente com os nível baixos de fosforilação da FAK. Para avaliar o efeito da SHP-2 na redução transitória da pFAK padronizou-se o silenciamento de SHP-2 em células C2C12 nos estados de proliferação e diferenciação. Após a transfecção com siRNASHP2 nas células C2C12 foi feita a extração total de proteínas em diferentes tempos para avaliar o nível de expressão da SHP-2 no estado de proliferação. Foi observada menor expressão desta proteína após 12 horas ao período de transfecção. Depois da transfecção em meio de cultivo com o silenciamento de SHP-2 padronizados em 12 horas as células foram induzidas a se diferenciarem através da privação de soro fetal bovino. A depleção de SHP-2 aboliu a redução transiente da fosforilação da FAK. Observou-se que a depleção de SHP-2 também impediu a diferenciação terminal dos mioblastos privados de soro fetal bovino em miotubos. Esses dados sugerem que a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK exercendo papel inibitório na ativação da FAK na transição das células C2C12 no estado de proliferação para diferenciação, influenciando a entrada destas células na diferenciação / Abstract: The myoblasts that form the skeletal muscle are derived from regions of the myotome of somites. In the process of myogenesis occurs transition of proliferative status to a state of differentiation which is characterised by disruption of the cell cycle, expression of muscle-specific genes, cell-cell recognition and training of myotubes multinucleate. For the study of the in vitro differentiation myogenic cell line C2C12 is a model well established. Where mitogens are moved from the culture medium (deprivation of fetal bovine serum), specific transcription factors are activated, leading to the differentiation in myotubes. The progression to the proliferative status of differentiation are involves several signaling proteins. In previous studies we showed that the modulation of the activity of FAK plays a critical role in the process of myogenesis of C2C12 cells. Relatively high levels of activity of FAK determine the maintenance of the state proliferative (indistinct) through activation of cyclin. It also demonstrated that transient reduction of the activity of FAK is essential for the myoblasts C2C12 begin the process of terminal differentiation in myotubes. In the present study was evaluated the hypothesis that the action of tirosino-phosphatase SHP-2 determines the reduction of transient focal membership of kinase (FAK) in the transition of proliferative state to the state of differentiation in the model of miogênese in C2C12 cells. The deprivation of fetal bovine serum produces a transient reduction (about 80% by ~ 2 hours) of the phosphorylation of FAK in the residue of Tyr-397, detected by antibody phsphoespecific anti-FAK-pY397. No change was observed in the expression of FAK protein during the trial period. Coimmunoprecitation experiments were performed to evaluate whether the reduction in the level of phosphorylation of FAK is accompanied by its association with SHP-2. There was an increase of about 2 times in the association between FAK and SHP-2 in the period coinciding with the low level of phosphorylation of FAK. To evaluate the effect of SHP-2 on the reduction of transient pFAK standardized up the silencing of SHP-2 in C2C12 cells in the states of proliferation and differentiation. It was observed lower expression of this protein after 12 hours the period of transfection. After Transfection in the midst of cultivation with the silencing of SHP-2 standard in 12 hours the cells were induced to differentiate by deprivation of fetal bovine serum. The depletion of SHP-2 abolished the reduction of transient phosphorylation of FAK. It was observed that the depletion of SHP-2 also prevented the terminal differentiation of myoblasts deprived of fetal bovine serum in myotubes. These data suggest that SHP-2 modulates the level of phosphorylation of FAK acting inhibitory role in the activation of FAK in the transition of C2C12 cells in the state of proliferation to differentiation, influencing the entry of these cells in the differentiation / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-09-14T12:25:10Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial_Leilane Sousa (Pré-Textuais, Rev. Lit e Objetivos).pdf: 1252437 bytes, checksum: d055c176d626e63f0a9ad128366526d6 (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-09-14T12:25:25Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial_Leilane Sousa (Pré-Textuais, Rev. Lit e Objetivos).pdf: 1252437 bytes, checksum: d055c176d626e63f0a9ad128366526d6 (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-14T12:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial_Leilane Sousa (Pré-Textuais, Rev. Lit e Objetivos).pdf: 1252437 bytes, checksum: d055c176d626e63f0a9ad128366526d6 (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Alternative methods are being developed to reduce, refine, and replace (3Rs) animals used in experiments and have been applied to test the safety of cosmetics and medicines. It is important to consider the difficulties that Brazil faces with customs and perishability issues that hinder and even prevent the use of commercially available reconstructed human skin models. The aim of this work was to develop a reconstructed human skin model (PHR-UFAM) and test its applicability for cytotoxicity and genotoxicity assays. For this, skins were generated using permanent human keratinocytes and fibroblasts (embedded in collagen) cells. The quality control was performed by morphological and immunohistochemical analyses, viability by MTT test with negative control, and barrier function test. The applicability for genotoxicity assays was evaluated by micronucleus test, neutral and alkaline comet, and modified comet for detection of DNA methylation sites with positive controls of each test defined by OECD and literature. The best condition tested allowed the development of a reconstructed human skin (PHR-UFAM) with epidermis presenting expression of immunohistochemical markers: epithelial (cytokeratins) and dermal (vimentin). The model followed quality parameters (histology, viability, and barrier function) and presented morphological similarity with models recognized and validated by OECD. The applicability of skin model for genotoxicity assays demonstrated the effectiveness of the positive controls: Mitomycin C that was able to increase significantly the micronucleus frequency when tested at concentrations of 1,5 e 3 μg/mL (3.03% and 3.51%, respectively); Ethylmethanesulfonate caused damage to the DNA when tested at concentrations of 5 e 10 μM by comet assay in both alkaline (damage index values of 59.3 and 103.7, respectively) and neutral (damage index of 40.7 and 125, respectively) versions; and 5-azacytidine in the modified comet assay for methylation detection, tested at concentrations of 0.5, 1 e 1.5 μM showed reduced damage indexes (107.5, 83.1, and 89.3, respectively). The results were similar to skin models validated by OECD and literature. Thus, with this work it was possible to develop a reconstructed human skin model composed entirely of permanent cells. However, further validation studies are required to prove its effectiveness for cytotoxicity and genotoxicity tests of substances with therapeutic or cosmetic potential. / O desenvolvimento de métodos alternativos in vitro baseia-se no refinamento, redução e substituição ao uso de animais em experimentação e têm sido desenvolvidos para testar a segurança de cosméticos e medicamentos. É importante considerar as dificuldades que o Brasil enfrenta com questões alfandegárias e de perecibilidade que dificultam e até mesmo impedem a utilização de modelos de pele humana reconstruída disponíveis comercialmente. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um modelo de pele humana reconstruída (PHR-UFAM) in vitro utilizando células de cultura permanente e testar suas aplicabilidades para ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade. Para isso, as peles foram geradas utilizando queratinócitos e fibroblastos (embebidos em colágeno) humanos permanentes. O controle de qualidade das peles foi feito por análise morfológica e imunohistoquímica, a viabilidade pelo teste do MTT com o controle negativo e teste de função barreira. A aplicabilidade para ensaios de genotocixidade foi avaliada pelo teste do micronúcleo, cometa em pH alcalino e neutro e cometa modificado para detecção de sítios de metilação no DNA com os controles positivos de cada teste definidos pela OECD e pela literatura. A melhor condição testada permitiu o desenvolvimento de uma pele humana reconstruída (PHR-UFAM) com uma camada epidérmica apresentando expressão de marcadores imunohistoquímicos epiteliais (citoqueratinas) e dérmico (vimentina). O modelo atendeu aos parâmetros de qualidade (histologia, viabilidade e função barreira) e apresentou semelhança morfológica com os modelos reconhecidos e validados pela OECD. A aplicabilidade para ensaios de genotoxicidade evidenciou efetividade dos controles positivos: Mitomicina C, que foi capaz de aumentar significativamente a frequência de micronúcleos em 3,03% e 3,51% nas concentrações de 1,5 e 3 μg/mL; Etilmetanossulfonato, que causou dano ao DNA no modelo de pele quando testado nas concentrações de 5 e 10 μM, avaliado pelo ensaio do cometa tanto na versão alcalina (índices de dano iguais a 59,3 e 103,7, respectivamente) quanto na neutra (índices de dano iguais a 40,7 e 125, respectivamente); e 5-azacitidina no ensaio do cometa modificado para detecção de metilação no DNA testada nas concentrações 0,5, 1 e 1,5 μM, que apresentou índices de dano reduzidos iguais a 107,5, 83,1 e 89,3, respectivamente, no modelo de pele PHR-UFAM. Os resultados foram comparados com o controle não tratado. Diante do exposto, com este trabalho foi possível desenvolver um modelo de pele humana reconstruída composta totalmente de células permanentes semelhante aos modelos validados e reconhecidos na literatura. Contudo, é necessária a realização de estudos de validação complementares que comprovem sua efetividade para ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade de substâncias com potencial terapêutico ou cosmético.

Para a avaliação do potencial irritante de substâncias aplicadas topicamente tem-se utilizado metodologias que baseiam nos estudos de Draize, onde preconiza-se o uso de animais. Devido à forte oposição a estes testes, intensa tem sido a busca por métodos alternativos visando diminuir ou eliminar a utilização de animais. Este estudo avaliou o potencial irritante de diversas substâncias através de duas metodologias: o teste in vivo , empregando metodologia oficial do Food and Drug Administration (FDA), onde utiliza-se coelhos e o teste de citotoxicidade in vitro - método de difusão em camada de agar sobreposta à monocamada de células - empregando as linhagens celulares He La e NCTC L 929 e o corante vital vermelho neutro. As amostras de produto acabado abrangeram colírios, testados sem diluição e xampus de uso adulto e infantil testados puros e diluídos a 25%, 5%, 1% e 0,1%. As matérias-primas compreenderam tensoativos aniônicos, não-iônicos e anfóteros testados após diluição. O material de acondicionamento foi representado por frascos de polietileno para colírios, testados através dos seus extratos em solução de NaCI 0,9%. Os resultados obtidos com as amostras de colírios e frascos de acondicionamento foram negativos quanto à irritação ocular em coelhos e comprovaram ausência de citotoxicidade nas duas linhagens celulares. As amostras de xampus apresentaram boa correlação dos resultados quando testadas sem diluição ou diluídas a 1,0% e 0,1 %. Foi calculada a correlação de Spearman entre os dados obtidos com as duas linhagens celulares sendo o valor do coeficiente r = 0,950 indicando uma correlação direta entre os resultados obtidos com as duas células. Os resultados demonstram a possibilidade de desenvolvimento de metodologias alternativas, sujeitas à validação, que resultem em procedimentos sensíveis, reprodutíveis, não sujeitos a critérios subjetivos de interpretação, visando assim, num primeiro estágio diminuir o uso de animais pelo emprego destas metodologias em avalições prévias do potencial irritante de substâncias químicas. / To evaluate the irritability potential of toppically laid on substances, some methodologies based on Draize\'s study where the use of animals is demanded, have been used. Due to the strong opposition of society and scientific comunity, the search for alternative methods having in view the reduction or even the elimination of animals have been intense, either through the use of volunteers or of in vitro methodologies. The present study has evaluated the irritability of several substances including finished products, raw materials and packagíng materials through two methodologies: the in vivo test which makes use of official methodology from Food and Drug Administration (FDA), where rabbits are employed and the citotoxicity in vitro test - method of diffusion in agar layer added to the monolayer of cells - using He La and NCTC L 929 cells lines and neutral red. The samples of the finished products embraced eye drops, tested without dilution, and shampoos for adults and children use both concentrated and diluted to 25%, 5%, 1% and 0.1 %. Raw materiais included anionis, non-anionic and amphoteric surfactants tested after dilution. The packaging material, represented by eye drops polyethylene bottles, was tested through its extracts in a NaCI 0,9% solution. The results obtained with the samples of eye drops and packaging materials were negative as for ocular irritation in rabbits and confirmed the absence of cytotoxicity in both cells lines. The samples of shampoos presented good correlation of results when tested without dilution or diluted to 1% and 0.1 %. It has been calculated Spearman correlation considering dates obtained with two cells lines, with value of coefficient r = 0,950 showing a direct correlation between results obtained with two cells. The results obtained with this study are likely to lead to sensitive and reproductive procedures, which won\'t arise subjective criteria of interpretation. Thus, the elimination of the use of animals will be possible at a first stage of previous evalution, and once a posterior validation of this methodology is done, the rational use of a smaller number of animais will be a reality.

