Le but de ces travaux de thèse est d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes de régulation contrôlant la division cellulaire au niveau moléculaire. La division cellulaire est composée de la mitose et la cytocinèse. Les deux processus doivent être coordonnés étroitement afin de garantir la stabilité du génome. La division cellulaire doit aussi s’équilibrer avec la croissance cellulaire pour que les cellules conservent une taille constante au cours des cycles successifs. La levure S. pombe est un organisme modèle simple très utilisé pour des études de cycle cellulaire et de cytocinèse. Dans ce modèle, nous avons focalisé ce travail de thèse sur les nœuds corticaux médians, des structures protéiques complexes, qui ont une fonction double dans l’engagement en mitose et dans le positionnement du plan de division. Les nœuds médians corticaux sont organisés par la kinase SAD Cdr2. Leur localisation et leur fonction sont régulées négativement pour la DYRK kinase Pom1 qui forme des gradients émanant des extrémités de la cellule. Les nœuds corticaux médians contiennent une voie d’inhibition pour Wee1 qui promeut l’entrée en mitose. Cette voie implique la kinase SAD Cdr1, un inhibiteur direct de Wee1 et pourrait coupler l’entrée en mitose à la taille de la cellule par levée progressive de l’inhibition exercée par Pom1 quand les cellules s’allongent. Cdr2 recrute aussi l’anillin Mid1 sur les nœuds corticaux médians ainsi qu’une série de composants additionnels, Blt1, Gef2, Nod1 et Klp8, pour former des précurseurs médians de l’anneau contractile de cytocinèse qui se compactent en un anneau fin pendant la mitose. La localisation médiane des nœuds, contrôlée négativement par les gradients polaires de Pom1 prédéfinit ainsi le plan de division au centre géométrique de la cellule. Dans la première partie de ma thèse, j’ai étudié la protéine des nœuds corticaux médians Blt1 dont la fonction restait énigmatique. Nous avons montré que Blt1 promeut une association robuste de Mid1 avec les nœuds corticaux. Blt1 interagit avec Mid1 via le RhoGEF Gef2 pour stabiliser les nœuds au cortex cellulaire durant les premiers stades de l’assemblage de l’anneau contractile. L’extrémité N-terminale de Blt1 est nécessaire à sa localisation ainsi qu’à sa fonction, tandis que son extrémité C-terminale favorise sa localisation au cortex en interagissant avec des phospholipides. Dans des cellules dans lesquelles ni Mid1 ni Blt1 ne peuvent s’attacher à la membrane, les nœuds se détachent du cortex et génèrent des anneaux contractiles de cytocinèse aberrants. Nous en avons conclu que Blt1 agit comme une protéine d’échafaudage pour les précurseurs de l’anneau contractile, et que Blt1 et Mid1 constituent des ancres membranaires redondantes pour le positionnement du plan de division. Dans une deuxième partie de ma thèse, j’ai étudié comment Cdr2 organise les différents composants des nœuds en voies fonctionnelles qui favorisent l’entrée en mitose et la division médiane. J’ai montré que l’interaction de Cdr2 avec Wee1 et Mid1 dépend du domaine UBA de Cdr2 de manière dépendante de l’activité kinase. En revanche, Cdr1 s’associe avec l’extrémité C-terminale de Cdr2, composée des domaines basique et KA1 d’association aux lipides membranaires. De manière intéressante, Mid1 interagit également avec l’extrémité C-terminale de Cdr2 et pourrait ponter les parties N- et C-terminales de Cdr2, alors que Blt1 s’associe à la région centrale de Cdr2. Nous faisons l’hypothèse que l’association des effecteurs de Cdr2 avec différents domaines de Cdr2 pourraient contraindre Cdr1 et Wee1 spatialement pour promouvoir l'inhibition de Wee1 quand la kinase Cdr2 est active. / The aim of this PhD work is to bring a better understanding of the regulatory mechanism controlling cell division in space and time at the molecular level. Cell division is composed of mitosis and cytokinesis. Both processes need to be perfectly coordinated in order to guarantee genome integrity. Cell division also needs to be properly balanced with cell growth to maintain cell size constant during successive cell cycles. Temporal and spatial regulatory mechanisms ensure the coordination of these events. The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is a simple rod-shaped model organism well-known for cell