Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Le cycle cellulaire est finement régulé dans le temps et l'espace. Nous avons abordé les aspects dynamiques des interactions que la cycline A2 entretient avec ses partenaires Cdk1, Cdk2 et l'ubiquitine au cours du cycle cellulaire, dans des lignées cellulaires humaines. A cette fin, nous avons eu recours aux approches de FRET (Förster/fluorescence resonance energy transfer) et de FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). Ceci nous a permis de montrer que les formes ubiquitinylées de la cycline A2 apparaissent principalement sous forme de foyers en prométaphase et se propagent ensuite à l'ensemble de la cellule. En outre, nous avons découvert que l'autophagie participe à la dégradation de cette cycline en mitose. Nous discutons les implications de ces observations quant à un rôle éventuel de la cycline A2 au moment de la formation de l'anneau de constriction, ainsi que de la participation de l'autophagie via cette cycline, dans la réponse aux dommages à l'ADN en mitose. / The cell cycle is finely regulated in time and space. We have studied the dynamical aspect of the interactions between cyclin A2 and its partners Cdk1, Cdk2 and ubiquitin during the cell cycle, in human cell lines. To this aim, we have used FRET (Förster/fluorescence resonance energy transfer) and FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) techniques. We have thus shown that ubiquitylated forms of cyclin A2 are detected predominantly in foci in prometaphase, before spreading throughout the cell. Moreover, we have shown that autophagy contributes to cyclin A2 degradation in mitosis. We discuss the implications of these observations regarding a possible role of cyclin A2 when the cleavage furrow forms, and the participation of autophagy in DNA damage response in mitosis.

Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont capables de se multiplier de façon autonome en l’absence de facteurs de croissance et de cytokines, un état appelé “état fondamental de pluripotence”. Le cycle cellulaire des cellules ES se caractérise : (i) par une expression élevée et uniforme de la cycline E et des complexes Cycline E-CDK2 au cours de la progression dans le cycle cellulaire et (ii) par une phase G1 très courte (1 heure) dont la traversée ne dépend ni des MAPK ni des points de contrôles régulés par la protéine du rétinoblastome (RB) et p53. Ces observations soulèvent la question de l’existence d’un lien de cause à effet entre ce phénomène de réplication autonome et la pluripotence. Mon projet de thèse se construit autour de trois axes qui montrent que : 1/ la phase G1 des cellules ES de souris est une phase de sensibilité accrue aux inducteurs de différenciation. 2/ la balance entre autorenouvellement et différenciation est perturbée, (i) quand l’expression de la cycline E est altérée, ou (ii) quand l’association de la cycline E avec la kinase CDK2 et le centrosome est bloquée. 3/ La signalisation par le LIF contrôle la formation et l’activation des complexes Cycline E/CDK2. Dans les cellules ES naïves Rex1+, l’allongement de la durée de la phase G1 induit par la privation de LIF précède, ou est concomitante, à la diminution de l’expression de marqueurs de pluripotence et à l’activation des marqueurs les plus précoces de la différenciation. Finalement, nous proposons un modèle dans lequel la signalisation par le LIF régule la transition G1/S et permet le maintien de l’autorenouvellement des cellules ES murines / Pluripotency can be captured and propagated in vitro from the epiblast of the pre-implantation blastocysts in the form of embryonic stem cells (ESCs). ESCs are capable of unlimited proliferation in an undifferentiated state while maintain the potential to differentiate into cells of all three germ layers in the embryo, including the germline. Two key features the ES cell mitotic cycle are (i) a vastly elevated and uniform expression of Cyclin E and Cyclin E/CDK2 complexes throughout the cell cycle and (ii) a short G1 phase characterized by the lack of RB- and p53-dependent checkpoints, and reduced dependency on MAPK signalling. During my PhD project, we explored whether and how the regulation of the cell cycle actively sustains self-renewal of mouse ESCs (mESCs). We demonstrated that: 1/ the G1 phase of mESCs is a phase of increased susceptibility to differentiation inducers. Thus shortening of G1 might shield undifferentiated cells from differentiation inducers and help ESCs to self-renew in the pluripotent state. 