Pouco se conhece a respeito da incidência ou prevalência da infecção pelo vírus da raiva em morcegos, ou ainda sobre a distribuição do vírus em tecidos e órgãos não nervosos. Os objetivos deste trabalho foram: i) verificar as espécies de morcegos mais freqüentemente envolvidas com a raiva no Estado de São Paulo, Sudeste do Brasil; ii) estudar a distribuição do vírus da raiva em tecidos e órgãos não nervosos de morcegos; iii) estudar os períodos de mortalidade das amostras de vírus da raiva encontradas nos cérebros e glândulas salivares de morcegos, após inoculação intracerebral em camundongos, e iv) comparação do isolamento do vírus da raiva no sistema camundongo e cultura de células de neuroblastoma (N2A). Entre abril de 2002 a novembro de 2003, 4.393 morcegos capturados de diferentes municípios do Estado de São Paulo foram enviados à Seção de Diagnóstico da Raiva do Instituto Pasteur de São Paulo. Destes, 82 (1,87%) foram positivos para raiva pela técnica de imunofluorescência aplicada aos materiais do cérebro e 33 morcegos pertenciam ao gênero Artibeus sp; 15 Myotis sp; 10 Epitesicus sp; 5 Lasiurus sp; 4 Nyctinomops sp; 4 Tadarida sp; 3 Histiotus sp; 1 Molossus sp; 1 Eumops sp e 6 vampiros Desmodus rotundus. A distribuição do vírus em diferentes órgãos foi examinada pela inoculação de camundongos e células N2A com suspensões a 20% preparadas a partir de fragmentos do cérebro, glândula salivar submandibular, pulmão, língua, coração, bexiga urinária, rins, gordura interescapular, músculo peitoral, trato genital (testículos ou ovários e útero) e estômago. O vírus foi prontamente recuperado de tecidos e órgãos não nervosos com diferentes graus de sensibilidade, tanto em camundongos como em células N2A, e os órgãos mais apropriados para o isolamento viral foram os cérebros e glândulas salivares. Os períodos máximos de mortalidade observados para os vírus presentes nos cérebros usualmente foram mais curtos que os das glândulas salivares, a média do período máximo &plusmn; desvio padrão calculado para os cérebros de morcegos hematófagos foi de 15,33 &plusmn; 2,08 dias e para as glândulas salivares, 11,33 &plusmn; 2,30 dias; para os morcegos insetívoros, 16,45 &plusmn; 4,48 dias para os cérebros e para as glândulas salivares, 18,91 &plusmn; 6,12 dias; e para os morcegos frugívoros, as suspensões cerebrais apresentaram período máximo médio 12,60 &plusmn; 2,13 dias e para as glândulas salivares, 15,67 &plusmn; 4,82 dias. O teste de ANOVA indicou existir diferenças significantes entre os períodos de mortalidade correspondentes às suspensões preparadas a partir dos cérebros de morcegos insetívoros (período mínimo) e glândulas salivares de morcegos insetívoros (período máximo) e entre glândulas salivares de morcegos insetívoros (período máximo) e cérebros de morcegos frugívoros (período mínimo), com p<0.001. O uso de células N2A para o primo-isolamento do vírus da raiva a partir de tecidos e órgãos não nervosos de morcegos, diferente de cérebros, não mostraram resultados consistentes, especialmente devido à contaminação bacteriana e fator toxicidade / Little is known about the incidence of infection or the prevalence rate of rabies in bats, or the distribution of virus in non-nervous tissues and organs. The aim of this work was to study: i) the most frequent species of bats involved with rabies virus infection in the State of São Paulo, Southeast Brazil; ii) the distribution of rabies virus in tissues and non-nervous organs of bats; iii) the mortality periods of virus found in brains and salivary glands of bats after intracerebral inoculation of mice, and iv) comparison of virus isolation in mice and N2A neuroblastoma cell culture. From April 2002 to November 2003, 4,393 bats captured from different municipalities of the State of São Paulo were sent to Rabies Diagnostic Section of the Instituto Pasteur de São Paulo - SP. Among these, 82 (1.87%) were found positive by the immunofluorescence technique applied to brain specimens and 33 bats were of the genus Artibeus sp; 15 Myotis sp; 10 Epitesicus sp, 5 Lasiurus sp, 4 Nyctinomops sp, 4 Tadarida sp, 3 Histiotus sp; 1 Molossus sp, 1 Eumops sp, and 6 vampires Desmodus rotundus. The distribution of virus in the organs was examined by inoculating mice and N2A cells with the 20% suspensions prepared from brain, submaxillary salivary gland, lungs, tongue, heart, urinary bladder, kidneys, brown fat, pectoral muscle, genital tract (testicles or ovaries and uterus), and stomach. The virus was promptly recovered from tissues and non-nervous organs at different degrees of sensitivity in both mice and N2A cells, and the most appropriate organs for the virus isolation were the brains and salivary glands. The maximum mortality periods found for the brain specimens usually were shorter than the salivary glands, the maximum mean perio &plusmn; standard deviation calculated for the brains taken from the vampire bats was 15.33 &plusmn; 2.08 days and for salivary glands, 11.33 &plusmn; 2.30 days; for the insectivorous bats the maximum for the brain suspensions was 16.45 &plusmn; 4.48 days and for the salivary glands, 18.91 &plusmn; 6.12; and for the frugivorous bats, the brain suspensions showed the maximum of 12.60 &plusmn; 2.13 days and the salivary glands, the mean maximum period of 15.67 &plusmn; 4.82 days. The ANOVA test indicated that the most significant differences in the mortality periods were between the suspensions prepared by the brains of insectivorous bats (minimum period) and salivary glands of insectivorous bats (maximum period); salivary glands of insectivorous bats (minimum period) and brains of frugivorous bats (minimum period) with p<0.001. The use of N2A cells for the prime isolation of rabies virus from tissues and non-nervous organs other than brains of bats did not show consistent results, especially due to bacterial contamination and toxicity factor

