Le trafic vésiculaire permet un échange coordonné de molécules entre les différents organites de la cellule et dépend largement des petites GTPases de la famille des Rabs dont le nombre varie entre 27 chez la Drosophile et 70 chez l’Homme. Un des prochains défis consiste donc à élucider les mécanismes cellulaires qui coordonnent l’activité de ces Rabs, laquelle garantit un transport vésiculaire ordonné au sein de la cellule. Les Rabs agissent comme des interrupteurs moléculaires grâce à leur capacité à cycler entre un état actif et inactif. L’activité des Rabs est contrôlée par des protéines régulatrices puis des effecteurs en aval coordonnent leurs différentes fonctions. La petite GTPase Rab11 est essentielle au développement de plusieurs organismes incluant la Drosophile, C. elegans et la souris puisqu’elle se retrouve au cœur de différentes voies de transport. D’ailleurs, le trafic de molécules dépendant de Rab11 est perturbé dans plusieurs pathologies. Malgré son rôle central dans le trafic vésiculaire, la régulation de Rab11 reste peu comprise in vivo. Cette thèse se penche sur les mécanismes moléculaires contrôlant les fonctions de Rab11 et de ses effecteurs lors de la migration cellulaire collective et lors de la cytocinèse. Nous avons identifié Evi5 comme un nouvel acteur clé de la migration cellulaire collective, et nous montrons qu’elle possède une activité Rab11-GAP essentielle pour maintenir les récepteurs de guidance actifs de façon polarisée au front de migration. Nous avons ensuite déterminé que Rab11 régule la communication cellulaire lors de la migration collective par l’entremise de son interaction avec la Moésine. Une question reste toutefois en suspens : sachant que Rab11 compte plus de 13 effecteurs, quels sont les mécanismes assurant la spécificité de l’interaction entre cette GTPase et un effecteur particulier? Une partie de la réponse provient peut-être de nos observations que les membres des Rab11-FIPs de classe I, une famille d’effecteurs de Rab11, interagissent avec les protéines d’échafaudage 14-3-3. Chez la Drosophile, Rip11 est le seul représentant des Rab11-FIPs de classe I et nous montrons que Rip11 aurait des fonctions inattendues durant la cytocinèse qui seraient coordonnées par 14-3-3. Nos recherches permettent de dresser un portrait plus authentique des mécanismes moléculaires régulant les différentes fonctions de Rab11 et de ses effecteurs in vivo. / Vesicle trafficking allows coordinated exchange of molecules between the cell organelles and depends largely on small GTPases of the Rab family which contains 27 members in Drosophila and 70 in Human. One challenge is to identify the cellular mechanisms which coordinate Rab activity to ensure ordered vesicle transport within the cell. Rab proteins act like molecular switch by cycling between an active and an inactive state. Rab activity is regulated by helper proteins, whereas downstream effector proteins coordinate the Rab functions. The small GTPase Rab11 is crucial for Drosophila, C. elegans and mouse development since Rab11 is at the heart of different transport routes. Thus, Rab11-dependent trafficking of molecules is perturbed in different pathologies. Despite its central role during vesicle trafficking, the regulation of Rab11 in vivo is poorly characterized. This thesis focus on the molecular mechanisms controlling the function of Rab11 and its effectors during collective cell migration and cytokinesis. We identify Evi5 as a novel key regulator of collective cell migration and we show that Evi5 has Rab11-GAP activity essential for maintaining active guidance receptors at the leading edge. We then show that Rab11 regulates cell communication during collective cell movement through its interaction with Moesin. A question still remained unanswered: knowing that Rab11 has more than 13 effectors, which mechanisms assure the specificity of interaction between this small GTPase and a particular effector? Part of the answer might come from our observation that class I Rab11-FIPs, known Rab11 effectors, are able to bind to the 14-3-3 scaffolding proteins. In Drosophila, Rip11 is the sole member of the class I Rab11-FIPs and we show that Rip11 has unexpected functions during cytokinesis which are coordinated by 14-3-3. Our research allows us to better understand the molecular mechanisms regulating Rab11 and its effectors in vivo.