cycle and cytokinesis studies. In this model, we focused the work of this thesis on the medial cortical nodes, complexe protein structures that have a dual role in mitotic commitment and in division plane positioning. Medial cortical nodes are organized by the SAD kinase Cdr2. Their localization and function is negatively regulated by the DYRK kinase Pom1 that forms a gradient emanating from the cell tips. Medial cortical nodes contain an inhibitory pathway for Wee1, promoting mitotic entry. This pathway involves the SAD kinase Cdr1, a direct inhibitor of Wee1 and has been proposed to couple mitotic entry to cell size by progressive alleviation of Pom1 inhibition when cells grow longer. Cdr2 also recruits to medial nodes the anillin Mid1 as well as a series of four additional components, Blt1, Gef2, Nod1 and Klp8, to form medial precursors for the cytokinetic contractile ring that compact into a tight ring during mitosis. Nodes medial localization, negatively controlled by Pom1 gradients, predefines thereby the division plane in the cell geometrical center. In a first part of my thesis, I studied the previously enigmatic cortical node protein Blt1. We showed that Blt1 promotes the robust association of Mid1 with cortical nodes. Blt1 interacts with Mid1 through the RhoGEF Gef2 to stabilize nodes at the cell cortex during the early stages of contractile ring assembly. The Blt1 N terminus is required for localization and function, while the Blt1 C terminus promotes cortical localization by interacting with phospholipids. In cells lacking membrane binding by both Mid1 and Blt1, nodes detach from the cell cortex and generate aberrant cytokinetic rings. We conclude that Blt1 acts as a scaffolding protein for precursors of the cytokinetic ring and that Blt1 and Mid1 provide overlapping membrane anchors for proper division plane positioning. In the second part of my thesis, I studied how Cdr2 scaffolds various nodes components to organize them in functional pathways promoting mitotic commitment and medial division. I showed that Cdr2 interaction with Wee1 and Mid1, depends on Cdr2 UBA domain in a kinase activity dependent manner. In contrast, Cdr1 associates with Cdr2 C-terminus composed of basic and KA-1 lipid-binding domains. Interestingly, Mid1 also interacts with Cdr2 C-terminus and may the bridge N- and C-terminal domains of Cdr2 while Blt1 associates with the central spacer region. We propose that the association of Cdr2 effectors with different Cdr2 domains may constrain Cdr1 and Wee1 spatially to promote Wee1 inhibition upon Cdr2 kinase activation.

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La cellule est l’unité à la base de la vie. Elle est généralement délimitée par sa membrane et contient un noyau et du cytoplasme en plus d’autres composantes. Les cellules se divisent afin de maintenir et de perpétuer la vie par duplication de leur matériel génétique et par leur séparation en deux cellules physiquement distinctes durant la cytocinèse. Cependant, la division cellulaire est parfois modifiée et aboutit à la formation d’un tissu contenant plusieurs noyaux bordés d’une membrane unique appelé syncytium. Les syncytia sont fréquemment retrouvés chez les organismes vivants, bien que leurs fonctions et mode de formation restent peu compris. L’organisation en syncytium est conservée chez tous les animaux étudiés à ce jour au niveau de la lignée germinale dans laquelle les cellules partagent un cytoplasme commun par l’intermédiaire d’un pont intercellulaire stable. Dans la majorité des lignées germinales étudiées, les cellules sont directement connectées l’une à l’autre par un pont intercellulaire stable qui émerge de cytocinèses incomplètes. Cependant, certaines lignées germinales sont organisées autour d’une cavité commune à laquelle chaque cellule germinale est connectée. Dans ces lignées germinales, les mécanismes qui mènent à l’expansion du syncytium sont peu compris. Ma thèse décrit l’utilisation de la lignée germinale primordiale de C. elegans à son premier stade larvaire pour mieux comprendre l’organisation, l’expansion et la fonction des lignées germinales syncytiales. En utilisant la microscopie électronique et confocale, j’ai découvert que l’organisation du syncytium est fixée au premier stade larvaire. En effet, les