O cultivo de células humanas para fins experimentais e terapêuticos se firmou como um dos pilares da biologia celular e tem se tornado uma prática laboratorial cada vez mais disseminada. Associada a esse processo está a contaminação por microrganismos, dentre os quais se destacam as bactérias do gênero Mycoplasma spp., os quais são os contaminantes detectados com maior frequência in vitro. Um dos pontos críticos no processo de garantia da qualidade, pureza e segurança para uso destas células é a adoção de uma metodologia analítica, para detecção de Mycoplasma spp., que seja simples e de rápida execução, com sensibilidade e especificidade adequada e economicamente viável. O objetivo desse trabalho foi desenvolver uma plataforma molecular (PCR em tempo real) para detecção de Mycoplasma spp. em culturas celulares. Para tanto, foram testados diversos conjuntos de primers (gene 16S rDNA) dentre os quais um foi selecionado para a plataforma molecular. Foram utilizadas amostras de DNA obtidas a partir do sobrenadante de cultura. A PCR em tempo real in house foi padronizada utilizando o intercalante fluorescente de DNA dupla fita BRYT Green® e produziu um fragmento de 270 pares de bases. A temperatura de melting para as amostras positivas foi definida no intervalo de 81 a 84°C. A plataforma molecular foi validada por meio dos parâmetros sensibilidade analítica e diagnóstica, especificidade analítica, potencial de arraste, precisão e robustez. O limite de detecção do teste (LOD) foi de 5 cópias/5 ?L. Para a especificidade, foi observada reação cruzada com bactérias de relação filogenética próxima e com DNA de célula humana. A sensibilidade diagnóstica foi de 100%. Não foi houve contaminação por arraste. O coeficiente de variação encontrado no parâmetro precisão foi de 0,64% e 1,80% para a avaliação intra-ensaio e inter-ensaio, respectivamente. O coeficiente de variação da análise robustez foi de 5,42%. Ao comparar a plataforma molecular com o teste comercial, observou-se que 29,85% (n=40) das amostras apresentaram resultados falso-negativos pelo teste comercial. Determinou-se ainda que a PCR em tempo real in house foi mais sensível do que o teste comercial. A análise por microscopia eletrônica de varredura demonstrou a presença de estruturas sugestivas de espécies de Mycoplasma spp. na superfície das células. A análise filogenética permitiu a classificação das espécies encontradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram propor o algoritmo para aplicação de um método de detecção simples e rápido para Mycoplasma spp.; e fazer deste uma ferramenta para o controle de qualidade das células cultivadas, garantindo a eficiência destas células para uso em pesquisa e maior segurança para uso em terapia celular. / The culture of human cells for experimental and therapeutic purposes has been consolidated as one of the foundations of cell biology and has increasingly become a widely used laboratory practice. The contamination by microorganisms is associated with this process, among them we can highlight bacteria of the genus Mycoplasma spp., which are contaminants more frequently detected in vitro. One of the critical points in the process of assuring quality, purity, and safety for the use of these cells is the adoption of an analytical methodology for the detection of mycoplasma that is simple and fast to conduct, with proper sensitivity and specificity and that is also economically viable. The objective of this work was to develop a molecular platform (real time PCR) for the detection of mycoplasmas in cell cultures. Therefore, we tested several sets of primers (16S rDNA gene), among them one was selected for the molecular platform. DNA samples used were obtained from the culture supernatant. In house real time PCR was standardized using BRYT Green® double-stranded DNA intercalating fluorescent and produced a fragment of 270 pair bases. The melting temperature for the positive samples was set in the range 81 to 84°C. The molecular platform was validated through the parameters: analytical and diagnostic sensitivity, analytical specificity, carry-over contamination, precision and robustness. The limit of detection of the test (LOD) was 5 copies/5 ?L. For specificity, it was observed a cross reaction with bacteria of close phylogenetic relationship and with human cell DNA. Diagnostic sensitivity was 100%. There was no carry-over contamination. The coefficient of variation was found in the precision values of 0.64% and 1.80% for intra-assay and inter-assay assessment, respectively. The variance coefficient of the robustness analysis was 5.42%. By comparing the molecular platform with the commercial test, we observed that 29.85% (n=40) of the samples showed false negative results by the commercial test. It has been determined further that the real-time PCR in house was more sensitive than the commercial test. The analysis by scanning electron microscopy demonstrated the presence of suggestive structures of Mycoplasma spp. species in the surface of cells. Phylogenetic analysis allowed the classification of the species found. The results obtained in this work allowed us to propose the algorithm for application of a simple and fast method for mycoplasma detection and making from this tool for quality control for cultured cells, assuring the efficiency of these cells for use in research and greater safety for use in cell therapy more safety to patients subjected to cell therapy.