2/ Cyclin E opposes differentiation and supports self-renewal of mESCs by two independent mechanisms, one of which being independent of CDK2 activation. 3/ LIF signalling regulates Cyclin E/CDK2 kinase activity therefore accelerating the G1 to S phase transition. Finally, we propose a model in which LIF signalling stimulates the G1 to S phase transition to shield mESCs from undesired differentiation signals and help them to self-renew in the pluripotent state

Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer dans le monde et devenu un véritable enjeu de santé publique. Environ 5% sont associés à une forme familiale : la polypose adénomateuse familiale, le Syndrome de Lynch et la MAP (MUTYH-Associated Polyposis). Implication du syndrome MAP dans les polyposes: Parmi 31 patients avec une polypose sans mutation sur APC, 6 (20%) présentaient une mutation biallélique sur MUTYH. Fréquence de la mutation c.1185_1186dup dans les MAP: Au sein d'un groupe de 36 familles mutées sur MUTYH, 11 avaient une mutation biallélique homozygote c.1185_1186dup. Cette mutation était significativement plus fréquemment observée chez les patients d'Afrique du Nord (79% vs. 5%, p<0,0001). La recherche d'un haplotype commun en utilisant 10 microsatellites a identifié un segment de 1,3 cM présent chez tous les patients avec la mutation c.1185_1186dup. Variants rares (VR) de la cycline D1 : La comparaison des fréquences alléliques des VR de la cycline D1 fut réalisée entre les cas (112 patients avec une polypose indéterminée et 44 avec un CCR précoce) et 866 témoins. Les VR étaient plus fréquemment observés dans le groupe de malades. En combinant les VR, une augmentation du risque était retrouvée pour le groupe de patients avec une polypose indéterminée: (OR=2,2); 95%IC, 1,1-4,4; P=0,03). Rôle des variants rares : 70 variants provenant de 17 gènes ont été examinés au sein de la même population. 21 était des VR (fréquence<1%) et 4 étaient plus fréquemment observés chez les cas (EXO1-12, MLH1-1, CTNNB1-1 et BRCA2-37, p<0,05). En combinant tous les VR avec une fréquence allélique <0,5%, un sur risque de 3,2 était observé (95%CI=1,1-9,5; p=0,04)

Les principaux régulateurs de la prolifération cellulaire sont les Cdk (cyclin dependent kinase), dont l'activité dépend de leur association avec leurs partenaires, les cyclines. Le contrôle du niveau d'expression des cyclines représente le premier mécanisme par lequel l'activité des Cdk est régulée. Cette régulation est essentielle pour maintenir l'équilibre prolifération/différenciation de la peau. Cependant, les mécanismes mis en jeu restent peu connus.<br />Nous avons montré que Brm, protéine des complexes de remodelage de la chromatine SWI/SNF, est responsable de la répression de la cycline A par la mise en place ou le maintien de deux nucléosomes situés sur les sites d'initiation de la transcription. De plus, nous avons mis en évidence que l'absence de brm conduit à accélérer la progression des cellules dans le cycle cellulaire en jouant sur le déroulement de la phase S. Cependant, les cellules dépourvues de brm présentent également une mitose rallongée et des aberrations chromosomiques. Ceci pourrait être la conséquence de la dérégulation de trois oncogènes : c-myc, cycline A et cycline E et pourrait expliquer pourquoi brm est mutée dans de nombreux cancers.<br />Enfin, nous avons montré que l'entrée en différenciation des kératinocytes s'accompagne d'une forte expression de p21 qui entraîne un arrêt en G2/M en inhibant les complexes Cycline A/Cdk. Cependant, les kératinocytes en différenciation ne peuvent maintenir cet arrêt et entre dans un état G1 à 4N, caractérisé par une forte expression de la Cycline E et l'absence de Cyclines de G2/M.