Les tissus épithéliaux présentent deux caractéristiques majeures, ils sont robustes (rôle de barrière) mais également plastiques lors de la morphogénèse. L'homéostasie des tissus épithéliaux repose sur la régulation de la balance prolifération/mort cellulaire. Dans ma thèse, je décris tout d'abord, les mécanismes moléculaires permettant à la cellule épithéliale de se diviser tout en maintenant l'intégrité du tissu. J'ai ensuite altéré cette intégrité, en utilisant le système de génération de clônes mosaïques, afin de comprendre comment la cohésion du tissu est maintenue. Ce travail m'a alors permis de comprendre comment l'adhérence est modulée, puis restaurée, au cours de la division cellulaire. Ainsi, j'ai montré que l'intégrité des tissus est assurée par l'action concomitante des forces d'adhésion et des forces de tension. Enfin, mon travail apporte également des éléments clés pour l'étude de la perte d'adhérence des cellules tumorales responsable en partie, de la progression des tumeurs solides en métastases. / Tissue homeostasis relies on the tight regulation of cell proliferation and cell death. Epithelial tissues are robust tissues that support the structure of developing embryos and adult organs and are effective barriers that physically protect the organism against pathogens. In my thesis, I have first described the molecular mechanisms responsible for maintaining tissue integrity during epithelial cell division. I have then abrogated this integrity by inducing mosaic clones within tissues to understand how tissue cohesion is maintained. This work shows how the continuity of adhesive properties is ensured during cell division. It also reveals new key elements that result in loss of adhesion in tissues and thus may be responsible for the progession from solid cancer to metastasis.

Le cancer est une maladie multifactorielle dont la première étape est souvent une mutation. Il est envisageable de prévenir l'apparition de cette maladie en limitant l'apparition de mutations. Le benzo(a)pyrène et le 1-nitropyrène sont deux mutagènes et cancérogènes très répandus dans notre environnement. Ces deux composés entrainent une réponse inflammatoire chez l'homme qui à son tour induit un stress oxydant aboutissant à des mutations. L'objectif de cette étude est de rechercher l'activité antimutagène de sept plantes médicinales et de deux molécules naturelles anti-inflammatoires, avec un intérêt plus développé pour l'Harpagophytum procumbens (HP) et son principal iridoïde : l'harpagoside. Elle consiste également à vérifier si l'activité anti-inflammatoire peut être reliée à une activité antimutagène. L'activité antimutagène a été étudiée au niveau des mutations chromosomiques à l'aide du test des micronoyaux sur lymphocytes humains, et au niveau des mutations ponctuelles à l'aide du test d'Ames. Tous les extraits HP, à l'exception de l'extrait méthanolique, possèdent une activité antimutagène importante dans le test des micronoyaux, mais aucun dans le test d'Ames. Pour les six autres plantes anti-inflammatoires, plus de la moitié des extraits possèdent une activité antimutagène. Nous avons montré que l'activité antioxydante n'est pas ou peu impliquée dans l'activité antimutagène. Il est probable que d'autres mécanismes d'action soient impliqués tels que l'inhibition de l'inflammation (NF-ĸB). C'est la première fois que ce type d'études est réalisé sur des plantes possédant une activité anti-inflammatoire et plus particulièrement sur l' Harpagophytum procumbens. / Cancer is a multifactorial disease in which the first step is often a mutation in the genome. It is then possible to prevent the onset of the disease by limiting the occurrence of mutations. Benzo (a) pyrene (BaP) and 1-nitropyrene (1-NPY) are two widespread mutagens and carcinogens in our environment. These two compounds produce an inflammatory response in humans which in turn induces oxidative stress leading to gene mutations. The objective of this study was to investigate the antimutagenic activity of seven medicinal plants and two natural anti-inflammatory molecules, especially in Harpagophytum procumbens (HP) with its major iridoid: harpagoside. However, also to check whether the anti-inflammatory activity may be related to antimutagenic activity. The antimutagenic activity was investigated with chromosomal mutations using the in vitro cytokinesis-block micronucleus assay in primary cultures of human lymphocytes, and at the point mutations using the Ames test. All HP extracts, except for the methanol extract, showed a significant anti-mutagenic activity in the micronucleus test. No antimutagenic activity could be detected by the Ames assay. For the six other anti-inflammatory plants, more than half of the extracts possessed an antimutagenic activity. We have shown that the antioxidant property was not responsible for the antimutagenic activity. Thus, it is likely that other mechanisms of action are involved, such as anti-adduct mechanism, inhibition of metabolism or inhibition of inflammation (NF-ĸB). This is the first report of antimutagenic properties of anti-inflammatory plants and more particularly of the Harpagophytum procumbens.