A terapia de fotobiomodulação tem sido vastamente utilizada em cultura de fibroblastos com o objetivo de se verificar seu real efeito na cicatrização de feridas e de se estabelecer os melhores parâmetros de luz. Pacientes com síndrome de Down (SD) possuem alta prevalência da doença periodontal (DP) e importantes alterações imunológicas, as quais podem interferir no processo de cicatrização. O objetivo do presente estudo foi de avaliar os efeitos da utilização de Laser e LED em fibroblastos gengivais de pacientes com e sem SD (FSD e FGH, respectivamente), verificando a viabilidade celular e o processo In vitro de cicatrização de feridas. As células foram cultivadas em placas de 96 poços (1x103 célula/poço) e colocadas em estado de aquiescência (meio DMEM com 1% de soro fetal bovino) 24h antes da irradiação e retomando sua condição inicial de 10% de soro fetal bovino (SFB) instantes antes da aplicação de Laser (AlGaAs - 660nm e AlGaInP - 810nm) e LED (637 ±15nm) com exceção do controle negativo (C-) que continuou com 1% de SFB. Os grupos foram divididos em: C+ (sem irradiação, 10% SFB), C- (sem irradiação, 1% SFB), LIV5 (5 J/cm2 por 3s), LIV8 (8 J/cm2 por 5s), LV5 (5 J/cm2, por 3s), LV8 (8 J/cm2 por 5s), LED3 (0,03 J/cm2 por 3s) e LED5 (0,05J/cm2 por 5s). A potência utilizada foi a mesma tanto para o Laser como para o LED (40mW). A viabilidade celular foi avaliada através dos testes colorimétricos MTT e Cristal Violeta, nos períodos de 24,48,72 e 96h. O teste de cicatrização de feridas In vitro (placas de 24 poços) para avaliação da migração dos fibroblastos, foi nos períodos de 12, 24, 36 e 48h. A análise estatística foi realizada através do teste ANOVA de medidas repetidas complementado pelo teste de Tukey (p<0,05). Os grupos experimentais, em grande parte dos períodos, obtiveram melhor viabilidade celular em relação ao C+, com exceção do grupo LIV8 que apresentou crescimento celular próximo de zero, em todos os períodos. Para FSD os melhores resultados foram com LIV5, LED3 e LED5 (p<0,05), enquanto que para FGH, foi o LV5 (p>0,05). No ensaio de cicatrização de feridas os melhores resultados foram LIV5 para FGH (p<0,05) e todos os tratamentos com exceção do LIV8 para FSD (p<0,05). Os FSD apresentaram maior fechamento da ferida em relação ao FGH nos períodos de 24 e 36h (p<0,05). Como conclusão, a fotobiomodulação por Laser e LED mostrou ser efetiva para viabilidade celular, tanto para o FGH como para o FSD, com exceção do Laser infravermelho de maior densidade de energia e maior tempo de exposição (LIV8). Na migração celular, a fotobiomodulação foi efetiva no maior fechamento da ferida para os FSD. Logo, a terapia de fotobiomodulação por Laser e LED, com os parâmetros adequados, parecer ser um tratamento adjuvante promissor para pacientes com SD. / The photobiomodulation therapy has been widely used in fibroblast culture in order to verify its effects on wound healing and to establish the best parameters of light. Down\'s syndrome patients (DS) present high prevalence of periodontal disease (PD) and important immunological changes, which could interfere on the wound healing process. The aim of this study was to evaluate the Laser and LED effects on gingival fibroblasts cultures from patients with or without DS (FSD and FGH, respectively), through cell viability tests and in vitro wound healing test. Cells were grown in 96-well plates (1x103 cells / well) and then, put in a quiescence environment, (DMEM medium with 1% fetal bovine serum) for 24 hours before irradiation. After that an initial condition of 10% fetal bovine serum (FBS) was set before Laser (Red -AlGaAs - 660nm and Infrared - AlGaInP - 810nm) and LED (637 ± 15nm) application, with the exception of the negative control (C-) which still remained with 1% FBS. The groups were divided in: C+ (no irradiation, 10% FBS), C (no irradiation 1% FBS), LIV5 (5J/cm2 for 3s), LIV8 (8 J / cm2 for 5s), LV5 (5J/cm2 for 3s), LV8 (8J/cm2 for 5s), LED3 (0.03J/cm2 for 3 seconds) and LED5 (0,05J / cm2 for 5s). The power output was the same for both Laser and LED (40mW). Cell viability was evaluated through MTT and Crystal Violet colorimetric tests, in periods of 24,48,72 and 96h. The in vitro wound healing assay (24 well plates), measured the fibroblasts migration, during 12, 24, 36 and 48 hours. Statistical analysis was performed using repeated measures ANOVA complemented by Tukeys test (p <0.05). The experimental groups, in most periods, presented higher cell viability compared to C+, except for the LIV8 group that exhibited cell growth near to zero, in all periods. In relation to FSD, the best results were with LIV5, LED 3 and LED 5 (p<0.05), while to FGH, the LV5 presented higher viability (p<0.05). The best results for the wound healing test were LIV5 for FGH (p<0,05) and all groups but LIV8 for FSD (p<0,05). FSD cells presented higher wound closure in relation to FGH at 24 and 36h (p<0,05). In conclusion, the Laser and LED photobiomodulation was effective for cell growth, for both FGH and FSD cells, except for the infrared laser with higher energy density and longer exposure time (LIV8). Photobiomodulation was more effective for wound closure by FSD cells. Therefore, laser and LED photobiomodulation therapy, with appropriate parameters, seems to be a promising adjunctive treatment for patients with DS.