Au cours du développement, les cellules acquièrent progressivement leur identité en établissant des profils transcriptionnels spécifiques qui seront maintenus à travers les divisions cellulaires successives par des mécanismes dits épigénétiques. En dépit de nombreuses sources de variations de l’environnement, génétiques ou aléatoires, les organismes vivants présentent des phénotypes très stéréotypés. Cela suggère l’existence de processus de régulation assurant l’homéostasie du développement. Chez la drosophile, la protéine Cycline G jouerait un rôle dans la stabilité du développement, processus qui tamponne les variations aléatoires du développement. De plus, cette cycline est un régulateur trancriptionnel et interagit avec deux Enhancers de Trithorax et Polycomb (ETP) : ASX et Corto, impliqués dans l’activation et la répression de nombreux gènes. L’analyse du= transcriptome des disques imaginaux d’ailes de larves de drosophile qui surpexpriment CycG nous a permis d’identifier ses cibles transcriptionnelles. Nous avons montré que le domaine d’interaction avec les ETP (ASX et Corto) de Cycline G pourrait être impliqué dans la stabilité du développement. Nos résultats suggèrent qu’une interaction fonctionnelle entre Cycline G et deux complexes Polycomb répresseurs (PR-DUB et PRC1), contrôlerait l’expression de gènes importants pour la stabilité du développement. Par ailleurs, l’interaction fonctionnelle entre des facteurs d’épissage et Cycline G serait également impliquée dans la stabilité du développement. Nos résultats suggèrent que la dérégulation de CycG induirait une augmentation du bruit transcriptionnel, ayant des répercussions sur la stabilité du développement. / During development, cells progressively acquire their identity by establishing specific transcriptional profiles that will be maintained throughout successive cell divisions by epigenetic mechanisms. Despite numerous sources of developmental variability - whether environmental, genetic or stochastic, living organisms exhibit uncannily stereotyped phenotypes, suggesting the existence of regulation processes tending to developmental homeostasis. In Drosophila, Cyclin G could participate in developmental stability, which buffers stochastic developmental variation. Moreover, this cyclin is a transcriptional regulator and interacts with two Enhancers of Trithorax and Polycomb (ETP): ASX and Corto, both involved in transcriptional gene silencing and activation. By studying the transcriptome of Drosophila imaginal wing discs overexpressing Cyclin G, we have identified its transcriptional targets. We determined that the ETP-interacting domain of Cyclin G (which binds ASX and Corto) may be involved in developmental stability. Our results show that a functional interaction between Cyclin G and two Polycomb group complexes involved in transcriptional gene silencing (PR-DUB and PRC1), may control the expression of genes required for developmental stability. Additionally, Cycling G might participate indevelopmental stability through functional interactions with splicing factors. Altogether, our results suggest that Cyclin G deregulation may induce an increase in transcriptional noise, resulting in heightened developmental variation.

Une surprolifération cellulaire associée à de l’aneuploïdie est un marqueur couramment retrouvé dans les cancers et une faible instabilité génétique peut-être un élément aggravant (sinon déclencheur) de la tumorigénèse. Récemment, il a été montré sur un modèle de cellules cancéreuses en culture qu’une forte aneuploïdie compromet la prolifération cellulaire en entraînant la mort de ces dernières. Au cours de ma thèse, nous avons souhaité tester si cette hypothèse se vérifiait in vivo en utilisant comme modèle, les tumeurs du système nerveux central de la larve de D. melanogaster. Nous avons fait le choix