A Febre de Chikungunya é uma doença sistêmica causada por arbovírus e estima-se que afete cerca de 1 milhão de pessoas anualmente. Os principais sintomas associados com esta doença são febre e poliartralgia, podendo esta última assumir um caráter crônico em cerca de metade dos casos. Devido aos inúmeros surtos que ocorreram nos últimos 50 anos, diversos estudos tiveram como objetivo determinar os mecanismos de replicação do vírus e da resposta imune. Mesmo assim, pouco se sabe sobre quais moléculas possibilitam o processo de infecção. Já foi demonstrada a importância de interferons, principalmente de tipo I, citocinas e quimiocinas na diminuição da replicação viral. Além disso, há uma preferência do vírus por tipos celulares específicos como células endoteliais e epiteliais. Porém, estudos mostram informações contraditórias referentes ao papel de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), principalmente com relação a monócitos e células B e T. Diante deste contexto, o tratamento utilizado atualmente é direcionado apenas ao alívio de sintomas uma vez que não existem drogas ou vacinas licenciadas específicas para esta doença. Logo, o objetivo deste trabalho é estudar as modificações transcricionais que ocorrem em amostras humanas durante o processo de infecção pelo vírus de Chikungunya de modo a esclarecer os mecanismos utilizados pelo sistema imune em resposta a infecção. Além disso, este estudo tem como finalidade apontar possíveis diferenças transcricionais entre amostras crônicas e não-crônicas. / The Chikungunya Fever is a systemic disease transmitted by arboviruses and is estimated to affect 1 million people annually. The main symptoms associated with this disease are fever and polyarthralgia, which can develop to chronic features in about half of the cases. Due to outbreaks that occurred in the last 50 years, many studies had the goal of determining the mechanisms of virus replication and immune response. Nevertheless, it is still poorly understood which molecules enable the ocurrence of the infection process. It has already been shown the importance of interferons, mainly type I, cytokines and chemokines in restricting the viral replication. In addition, the Chikungunya virus shows a preference for specific cell types such as endothelial and epithelial cells. However, studies display contradictory information regarding the role of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), mainly in relation to monocytes and B and T cells. Given this context, the treatment currently used is directed only to alleviate the symptoms since there are no specific licensed drugs or vaccines for this disease. Therefore, the objective of this work was to study the transcriptional modifications that occur in humans during the process of Chikungunya virus infection in order to clarify the mechanisms used by the immune system. In addition, it aims to point out possible transcriptional differences between sample from the Chronic and Non-Chronic acute phase of the infection.

Microarray technology permit us to study the expression levels of thousands of genes simultaneously. The technique has a wide range of applications including identification of genes that change their expression in cells due to disease or drug stimuli. The dissertation is addressing statistical methods for the selection of differentially expressed genes in two experimental conditions. We propose two different methods for the selection of differentially expressed genes. The first method is a classical approach, where we consider a common distribution for the summary measure of equally expressed genes. To estimate this common distribution, the Johnson system of distribution is used. The advantage of using Johnson system is that, there is no need of a parametric assumption for gene expression data. In contrast to other classical methods, in the proposed method, there is a sharing of information across the genes by the assumption of a common distribution for the summary measure of equally expressed genes. The second method is the gene selection using a mixture model approach and Baye's theorem. This approach also uses the Johnson System of distribution for the estimation of distribution of summary measure. Johnson system of distribution has the flexibility of covering a wide variety of distributional shapes. This system provides a unique distribution corresponding to each pair of mathematically possible values of skewness and kurtosis. The significant flexibility of Johnson system is very useful in characterizing the complicated data set like microarray data. In this dissertation we propose a novel algorithm for the estimation of the four parameters of the Johnson system.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:32:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 619084 bytes, checksum: 33699c369d9fd3f595c40375c27f4c43 (MD5) Previous issue date: 2013-01-16 / One of the current objectives of molecular biology is to measure and assess the gene expression profiles in different types of biological tissues, to understand the mechanisms of molecular transformation under certain conditions. Next-generation sequencing (NGS) technologies promote DNA sequencing in platforms capable of generating information about millions of base pairs in a single step. However these technologies still have high cost, making it difficult to obtain large number of repetitions of sample data. Therefore, it becomes necessary the discovery and the improvement of efficient statistical methodologies for optimizing analysis of data generated in genome sequencing