La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lésions qui déforment l’hélice d'ADN et qui bloquent à la fois la réplication et la transcription. Parmi ces lésions, il y a les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en évidence par l’existence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), causée par des mutations affectant des gènes impliqués dans cette voie de réparation. Les personnes atteintes sont caractérisées par une photosensibilité extrême et une forte prédisposition à développer des tumeurs cutanées (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment compétents en réparation, portent plutôt des mutations dans le gène codant pour l'ADN polymérase η (polη). Polη est une ADN polymérase translésionnelle capable de contourner avec une grande fidélité certaines lésions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymérases réplicatives. Ainsi, la polη prévient la formation de mutations et permet la reprise de la synthèse d'ADN. L'objectif principal de cette thèse est d'évaluer le rôle potentiel de voies de signalisation majeures dans la régulation de la NER, dont celles régulées par la kinase ATR (Ataxia Télangiectasia and Rad3-related kinase). Suite à l'irradiation UV, ATR est rapidement activée et phosphoryle des centaines de protéines qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et joue un rôle notoire dans le maintient de la stabilité génomique. Nous avons postulé qu’ATR puisse réguler la NER de manière dépendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothèse représente un grand défi car, pour des raisons techniques, les méthodes conventionnelles n’ont pas à ce jour été adaptées pour l'évaluation de la cinétique de réparation au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc développé une méthode novatrice basée sur la cytométrie en flux permettant de quantifier avec grande précision la cinétique de réparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle méthode, nous avons pu démontrer que l'inhibition d'ATR ou polη résulte en une très forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces études ont révélé, pour la première fois, une fonction critique pour ces protéines dans le retrait des lésions qui bloquent la réplication. En outre, nous avons démontré que la synthèse d'ADN est indispensable pour l’inhibition de la réparation en phase-S, reflétant un lien potentiel entre la NER et la réplication. Curieusement, nous avons également montré que parmi six lignées cellulaires tumorales choisies aléatoirement, trois présentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient être caractérisés par un tel défaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un déterminant majeur dans la réponse clinique aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses via l'induction de lésions à l’ADN. / Nucleotide excision repair (NER) is a critical pathway in humans for repairing highly genotoxic helix-distorting DNA lesions that strongly block both replication and transcription. Among these lesions are ultraviolet-induced 6-4 photoproducts (6-4PPs) and cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). The physiological importance of NER is highlighted by individuals afflicted with Xeroderma pigmentosum (XP), who carry mutations in NER pathway genes and as such exhibit extreme photosensitivity and remarkable predisposition to cutaneous tumorigenesis (1000-fold increase). On the other hand patients with the variant form of Xeroderma pigmentosum (XPV) are considered proficient in NER, and rather carry germline mutations in the gene encoding DNA polymerase η (polη). Polη is a specialized translesion DNA polymerase able to accurately bypass certain lesions including CPDs which otherwise completely inhibit the progression of normal replicative polymerases, thereby preventing mutations and allowing the resumption of DNA synthesis. The main goal of this thesis was to elucidate the potential role in NER of major DNA damage signalling cascades, including that regulated by the ataxia telangiectasia and rad 3-related kinase (ATR). Following UV irradiation, ATR is rapidly activated and phosphorylates hundreds of proteins that regulate cell cycle checkpoints and maintain genomic stability. We postulated that ATR might regulate NER in a cell cycle-specific manner. However testing this presented a great challenge, as (for technical reasons) traditional NER assays have to date not been adapted for evaluation of repair kinetics during individual phases of the cell cycle. We therefore developed a novel flow cytometry-based assay for sensitive quantification of 6-4PPs and CPDs repair efficiency during each of G0/G1, S, and G2/M. With this new assay, we were able to show that inhibition of either ATR or polη results in strong inhibition of NER capacity exclusively during S phase of the cell cycle. This revealed, for the first time, a critical function for these proteins in removal of replication-blocking DNA adducts. In addition, we demonstrated that active DNA synthesis is required for S phase-specific repair inhibition, reflecting a potential relationship between NER and replication. Intriguingly, we also showed that among six tumor cell lines, three exhibit total abrogation of NER uniquely during S phase, indicating that many human cancers may be characterized by such a defect. Our findings therefore could harbour important implications for cancer treatment. Indeed, NER status of tumors clearly appears to constitute a major determinant in the clinical response to chemotherapeutic drugs such as cisplatin, which inhibit the growth of rapidly proliferating cancer cells through induction of replication-blocking DNA lesions.