Les phosphoinositides sont des molécules régulatrices présentes à l'interface membrane-cytosol, impliquées dans la transduction du signal, le trafic membranaire ainsi que l'organisation du cytosquelette. Ces lipides recrutent non seulement diverses protéines vers des compartiments spécifiques, mais régulent aussi leur activité enzymatique. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, ils interagissent directement avec le domaine RhoGAP de la protéine Rgd1, identifiée comme un activateur commun aux GTPases Rho3 et Rho4. Ces 2 protéines, respectivement impliquées dans la croissance polarisée et la cytocinèse, voient leur activité GTPasique exacerbée en présence de Rgd1pet des PIPs. L'objectif de cette thèse était comprendre à l'échelle moléculaire le processus unique d'activation de RhoGAP par les PIPs. Pour ce faire, nous avons réalisé l'étude structurale de RhoGAP par cristallographie couplée à la RMN en solution. Nos résultats montrent que le domaine possède les éléments essentiels à l'activation des protéines Rho. L'interaction avec les PIPs a été suivie par RMN en présence de PI(4)P et de PI(4,5)P2, respectivement localisés dans les vésicules de sécrétion et à la membrane plasmique. Nos résultats révèlent un site de liaison commun aux PIPs dans une région non conservée chez les domaines RhoGAP. L'affinité des complexes, de l'ordre de la centaine de micromolaires suggèrent qu'in vivo l'interaction soit transitoire et réversible avec les PIPs. La sélectivité de l'interaction se ferait donc de façon spatio-temporelle, au niveau des vésicules de sécrétion pour la croissance polarisée et de la membrane plasmique pour la cytocinèse. / Phosphoinositides act as regulatory and signalling molecules at the membrane-cytosol interface in signal transduction, membrane traffic and cytoskeleton organization. These lipids recruit several proteins to specific compartments, but also regulate their activity. In the yeast Saccharomycescerevisiae, they directly bind the Rgd1-RhoGAP domain, that stimulates the GTPase activity of bothRho3p and Rho4p. The GTPase activity of these two Rho proteins, respectively involved in the polarized growth and cytokinesis of the yeast, is enhanced with the presence of Rgd1p and PIPs. The main objective of this thesis is to understand the PIP-RhoGAP interaction at the molecular level. In order to do that, we coupled X-ray structure determination to solution NMR spectroscopy on the isolated RhoGAP domain. Our results show that the domain contains the conserved elements that would usually confer the catalytic GTPase activation. We us e liquid-state NMR spectroscopy to follow the interaction with PI(4)P and PI(4,5)P2, respectively found in secretion vesicles and the plasma membrane. Our study reveals a common binding site for both PIPs in a non-conserved region in the RhoGAP domain family. We measured sub-millimolar binding affinity for PIPs. Such moderate binding affinities are consistent with the biological requirement for reversible complex formation. The selectivity of the interaction could be made in a spatio temporal way, on the secretion vesicles during polarized growth and at the plasma membrane during cytokinesis.

Die Zellteilung/Zytokinese ist ein grundlegender zellulärer Prozess und essentiell für das Wachstum von einzelligen und mehrzelligen Organismen. Reguliert wird dieser Prozess durch komplexe molekulare Mechanismen sowie einer Vielzahl von interaktiven Netzwerken. In Pilzen koordiniert eine Kinase-Kaskade, das Septierungs-Initiierungs Netzwerk (SIN) das Fortschreiten des Zellzyklus mit dem Beginn der Zellteilung und kontrolliert die Septenbildung. Fehlregulation des homologen Hippo Netzwerks in Tieren führt zu Gewebewucherungen und Tumorbildung, was die konservierte Bedeutung dieser Regulationsnetzwerke in verschiedenen Organismen unterstreicht. Obwohl die Septenbildung essentiell für das Wachstum und die Differenzierung von Schimmelpilzen ist, bleibt die Frage wie die Septierung reguliert wird und aus welchen Komponenten sich das SIN Netzwerk in filamentösen Pilzen zusammensetzt bisher noch unbeantwortet. Mit Hilfe von in silico Analysen konnten homologe Proteine für fast alle SIN Netzwerk Komponenten im Modellorganismus Neurospora crassa identifiziert werden. Die Analyse dieser vorhergesagten SIN Komponenten ermöglichte die Charakterisierung der SIN-Kinase-Kaskade, bestehend aus CDC-7, SID-1 und DBF-2 sowie den entsprechenden, regulatorischen Untereinheiten CDC-14 und MOB-1. Es konnte gezeigt werden, dass DBF-2 durch SID-1 am hydrophoben Motiv phosphoryliert und aktiviert wird und dass eine SID-1 abhängige Stimulation von DBF-2 durch Zugabe von CDC-7 weiter gesteigert wird. Diese Daten liefern den ersten biochemischen Nachweis für die schrittweise Aktivierung einer dreistufigen SIN-Kinase-Kaskade in Pilzen. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die gesamte SIN Kaskade konstitutiv und Zellzyklus unabhängig an den Spindelpolkörpern akkumuliert und dass alle SIN Proteine an kontrahierenden Septen lokalisieren. Demzufolge ist im Gegensatz zu den einzelligen Pilzen die Lokalisation und Aktivität der SIN Komponenten in Synzytium-bildenden Ascomyzeten Zellzyklus unabhängig. Darüber hinaus deutet die Charakterisierung von DBF-2 Mutanten, in denen die beiden regulatorischen Aminosäuren (Ser499 and Thr671) mutiert sind, darauf hin, dass ein dynamischer Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungszyklus des Ser499 entscheidend für die Aktivität und Funktion von DBF-2 in N. crassa ist. Diese Daten haben Einfluss auf das allgemeine Verständnis der Aktivierung von NDR Kinasen, denn bisher wurde für NDR Kinasen höherer Eukaryonten eine