platforms. The overall objective of this work was to evaluate the effect of the number of repetitions in the identification of differentially expressed genes, in RNA-Seq experiments, contributing to the clarification of the statistic that researchers will assist in data analysis in RNA-Seq experiments. Specifically, we evaluate empirically the effect of the number of repetitions in the statistical analysis of gene expression in RNA-Seq experiments. To carry out the analyses we used a dataset defined in Li et al. (2008), which compared treated and non-treated cancer cells. That work had four biological replications for the control group (non-treated) and three replications for biological treatment group (cells that have received the treatment). The data was analyzed using the package DESeq from the statistical environment R. A total of 2566 genes were considered differentially expressed (DE) when we evaluate the original and complete dataset. When we analyzed three replications of the control and treatment, we found, on average, 2153 genes DE. From the moment in which only two reps for both treatments were used, were identified, on average, 1241 genes DE. The major change in the number of genes DE was observed when replications were not used. In this case we identified around 44 differentially expressed genes. According to the results generated in the analysis, it was possible to verify that the number of repetitions is an essential factor in order to obtain a significant number of differentially expressed genes. / Um dos objetivos atuais da biologia molecular é medir e avaliar os perfis de expressão gênica em diferentes tipos de tecidos biológicos, para entender os mecanismos de transformação molecular sob determinadas condições. Tecnologias de sequenciamento de Nova Geração (NGS) promovem o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informações sobre milhões de pares de bases em uma única etapa. Porém essas tecnologias ainda apresentam custo elevado, dificultando a obtenção de elevado número de repetições de dados amostrais. Assim, torna-se necessária a descoberta e o aprimoramento de metodologias estatísticas eficientes para a otimização das análises de dados gerados em plataformas de sequenciamento de genomas. O objetivo geral desse trabalho consistiu em avaliar o efeito do número de repetições na identificação de genes diferencialmente expressos, em experimentos de RNA-Seq, contribuindo para o esclarecimento de pesquisadores que venham a auxiliar nas análises de dados em experimentos de RNA-Seq. De forma específica, avaliamos empiricamente o efeito do número de repetições na análise estatística da expressão gênica em experimentos de RNA-Seq. Para a realização das análises foi utilizado um conjunto de dados definido em Li et al. (2008), o qual comparou células cancerígenas tratadas e não tratadas. Naquele estudo havia quatro repetições biológicas para o grupo controle (células não tratadas) e três repetições biológicas para grupo de tratamento (células que receberam o tratamento). Os dados foram analisados utilizando o pacote DESeq do Programa computacional R. Um total de 2566 genes foram considerados diferencialmente expressos (DE) quando avaliamos o conjunto de dados original completo. Quando analisamos três repetições do controle e do tratamento, nós encontramos, em média, 2153 genes DE. A partir do momento em que apenas duas repetições para ambos os tratamentos foram utilizadas, foram identificadas, em média, 1241 genes DE. A grande alteração no número de genes DE foi observada quando repetições não foram utilizadas. Nesse caso identificamos em torno de 44 genes diferencialmente expressos. De acordo com os resultados gerados nas análises, foi possível verificar que o número de repetições é um fator essencial para se obter um número significativo de genes diferencialmente expressos.

The in vitro cell culture models of human pluripotent stem cells (hPSC)-derived cardiomyocytes (CMs) have gained a predominant value in the field of drug discovery and is considered an attractive tool for cardiovascular disease modellings. However, despite several reports of different protocols for the hPSC-differentiation into CMs, the development of an efficient, controlled and reproducible 3D differentiation remains challenging. The main aim of this research study was to understand the changes in the gene expression as an impact of spatial orientation ofhPSC-derived CMs in 2D(two-dimensional) and 3D(three-dimensional) culture conditions and to identify the topologically important Hub and Hub-Bottleneck proteins using centrality measures to gain new knowledge for standardizing the pre-clinical models for the regeneration of CMs. The above-mentioned aim was achieved through an extensive bioinformatic analysis on the list of differentially expressed genes (DEGs) identified from RNA-sequencing (RNA-Seq). Functional annotation analysis of the DEGs from both 2D and 3D was performed using Cytoscape plug-in ClueGO. Followed by the topological analysis of the protein-protein interaction network (PPIN) using two centrality parameters; Degree and Betweeness in Cytoscape plug-in CenTiScaPe. The results obtained revealed that compared to 2D, DEGs in 3D are primarily associated with cell signalling suggesting the interaction between cells as an impact of the 3D microenvironment and topological analysis revealed 32 and 39 proteins as Hub and Hub-Bottleneck proteins, respectively in 3D indicating the possibility of utilizing those identified genes and their corresponding proteins as cardiac disease biomarkers in future by further research.