d’utiliser des mutants pour des gènes impliqués dans la formation du fuseau mitotique et la ségrégation des chromosomes (Sas-4 ou AurA) afin d’induire ces tumeurs. Pour générer l’aneuploïdie, nous avons choisi d’associer les mutations sas-4 ou aurA avec des mutations pour des gènes essentiels du SAC, Mad2 ou BubR1ken. Nous avons ensuite analysé par immunofluorescence et microscopie l’effet de la perte du SAC sur la prolifération des Nb. Pour sas-4, la perte du SAC cause l’apparition d’une forte aneuploïdie et une baisse du nombre de Nb associée à une forte réduction de taille des cerveaux. Cela compromet totalement la capacité des cerveaux mutants à induire des tumeurs lorsqu’on les injecte dans l’abdomen de mouches adultes saines. Dans le cas d’aurA, ni hausse de l’aneuploïdie dans le tissu ni baisse de la prolifération des Nbs n’ont été observés. Par ailleurs, la même forte proportion de mouches injectées avec des cerveaux aurA ou aurA mad2 développant une tumeur a été constaté. Afin de mieux comprendre pourquoi le mutant aurA ne réagit pas comme le mutant sas-4 à la déplétion du SAC, nous avons entrepris une analyse détaillée des mutants aurA et aurA mad2. Nous avons d’abord observé que, malgré la perte du SAC, 1) il existe toujours un délai en mitose dans aurA mad2 et 2) il existe un délai entre la satisfaction du SAC et l’entrée en anaphase dans aurA. Comme l’entrée en anaphase est dépendante de la dégradation de la CycB et de la Sécurine via l’APC/C, nous avons analysé le comportement de la CycB (couplé à une étiquette GFP) par vidéo-microscopie en temps réel et observé un défaut de la régulation de la dégradation de cette dernière dans le mutant aurA ainsi que dans le double mutant aurA mad2. Ces observations nous ont permis de proposer un nouveau rôle pour la kinase AurA dans la régulation de la dégradation de la CycB en fin de mitose. / Cellular overproliferation associated with aneuploidy is a common hallmark of cancers. Low genetic instability may be a contributing factor of tumorigenesis. Recently, it was shown on a cellular cancer model in culture that strong aneuploidy compromises cell proliferation by causing cell death. During my thesis, we have test if this hypothesis was verified in vivo by using as a model, the tumours of the larval central nervous system of D. melanogaster. We decided to use mutants involved in mitotic spindle formation and chromosome segregation (Sas-4 or AurA) to induce these tumours. To generate aneuploidy, we chose to associate these mutations with mutations in genes essential for the SAC, Mad2 or BubR1ken. We then analysed the effect of the SAC depletion on the Nb proliferation. For sas-4, loss of the SAC leads to high aneuploidy and a decrease in Nb number associated with brain size reduction. It completely undermines the ability of mutant brain to induce tumors when injected into the abdomen of healthy adult flies. In the case of aurA, nor increase of aneuploidy in tissue or decrease in nb proliferation have been observed. Moreover, the same proportion of flies injected with aurA or aurA mad2 brains developed tumours. To better understand why the aurA mutant not react as the sas-4 mutant to the SAC depletion, we undertook a detailed analysis of aurA and aurA mad2 mutants. We first observed that despite the SAC depletion, 1) there is always a delay in mitosis in aurA mad2 and 2) there is a delay between SAC satisfaction and anaphase onset in aurA. Since anaphase onset is dependent of the CycB and Securine degradation via the APC / C, we analysed the behaviour of the CycB (coupled with a GFP tag) by real-time videomicroscopy and observed a defect in the regulation of CycB degradation in aurA and in the double aurA mad2 mutant. These observations lead us to propose a new role for AurA kinase in regulating the degradation of CycB at the end of mitosis.