Notre génome est constamment attaqué par des facteurs endogènes et exogènes qui menacent son intégrité et conduisent à différents types de dommages. Les cassures double brins (CDBs) font partie des dommages les plus nuisibles car elles peuvent entraîner la perte d'information génétique, des translocations chromosomiques et la mort cellulaire. Tous les processus de réparation se déroulent dans le cadre d'une chromatine hautement organisée et compartimentée. Cette chromatine peut être divisée en un compartiment ouvert transcriptionnellement actif (euchromatine) et un compartiment compacté transcriptionnellement inactif (hétérochromatine). Ces différents degrés de compaction jouent un rôle dans la régulation de la réponse aux dommages à l’ADN. L'objectif de mon premier projet était de comprendre l'influence de l'organisation 3D du génome sur la réparation de l'ADN. Pour cela, j’ai utilisé deux approches complémentaires dans le but d’induire et de cartographier les CDBs dans le génome de souris. Mes résultats ont mis en évidence un enrichissement de γH2AX, facteur de réparation des dommages à l’ADN, sur différentes régions du génome de cellules souches embryonnaires de souris, et ont également montré que les dommages persistent dans l’hétérochromatine, contrairement à l’euchromatine qui est protégée des dommages. Pour mon deuxième projet, j'ai cartographié l'empreinte génomique de 53BP1, facteur impliqué dans la réparation des CDBs, dans des cellules U2OS asynchrones et des cellules bloquées en G1 afin d’identifier de nouveaux sites de liaison de 53BP1. Mes résultats ont permis d’identifier de nouveaux domaines de liaison de 53BP1 couvrant de larges régions du génome, et ont montré que ces domaines de liaison apparaissent dans des régions de réplication moyenne et tardive. / Our genome is constantly under attack by endogenous and exogenous factors which challenge its integrity and lead to different types of damages. Double strand breaks (DSBs) constitute the most deleterious type of damage since they maylead to loss of genetic information, translocations and cell death. All the repair processes happen in the context of a highly organized and compartmentalized chromatin. Chromatin can be divided into an open transcriptionally active compartment (euchromatin) and a compacted transcriptionally inactive compartment (heterochromatin). These different degrees of compaction play important roles in regulating the DNA damage response. The goal of my first project was to understand the influence of 3D genome organization on DNA repair. I used two complementary approaches to induce and map DSBs in the mouse genome. My results have shown that enrichment of the DNA damage repair factor γH2AX occurs at distinct loci in the mouse embryonic stem cell genome and that the damage persists in the heterochromatin compartment while the euchromatin compartment is protected from DNA damage. For my second project, I mapped the genomic footprint of 53BP1, a factor involved in DSBs repair, in asynchronous and G1 arrested U2OS cells to identify novel 53BP1 binding sites. My results have identified novel 53BP1 binding domains which cover broad regions of the genome and occur in mid to late replicating regions of the genome.

La Poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle de protéines, impliquée dans un grand nombre de processus biologiques, dont la réparation de l’ADN. Alors que la fonction et le mode d’action de la Poly(ADP-ribose) (PAR) Polymérase 1 (PARP1), activée en réponse aux dommages de l’ADN sont bien compris, on en sait beaucoup moins sur la fonction et la régulation de l’enzyme de dégradation du PAR, la Poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). Dans le contexte de ce projet de thèse, nous décrivons de nouvelles lignées U2OS stables, déficientes pour toutes les isoformes de PARG, permettant la complémentation inductible avec chacun des isoformes de PARG. Ces modèles nous ont permis d’évaluer les contributions relatives des isoformes à la réparation de dommages à l’ADN. Nous avons identifié un nouveau partenaire cellulaire de PARG : la protéine-kinase dépendante des dommages à l’ADN (DNA-PK). Nous explorons l’interaction fonctionnelle de ces deux protéines dans le contexte de la réponse cellulaire à la camptothécine (CPT), un agent anticancéreux inhibant la topoisomérase I et provoquant l’activation simultanée de PARP1 et DNA-PK. / Poly (ADP-ribosyl) ation is a post-translational modification of proteins involved in a large number of biological processes, including DNA repair. While the function and mode of action of Poly (ADP-ribose) (PAR) Polymerase 1 (PARP1), activated in response to DNA damage, is well understood, much less is known about the function and regulation the PAR degrading enzyme, Poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). In the context of this thesis project, we describe new stable U2OS lines, deficient for all PARG isoforms, allowing the inducible complementation with each of the PARG isoforms. These models allowed us to evaluate the relative contributions of the isoforms to DNA damage repair. We have identified a new cellular partner of PARG: the DNA-dependent protein kinase-dependent kinase (DNA-PK). We explore the functional interaction between these two proteins in the context of the cellular response to camptothecin (CPT), an anticancer drug that inhibits topoisomerase I and induces the simultaneous activation of PARP1 and DNA-PK.

Notre génome est continuellement endommagé par des agents provoquant des lésions de l’ADN. Les cassures doubles brins de l’ADN (CDBs) sont les lésions les plus dangereuses. En effet, une CDB mal réparée peut mener à des aberrations de l’ADN pouvant conduire à l’apparition d’un cancer. Dans le but d’éviter les effets délétères des CDBs, nos cellules ont développé une voie de signalisation, nommée réponse aux dommages de l’ADN (RDA), permettant la détection des cassures et l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire afin d’arrêter le cycle pendant la réparation des CDBs. Une des caractéristiques principales de la RDA est l’accumulation d’un grand nombre de facteurs sur l’ADN autour de la cassure, formant un foyer visible en microscopie. Cependant, l’efficacité de réparation de l’ADN est entravée par la structure condensée de la chromatine environnante. Les mécanismes de réparation de l’ADN surmontent ce problème en recrutant de nombreuses protéines permettant le réarrangement de la chromatine afin de faciliter la réparation. Le but de mon travail de thèse est d’identifier de nouvelles protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine autour des CDBs. D’une part nous avons pour but d’identifier le protéome complet d’un foyer de réparation de l’ADN grâce à la technique PICh (Proteomics of Isolated Chromatin loci). D’autre part, nous étudions le rôle de l’oncoprotéine SET/TAF-1β, que nous avons identifié lors d’un criblage siRNA réalisé dans le but de découvrir de nouveaux facteurs chromatiniens impliqués dans la réparation des CDBs. / Various DNA damaging agents, that can cause DNA lesions, assault constantly our genome. The most deleterious DNA lesions are the breaks occurring in both strands of DNA (Double stand breaks: DSBs). Inefficient repair of DSBs can lead to aberrations that may induce cancer. To avoid these deleterious effects of DSBs, cells have developed signalling cascades which entail detection of the lesions and spreading of the signal that leads to arrest in cell cycle progression and efficient repair. A major characteristic of DNA damage response (DDR) is the accumulation of a vast amount of proteins around the DSBs that are visible in the cell as DNA damage foci. However, efficient DNA repair is hampered by the fact that genomic DNA is packaged into chromatin. The DNA repair machinery overcomes this condensed structure to access damaged DNA by recruiting many proteins that remodel chromatin to facilitate efficient repair. The aim of my PhD work is to identify novel proteinsinvolved in the DDR and/or the remodelling of chromatin surrounding DSBs. On one hand, we take advantage of the PICh (Proteomics of Isolated Chromatin loci) technique and we aim to identify the entire proteome of DNA repair foci. On the other hand, we study the role of the oncogene SET/TAFIβ, a major hit of a siRNA screen performed to identify novel chromatin related proteins that play role in repair of DSBs.