Bladder cancer (BCa) is one of the most common malignancies and has a relatively poor outcome worldwide. However, the molecular mechanisms and processes of BCa development and progression remain poorly understood. Therefore, the present study aimed to identify candidate genes in the carcinogenesis and progression of BCa. Five GEO datasets and TCGA-BLCA datasets were analyzed by statistical software R, FUNRICH, Cytoscape, and online instruments to identify differentially expressed genes (DEGs), to construct protein‒protein interaction networks (PPIs) and perform functional enrichment analysis and survival analyses. In total, we found 418 DEGs. We found 14 hub genes, and gene ontology (GO) analysis revealed DEG enrichment in networks and pathways related to cell cycle and proliferation, but also in cell movement, receptor signaling, and viral carcinogenesis. Compared with noncancerous tissues, TPM1, CRYAB, and CASQ2 were significantly downregulated in BCa, and the other hub genes were significant upregulated. Furthermore, MAD2L1 and CASQ2 potentially play a pivotal role in lymph nodal metastasis. CRYAB and CASQ2 were both significantly correlated with overall survival (OS) and disease-free survival (DFS). The present study highlights an up to now unrecognized possible role of CASQ2 in cancer (BCa). Furthermore, CRYAB has never been described in BCa, but our study suggests that it may also be a candidate biomarker in BCa.

A diferenciação morfo-fisiológica entre rainhas e operárias de Apis mellifera decorre da alimentação recebida durante o desenvolvimento larval. Dentre as diferenças morfológicas entre as duas castas encontram-se estruturas especializadas para a coleta de pólen e própolis, localizadas nas pernas metatorácicas das operárias, ausentes nas pernas de rainhas. Os padrões de expressão de Ultrabithorax (Ubx) durante o desenvolvimento de operárias e rainhas estão associados aos padrões de cerdas das pernas de fêmeas adultas. Pernas mesotorácicas de operárias apresentam estruturas descritas como importantes na coleta de pólen, ausentes em rainhas. Por outro lado, as asas não possuem estruturas casta-específicas. No presente trabalho, análises globais de transcrição gênica por hibridação de lâminas de microarrays a partir de RNA total de pernas metatorácicas de operárias e rainhas em três estágios do desenvolvimento mostram 1952 genes diferencialmente expressos. Discos de pernas metatorácicas de larvas no início do quinto estágio larval, quando comparados aos de estágios mais tardios no desenvolvimento, têm alto níveis de transcritos de ativadores de Ubx, o qual está 25 vezes mais expresso em estágios subseqüentes do desenvolvimento. Buscas por motivos de ligação de fatores de transcrição nos promotores dos grupos de genes diferencialmente expressos revelam que os motivos para ligação de Ubx, Zeste e Twist estão super-representados em um dos conjuntos analisados. Dentro deste grupo, estão presentes genes cujos ortólogos em Drosophila são controlados por Ubx, como o caso do gene lola. Análises do processamento do mRNA de Ubx em pernas e asas de ambas as castas mostram que são produzidas três isoformas diferentes quanto à presença de dois microéxons (m1 and m2), que contêm 42 nt and 53 nt, respectivamente. A isoforma IIa-like, que contém o m2, entretanto, parece não ser capaz de produzir uma proteína Hox, já que possui um códon de terminação antes do homeodomínio. O perfil de transcrição diferencial de Ubx entre as castas está associado a apêndices que apresentam diferenças morfológicas, sendo Ubx mais transcrito em pernas meso e metatorácicas de operárias que rainhas. Quando analisadas as porcentagens de expressão de cada isoforma nos apêndices, claramente a isoforma IVa-like, sem microéxons, é a mais transcrita em todos os tecidos. Entretanto, nota-se que nas asas anteriores, onde há menos Ubx, a isoforma IIa-like é