Materiais poliméricos têm sido usados em um vasto número de aplicações médicas e farmacêuticas, caracterizando-se como biomateriais. Antes do uso humano, se faz necessário uma criteriosa programação de testes que permitam investigação da segurança do material e avaliação da eficácia e assim, avaliar sua biocompatibilidade. Essa atenção também tem sido aplicada a materiais nanoparticulados, inclusive de constituição polimérica. Sendo assim, antes da liberação destes materiais para uso humano, testes preliminares são feitos in vitro e in vivo, neste caso com experimentação animal. Paralelamente à crescente busca em se manter a segurança biológica, a ciência tem procurado metodologias alternativas para se obter resultados seguros e que possam substituir os obtidos in vivo. Neste contexto, surge grande interesse no uso de culturas celulares, primeiramente em monocamadas e posteriormente, o desenvolvimento de culturas celulares em estrutura tridimensional, mimetizando de maneira mais próxima o que ocorre in vivo. Considerando as diversas vantagens obtidas no estudo de culturas tridimensionais, este estudo teve como objetivo desenvolver tal modelo, visando simular sistemas de avaliação para biocompatibilidade de materiais poliméricos, testando nanopartículas de polibutilcianoacrilato. Foram cultivadas células de fibroblasto e melanócito humanos e células de melanoma (SK-Mel-103) em monocamada e em matriz tridimensional de colágeno tipo I e avaliada a citotoxicidade em 24, 48 e 72 horas das nanopartículas utilizando os testes de Exclusão Azul de Tripan e MTT. Os resultados indicam que as nanopartículas de polibutilcianoacrilato são mais citotóxicas com o aumento da concentração da amostra, assim como o IC50 foi decrescente ao longo dos dias, demonstrando a intensificação da resposta biológica no decorrer do tempo e foram mais citotóxicas para as células de melanoma. Este perfil de aumento de citotoxicidade com o passar do tempo também foi observado no ensaio clonogênico, onde as células foram cultivadas em monocamada e incubadas com a amostra até 14 dias. Os testes de viabilidade celular em cultura tridimensional evidenciaram faixa de IC50 um pouco maior do que em monocamada, demonstrando uma pequena redução na citotoxicidade quando avaliada no ambiente 3D. Foram feitos testes de caracterização do tipo de morte utilizando citometria de fluxo, confirmando os dados dos testes de viabilidade que indicam aumento de morte com o aumento da concentração de teste. A morte acontece por apoptose tardia. Nas concentrações próximas ao IC50, há indicação que as nanopartículas de polibutilcianoacrilato inibem a autofagia em fibroblastos e células de melanomas cultivados em monocamada, característica que é anulada quando o comportamento é avaliado em ambiente tridimensional. Os resultados indicam que nanopartículas de polibutilcianoacrilato podem levar a modificação da resposta celular dependendo da concentração empregada e do ambiente de cultivo das células, mostrando serem promissores o estudo e o emprego de ambiente tridimensional na avaliação de citotoxicidade de nanopartículas poliméricas. / Polymeric materials have been widely used as biomaterials in medical and pharmaceutical applications. Before their use in humans, a number of tests is necessary to investigate the safety and effectiveness of the biomaterial in order to determine its biocompatibility. This attention has been given to nanoparticulate materials, including those of polymeric composition. Thus, in vitro and in vivo preliminary tests are done before these materials are released for human use. In parallel with the concern with biological safety studies, there has been a continuous effort in finding alternative methods to replace the current in vivo animal tests and provide reliable results regarding safety. In this context, great interest arises in the use of cell culture, firstly as monolayer and secondly as three-dimensional cell culture systems that mimic more closely the in vivo morphology. Taking into account all the advantages of three-dimensional cell culture studies, the aim of this work is to develop a three-dimensional model that can effectively evaluate polymeric biomaterials biocompatibility using polybutylcyanoacrylate nanoparticles. Cell culture of human fibroblasts, melanocytes and melanoma cells (SK-Mel-103) were cultured in monolayer and on type I collagen matrix. Polybutylcyanoacrylate nanoparticles cytotoxicity was evaluated in 24, 48 and 72 hours using Tripan Blue and MTT assays and the results found were dose and time-dependent to all cell types. Moreover, melanoma cells were significantly more sensitive to the nanoparticles toxicity. The same profile of cytotoxic response was observed in the clonogenic assay, where cells were cultured in low-density monolayer and incubated with the nanoparticles for 14 days. Cell viability assays in 3D culture had a slightly higher IC50 range when compared to the monolayer results, which suggests a reduction in the nanoparticle cytotoxicity in the 3D environment. Cell death analysis using flow cytometry confirmed the dose-dependent response obtained by cell viability assays. Cell death occurred mostly via late apoptosis. There is suggestive evidence that treatment with polybutylcyanoacrylate nanoparticles in concentrations close to the IC50 inhibits autophagy in fibroblasts and melanoma cells when cultured in monolayers, but this response could not be observed in the 3D environment. Our results showed that polybutylcyanoacrylate nanoparticles can modify cell response depending on the concentration used and the conditions of cell culture. We conclude that the 3D cell culture is a promising method for the evaluation of polymeric nanoparticles cytotoxicity.