deux cellules germinales primordiales (CGP) sont chacune individuellement connectée à une cavité cytoplasmique centrale par le biais de ponts intercellulaires stables. Nous avons nommé cette cavité le proto-rachis car l’organisation des CGP est identique à l’organisation de la gonade adulte. Chez l’adulte, les ponts intercellulaires qui connectent les cellules germinales au rachis sont stabilisés par des régulateurs d’actomyosine. Nous avons vérifié si cela était également le cas dans la gonade au premier stade larvaire. Tous les régulateurs présents dans la gonade adulte, sont aussi présent dans les ponts intercellulaires des CGP, mais la lignée germinale primordiale est réfractaire à la perturbation de la fonction de ces régulateurs. Ce résultat suggère que les régulateurs d’actomyosine sont organisés de manière très stable au premier stade larvaire. Afin de mieux comprendre comment le syncytium se développe dans la lignée germinale de C. elegans, j’ai ensuite suivi la première division des CGP par microscopie à temps réel. J’ai mis en évidence que l’anneau de cytocinèse se stabilise, puis se déplace vers le proto-rachis jusqu’à qu’il s’y intègre. Ces résultats indiquent que le syncytium se développe par cytocynèse incomplète. De plus, mes résultats montrent que la connexion au proto-rachis est maintenue durant la division des CGP. C’est pourquoi nous proposons un modèle pour l’expansion du syncytium dans lequel l’anneau de cytocinèse stabilise pour connecter une des cellules filles au proto-rachis, tandis que l’autre cellule fille est connecté par l’anneau stable qu’elle aura hérité de la cellule mère. Enfin, pour s’assurer que les mécanismes d’expansion du syncytium observés durant la division des CGP sont conservés au cours du développement de la gonade, j’ai conceptualisé et créé un dispositif de micro-fluidique qui en théorie permettrait de suivre plusieurs séries de division des CGP. En somme, mon travail de doctorat a fourni une caractérisation détaillée de la structure du syncytium dans la lignée germinale de C. elegans au premier stade larvaire, ainsi qu’un modèle pour l’expansion du syncytium. Mes découvertes indiquent que malgré des différences dans l’organisation des syncytia, la cytocinèse incomplète est un mécanisme conservé dans toutes les lignées germinales animales. Des travaux futurs seront nécessaires pour découvrir quelles voies de signalisation moléculaires sont sous-jacentes aux mécanismes de formation des syncytia, et ainsi de mieux comprendre quelle est la fonction de ces structures fascinantes. / The cell constitutes the basic unit of life. It is generally delimited by its membrane and contains a nucleus and cytoplasm amongst other components. To maintain and perpetuate life, cells divide by duplicating their genetic material, and by physically separating into two distinct cells during the process called cytokinesis. However, cell division is sometimes modified and leads to the formation of a tissue in which several nuclei are delimited by a single membrane, called a syncytium. Syncytial tissues are common amongst living organisms, but why and how they form remains unclear. The syncytial architecture is conserved in all studied animal germlines where germ cells share a common cytoplasm through stable intercellular bridges. In most animal germlines, the germ cells are directly connected with one another, and the stable intercellular bridges that connect the cells are known to arise from regulated incomplete cytokinesis. However, some germlines are organized around a central common cavity to which each germ cell is connected. In such germlines, the mechanisms of syncytium expansions remain unknown. My thesis describes the use of the C. elegans germline primordium at the first larval stage to better understand the organization, the expansion, and the function of germline syncytia. Using electron and confocal microscopy I found that the organization of the syncytium is established at the first larval stage. The two germ cells called the primordial germ cells (PGCs) each connect to a central cytoplasmic cavity through stable intercellular bridges. Because this organization is identical to the adult germline where each germ cell is connected to the central rachis, we termed the cavity between the PGCs proto-rachis. In