proporcionalmente mais transcrita que II nos outros apêndices. Destaca-se uma tendência à inclusão do microéxon m1 (isoforma IIIa-like) ao mRNA de Ubx transcrito em asas posteriores e pernas de rainhas em comparação a operárias, em detrimento da isoforma IVa-like. Análises do uso da região 3UTR em pupas de operárias mostram que há um microssatélite transcrito na porção distal da região 3UTR deUbx. A estrutura secundária predita agrupa separadamente as regiões codificadora e as regiões 3UTR proximal e distal. Análises de seqüenciamento de última geração revelaram que oito dos 51 microRNAs com sítios-alvo preditos na região 3UTR de Ubx estão mais expressos em asas anteriores, e outros dois em asas posteriores. Assim, nossos resultados mostram que o controle da expressão diferencial de Ubx é dada pela ativação desse gene por fatores de transcrição que se ligam ao promotor, controle do splicing alternativo, e expressão de microRNAs diferencial em cada casta e apêndice, controlando, assim, a morfogênese diferencial dos apêndices de fêmeas observada em A. mellifera. / Along with differences in physiological and behavioral characteristics, workers and queens of Apis mellifera also differ in appendage morphology. Some appendage specializations in the hind legs of honeybee workers, which are highly specialized pollinators, deserve special attention. The hind tibia of the worker has an expanded bristle-free region used for carrying pollen and propolis, the corbicula. In queens, this structure is absent. Although these morphological differences have been well characterized, the genetic inputs triggering the development of this alternative morphology have remained unknown. Through microarray analysis, we detected 1,952 genes that are differentially expressed during worker versus queen hind leg development. The gene expression signatures of the two castes have similar patterns of genes controlling development. At the beginning of the last larval instar, Ultrabithorax (Ubx) activators are more strongly expressed than in prepupae and early pupae; at this time Ubx expression is approximately 25 times higher. Within the gene expression signature, we identified a cluster formed by genes in which Ubx, Twist and Zeste binding sites are over-represented. This cluster includes genes for which Drosophila orthologs are known to be bound by Ubx, as in the case of lola. We also tested the extent of Ubx mRNA processing during wing and leg development. Unexpectedly, we found Ubx alternative splicing in both workers and queens; there were two microexons (m1 and m2) encoding 42 nt and 53 nt, respectively, arguing against the hypothesis that alternative splicing occurs exclusively within the Diptera. Inclusion of the m2 exon inserts a stop codon upstream from the exon containing the homeodomain, producing a truncated protein. Moreover, these bee microexons conserve the nucleotides known to be important for alternative splicing in Drosophila. During bee wing development, Ubx mRNA isoforms are transcribed in similar amounts in both castes; however, during leg development, queens produce 60% of the Ubx levels transcribed by workers. Analysis of 3UTR usage during bee development revealed a microsatellite region transcribed within the Ubx 3UTR. The predicted secondary structure locations separated the coding region into three branches and the proximal and the distal 3UTR regions. Deep-sequencing analysis revealed that eight out of 51 miRNAs predicted to target the Ubx mRNA are more highly expressed in worker forewings and two are more expressed in the hindwings. Therefore, we conclude that Ubx differential expression is activated by transcription factors that bind to its promoter, by control of alternative splicing, and moreover by microRNAs differentially expressed according to tissue and caste, resulting in differential morphogenesis of the hind leg in honeybee females.

Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termodimórfico, é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica prevalente da América Latina. A patogenicidade aparenta estar intimamente relacionada com a transição dimórfica da forma de micélio para a de levedura, que é induzida pela mudança da temperatura do ambiente pela temperatura do hospedeiro mamífero. Há poucas informações disponíveis sobre genes de P. brasiliensis que são necessários durante a fase patogênica. Nós, então, realizamos as técnicas de SSH (“Suppression Subtraction Hybridization") e de “Macroarray" com o objetivo de identificar genes que sejam preferencialmente expressos na fase leveduriforme do isolado Pb18. Genes identificados em ambos os procedimentos estão mais expressos na fase leveduriforme e estão envolvidos em metabolismo básico, transdução de sinal, crescimento e morfogênese e metabolismo do enxofre. Para testar se as mudanças observadas na expressão gênica refletem as diferenças entre as condições de crescimento usadas para obter as duas formas morfológicas preferivelmente às diferenças intrínsecas dos tipos celulares, nós realizamos experimentos com RT-PCR em tempo real utilizando preparações de RNA derivadas de ambas as fases, micélio e levedura, crescidas a 26°C e 37°C nos meios de cultura completos (YPD e Sabouraud) e meio mínimo. Vinte genes, incluindo AGS1 ( -1,3-glucan synthase) e TSA1 (thiol-specific antioxidant), foram mostrados como mais expressos na levedura patogênica em relação ao micélio. Embora a expressão de RNA mensageiro foi bastante diferente em relação aos meios completos e meio mínimo, mostramos uma tendência geral para que esses genes serem mais expressos nas células leveduriformes patogênicas de P.x brasiliensis. Além disso, mostramos a complementação dos genes METR e SCONC de P. brasiliensis e uma cepa com estes genes deletados de Aspergillus nidulans, sugerindo uma possível homologia entre eles. Mostramos também a análise de genes da via do metabolismo do enxofre foram mais expressos na levedura patogênica de P. brasiliensis em relação ao micélio saprofítico. / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a prevalent systemic mycosis in Latin America. Pathogenicity appears to be intimately related to the dimorphic transition from the hyphal to the yeast form, which is induced by a shift from environmental temperature to the temperature of the mammalian host. Little information is available on the P. brasiliensis genes necessary during the pathogenic phase. We have therefore undertaken Suppression Subtraction Hybridization (SSH) and macroarray analyses with the aim of identifying genes that are preferentially expressed in the yeast phase. Genes identified by both procedures as being more highly expressed in the yeast phase are involved in basic metabolism, signal transduction, growth and morphogenesis, and sulfur metabolism. In order to test whether the observed changes in gene expression reflect the differences between the growth conditions used to obtain the two morphological forms rather than differences intrinsic to the cell types, we performed real-time RT-PCR experiments using RNA derived from both yeast cells and mycelia that had been cultured at 37 and 26°C in either complete medium (YPD or Sabouraud) or minimal medium. Twenty genes, including AGS1 ( 1,3-glucan synthase) and TSA1 (thiol-specific antioxidant), were shown to be more highly expressed in the yeast cells than in the hyphae. Although their levels of expression could be different in rich and minimal media, there was a general tendency for these genes to be more highly expressed in the yeast cells. Moreover, complementation of P. brasiliensis METR and SCONC genes in strains of Aspergillus nidulans with these genes deleted suggested a possible homology between them. We show the analyses of genes involved in the xii sulphur metabolism pathway and these genes were more expressed in the pathogenic yeast than saprophytic mycelia of P. brasiliensis.