Ce travail de thèse a comporté deux parties distinctes : l'une porte sur l'étude du complexe TAR/Tat/cycline T1 impliqué dans la transactivation de la transcription de l'ARN du virus HIV-1, l'autre concerne différentes facettes de la régulation de l'épissage de l'ARN du virus HIV-1. L'interaction de la protéine virale Tat avec l'élément TAR présent à l'extrémité 5' des ARN du virus HIV-1 d'une part, et la cycline T1, composant du complexe p-TEFb responsable de l'hyperphosphorylation de l'ARN polymérase II d'autre part, est primordial pour obtenir des ARN viraux de pleine longueur. Dans l'objectif de réaliser une étude structurale du complexe TAR/Tat/cycline T1, l'ARN TAR et un fragment de la cycline T1 ont été produits en grandes quantités. De nombreuses tentatives de complexation des trois partenaires (TAR, Tat et cycline T1) ont été effectuées, mais la qualité des cristaux n'était pas suffisante pour une étude radiocristallographique du complexe. L'épissage est une étape majeure du cycle de multiplication du virus HIV-1. Son ARN comporte 5 sites donneurs et 8 sites accepteurs dont l'utilisation combinée permet la production des 9 ORF virales. Les variations de l'épissage alternatif de l'ARN du virus HIV-1 en fonction de l'expression de protéines virales Tat et Nef ont été étudiées. Nous avons par ailleurs étudié l'effet des protéines SR sur l'utilisation des sites accepteurs A2 et A3. L'étude fine de l'élément régulateur ESEt du site A3 a révélé l'implication de la protéine SR 9G8 dans le schéma complexe de régulation de ce site. / This work of thesis contained two different parts : the one concerns the study of the TAR/Tat/cycline T1 complex involved in the transactivation of the transcription of the HIV-1 RNA, the other one concerns various facets of the regulation of the splicing of the HIV-1 RNA. The interaction of the viral protein Tat with the TAR element present in the 5 ' extremity of the HIV-1 RNA on one hand, and the cycline T1, composing of the complex p-TEFb responsible for the hyperphosphorylation of the RNA polymerase II on the other hand, is essential to obtain viral RNA of full length. In the objective to realize a structural study of the complex TAR/Tat/cycline T1, TAR RNA and a fragment of the cycline T1 were produced in appropriate quantities. Numerous attempts of complexation of three partners (TAR, Tat and cycline T1) were made, but the quality of crystals was not sufficient for a radiocristallographic study of the complex. Splicing is a major stage of the cycle of reproduction of the virus HIV-1. His RNA contains 5 donor splice sites and 8 acceptor splice sites whose combined use allows the production 9 viral ORF. The variations of the alternative épissage of HIV-1 RNA according to the expression of viral proteins Tat and Rev were studied. We besides studied the effect of proteins SR on the use of acceptor splice sites A2 and A3. The fine study of the regulating element ESEt of the site A3 revealed the involvement of the SR protein 9G8 in the complex regulation of this site.

L’homéostasie des tissus et la formation d’organes fonctionnels au cours du développement mettent en jeu un équilibre entre prolifération, croissance, mort et différenciation des cellules. Cycline G de D. melanogaster est une protéine impliquée dans plusieurs de ces processus de maintien de l’homéostasie tissulaire. Au cours de ma thèse, j’ai montré que Cycline G est impliquée dans le maintien épigénétique des identités cellulaires au cours du développement. En effet, CycG interagit avec des gènes codant des facteurs chromatiniens des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG), impliqués respectivement dans le maintien d’un état réprimé ou activé des gènes au cours des divisions cellulaires. Ces interactions corrèlent avec une modification du profil d'expression des gènes homéotiques Scr et Ubx, qui suggère un rôle de Cycline G dans la répression de ces gènes. Je me suis également intéressée au rôle de CycG dans la stabilité du développement (SD), qui participe au maintien de l’homéostasie en contrôlant les variations stochastiques des processus développementaux. En effet, la surexpression de CycG induit une asymétrie visible de la taille des ailes des mouches, indiquant que la SD est altérée. L’étude des bases génétiques de ce processus par une analyse de gènes candidats suggère que des gènes PcG et trxG jouent un rôle dans la SD. Par ailleurs, l’asymétrie induite par CycG est aggravée par des mutations des effecteurs de la compétition cellulaire, un mécanisme via lequel des cellules entraînent l’apoptose de cellules voisines de moindre capacité proliférative. Ces résultats soulèvent l’intéressante possibilité d’une implication de la compétition cellulaire dans la SD. / Tissue homeostasis and formation of functional organs during development require a precise balance between proliferation, growth, cell death and differentiation. Drosophila Cyclin G is involved in several of these processes. During my PhD, I showed that Cyclin G is implicated in epigenetic maintenance of cell identities during development. Indeed CycG interacts with genes of the Polycomb (PcG) and trithorax (trxG) groups that encode chromatin factors involved in the maintenance through cell divisions of repressed or active transcriptional state of genes, respectively. These interactions correlate with a change of the homeotic genes Scr and Ubx expression profile, suggesting a role for Cyclin G in the repression of these genes. I also addressed the role of CycG in developmental stability that participates in tissue homeostasis by buffering stochastic variations of developmental processes, also known as developmental noise. CycG overexpression induces a visible asymmetry of wing size, indicating that developmental stability is impaired. Genetic and cellular bases of this process are poorly understood. The results of a gene candidate approach suggest that PcG and trxG genes contribute to developmental stability. Besides, CycG-induced asymmetry is increased by mutating effectors of cell competition, a phenomenon through which cells induce apoptosis of less fit neighbour cells. These observations raise the question of a role for cell competition in developmental stability.