folgegebundene Phosphorylierung beider regulatorischer Reste angenommen. Der Ste20-verwandten Kinase MST-1 konnte eine Funktion als SIN-assoziierte Kinase, die parallel zu SID-1 agiert, zugeordnet werden. SID-1 und MST-1 werden auf entgegengesetzte Weise von der oberhalb agierenden SIN Kinase CDC-7 reguliert, was nahelegt, dass MST-1 für die Feinabstimmung des SIN erforderlich ist. Lifeact- und Formin-GFP Reporter Konstrukte zeigten, dass in der Δmst-1 Mutante abnormale, kortikale Actomyosin-Ringe gebildet werden, was eine Fehlpositionierung der Septen und die Bildung von unregelmäßigen Spiralen zur Folge hat. Diese Defekte entsprechen partiell jenen der MOR Mutanten. Diese Mutanten weisen ein defektes NDR Kinase Netzwerk auf, welches für das polare Wachstum verantwortlich ist (MOR). Es stellte sich heraus, dass MST-1 mit den zentralen MOR Kinasen POD-6 und COT-1 interagiert und sowohl die SIN Effektor Kinase DBF-2 als auch die MOR Effektor Kinase COT-1 aktiviert. Somit fungiert MST-1 als dual-spezifisches Enzym. Eine weitere Vernetzung beider Signalwege ist durch die Bildung von Heterodimeren gegeben. Die in dieser Studie identifizierten verschiedenen Ebenen der Vernetzung des SIN und MOR, sowie entsprechende Daten aus anderen Modellorganismen wie S. pombe und D. melanogaster, lassen vermuten, dass antagonistische Interaktionen zwischen homologen NDR Kinase Netzwerken ein genereller Mechanismus zur Koordination beider Signalwege darstellt und auch in höheren Organismen konserviert ist. Durch die Annotierung mehrerer Pilzgenome wurden zahlreiche Gene mit einer Homologie zu den S. cerevisiae BUD Genen auch in filamentösen Pilzen identifiziert. Epistatische und biochemische Analysen ergaben, dass das MOR Netzwerk als negativer Regulator der Septenbildung oberhalb des BUD komplex fungiert und dass COT-1 im Gegensatz zu DBF-2, die beiden Septierungsmarkerproteine BUD-3/BUD-4 phosphoryliert. Folglich könnte die Regulation von BUD-3 (und eventuell auch BUD-4) durch COT-1 ein Mechanismus des MOR Netzwerks sein, um die Septenbildung in N. crassa zu inhibieren.

Les cellules épithéliales forment un tissu de cellules étroitement juxtaposées qui assure une barrière physique et chimique entre les compartiments internes et externes du corps. L’intégrité de ces tissus est donc essentielle. Au cours du développement et de la vie adulte, le tissu doit grandir ou se régénérer, ce qui implique de nombreuses divisions cellulaires. La dernière étape de la division, la cytodiérèse, met en jeu la formation d’un anneau contractile qui, en se fermant, va séparer les cellules sœurs. Une fois complètement fermé, il donne naissance au midbody, juste sous le niveau des jonctions adhérentes, au sein des jonctions septées, chez la drosophile. L’ultime étape, l’abscission, permet la séparation physique définitive et l’isolation cytoplasmique des cellules sœurs. Si de nombreuses études ont décrit ces processus dans les cellules isolées, peu de choses sont connues quant à la cytodiérèse des cellules épithéliales. Ce travail de thèse a permis de mettre en évidence que malgré le recrutement de tous les effecteurs et régulateurs de l’abscission, celle-ci est retardée dans les cellules épithéliales. Des expériences de photo-conversion de KAEDE ont montré que l’abscission est liée à l’entrée en mitose des cellules épithéliales. La question de l’intégrité du tissu et notamment de la barrière de perméabilité a ensuite été investigué. Nous avons montré que les cellules voisines formaient des protrusions de membrane restant connectées au midbody tout au long de sa lente migration vers le pôle basal des cellules. Les expériences de FRAP menées sur les jonctions bicellulaires et tri-cellulaires des jonctions septées ont permis de montrer que celles-ci se formaient juste sous les jonctions adhérentes et toujours au-dessus du midbody, participant ainsi à la migration de ce dernier vers le pôle basal. Les contacts maintenus avec les voisines ainsi que l’assemblage polarisé des jonctions septées participent au maintien de l’intégrité du tissu au cours des divisions de cellules épithéliales. / Epithelial cells are closely juxtaposed to form a tissue playing a physical and chemical barrier between external and internal body compartments. Thus, tissue integrity is essential. During development and adult life, epithelia has to growth and regenerate meaning a lot of divisions. At the end of cell division, cytokinesis occurs, implying the formation of a contractile ring which contracts to separate daughter cells. In Drosophila, once totally closed, the contractile ring gives rise to the midbody, just below adherens junctions, in the septate junctions layer. Last step of cytokinesis, abscission, permits the final cut and the cytoplasmic isolation of daughter cells. If cytokinesis is well described in isolated cells, little is known about epithelial cells cytokinesis. This work shows that whereas all abscission regulators and effectors are recruited, abscission is delayed in epithelial cells. KAEDE photo-conversion assays show that abscission is linked to epithelial cells mitosis entry. Then we investigate how permeability barrier is maintained during cell division. We show that neighboring cells present finger-like protrusions contacting the midbody all along the midbody is moving basally across septate junctions. FRAP experiments on bicellular and tricellular septate junctions show that they form just below adherens junctions and always above the midbody, leading to its basal migration. Contacts maintained with neighbors and polarized assembly of septate junctions participate to the maintenance of tissue integrity throughout epithelial cells divisions.