Die Proteinkinase C (PKC) ist eine wichtige Signaltransduktionskomponente, deren Aktivierung die Expression zahlreicher Gene induziert und zur Zelldifferenzierung und Zellproliferation führt. Ein besonders hohes Expressionsniveau der PKC findet man in vielen Tumoren. So korreliert in malignen Gliazellen das Expressionsniveau der PKC mit deren Wachstumsgeschwindigkeit. Es wird angenommen, daß die aktivierte PKC eine wichtige Rolle in der Tumorpromotion hat. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob in Astrozytomzellinien Gene zu finden sind, die nach PKC-Aktivierung durch den Phorbol-Ester TPA differentiell exprimiert werden. Zunächst wurden kultivierte Zellen der Astrozytomzellinie LN-405 mit TPA respektive dem PKC-Inhibitor Chelerythrin behandelt. Nach Gewinnung der mRNA aus der zuvor isolierten RNA wurden in einem mehrstufigem PCR-Verfahren (SSH) cDNA-Abschnitte gewonnen, die zu vermeintlich differentiell exprimierten Genen gehören. Diese cDNA-Abschnitte wurden in Plasmid-Vektoren eingefügt, kloniert und zur Bestimmung sequenziert. Um falsch positive Sequenzen zu erkennen, wurden die zuvor radioaktiv markierten cDNA-Abschnitte mit Northernblots hybridisiert. Gleichzeitig ließ sich so ein zeitabhängiger Anstieg der Expression nach PKC-Stimulation untersuchen. Durch den PCR-Select-Assay (SSH) konnten insgesamt 11 Gene gefunden werden, die sich in der radioaktiven Northernblot-Hybridisierung, als nach PKC-Aktivierung differentiell exprimiert, darstellen ließen. Dabei bestätigt der gefundene Zusammenhang zwischen PKC-Aktivierung und differentieller Exprimierung bei fünf der 11 Gene (IL-8, Calpain, Interferon-gamma Rezeptor 2, Methionin Adenosyltransferase, beta-2 adrenerger Rezeptor) Ergebnisse anderer Autoren, wobei dieser Zusammenhang nur bei zwei Genen (IL-8 und Calpain) auch in Astrozytom- bzw. Gliom-Zellen schon früher gezeigt werden konnte. Sechs Gene (M-Phase Phosphoprotein-1, ect2-Onkogen, ERM-Gen, Ornithin-Decarboxylase-Antizym 2, MHC-bindendes Protein 2, Sequenz aus Cosmid F0811) wurden in der vorliegenden Arbeit erstmalig als PKC-abhängig exprimiert beschrieben. Die gefundenen Gene haben auf verschiedene Funktionen der Zellen Einfluß. So beeinflussen sie die Regulation des Zellzyklus (MPP1, ect2-Oncogen), die Immunregulation (MBP-2, IL-8, Interferon-gamma Rezeptor 2), die Signaltransduktion (beta-2 AR), die Transkription (ERM-Gen), die Proteinsynthese (ODC-Antizym, MAT), die Wachstumskontrolle (ODC-Antizym) und die Regulation der PKC selbst (Calpain). Für fünf Gene läßt sich ein eindeutiger Zusammenhang mit der Tumorpromotion herstellen: IL-8 (Angioneogenese), MBP-2 (Immunsuppression), ERM-Gen (Transkriptionspromotion), MAT (allgemein fördernder Einfluß auf den Metabolismus) und ect2-Oncogen (Oncogen). / The protein kinase C (PKC) is one of the major signal transduction systems and its activation leads to the induction of the expression of several genes, to cell differentiation and cell proliferation. Very high expressed PKC are found in many tumors. In malignant glia cells the expression of PKC correlates with their proliferation rate. The PKC activity has an important role for the tumor promotion. The object of this paper, was to investigated, if there are genes differentialy expressed after activation of PKC through the phorbol-ester TPA in astrocytoma cell lines. The astrocytoma cell line LN-405 was incubated with TPA and the PKC-inhibitor chelerythrine respectively. After isolation of RNA and mRNA the suppression subtractive hybridization (SSH) was used to isolate differentially expressed cDNA fragments. These cDNA fragments were inserted into the T/A cloning vector, cloned and sequenced. To detect false positives the cDNA fragments were analysed with northern blot technique. Examined was also a time-dependent acceleration of expression after TPA treatment. 11 genes were detected by suppression subtractive hybridization, showing differentially expressed in the northern blot hybridization. Five of the genes were found differentially expressed after PKC activation before (IL-8, calpain, interferon gamma receptor 2, beta-2-adrenergic receptor, methionine adenosyltransferase alpha), two of these genes (IL-8, calpain) also in astrocytoma- and glioma-cells respectively. Six genes (M-phase phosphoprotein 1, ect2-onkogene, erm gene, ornithine decarboxylase antizyme 2, MHC binding protein 2, sequence from Cosmid F0811) were described as PKC dependent expressed for the first time. The genes detected influence several cell functions. They are involved in cell-cycle regulation (MPP1, ect2-oncogene), immuneregulation (MBP-2, IL-8, interferon gamma receptor 2), signal transduction (beta 2 adrenergic receptor), transcription (erm-gene), synthesis of proteins (ODC-antizyme 2, MAT), growth control (ODC-antizyme) and regulation of PKC (Calpain). Five genes show a clear connection to tumor promotion: IL-8 (angioneogenesis), MPB-2 (immunesuppression), erm gene (promotion of transcription), MAT (promotion of metabolism) and ect2-oncogene (oncogene).