the adult gonad, the intercellular bridges that connect the germ cells to the rachis are stabilized by actomyosin regulators, so I verified if this was also the case in the first larval stage gonad. All the regulators that localize to adult intercellular bridges were also present between the PGCs, but the primordial germ line is refractory to perturbation of these regulators. This suggests that the actomyosin regulators are organized in a very stable manner in the first larval stage germline. I next tracked the first division of the PGCs with live imaging to better understand how the syncytium expands in the C. elegans germline. I found that the cytokinetic ring stabilizes, then displaces towards the proto-rachis until it integrates into the syncytial structures. This finding suggests the syncytium expands by incomplete cytokinesis. In addition, my results indicate that the connection to the proto-rachis was maintained during PGCs division. We therefore propose a model in which the cytokinetic ring stabilizes and connects one of the daughter cells to the proto- rachis while the other cell is connected through the inherited stable ring from the mother cell. Finally, I designed and a created a microfluidic device that in theory would allow us to live image several rounds of PGCs division. This would confirm if the mechanisms of syncytium expansion that we observed during the first division of the PGCs are conserved in further development. My work has provided a detailed characterization of the syncytial structure in the C. elegans germline primordium as well as a model for syncytium expansion. My findings indicate that despite differences in the organization of the syncytium, incomplete cytokinesis is conserved as the mechanism for syncytium expansion in all animal germlines. Further research will be necessary to bring to light the molecular pathways underlying syncytium formation to have a better understanding of the function of these fascinating structures.

Essentiel au maintien d’un organisme sain, la division cellulaire est un processus biologique composée de deux phases : la mitose et la cytokinèse. Au cours de la mitose, un fuseau mitotique bipolaire est assemblé et les chromosomes s’alignent au niveau de la plaque métaphasique par l’attachement des kinétochores aux microtubules du fuseau. Une fois les chromosomes alignés, les chromatides soeurs sont séparées par les microtubules pendant l'anaphase et sont ségréguées entre les cellules filles. La cytokinèse est initiée peu après le début de l'anaphase, marquant ainsi la fin de la division cellulaire en séparant le cytoplasme en deux nouvelles cellules filles. Une exécution précise de la mitose et de la cytokinèse est essentielle pour le maintien de l'intégrité du génome. L'échec de l'un de ces processus affecte la fidélité génétique. Les erreurs de ségrégation des chromosomes durant la mitose peuvent entraîner un gain ou une perte de chromosomes entiers, appelé aneuploïdie. Tandis que l'échec de la cytokinèse conduit à la formation d'une cellule binucléée avec un génome entièrement dupliqué, appelé tétraploïdie. Dans les cellules somatiques, la tétraploïdie peut conduire à l'arrêt du cycle cellulaire, à la mort cellulaire, ou provoquer une instabilité chromosomique (CIN), favorisant ainsi la prolifération de cellules avec un potentiel tumorigène. Par conséquent, il est essentiel de bien comprendre la régulation et les causes potentielles de l’échec de la cytokinèse en particulier dans le contexte des systèmes multicellulaires comme l’embryon. En effet, dans ces systèmes, la réduction progressives de la taille des cellules coïncident avec les principaux évènements du développement. De plus, la binucléation est fréquemment observée dans les cliniques de fertilité chez les embryons humains. Cependant, l’impact de la binucléation sur les divisions préimplantatoires demeure inexpliqué à ce jour. Afin de déterminer les conséquences de la tétraploïdie, nous avons utilisé l'embryon de souris pour modèle et réalisé des expériences d'immunofluorescence à haute résolution et une imagerie sur cellules vivantes. Nous avons découvert que la tétraploïdie chez les embryons de souris provoque une CIN et l'aneuploïdie par un mécanisme différent de celui des cellules somatiques. Dans les