Le VIH-1, ou Virus de l’ImmunoDéficience Humain de type I, est un pathogène intracellulaire dont le cycle de réplication dépend entièrement des machineries cellulaires. Des interactions entre les protéines virales et cellulaires sont donc essentielles pour l’achèvement de chaque étape du cycle de multiplication du VIH-1. Comprendre comment le virus VIH-1 détourne la machinerie cellulaire à son profit est un élément clé pour le combattre. L’objectif de mon travail de thèse était d’explorer le rôle de la protéine Bécline-1 dans la formation et la libération des particules virales. Cette protéine, composant du complexe phosphatydylinositol-3-Phosphate-kinase III (PI3K-III), est impliquée dans l’autophagie, le trafic intracellulaire et la cytocinèse.Au cours de ma thèse, nous avons développé les outils d’ARN interférence afin de décrypter le rôle de Bécline-1 dans le cycle réplicatif du VIH-1. De manière très intéressante, nous avons mis au jour un nouveau rôle de Bécline-1 lors des étapes précoces de la mitose, jamais décrit, ni publié à ce jour. Un mauvais déroulement de la mitose induit de l’instabilité génomique pouvant conduire à la mort cellulaire ou à une transformation maligne. Au cours de cette thèse, nous avons établi que l’extinction de Bécline-1 induit un défaut d’attachement des chromosomes, via leurs kinétochores, aux microtubules, conduisant à un blocage des cellules en prométaphase. Cette extinction provoque un défaut d’organisation du kinétochore en diminuant le recrutement des protéines CENP-E, CENP-F et ZW10 au niveau de cette structure protéique. Nous avons également montré une interaction directe entre Bécline-1 et Zwint-1, une protéine du kinétochore, jouant un rôle essentiel pour l’accrochage des microtubules aux kinétochores. Enfin, nous avons montré que ce nouveau rôle de Bécline-1 dans l’alignement des chromosomes en mitose est indépendant de son association avec ses partenaires du complexe PI3K-III et de son rôle dans l’autophagie.Le second volet de ma thèse a porté sur l’étude du rôle de Bécline-1 au cours du cycle réplicatif du virus. Nos résultats montrent que cette protéine est nécessaire à l’établissement des phases tardives du cycle viral. Nos expériences de production virale montrent que l’extinction de Bécline-1 provoque une forte accumulation des sous-produits de la protéine Gag du virus dans les cellules, et réduit la libération des particules virales dans le milieu extracellulaire. Par immunofluorescence, nous observons que des composants viraux s’accumulent massivement à la membrane sous l’effet de l’extinction de Bécline-1 dans les cellules. Par ailleurs, ces résultats sont dépendants de l’expression du facteur de restriction BST2 dans la cellule. Ces derniers résultats ouvrent d’importantes perspectives quant au rôle de Bécline-1 et du PI3K-III sur le cycle de réplication du VIH-1.L’ensemble de ces travaux démontre l'importance de la protéine Beclin-1, pour le maintien de l'intégrité du génome pendant la mitose et pour le cycle de réplication du VIH 1. / HIV-1, or Human Immunodeficiency Virus type 1, is an intracellular pathogen whose replication cycle entirely depends on cellular machineries. Interactions between the viral and cellular proteins are therefore essential to the completion of each step of HIV-1's multiplication cycle. Understanding how the HIV-1 virus uses the cellular machinery to its own benefit is a key element to combat it. The objective of my thesis work was to explore the role of the Beclin-1 protein in the formation and the release of viral particles. This protein, a component of the phosphatydylinositol-3-Phosphate-kinase III (PI3K-III) complex, is involved in autophagy, intracellular trafficking and cytokinesis. Throughout my thesis researches, we have developed the RNA interference tools in order to decipher the role of Beclin-1 in HIV-1's replicative cycle. Very interestingly, we have found out a new role of Beclin-1 in the early stages of mitosis which had never been described nor published before. A bad execution of mitosis induces genomic instability which can lead to cell death or malignant transformation. During this thesis work, we have demonstrated that the extinction of Beclin-1 causes a defect in the attachment of chromosomes to microtubules through their kinetochores, leading to the locking of cells in prometaphase. This extinction provokes a defect in the organization of the kinetochore by diminishing the recruitment of the CENP-E, CENP-F and ZW10 proteins at the level of this protein structure. We have also found out that there is a direct interaction between Beclin-1 and Zwint-1, a protein of the kinetochore that plays an essential role in the attachment of the kinetochores to the microtubules. Finally, we have demonstrated that this new role of Beclin-1 in the alignment of the chromosomes during mitosis is independent of both its association with its partners from the PI3K-III complex and its role in autophagy. The second strand of my thesis dealt with the role of Beclin-1 in the virus replicative cycle. Our results show that this protein is essential to the setting up of the late phases of the viral cycle. Our experiments of viral production have shown that the extinction of Beclin-1 causes a high accumulation of the by-products of the virus' Gag protein in the cells, and reduces the release of viral particles in the extracellular medium. By immunofluorescence, we detected a massive accumulation of viral components on the membrane as a result of the extinction of Beclin-1 in the cells. Besides, these results depend on the expression of the BST2 restriction factor in the cell. These latter results open up significant prospects regarding the role of Beclin-1 and that of the PI3K-III complex in HIV-1's replication cycle. All these researches demonstrate the importance of the Beclin-1 protein in two mechanisms that allow the maintenance of genomic integrity during mitosis and the HIV-1 replication cycle.