Um dos desafios atuais da pesquisa em frutíferas tropicais é incorporar abordagens baseadas em marcadores moleculares nos programas convencionais de melhoramento. O maracujá-doce (Passiflora alata) é uma espécie diploide, de fecundação cruzada e pouco explorada. Recentemente, nosso grupo construiu um mapa de ligação de P. alata composto de diferentes tipos de marcadores moleculares. Além disso, dispõe-se de um conjunto de transcritos de Passiflora edulis, obtidos a partir de duas bibliotecas de expressão: forward e reverse onde foram isolados transcritos diferencialmente expressos na planta inoculada com Xanthomonas axonopodis (Xap) (672) e na planta controle, não inoculada (310), respectivamente. Assim, neste estudo, este conjunto de transcritos foi explorado visando ao desenvolvimento de marcadores SSR e SNP com o intuito de enriquecer, posteriormente, o mapa de ligação de P. alata com marcadores funcionais putativos. Para o desenvolvimento dos marcadores SSRs, as 672 sequências da biblioteca forward foram investigadas e em 91 delas foram encontrados 115 SSRs. Como esperado, a classe de repetições trinucleotídicas foi a mais abundante, sendo o motivo (AG)n o mais comum entre as repetições dinucleotídicas. Desenhou-se primers para amplificar 42 desses SSRs. Dois acessos de P. edulis e seis indivíduos da população de mapeamento de P. alata foram usados nos testes de transferibilidade e avaliação do polimorfismo. Trinta e quatro pares de primers apresentaram bom padrão de amplificação, porém apenas 10 deles revelaram polimorfismo em P. alata. Para o desenvolvimento dos marcadores SNPs, 118 sequências selecionadas das bibliotecas de expressão forward e reverse foram usadas para o desenho de primers; 37 delas foram usadas para avaliar o polimorfismo no mesmo set de indivíduos de P. alata. Foram encontrados 34 locos contendo SNPs bialélicos em 16 fragmentos gênicos, cujas sequencias variaram em tamanho de 332 a 872 pb. Considerando todos os fragmentos gênicos (16), foi analisado um total de 10.003 pb; a frequência de SNPs foi estimada como sendo 1 a cada 294 pb. Observou-se a mesma ocorrência de SNPs (50%, 17/34) em regiões codantes e não-codantes. Uma função putativa pôde ser atribuída a todos os fragmentos gênicos de P. alata, sendo que 82% mostraram homologia com as mesmas proteínas das sequências de origem, isoladas de P. edulis. No geral, os locos marcadores apresentaram baixo nível de polimorfismo molecular. Este é o primeiro trabalho sobre o desenvolvimento de locos marcadores funcionais putativos em Passiflora usando transcritos expressos em resposta à Xap. / One of the current challenges of tropical fruit research is to incorporate molecular marker-based approaches into conventional breeding programs. The sweet passion fruit (Passiflora alata) is a diploid, outcrossing and underexploited species. Recently, our group has constructed a P. alata linkage map consisted of different types of molecular markers. Moreover, we have a set of transcripts of Passiflora edulis obtained from two expression libraries: the forward and the reverse where differentially expressed transcripts were isolated from a plant inoculated with Xanthomonas axonopodis (Xap) (672), and from the control plant, uninoculated (310), respectively. Thus, in this study, this set of transcripts were exploited aiming at the development of SNP and SSR markers for future enrichment of the P. alata linkage map with putative functional markers. For the development of SSR markers, the 672 sequences from the forward library were investigated and 91 of them were found to have 115 SSRs. As expected, the trinucleotide class of repeats was the most abundant, and the (AG)n motif was the most common among the dinucleotide repeats. Primers were designed to amplify 42 of these SSRs. Transferability tests and polymorphism investigation were carried out using two accessions of P. edulis and six individuals of the mapping population of P. alata. Thirty-four primer pairs showed a good amplification pattern but only 10 loci revealed polymorphism in P. alata. For the development of SNP markers, 118 sequences selected from forward and reverse expression libraries were used for designing primers; 37 were used to assess the polymorphism in the same set of individuals of P. alata. Thirty-four biallelic SNPs were found in 16 gene fragment sequences that ranged in size from 332 to 872 bp. Considering all gene fragments, a total of 10,003 bp was obtained; the frequency of SNPs was estimated to be 1 every 294 bp. The same prevalence of SNPs (50%, 17/34) was observed within coding and non-coding regions. A putative function was assigned to all gene fragments of P. alata; 82% of them have shown homology to the original protein sequences isolated from P. edulis. Overall, the marker loci showed a low level of molecular polymorphism. This is the first report on the development of putative functional marker loci in Pasiflora using transcripts induced in response to Xap.