Le maintien de l'intégrité du génome est essentiel pour la survie cellulaire et la propagation de l'information génétique. Une mauvaise prise en charge des dommages de l’ADN et / ou une aberration de la maintenance de l’intégrité des télomères - les extrémités des chromosomes linéaires - provoquent chez l'homme des pathologies associées à une instabilité génétique. Ainsi, des dysfonctions télomériques sont à l’origine de la Dyskératose Congénitale (DC), et de sa forme rare et sévère, le Syndrome de Hoyeraal-Hreidarsson (HHS). Les DC et HHS se caractérisent principalement par une insuffisance médullaire progressive, des défauts développementaux et une prédisposition à développer des cancers. Par ailleurs, de nombreux syndromes associant déficits immunitaires et anomalies développementales sont causés par des défauts de réparation de l'ADN (cas de déficits immunitaires sévères, de l’Anémie de Fanconi (FA), de l’ataxie télangiectasie (AT), etc …). Au cours de ce travail, nous avons réalisé une étude phénotypique et génétique de patients atteints de deux pathologies aux caractéristiques cliniques distinctes. Ce travail de thèse a permis : 1) d'une part d'identifier des mutations de RTEL1 chez 3 patients atteints de HHS, décrivant ainsi une nouvelle cause moléculaire de cette pathologie. L'analyse des cellules de ces patients a révélé le rôle crucial que joue RTEL1 sur la stabilité du génome et le maintien des télomères dans des cellules humaines. 2) d'autre part, d'identifier un défaut en MYSM1, une histone déubiquitinase, dans un nouveau syndrome immuno-hématologique associé à des défauts de réparation de l’ADN présentant certaines similitudes avec l'anémie de Fanconi. Cette étude démontre pour la première fois, qu'outre son rôle dans la régulation transcriptionnelle, MYSM1 participe également aux mécanismes de réparation des lésions de l'ADN. / Maintaining genome integrity is essential for cell survival and propagation of the genetic information. Improper management of DNA damages and / or aberrations in maintenance of telomere - the ends of linear chromosomes - causes humans disorders associated with genetic instability. Thus, in humans, telomere dysfunction causes Dyskeratosis Congenita (DC), and its rare and severe form, Hoyeraal-Hreidarsson Syndrome (HHS). DC and HHS are mainly characterized by progressive bone marrow failure, developmental defects and predisposition to cancer. In addition, many syndromes involving immunodeficiency and developmental abnormalities are caused by defects in DNA repair (e.g. severe immune deficiencies, Fanconi Anemia (FA), Ataxia Telangiectasia (AT),…). In this work, we performed a phenotypic and genetic study of patients with two syndromes presenting distinct clinical features. This work permitted : 1) on one hand, to identify RTEL1 mutations in patients with HHS and describe a new molecular cause of this disease. The analysis of patients’ cells revealed the crucial role for RTEL1 in genome stability and telomere maintenance in human cells. 2) on the other hand, to identify mutations in MYSM1, a histone deubiquitinase, in a new immuno-hematological syndrome associated with defects in DNA repair and sharing some similarities with Fanconi anemia. This study demonstrates for the first time that, in addition to its role in transcriptional regulation, MYSM1 is required to cope with DNA damages.