Orientador: Marcelo Rocha Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_GustavoNarvaes_D.pdf: 3246599 bytes, checksum: 781e1f21b54daff1efa5c67e98bb5e59 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O hormônio paratireóideo (PTH) é o principal regulador da homeostasia dos íons minerais, cálcio e fosfato, no organismo, exercendo um papel chave no desenvolvimento e homeostase dos tecidos mineralizados. Recentemente nós demonstramos que durante a formação do incisivo de camundongos, a administração intermitente de PTH causou um aumento da taxa de aposição dentinária e resultou em mudanças nas propriedades mecânicas e materiais da dentina formada. Com isso, os estudos apresentados aqui se propuseram a investigar: 1) Os efeitos da exposição transiente (1 ou 24h/ciclo) ou contínua (48h) ao hPTH(1-34) na deposição mineral, na expressão gênica de Fosfatase Alcalina (ALP), Metaloproteinase 2 (MMP2), Biglican (BGN) e Colágeno tipo I (COL1), e na atividade de MMP2 e ALP em odontoblastos MDPC-23; 2) A participação das vias de sinalização dependentes de proteína quinase A (PKA) e proteína quinase C (PKC) na resposta proliferativa e apoptótica de odontoblastos MDPC-23 a diferentes tempos de exposição ao hPTH(1-34) (1, 24 ou 48 horas); 3) O efeito do tratamento do hPTH(1-34) na espessura dos cristais minerais formados durante a odontogênese de incisivos de camundongos. 4) Os efeitos da administração intermitente de hPTH(1-34) na dentinogênese terciária em camundongos. Os resultados mostram que a exposição transiente ao PTH diminuiu a deposição mineral e atividade de ALP. Já as expressões gênicas de ALP, BGN e COL1 estavam aumentadas no grupo 24h/ciclo, enquanto que o grupo Contínuo apresentou um aumento da expressão gênica de BGN e COL1. Também, os níveis de MMP2 secretados estavam aumentados no grupo 1h/ciclo e diminuídos no grupo Contínuo. A exposição ao PTH modula a resposta proliferativa e apoptótica de odontoblastos MDPC-23 de uma maneira dependente do tempo. Além disso, a via PKA atua na resposta a curta exposição ao PTH (1h), mantendo os níveis de proliferação e apoptose das células, enquanto que a via PKC é ativada nos tempos mais longos de exposição (24 e 48hs) levando a um aumento da apoptose e redução da proliferação celular. A administração intermitente de PTH não alterou a espessura dos cristais minerais da dentina de incisivos em formação e nem a quantidade de dentina terciária reacional em molares de camundongos. No entanto, o tratamento com PTH aumentou a concentração de zinco e diminuiu a concentração de cálcio na dentina de molares normais e em molares com indução de dentinogênese terciária. Com isso, pode-se concluir que o hPTH (1-34) modula a mineralização, apoptose e proliferação de odontoblastos MDPC-23 de maneira dependente do tempo, e que as vias de sinalização dependentes de PKA e PKC participam da resposta proliferativa e apoptótica. Além disso, nos modelos utilizados, a administração intermitente de PTH não teve efeito na espessura de cristais da dentina de incisivos, e também não demonstrou ser capaz de aumentar a formação de dentina terciária reacional em molares de camundongos / Abstract: Parathyroid hormone (PTH) is the major regulator of the calcium and phosphate ions in and plays a key role in the development and homeostasis of mineralized tissues. Recently we demonstrated that during the formation of the incisor of mice, intermittent PTH administration caused an increase of dentin apposition rate and it was associate to changes in the composition and in the mechanical properties of the formed dentin. Thus, the studies presented here were designed to investigate: 1) The effects of transient exposure (1 or 24h/cycle) or continuous (48h) to hPTH (1-34) in the mineral deposition and in the gene expression of alkaline phosphatase (ALP), metalloproteinase 2 (MMP2), Biglican (BGN) and type I collagen (COL1), and activity of MMP2 and ALP in odontoblast-like cells (MDPC-23); 2) The involvement of signaling pathways dependent of protein kinase A (PKA) and protein kinase C (PKC) in the proliferative and apoptotic response of MDPC-23 at different times of exposure to hPTH (1-34) (1, 24 or 48 hours); 3) The effect of the hPTH (1-34) treatment on the thickness of mineral crystals formed during dentinogenesis of the mice incisors. 4) The effects of intermittent hPTH (1-34) administration on the tertiary dentinogenesis in mice molars. The results showed that the transient exposure to PTH decreased the mineral deposition and ALP activity. The gene expressions of ALP, COL1 and BGN were higher in the group treated with PTH for 24h/cycle, while the PTH continuous administration group (48h) showed an increase in gene expression of COL1 and BGN. Also, the levels of secreted MMP2 were increased in 1h/cycle and decreased in the Continuous group (48h). The exposure to PTH modulates apoptotic and proliferative response of MDPC-23 in a time-dependent manner. Furthermore, the PKA pathway operates in response to short-term exposure to PTH (1h), maintaining levels of proliferation cell and apoptosis, whereas the PKC pathway is activated in longer exposure times (24 and 48h) leading to an increase apoptosis and decreased cell proliferation. The intermittent PTH administration did not change the thickness of the dentin mineral crystals of the incisors mice, and did not alter the deposition volume of the reactional tertiary dentin in the mice molars. However, treatment with PTH increased the concentration of zinc and decreased calcium concentration in normal dentin of molars with or without induction of tertiary dentinogenesis. Thus, it can be concluded that hPTH (1-34) modulates the mineral deposition, proliferation and apoptosis of the odontoblasts MDPC-23 in a time-dependent manner, and the signaling pathways PKA and PKC dependent participate of that proliferative and apoptotic response. Furthermore, in the models used here, the intermittent administration of PTH did not affect the thickness of the incisor dentinal crystals, and also not shown to be able to enhance the formation of reactional tertiary dentin in molar mice / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

Orientadores: Maria Ligia Rodrigues Macedo, Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T00:07:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ventura_ClaudioAngelo_D.pdf: 5407567 bytes, checksum: 8408eb98403ba9f693c16020c7c85169 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Lectinas constituem uma classe de proteínas ou glicoproteínas que são capazes de ligar-se, reversivelmente e seletivamente, a carboidratos sem causar transformação química. Estudos têm mostrado que a ligação de lectinas a carboidratos de superficie celular de células normais e malignas leva a vários efeitos biológicos tais como proliferação celular e apoptose. Neste trabalho, nós investigamos os efeitos citotóxicos induzidos por TEL (uma lectina, isolada de sementes de Talisia esculenta, a qual preferencialmente liga-se a resíduos de manose) sobre linhagens de células tumorais e não-tumorais. Células Vero (rim de macaco verde afiicano) e Rela (carcinoma cervical humano) tratadas com TEL exibiram perda da integridade da membrana plasmática, retração celular, condensação da cromatina, fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos. Além disso, células Vero e Rela tratadas com TEL também revelaram uma drástica desorganização do citoesqueleto de actina. A