Au sein d'un organisme les cellules se divisent et assurent la croissance, la différentiation et l'homéostasie des tissus. Des travaux récents proposent qu'elles communiquent activement entre voisines au sein des organes solides pour coordonner leur propre division et la préservation de l'intégrité tissulaire. Nous proposons que la signalisation Eph-éphrine, acteur de la communication cellulaire locale, participe à cette coordination entre division cellulaire et cohésion du tissu. Au cours de ma thèse, j'ai démontré dans plusieurs modèles cellulaires que la signalisation Eph-éphrine contrôle la division cellulaire et peut induire des retards dans l'abscission et de la polyploïdie. J'ai prouvé par vidéomicrosocpie que ces défauts d'abscission dépendent du domaine catalytique du récepteur EphB2 et de l'activation de la protéine tyrosine kinase relais c-Src. En cascade, c-Src phosphoryle un régulateur clé de la stabilité du pont intercellulaire, la protéine citron kinase (CitK). J'ai également observé que CitK était anormalement localisé durant la cytocinése en aval de la voie Eph. Par des essais kinase in vitro, j'ai exclu une phosphorylation directe de CitK par le récepteur Eph et identifié c-Src comme capable de phosphoryler directement CitK. J'ai identifié les résidus tyrosines de CitK phosphorylés par c-Src, mutés deux d'entre eux et à l'aide d'analyses de sauvetage phénotypique, démontré que ces résidus étaient nécessaires et suffisants pour induire des défauts d'abscission. J'ai ensuite validé in vivo ce rôle original de la voie Eph-éphrine, dans le contexte du développement neuronal chez la souris. Plusieurs membres de la famille des Eph-éphrines sont exprimés dans les progéniteurs neuraux à l'origine des neurones corticaux et des auteurs ont montrés que CitK contrôle la cytocinèse de ces cellules. En utilisant un système Cre-lox, j'ai spécifiquement éteint la signalisation Eph dans ces progéniteurs et observé une modification de la ploïdie neuronale dans ces animaux. J'ai également observé dans les progéniteurs neuraux une co-localisation physiologique de résidus tyrosines phosphorylés et de la protéine CitK, qui adopte un enrichissement apical caractéristique. Ces résultats suggèrent notamment que la signalisation Eph-éphrine pourrait contrôler l'abscission des progéniteurs neuraux via la phosphorylation de CitK. La cytocinèse est aujourd'hui décrite comme un processus cellulaire autonome orchestré par la machinerie intracellulaire. Les résultats obtenus durant mon doctorat suggèrent que la cytocinèse est également régulée par l'environnement local de la cellule comme j'en ai fait la démonstration avec la signalisation Eph-éphrine. D'autre part, mes travaux suggèrent que la phosphorylation de CitK sert d'interrupteur moléculaire durant la progression à travers la division cellulaire et le contrôle de la ploïdie des neurones. / Cells within an organism successfully divide to ensure growth, differentiation and homeostasie. Recent work suggests that dividing cells actively communicate with neighbours thus spatially and temporally coordinating cell division while maintaining tissue cohesiveness. We hypothesized that Eph-ephrin signalling, a local cell-cell signalling pathway, could participate in coordinating cell division within a tissue. Using vertebrate and invertebrate cell culture models I showed that Eph-signalling controls cell division and induces delay in the abscission of nascent daughter cells as well as polyploidy. Using time-lapse imaging I proved that the Eph-mediated abscission failure depends on the catalytic activity of the receptor via the non receptor tyrosine kinase relay molecule c-Src. Downstream of Eph signalling c-Src phosphorylates the protein citron kinase (CitK) a well known regulator of intercellular bridge stability. I also observed that CitK was abnormally localized during cytokinesis when Eph signalling was active. Further, using in vitro kinase assays, I demonstrated that Eph does not directly phosphorylate CitK but that c-Src could do so. In addition, using Mass Spectrometry I mapped all tyrosine residues directly phosphorylated by c-Src. I mutated two of them located in the Rho binding domain of CitK and demonstrated that phosphorylation of those residues are necessary and sufficient to induce cytokinesis failure. I validated in vivo this novel role of Eph-ephrin signalling in a physiological context in the developing mouse neocortex. Members of the Eph/ephrin family are expressed in neural progenitors that give rise to neurons of the cortex upon neurogenic division. Importantly, CitK has been shown by others to control cytokinesis of these progenitor cells. Using the Cre-lox system, I specifically turned off Eph forward signalling in neural progenitor cells and observed an alteration of neuronal ploidy in these mutant animals. Further, I also observed that CitK which adopts a particular apical localisation in neural progenitors physiologically co-localized with phosphorylated tyrosine residues. Altogether, these results suggest that Eph-ephrin signalling controls abscission of neural progenitors by promoting phosphorylation of CitK. The textbook view of cytokinesis is that it is a cell autonomous event orchestrated by the intracellular machinery. Data obtained during my PhD suggest that cytokinesis is also regulated by local environment, here Eph/ephrin signalling, and that phosphorylation of CitK may represent a molecular switch in the normal progression of cell division and in the control of neuronal ploidy.

