Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Embora o potencial das sementes de pinhÃo manso como fonte de matÃria prima para a produÃÃo de biodiesel seja amplamente reconhecido, pouco se sabe sobre os padrÃes de deposiÃÃo de Ãleo e proteÃna durante o desenvolvimento da semente. A disponibilidade deste conhecimento serà de fundamental importÃncia para a criaÃÃo de novos genÃtipos que atendam a demanda das indÃstrias do biodiesel. Neste trabalho, foi realizada uma anÃlise proteÃmica inicial do endosperma em desenvolvimento e maduro, objetivando identificar proteÃnas envolvidas no metabolismo de Ãcidos graxos assim como proteÃnas com propriedades alergÃnicas/tÃxicas/antinutricionais que sÃo responsÃveis por tornar o resÃduo da extraÃÃo do Ãleo inadequado para o consumo animal. AtravÃs de eletroforese bidimensional (2DE) foram estabelecidos mapas de referÃncia das fraÃÃes protÃicas do endosperma de sementes em desenvolvimento (ESD) e maduras (ESM), que foram obtidas explorando as propriedades de solubilidade diferencial das proteÃnas do endosperma. Desses mapas de referÃncia, um total 1480 spots foram selecionados (712 âESDâ e 768 âESMâ), retirados dos gÃis 2DE e digeridos com tripsina para posterior anÃlise por espectrometria de massa. Foram utilizados para as buscas, os bancos de dados do NCBInr e um banco de dados local de ESTs de sementes em desenvolvimento e durante a germinaÃÃo de sementes de pinhÃo manso. Um total de 525 spots foram identificados e classificados funcionalmente. Embora a maioria das proteÃnas identificadas fosse relacionadas com funÃÃo de reserva, proteÃnas envolvidas em vias biossintÃticas dos Ãcidos graxos e dos diterpenos foram identificadas, assim como vÃrias proteÃnas relacionadas com metabolismo, inibidores de protease e a proteÃna tÃxica curcina. A taxa de identificaÃÃo relativamente baixa obtida neste estudo pode em parte ser atribuÃda ao fato de nÃo existir bancos de dados extensos para esta espÃcie. Os resultados aqui apresentados representam a primeira anÃlise em profundidade do padrÃo de deposiÃÃo e identificaÃÃo das proteÃnas de sementes de pinhÃo manso e fixam as bases sobre as quais o proteoma completo de sementes de pinhÃo manso poderà ser estabelecido. / Although the potential of the seed Jatropha as a source of raw material for the production of biodiesel is widely recognized, little is known about the deposition patterns of oil and protein during seed development. The availability of this knowledge will be crucial for the creation of new genotypes to meet the demand from the biodiesel industry. In this study, we performed an initial proteomic analysis of the endosperm in developing and mature in order to identify proteins involved in fatty acid metabolism as well as proteins with allergenic properties / toxic / antinutritional that are responsible for marking the residue of oil extraction unsuitable for consumption animal. Through two-dimensional electrophoresis (2DE) were established reference maps of protein fractions from the endosperm of the seed development (ESD) and mature (ESM), which were obtained by exploring the properties of differential solubility of proteins in the endosperm. These reference maps, 1480 spots in total were selected (712 "ESD" and 768 "ESM"), removed from the 2DE gel and digested with trypsin for subsequent analysis by mass spectrometry. Were used for searching the databases NCBInr and a local database of ESTs from developing seeds and during germination of Jatropha. A total of 525 spots were identified and classified functionally. Although most of the proteins identified were related reservation function, proteins involved in biosynthetic pathways of fatty acids were identified and diterpenes, as well as various metabolic-related proteins, protease inhibitors and curcina toxic protein. The relatively low rate of identification obtained in this study may in part be attributed to the fact that there is extensive databases for this species. The results presented here represent the first in-depth analysis of the deposition pattern and identification of proteins from seeds of Jatropha and lay the foundations on which the complete proteome of seeds of Jatropha can be established.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A realizaÃÃo desta pesquisa teve por objetivos a descriÃÃo do mapa eletroforÃtico bidimensional do plasma seminal de touros adultos Bos indicus, raÃa Brahman, bem como a determinaÃÃo das associaÃÃes estatÃsticas entre proteÃnas do plasma seminal e parÃmetros seminais destes touros. Amostras de sÃmen de 56 touros foram coletadas e o plasma seminal foi obtido atravÃs de centrifugaÃÃo e submetido à eletroforese bidimensional. Os gÃis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados por meio do aplicativo PDQuest. Os touros foram divididos em grupos de alta e baixa motilidade espermÃtica e alto e baixo percentual de cÃlulas espermÃticas morfologicamente normais. As proteÃnas mais abundantes no plasma seminal dos touros Bos indicus e detectadas em todos os 56 gÃis apresentaram semelhanÃa