Un couple canadien sur six aurait des problèmes de fertilité. Jusqu’à 70% des embryons humains générés en clinique de fertilité possèdent des cellules avec un nombre erroné de chromosomes appelées cellules aneuploïdes. L’aneuploïdie est le résultat d’une mauvaise ségrégation des chromosomes durant la division cellulaire et réduit les chances de grossesse à terme. Il fut démontré que les embryons ont un temps de division différent et que ce temps peut être un indicateur de sa santé. Cependant, comment cette division affecte l’embryon au niveau cellulaire reste à démontrer. Chez les cellules somatiques, le temps de divisions cellulaires (phase-M) est directement lié à l'intégrité chromosomique. Plus précisément, une phase-M prolongée peut provoquer une séparation prématurée des chromatides sœurs appelée "fatigue des cohésions" (CF). Indépendamment, divers mécanismes réduisent les erreurs de ségrégation des chromosomes. L’un d’entre eux, le point de contrôle de l'horloge mitotique (mitotic-timer) fut décrit chez les cellules somatiques comme actif après une prolongation de la phase-M provoquant ainsi un arrêt G1/S des cellules filles. L’existence du mitotic-timer et la présence de CF chez l'embryon de mammifère reste inconnues. Des travaux suggèrent que certains points de contrôle sont défaillants chez les embryons. Ici, nous faisons l’hypothèse que les embryons préimplantatoires n'ont pas de mitotic-timer et examinons leurs capacités de division après une exposition à des agents perturbateurs de la mitose. La durée de la phase-M fut manipulée chez des embryons de souris au stade deux-cellules avec un inhibiteur du complexe de promotion de l’anaphase. L'imagerie de cellules fixées et vivantes fut réalisée sur un microscope confocal et à fluorescence inversée. Contrairement aux cellules somatiques, les embryons préimplantatoires ne parviennent pas à activer le mitotic-timer après une phase-M prolongée de 6 heures au stade 2-cellules, et ils se développent jusqu'au stade blastocyste. Cette même extension conduit à la CF, qui induit des défauts de ségrégation chromosomique. En revanche, une extension extrême (14 heures) de la phase-M provoque un arrêt du cycle cellulaire à l'interphase suivante. Également, une accumulation de dommages à l'ADN est observée avec l'individualisation des chromosomes en phase-M. Pour résumer, une prolongation extrême de la phase-M provoque un arrêt du cycle cellulaire. Une phase-M de 6 heures suffit à provoquer des erreurs de ségrégation, mais n’active pas le mitotic-timer et conduit ainsi à une instabilité chromosomique. Par conséquent, comme les embryons sont sensibles à la CF, nous nous sommes demandé si les œufs en métaphase II, où le fuseau persiste pendant plusieurs heures, pourraient également être sujets à la CF. Pour tester cela, nous avons examiné des ovocytes de souris jeunes (2-3 mois) et âgées (16 mois), ainsi que des ovocytes humains. De manière frappante, la fréquence des chromosomes mal alignés n'était pas associée à la durée de l'arrêt en métaphase II, quel que soit l'espèce ou l'âge. En conclusion, contrairement aux embryons, les ovocytes en métaphase-II semblent protégés de la CF pour garantir l'intégrité du génome pendant l'arrêt prolongé qui précède la fécondation. Nous pensons que l’intégration de la durée de la phase-M pourrait améliorer la sélection des embryons viable en clinique. / One in six Canadian couples struggle with infertility. Nearly 70% of human embryos generated in fertility clinics contain aneuploid cells, possessing the wrong number of chromosomes due to errors during embryonic cell division in chromosome segregation. Aneuploidy reduces the risk of full-term pregnancy and is the cause of various genetic disorders. It has been reported that the timing of cell divisions in the early embryo is variable and may be an indicator of embryo health, but we have a limited understanding of how mitotic timing in the embryo impacts the embryo on a cellular level. In somatic cells the timing of cell divisions has recently been shown to relate directly to chromosome integrity. Specifically, extended M-phase can cause premature separation of sister chromatids, known as "cohesion fatigue" (CF). In addition, several checkpoints operate to reduce chromosome segregation