La cellule est l’élément fondamental de la vie. Plus d’une vingtaine de trillions de cellules forment les organes et tissus de notre corps. Ces cellules sont de taille spécifique puisqu’elles ont des fonctions précises au sein de leur tissu respectif. Dans la plupart des cas, les cellules doivent proliférer en se divisant pour se renouveler et ainsi assurer le bon fonctionnement d’un organisme. La dernière étape de la division cellulaire, la cytokinèse, est exécutée par la contraction d’un anneau contractile d’actomyosine, nécessaire pour effectuer la séparation physique de la cellule en deux cellules filles. La première partie des travaux décrits dans cet ouvrage portent sur la caractérisation de la cytokinèse en utilisant, comme modèle in vivo, les cellules précurseur de la vulve (VPCs) du nématode C. elegans. Notre étude révèle que plusieurs aspects de l’anneau d’actomyosine s’ajustent en fonction de la taille de la cellule. Entre autres, la largeur de l’anneau contractile, juste avant sa constriction, s’ajuste en fonction de la longueur des VPCs. De plus, la rapidité avec laquelle l’anneau se contracte dépend de la circonférence de la cellule. Ces découvertes nous ont amené à nous demander comment la cellule régule sa taille? Les cellules en prolifération maintiennent leur taille en homéostasie en équilibrant leur taux de croissance et de division cellulaire. Afin d’interroger les gènes impliqués dans le maintien de la taille cellulaire du mammifère, nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9, afin d’éliminer par délétion tous les gènes humains, à raison d’un par cellule, pour identifier ceux qui causent une augmentation ou une diminution de la taille cellulaire. Cette étude nous a permis d’identifier plusieurs gènes déjà connus régulant la croissance cellulaire. De plus, nous avons identifié un groupe de gènes, incluant TLE4 un corépresseur de la transcription que nous avons caractérisé, n’ayant jamais été associé avec une fonction de contrôle de la taille cellulaire chez les mammifères. En somme, nos travaux ont contribué à l’approfondissement des connaissances sur la division cellulaire, plus précisément la cytokinèse, et des gènes impliqués dans le maintien de la taille cellulaire. Une meilleure connaissance du fonctionnement de ces deux évènements cellulaires est essentielle puisque leur dérégulation peut entrainer plusieurs pathologies, incluant le cancer. / Cells are the fundamental building blocks of life. The human body contains over twenty trillion cells that make up the different tissues and organs of our bodies. Cells within organs are of specific sizes to perform their specialized functions. In most cases, these cells must divide to proliferate and replenish the population of cells essential for proper organism function. The final stage of cellular division, termed cytokinesis, entails the assembly and constriction of a contractile ring that drives the dramatic cell shape changes required to physically partition the cell into two daughter cells. The first part of the work presented in this thesis addresses the characterization of cytokinesis in the epithelial vulval precursor cells (VPCs) of the nematode worm C. elegans. This study principally revealed that several aspects of cytokinesis scale with cell size. For instance, I observed that the breadth of the actomyosin ring scaled with VPC length. In addition, the speed of contractile ring constriction scaled with the circumference of VPCs. These scaling events raised the more general question as to how cells regulate their size. Proliferating cells attain cell size homeostasis by balancing cell growth and cell division. In order to define the molecular regulators of size in human cells a genome-wide approach was taken. Recently developed CRISPR/Cas9 technology was used to perform the first pooled knockout screens for human cell size regulators in the NALM-6 pre-B lymphocytic cell line. These screens revealed many genes that affect the size of NALM-6 cells, a number of which were previously known to be involved in growth regulation. In addition, these screens revealed the identity of many genes with no previously established functions associated with cell size regulation. Amongst the previously unknown regulators, I characterized the function of a co-repressor of transcription, TLE4, which I showed functions as a regulator of the B-cell lineage. This work contributes to the knowledge of the mechanics of cytokinesis in C. elegans epithelial cells and of the genes that coordinate cell size in humans. These results provide insights into cell growth and division in normal cells and how these processes may be perturbed in cancer and other diseases.