cellules somatiques, la formation des fuseaux multipolaires causée par des centrosomes surnuméraires est le principal mécanisme conduisant à la tétraploïdie et ainsi, à une CIN. En revanche, chez les embryons de souris, qui ne possèdent pas de centrosomes, la tétraploïdie ne conduit pas à la formation des fuseaux multipolaires. Les embryons tétraploïdes de souris développent une CIN en raison d’une réduction du renouvellement des microtubules et d’une altération de l’activité de correction d’erreurs dans l’attachement des kinétochores aux microtubules. Ainsi, une mauvaise correction de l’attachement des kinétochores aux microtubules entraîne des niveaux élevés d'erreurs de ségrégation chromosomique. Dans le cadre d'une étude de suivi, nous avons ensuite utilisé des différentes expériences d'imageries sur des cellules vivantes et d'immunofluorescences. Celles-ci furent couplées à des micromanipulations de la taille des cellules, des techniques modifiant l'adhésion cellulaire et des approches de knock-down des protéines pour étudier les mécanismes de régulation de la cytokinèse. Les expériences d'imageries sur cellules vivantes et les micromanipulations du volume cytoplasmique ont démontré que la taille des cellules détermine la vitesse de constriction de l'anneau contractile, c'est-à-dire que la vitesse de constriction devient progressivement plus lente à mesure que la taille des cellules diminue. Cependant, ce phénomène n'a lieu que lorsque les embryons atteignent le stade de 16 cellules ce qui suggère qu'une limite supérieure de vitesse de constriction peut exister pour restreindre l’augmentation de cette vitesse quand les cellules sont trop grandes. La taille des cellules étant un déterminant de la progression de la cytokinèse, nos expériences de knock-down des protéines ont, de plus, démontré que la formation de la polarité cellulaire a un impact négatif sur l'assemblage et la constriction de l'anneau contractile dans les cellules externes au stade de morula. Plus précisément, nous avons constaté que la polarité limite le recrutement des composants de la cytokinèse spécifiquement d'un côté de l'anneau contractile, provoquant ainsi un déséquilibre de l’ingression du sillon de clivage et réduisant la vitesse de constriction dans les cellules externes. Nous spéculons que la polarité cellulaire agit comme un obstacle à la progression de la cytokinèse, rendant ainsi les cellules externes plus sensibles à un échec de la cytokinèse. Ces études ont démontré un nouveau mécanisme par lequel la tétraploïdie conduit à l’instabilité chromosomique et à l’aneuploïdie chez les embryons. Ainsi un défaut de la dynamique de correction de l’attachement des kinétochores aux microtubules entraîne une mauvaise ségrégation des chromosomes indépendamment à la formation des fuseaux multipolaires. Ce travail a mis en évidence un rôle inhibiteur de la polarité apicale inattendu sur la machinerie cytokinétique. Cette inhibition pourrait fournir une explication mécanistique de l’incidence élevée de la binucléation dans le trophectoderme. Dans l'ensemble, ces résultats contribuent à notre compréhension du contrôle spatio-temporel de la cytokinèse au cours du développement embryonnaire et fournissent de nouvelles informations mécanistiques sur les origines et les conséquences biologiques de la tétraploïdie chez les embryons préimplantatoires. Les résultats présentés dans cette thèse ont des implications cliniques importantes, puisqu’ils fournissent des preuves définitives que la tétraploïdie générée par un échec de la cytokinèse est délétère pour le développement embryonnaire. Ces travaux mettent ainsi en lumière que la binucléation est un critère de sélection embryonnaire important à considérer lors des traitements de fertilité. / Cell division is comprised of mitosis and cytokinesis and is an essential biological process for the maintenance of healthy organisms. During mitosis, a bipolar spindle is assembled, and the chromosomes are aligned at the metaphase plate via the attachment of kinetochores to spindle microtubules. Once chromosome alignment is achieved, the sister chromatids are pulled apart by the microtubules during anaphase and segregated into the nascent daughter cells. Cytokinesis is initiated after anaphase onset and marks the completion of cell