Recentemente desenvolvida, a biotecnologia denominada por Microarrays permite o monitoramento simultâneo dos valores de expressão gênica de centenas de milhares de genes, fator este que traz uma nova interpretação aos resultados obtidos em pesquisas desenvolvidas nas mais diversas áreas do conhecimento incluindo, por exemplo, a Farmacologia e Medicina, uma vez que os resultados obtidos são interpretados ao nível molecular. Contudo, apesar de muita tecnologia ser empregada à técnica de Microarrays, sua aplicação ainda ocasiona algumas complicações decorrentes, por exemplo, das inúmeras fontes de variação existentes, da escala das respostas ou da natural dificuldade de se analisar uma grande quantidade de fragmentos genéticos avaliados sob poucas unidades experimentais. Frente a estas complicações, atualmente, muitas são as propostas metodológicas de análises estatísticas para atenuar ou eliminar os problemas inerentes à técnica de Microarrays e propiciar a extração de resultados mais confiáveis a partir dos valores de expressão gênica, porém muitos desafios ainda persistem. Sob esta colocação, o presente trabalho procurou explorar duas metodologias de análise estatística alternativas no que diz respeito a seus conceitos, embora ambas tenham sido contextualizadas ao problema de Microarrays e aplicadas para se atingir o mesmo objetivo: possibilitar a identificação dos genes diferencialmente expressos sob distintas condições experimentais. A primeira metodologia consistiu da aplicação de Modelos de Análise de Variância de efeitos fixos com a adoção de modificações nas estatísticas de teste, metodologias de correções para múltiplos testes e a construção de gráficos vulcão. Já, a segunda metodologia consistiu da contextualização e aplicação da Teoria da Resposta ao Item TRI aos experimentos de Microarrays, abordagem esta pouco explorada na análise deste tipo de dado, mas a qual possibilita a seleção de genes diferencialmente expressos a partir de uma medida latente estimada para cada gene e a construção de uma escala para as categorias de resposta de expressão gênica. A motivação para este trabalho originou de um experimento de Microarrays com ratos congênicos disponibilizado pelo Laboratório de Cardiologia e Genética Molecular do Instituto do Coração (InCor-USP) cujo objetivo é identificar genes associados à hipertensão. / Recently developed, the biotechnology denominated Microarrays permits a simultaneous monitoring of the gene expression values of hundred thousands of genes; fact that introduces a new interpretation of the results obtained in researches developed in many distinct areas including, for example, Pharmacology and Medicine, once the obtained results are read according to the molecular level. However, despite the fact that much technology is used in the Microarrays technique, its application still causes some implications, for example, the countless sources of existing variance, the scale of answers or the natural difficulty in analyzing a large number of genetic fragments measured by few experimental units. Facing such complications, a lot of methodologies were suggested in order to reduce or eliminate the problems caused by the Microarrays technique and also foster the obtainment of more reliable results from the gene expression values, yet many challenges still persist. Under this perspective, the present work aimed at exploring two alternative methodologies regarding concepts, despite both were contextualized according to the Microarrays problem and applied with the same objective: enabling the identification of the genes differently expressed under different experimental conditions. The first methodology was composed by the application of Analysis of Variance Models of fixed effects with changes in the test statistics, correction methodologies for multiple tests and volcano plot. The second methodology consisted of the contextualization and application of the Item Response Theory IRT towards the Microarrays experiments, being this one not much explored in analysis that use this kind of data, but enabling the selection of genes differently expressed from an estimated latent trait for each gene and the construction of a scale for the categories of gene expression answers. The motivation for the present work came from an experiment of Microarrays with congenic mice made available by the Cardiology and Molecular Genetics Laboratory of the Heart Institute (InCor-USP) that aimed at identifying genes associated with hypertension.