Chez la femme, le risque de concevoir un embryon aneuploïde augmente de façon exponentielle dès 35 ans. La majorité de ces aneuploïdies sont dues à de mauvaises ségrégations des chromosomes lors des deux divisions de méiose dans l'ovocyte. Afin de limiter les erreurs de ségrégation, les divisions méiotiques doivent impérativement se dérouler en deux temps et de manière contrôlée. Un premier aspect de ma thèse a consisté à étudier les mécanismes qui régulent la séparation des chromosomes dans l'ovocyte de souris. J'ai montré que la Cycline A2 joue un rôle essentiel pour la séparation des chromatides s¿urs en méiose II. Au contraire, cette protéine doit impérativement être absente des régions centromériques en méiose I afin d'éviter une séparation précoce des chromatides s¿urs qui conduirait à la formation d'un ovocyte aneuploïde. Dans un seconde temps, mes travaux de thèse ont visé à étudier le mécanisme de surveillance de la première transition métaphase-anaphase appelé SAC (Spindle Assembly Checkpoint). Il a été montré que l'expression d'une protéine du SAC appelée BubR1 décroît naturellement dans les ovocytes avec l'âge maternel. Afin d'analyser les conséquences de cette diminution, j'ai utilisé une lignée de souris totalement délétée pour la protéine BubR1 spécifiquement dans les ovocytes. J'ai montré que la perte totale de BubR1 entraîne plus de 80% d'aneuploïdies dans l'ovocyte dès la première division de méiose. La méiose I est accélérée et les chromosomes homologues se séparent de façon anarchique. De plus, le fuseau méiotique devient instable. La diminution naturelle de BubR1 pourrait ainsi expliquer l'augmentation du nombre d'aneuploïdie avec l'âge maternel. / Women in industrialized countries tend to postpone childbearing, leading to a 70% increase intrisomic pregnancies over 20 years. Meiosis in females is error prone, with rates of meiotic chromosome missegregations strongly increasing towards the end of the reproductive lifespan. A strong reduction of BubR1 has been observed in oocytes of women approaching menopause and in ovaries of aged mice, which led to the hypothesis that deterioration of spindle assembly checkpoint fidelity contributes to age-related aneuploidization. However, this idea has remained controversial since transient knock-down of BubR1 was found to prevent meiotic prophase arrest and chromosome segregation in a checkpoint independent manner. We employed a conditional knockout approach in mouse oocytes to dissect the meiotic roles of BubR1. We show that BubR1 is required for diverse meiotic functions, including persistent spindle assembly checkpoint activity, timing of meiosis I, and establishment of robust kinetochore-microtubule attachments in a meiosis specific manner, but not prophase I arrest. These data reveal that BubR1 plays a multi-faceted role in chromosome segregation during the first meiotic division and suggest that age-related loss of BubR1 is a key determinant of formation of aneuploid oocytes as women approach menopause. Using mouse oocytes, a second aspect of my thesis reveals that cyclin A2 promotes entry into meiosis, as well as an additional unexpected role, namely, its requirement for separase- dependent sister chromatid separation in meiosis II.