Fragmentação intemuc1eossomal do DNA foi detectada pelo método de TUNEL e eletroforese em gel de agarose. Os efeitos citotóxicos induzidos por TEL foram progressivos e mostraram que as alterações morfológicas e os danos ao DNA ocorreram após a perda da integridade da membrana. Adicionalmente, TEL inibiu significantemente a proliferação das células Rela de maneira dependente da concentração. Nós também mostramos através de microscopia de tluorescência que TEL é intemalizada nas células Vero dentro de pequenas vesículas que depois se acumulam da região perinuclear; nas células Rela, a intemalização não foi observada. Foi estabelecido que a atividade das caspases-3 e -9 aumentaram nas células Vero e Rela de uma maneira dependente do tempo. Em contraste com as células Vero, a atividade da caspase-3 precedeu a ativação da caspase9 nas células Rela. Os efeitos citotóxicos e a intemalização de TEL foram bloqueados pela mano se, sugerindo que a ligação de TEL ao carboidrato específico na superficie celular é um pré-requisito para esses processos. Os resultados mostraram que a morte celular induzida por TEL nas células Vero e Rela seguiu uma série de eventos que culminou em um modo apoptótico de morte celular. Finalmente, uma vez que as células Rela foram altamente sensíveis a citotoxicidade induzida pela lectina, TEL merece futuras investigações porque suas propriedades podem ser uma ferramenta útil na terapia contra câncer cervical humano / Abstract: Lectins constitute a class of proteins or glycoproteins which are capable of binding carbohydrates selectively and reversibly without causing their chemical transformation. Studies have shown that lectin binding to cell surface carbohydrates of normal and malignants cells triggers various biological effects such as cellular proliferation and apoptosis. In this work, we investigate the cytotoxic effects induced by TEL (a lectin, isolated from Talisia esculenta seeds, which binds preferentially to mannose residues), on tumoral and non-tumoral cell lines. TEL- treated Vero (African green monkey kidney) and Hela (human cervical carcinoma) cells exhibited loss of plasma membrane integrity, cellular retraction, chromatin condensation, nuclear fragmentation and formation of apoptotic bodies. Furthermore, TEL-treated Vero and Hela cells also revealed a drastic disorganization of the actin cytoeskeleton. Internucleossomal DNA fragmentation was detected by TUNEL method. and agarose gel electrophoresis. TEL-induced cytotoxic effects were progressive and showed that the morphological alterations and DNA damage occurred after the loss of membrane integrity. Additionally, TEL significantly inhibited the proliferation of Hela cells in a concentration- dependent manner. We also show through of fluorescence microspy that TEL is internalized in Vero cells into small visicles that further coalesce in the perinuclear region; in Hela cells, TEL internalization was not observed. It was established that caspase-3 and -9 activity increased in Vero and Hela cells after TEL treatment in a time- dependent manner. In contrast to Vero cells, caspase- 3 activity preceded the activation of caspase-9 in Hela cells. The cytotoxic effects and the internalization of TEL was blocked by manose, suggesting that the binding of TELto specific carbohydrate on the cell-surface is a prerequisite for these processes. The results showed that TEL- induced cell death in Vero and HeLa cells followed by down stream events leading to apoptotic mode of cell death. Finally, since Hela cells were highly sensitive to lectin-induced cytotoxicity, TEL merits further investigation due to its properties can be a useful tool in therapy against human cervical cancer / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Rubens Maciel Filho, Jorge Vicente Lopes da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T15:30:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Senedese_AnaLiviaChemeli_M.pdf: 22505646 bytes, checksum: 1c68dba091d7e2e2fc02cd7387c9852e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Em decorrência da grande demanda de transplantes de órgãos e tecidos no Brasil, ha estímulos para criação de terapias alternativas como o desenvolvimento de substitutos biológicos temporários, isto e, scaffolds, através da Bioengenharia e Engenharia Tecidual, descartando a necessidade de doadores. Neste trabalho, foi utilizado o polímero policaprolactona (PCL) para estruturar scaffolds 3D por meio da plataforma experimental de manufatura aditiva Fab@CTI, a qual apresenta um cabeçote de extrusão intercambiável construído para entrada de material em forma de filamento. Uma nova proposta de orientação de raster foi criada para o design dos scaffolds. Foram estruturados scaffolds com raster regular e randômico com poros de 0.25, 0.5 e 1 mm. Analises de Difração de raios-x (DRX), Calorimetria exploratória diferencial (DSC) e Espectroscopia de absorção no infravermelho com transformada em Fourier (FTIR) foram realizadas para verificar possíveis mudanças nas propriedades térmicas do material durante o processamento. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi feita para checar a morfologia dos scaffolds e medir o diâmetro dos filamentos extrudados na Fab@CTI alem do espaçamento entre eles. Também foram realizadas analises de citotoxicidade e viabilidade celular com células tronco mesenquimais de tecido adiposo. Ainda, utilizando o software modeFRONTIER, foi feita uma simulação de valores de modulo de compressão do PCL possíveis de serem obtidos. Os resultados de DRX e FTIR não mostraram degradação do PCL e o DSC revelou algumas alterações no ponto de fusão e diminuição da cristalinidade. Os scaffolds não se mostraram tóxicos e os modelos com poros de 0.25 mm e raster regular e randômico foram os que apresentaram viabilidade celular / Abstract: Due to the demand for organs and tissues transplants in Brazil, is indeed the creation of new therapies as the development of temporary biological substitutes, ie, scaffolds, through Bioengineering and Tissue Engineering, discarding the require for donors. In this work, we used the polymer polycaprolactone (PCL) to structure 3D scaffolds by the additive manufacturing experimental platform, Fab@CTI, which presents an interchangeable extrusion head build to filaments materials input. A new proposal for random raster was presented to design the scaffolds. Were structured scaffolds with regular and random raster and pores of 0.25, 0.5 and 1 mm. Analysis of X-Ray Diffraction (XRD), Differential Scanning Calorimetry (DSC) and Fourier Transform Spectroscopy (FTIR) were conducted to check for possible changes in thermal properties of the material during the processing. Scanning Electron Microscopy (SEM) was done to check the morphology of scaffolds and measure the diameter of filaments extruded at Fab@CTI beyond the distance between them. Analyses of cytotoxicity and cell viability with mesenchymal stem cells from adipose tissue were also performed. In addition, using the software modeFRONTIER, a simulation of compressive modulus of PCL was done with values possible to obtain. The result of the XRD and FTIR showed no degradation of PCL and DSC revealed some changes in melting point and decrease of crystallinity. The scaffolds were not toxic and models of 0.25 mm pores and both regular and random raster showed cell viability / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Mestre em Engenharia Química