errors. The mitotic timer (MitClock) has been described in somatic cells where an extended duration of M-phase can cause a subsequent G1/S arrest. But whether MitClock can operate in the mammalian embryo, and whether the embryo is susceptible to CF, are unknown. Other work suggests that well characterised genetic integrity-protecting pathways may be lacking in embryos. We therefore hypothesized that early mammalian embryos lack a mitotic clock checkpoint and we aimed to examine their ability to divide following exposure to mitotic disrupting agents. To address these questions, M-phase duration was manipulated in two-cell stage mice embryos with an anaphase promoting complex inhibitor. Fixed-cell and live imaging were performed on confocal and inverted fluorescence microscopes. In contrast to somatic cells, preimplantation embryos fail to activate MitClock after 6-hours in a prolonged M-phase at the 2-cell stage, and embryos develop to blastocysts. Importantly however, this same extension leads to CF, which induces chromosome segregation defects. In contrast, an extreme (14 hour) M-phase extension causes cell cycle arrest in the subsequent interphase, which we show involves the accumulation of DNA damage and is potentiated by chromosome individualisation in M-phase. To summarise, while extreme elongation of M-phase can cause cell cycle arrest, even a 6-hour M-phase is enough to elicit CF and chromosome segregation errors. The 6-hour M-phase fails to activate a mitotic clock checkpoint and thus leads to chromosomal instability. As we have shown that embryos are susceptible to CF, we wondered whether Metaphase-II eggs, where the spindle persists for several hours, might also be prone to CF. To test this, we examined oocytes from young (2-3 months) and old (16 months) mice, as well as human oocytes matured from GV stage from patients undergoing fertility treatment. Strikingly, the frequency of misaligned chromosomes was not associated with the length of Metaphase-II arrest regardless of species, or age. We conclude that, contrary to what we found to be the case for mitotic M-phases in the early embryo, the chromosomes on Metaphase-II spindles are protected from cohesion fatigue to protect genome integrity during the prolonged Metaphase-II arrest that precedes fertilization. Altogether, we speculate that integration of M-phase lengths into embryo selection algorithms may in future improve the ability to select the most viable embryo in the clinic.

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base. / Apurinic/apyrimidinic (AP) sites are a form of highly mutagenic DNA damage that arise either spontaneously or by a variety of DNA damaging agents. To preserve genomic stability two AP endonuclease families, endo-IV and exo-III, evolved to counteract the mutagenic effect of AP sites. While members of both families were identified in multiple unicellular organisms, notably E. coli and S. cerevisiae, no members of the endo-IV family were identified in multicellular ones, with the exception of C. elegans and its close relatives, particularly C. briggsae. We set out to investigate the biological importance of APN-1 in C. elegans using gene knockdown approach. In our study, we showed that the knockdown of C. elegans apn-1 gene, using RNAi causes the accumulation of spontaneous and drug induced mutations, resulting in a delay in egg hatching, decreased survival and longevity. Furthermore, we have showed that the accumulated mutations lead to delays in cell cycle progression during early embryogenesis, thus providing a possible explanation for the observed delay in hatching. Although we showed increased mutations in the gut of the worm, we were unable to confirm APN-1 distribution tagged with GFP. The transgenic APN-1-GFP animal did not express enough of this fusion protein to be visualized by fluorescent microscopy, although it was detected by Western blot analysis. The transgenic animals over-expressing APN-1-GFP were unstable and showed phenotypes consistent with genetic defects. In conclusion, it would seem that C. elegans has evolved to retain a balanced level of APN-1, which plays a versatile role in maintaining genetic integrity, since this organism lacks a full complement of the enzymes in the base-excision repair pathway.