Thesis (MSc (Radiography))--Cape Peninsula University of Technology, 2018 / Background: Breast cancer is one of the most commonly diagnosed among woman in South Africa, and a more resilient effort should be focused on treatment improvements. Worldwide, proton therapy is increasingly used as a radiation treatment alternative to photon therapy for breast cancer, mostly to decrease the risk for radiation-induced cardiovascular toxicity. This in vitro study aims to determine a better understanding of the radiosensitivity of both tumour and normal breast cell lines to clinical proton irradiation. In addition, we propose to investigate whether the increase in linear energy transfer (LET) towards the distal part of the proton beam results in an increase in relative biological effectiveness (RBE) for both cell lines. Methods: Malignant (MCF-7) and non-malignant (MCF-10A) breast cells were irradiated at different water equivalent depths in a 200 MeV proton beam at NRF iThemba LABS using a custom-made Perspex phantom: the entrance plateau, 3 points on the Bragg peak, the D80% and the D40%. A cytokinesis-block Micronucleus (CBMN) assay was performed and Micronuclei (MNi) were manually counted in binucleated cells (BNCs) using fluorescent microscopy. Reference dosimetry was carried out with a Markus chamber and irradiations were performed with a clinical proton beam generated at NRF iThemba LABS that was degraded to a R50 (half-value depths) range of 120 mm, with a field size of 10 cm x 10 cm and a 50 mm SOBP. The phantom could be adjusted to accommodate different perspex plates depending on the depth required within the proton beam. Cells were then exposed to 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 Gy doses for each cell line independently and for each dose point. Results and Discussion: For the CBMN results, a program was developed on Matlab platform to calculate the 95% confidence ellipse on the co-variance parameters α and β. These values were determined by fitting the linear quadratic dose response curve to the average number of radiation induced MNi per 1000 BN cells. The ellipse region around a coordinate (the average MN frequency) for both MCF-7 and MCF-10A cells at the plateau region was defined by the mean estimate of the α-value and the β-value that were plotted on the X-axis and Y-axis respectively. The ratio of the two parameters, α/β, is a measure of the impact of fractionation to determine the biological effective dose. In fractionated proton therapy, the MCF10A cells will repair less between two fractions compared to the MCF7 cells. This is not an indication of therapeutic gain from a fractioned treatment protocol. For this reason, the hypofractionated stereotactic treatment protocols that can be applied with protons could be to the befit of the breast cancer patient. The above argument is based only on the radiosensitivity of the two cell lines exposed in the plateau region. Further analysis of the 95% confidence ellipse of both cell lines also showed a clear increase of the alpha value toward the distal portion of the beam and indicates an increase in energy transfer in this region. The gradual increase in α and β parameters with depth for protons for both cells is of clinical importance, since it implicates a non-homogeneous dose within the targeted area and an unwanted high dose behind the targeted area. Distal energy modulation could be investigated especially with larger breast tumours. RBE was calculated as the ratio of the dose at the different positions to the dose at the entrance plateau position (reference) to obtain an equal level of biological effect. A statistically significant difference in radiosensitivity could be observed between malignant and non-malignant cells at all positions (p<0.05). The variation in RBE was between 0.99 to 1.99 and 0.92 to 1.6 for the MCF-7 and MCF10A cell respectively. Conclusions: There is a variation in RBE along the depth-dose profile of a clinical proton beam. In addition, there is difference in radiosensitivity between the cancerous cells and the normal breast cells. While this study highlights a variation in sensitivity between cells it could be used by the modelling community to further develop biologically motivated treatment planning for proton therapy.