division by partitioning the cytoplasm of the dividing cell into two new daughter cells. Successful and timely completion of both mitosis and cytokinesis is key for the maintenance of genome integrity, and failure in either one of these processes affects genetic fidelity. Whereas chromosome segregation errors in mitosis can lead to whole chromosome gains or losses, termed aneuploidy, cytokinesis failure leads to the formation of a binucleated cell with an entirely duplicated genome, termed tetraploidy. In somatic cells, tetraploidy can either lead to cell cycle arrest and death or cause chromosomal instability (CIN), thereby promoting the proliferation of cells with high tumorigenic potential. Therefore, understanding cytokinesis regulation and the potential causes of cytokinesis failure is key, especially in the context of multicellular embryonic systems, wherein progressive cell size reductions coincide with developmental transitions. Moreover, binucleation is frequently observed in human embryos in fertility clinics, and whether binucleation impacts early divisions remains elusive. To elucidate the consequences of tetraploidy, we used the mouse embryo as a model and employed high-resolution immunofluorescence and live-cell imaging experiments. We found that tetraploidy in mouse embryos causes CIN and aneuploidy by a mechanism distinct from that of somatic cells. Whereas in somatic cells multipolar spindle formation caused by supernumerary centrosomes is the major mechanism by which tetraploidy leads to CIN, in mouse embryos - which are acentriolar – tetraploidy does not lead to multipolar spindle formation. Instead, mouse tetraploid embryos develop CIN due to reduced microtubule turnover and impaired error correction activity, which prevents the timely resolution of kinetochore-microtubule mis-attachments, thereby leading to high levels of chromosome segregation errors. As a follow-up study, we next employed live imaging and immunofluorescence experiments, coupled with micromanipulations of cell size, cell adhesion and protein knockdown approaches to investigate the regulatory mechanisms of cytokinesis. Live imaging experiments and micromanipulations of cytoplasmic volume demonstrated that cell size determines the speed of contractile ring constriction i.e., constriction speed becomes progressively slower as the cells decrease in size. However, this phenomenon takes place only when embryos reach the 16-cell stage, suggesting that an upper limit of constriction speed may exist to restrict the scalability of ring constriction to cell size. In addition to cell size being a powerful determinant of cytokinesis progression, our loss-of-function experiments revealed that the emergence of cell polarity negatively impacts contractile ring assembly and constriction in outer cells at the morula stage. More specifically, we found that polarity limits the recruitment of cytokinesis components specifically to one side of the contractile ring, thereby causing unbalanced furrow ingression and reducing constriction speed in outer cells. We speculate that cell polarity may act as an obstacle for cytokinesis progression and render outer cells to be more susceptible to cytokinesis failure. These studies have revealed a novel mechanism by which tetraploidy leads to chromosomal instability and aneuploidy in embryos, wherein defective kinetochore-microtubule dynamics cause chromosome mis-segregation in a manner independent of multipolar spindle formation. In addition, this work unravelled an unexpected inhibitory role of apical polarity on the cytokinetic machinery that might provide a mechanistic explanation for the high incidences of binucleation in the outer layer of blastocysts. Altogether, these findings contribute to our understanding of the spatiotemporal control of cytokinesis during embryonic development and provide new mechanistic insights into the origins and biological consequences of tetraploidy in preimplantation embryos. The results presented in this thesis have substantial clinical implications, as they provide definitive evidence that tetraploidy generated by cytokinesis failure is deleterious to embryonic development, therefore underlining binucleation as an important embryo selection criterion to be considered during fertility treatments.