Le cancer de la prostate est la forme de cancer la plus fréquente et la troisième cause de décès par cancer chez l’homme dans les sociétés occidentales. Alors que la plupart des cancers de la prostate localisés sont éradiqués chirurgicalement, la plupart des tumeurs métastatiques répondant initialement aux thérapies par privation d’androgènes deviennent résistantes au traitement, causant généralement le décès du patient. Les gènes suppresseurs de tumeur PTEN et p53 étant fréquemment mutés dans les cancers de la prostate métastatiques et résistants à la castration, le laboratoire d’accueil a généré des modèles murins dans lesquels Pten et/ou Trp53 sont sélectivement invalidés à l’âge adulte dans les cellules épithéliales prostatiques dans le but de déterminer les évènements clés conduisant à la progression du cancer de la prostate. Notre étude révèle que l’invalidation de PTEN stimule la prolifération des cellules épithéliales prostatiques et conduit à des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux en quelques mois. Cette hyper-prolifération induit un stress réplicatif et une réponse aux dommages de l’ADN qui va conduire à un arrêt progressif de la croissance cellulaire et une entrée en sénescence. Les cellules sénescentes sécrètent de nombreuses cytokines et de chimiokines, et peuvent accumuler des mutations contribuant ainsi à la progression de la tumeur. Il est notable qu’en l’absence de Trp53, les épithéliums prostatiques dépourvus de Pten développent des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux entrant en sénescence. Cependant, la formation d’adénocarcinomes est accélérée et des tumeurs sarcomatoïdes pouvant générer à long terme des métastases apparaissent. En l’absence de Pten, certaines cellules épithéliales prostatiques perdent leur identité moléculaire en exprimant des marqueurs caractéristiques de cellules souches et différenciation neuroendocrinienne. Nous avons également mis en évidence des cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN et p53 résistantes à la castration exprimant à la fois des marqueurs de cellules basales et luminales. En conclusion, nos travaux ont permis une avancée dans la compréhension des mécanismes conduisant à des formes incurables de cancer de la prostate. Les traitements actuels ayant des effets secondaires importants et pouvant générer des résistances, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant l’élimination des cellules sénescentes mais aussi des cellules épithéliales prostatiques exprimant des marqueurs de cellules basales et luminales dans les lésions précancéreuses représente des perspectives intéressantes pour traiter le cancer de la prostate. / Prostate cancer (PCa) is a leading cause of male cancer death worldwide. While most locally PCa are curable, metastatic tumors initially respond to androgen deprivation therapy but ultimately relapse to castration-resistant prostate cancer (CRPC), which is a lethal disease. Since the tumor suppressor genes PTEN and p53 are frequently mutated in metastatic and CRPC, the host laboratory generated mouse models in which Pten and/or Trp53 are selectively ablated in adult prostatic epithelial cells (PECs) in order to unravel the key events leading to prostate cancer progression. Our study reveals that Pten ablation stimulates PECs proliferation forming prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) within a few months. This hyper-proliferation induces replicative stress and a DNA damage response (DDR), which in turn leads to a progressive growth arrest with characteristics of cell senescence. As senescent cells secrete a large number of cytokines and chemokines, and can accumulate other mutations, they might contribute to tumor progression. Importantly, in the absence of Trp53, most Pten-null PECs develop PINs that enter senescence. However partial loss of PECs identity is detected as we show enhanced stemness and focal neuroendocrine differentiation of luminal Pten-null PECs. In some cases, adenocarcinoma and sarcomatoid tumors are formed, and more than one-third of the latter develop metastases. Strikingly, we also show formation of a castrate-resistant cell entity of both Pten and Pten/Trp53-null PECs sharing luminal and basal markers. Taken together, as current treaments lead to side effects and resistance, the development of therapeutic strategies to eliminate senescent cells/and or PECs expressing luminal and basal/stem progenitor in pre- cancerous lesions represents promising option for prostate cancer treatment.

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base. / Apurinic/apyrimidinic (AP) sites are a form of highly mutagenic DNA damage that arise either spontaneously or by a variety of DNA damaging agents. To preserve genomic stability two AP endonuclease families, endo-IV and exo-III, evolved to counteract the mutagenic effect of AP sites. While members of both families were identified in multiple unicellular organisms, notably E. coli and S. cerevisiae, no members of the endo-IV family were identified in multicellular ones, with the exception of C. elegans and its close relatives, particularly C. briggsae. We set out to investigate the biological importance of APN-1 in C. elegans using gene knockdown approach. In our study, we showed that the knockdown of C. elegans apn-1 gene, using RNAi causes the accumulation of spontaneous and drug induced mutations, resulting in a delay in egg hatching, decreased survival and longevity. Furthermore, we have showed that the accumulated mutations lead to delays in cell cycle progression during early embryogenesis, thus providing a possible explanation for the observed delay in hatching. Although we showed increased mutations in the gut of the worm, we were unable to confirm APN-1 distribution tagged with GFP. The transgenic APN-1-GFP animal did not express enough of this fusion protein to be visualized by fluorescent microscopy, although it was detected by Western blot analysis. The transgenic animals over-expressing APN-1-GFP were unstable and showed phenotypes consistent with genetic defects. In conclusion, it would seem that C. elegans has evolved to retain a balanced level of APN-1, which plays a versatile role in maintaining genetic integrity, since this organism lacks a full complement of the enzymes in the base-excision repair pathway.

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l’acétylation de l’histone H3 sur la Lysine 56 (H3K56ac) a lieu sur toutes les histones H3 nouvellement synthétisées qui sont déposées derrière les fourches de réplication. L’acétylation de H3K56 joue un rôle primordial dans l’assemblage de l’ADN lors la réplication et la réparation. L’acétylation de H3K56 joue également un rôle important dans la stabilité génomique et la stabilisation des fourches de réplication bloquée. En effet, les cellules dépourvues de H3K56ac sont sensibles au méthane sulfonate de méthyle (MMS) et à d’autres agents génotoxiques qui causent du stress réplicatif. Notre projet visait à investiguer les liens entre la protéine du réplisome Ctf4 et l’acétyltransférase d’histone Rtt109. Dans un premier lieu, la délétion de CTF4 a partiellement contré la sensibilité des cellules rtt109Δ au MMS. Notre analyse génétique a aussi montré que Ctf4, Rtt109, et le complexe Rtt101-Mms1-Mms22 agissent dans la même voie de réponse face à un stress réplicative. Nos résultats montrent que les cellules ctf4Δ et rtt109Δ présentent des foyers intenses du complexe de liaison à l'ADN simple-brin RPA en réponse au stress réplicatif, suggérant la formation excessive de régions d'ADN simple-brin aux fourches de réplication bloquées, ce qui conduit à une hyper activation des points de contrôle des dommages à l'ADN. Ces mutants présentent des ponts anaphase et des foyers persistants des protéines de recombinaison homologues Rad51 et Rad52 en réponse aux génotoxines, suggérant ainsi que la structure anormale des réplisomes bloqués peut compromettre leur récupération. Nos résultats indiquent également que la délétion des gènes de la RH (RAD51, RAD52, RAD54, RAD55 et MUS81) avec ctf4Δ et rtt109Δ respectivement, engendre une sensibilité synergique au MMS, suggérant que les cellules qui sont déficientes en H3K56 acétylation utilisent la RH pour réparer les dommages causés suite à un stress réplicatif. En conclusion, nos résultats suggèrent que les cellules déficientes en H3K56ac présentent des défauts de RH en réponse aux dommages à l’ADN induits par le MMS durant la phase S. / In Saccharomyces cerevisiae, histone H3 lysine 56 acetylation (H3K56ac) occurs on all newly synthesized histones H3 that are deposited behind DNA replication forks. H3K56ac plays critical role in chromatin assembly during DNA replication and repair. H3K56ac is also required for genome stability and stabilization of stalled replication fork. Cells lacking H3K56ac are sensitive to methyl methane sulfonate and other drugs that cause replicative stress. In this thesis, we investigated the links between the replisome protein Ctf4 and the H3K56 acetyltransferase Rtt109. Deletion of CTF4 partially rescued the sensitivity of rtt109Δ cells to methyl methane sulfonate. Genetic analyses also showed that Ctf4, Rtt109, and the Rtt101-Mms1-Mms22 complex act in the same pathway to response to replicative stress. ctf4Δ and rtt109Δ cells displayed intense foci of the single-stranded DNA binding complex RPA during replicative stress, suggesting formation of excess single-stranded DNA regions at stalled replication forks, leading to hyper activation of DNA damage checkpoints. These mutants accumulated anaphase bridges and persistent foci of the homologous recombination proteins Rad51 and Rad52 in response to genotoxins, suggesting that abnormal DNA structure formed at stalled replisome may compromise their recovery. Deletion of HR genes (RAD51, RAD52, RAD54, RAD55 and MUS81) together with ctf4Δ and rtt109Δ presents synergistic sensitivity to MMS, suggesting that H3K56ac deficient cells use HR to repair the damages caused by replicative stress. Overall our results demonstrate that H3K56ac deficient cells cannot recover MMS- induced damages because HR is compromised in these mutants.