com espermadesinas e BSPs. A expressÃo de spots com valores de kDa e pI equivalentes aos das proteÃnas aSFP, BSPs, clusterina , albumina e osteopontina foram estatisticamente diferentes entre os grupos de animais com parÃmetros contrastantes de motilidade e morfologia espermÃticas. As associaÃÃes encontradas entre tais spots protÃicos e os parÃmetros seminais sugerem a possibilidade do uso destes como marcadores moleculares da fertilidade potencial dos animais. / This research aimed to describe the two-dimensional electrophoresis map of bull seminal plasma of adult Bos indicus, Brahman, and the determination of statistical associations between proteins of seminal plasma and semen parameters of these bulls. Semen samples from 56 bulls were collected and seminal plasma was obtained by centrifugation and subjected to two-dimensional electrophoresis. The gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using PDQuest application. The bulls were divided into groups of high and low sperm motility and high and low percentage of morphologically normal sperm cells. The most abundant proteins in seminal plasma of bulls Bos indicus and detected in all 56 gels showed similarity to espermadesinas and BSPs. The expression of spots with pI values ​​kDa protein equivalent to aSFP, BSPs, clusterin, albumin and osteopontin were significantly different between groups of animals with contrasting parameters of sperm motility and morphology. The associations found between such protein spots and semen parameters suggest the possibility of their use as molecular markers of potential fertility of animals.

O ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), substância utilizada como autoindutor nos sistemas de Quorum Sensing da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, foi utilizado como um modelo de estudos para a análise de moléculas secretadas por populações celulares utilizando técnicas eletroanalíticas. Cultivos celulares provenientes de três linhagens diferentes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri foram utilizados para os estudos. Uma linhagem selvagem (WT), que produzia DSF em quantidades naturalmente observadas, e duas linhagens geneticamente modificadas. Em uma linhagem (ΔC) a modificação genética resultava em elevada produção de DSF, para a segunda (ΔF) o resultado era a anulação da produção do autoindutor. As principais técnicas analíticas utilizadas foram: voltametria cíclica, eletroforese capilar e cromatografia líquida (com detecção UV-Vis e acoplada a espectrometria de massas), sendo a última para efeitos de comparação. Procedimentos de extração líquido-líquido com solventes orgânicos foram realizados como etapas de pré-tratamento de amostras, visando diminuir a quantidade de interferentes e realizar uma pré-concentração do analito. Três metodologias principais foram adotadas. Uma primeira voltada para a diferenciação dos cultivos celulares, analisando-se ou os sobrenadantes provenientes dos cultivos ou os extratos resultantes dos pré-tratamentos desses sobrenadantes, tendo como principal foco a identificação de um sinal diferencial entre os cultivos que correspondesse às quantidades de DSF, ou seja, inexistente para a linhagem ΔF, de alta intensidade para linhagem ΔC e de intensidade intermediária para a linhagem WT. A segunda metodologia foi baseada no uso de uma molécula modelo para realizar experimentos e obter dados como parâmetros físico-químicos, o ácido láurico (ácido dodecanóico) foi escolhido por sua semelhança estrutural e facilidade de obtenção, curvas de calibração e experimentos de separação de moléculas com estrutura semelhante foram realizados com a técnica de eletroforese capilar. Uma terceira metodologia foi desenvolvida utilizando o padrão do ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), curvas de calibração foram obtidas com o padrão isolado apresentando ótimas linearidades, tanto com a técnica de eletroforese capilar quanto com cromatografia líquida com detecção UV-Vis, experimentos de adição de padrão às amostras também foram executados. Os experimentos realizados com as amostras não apresentaram os resultados esperados, os problemas foram associados principalmente à quantidade de interferentes na amostra e a baixa concentração do analito nos cultivos, sendo que os métodos de extração realizados não foram suficientes para solucioná-los. O insucesso da técnica de voltametria cíclica foi associado ao envenenamento do eletrodo, devido à alta quantidade de compostos orgânicos presentes na amostra, e dúvidas relacionadas à eletroatividade do DSF. As dificuldades encontradas com a técnica de eletroforese capilar foram associadas à alta força iônica da amostra, presença de interferentes e baixa concentração do analito nos cultivos. Mesmo os experimentos realizados com cromatografia líquida acoplada a detecção com espectrometria de massas não atenderam às expectativas, dificultando a elucidação dos problemas encontrados até então e impossibilitando o desenvolvimento de uma metodologia que atendesse aos objetivos propostos. / Cis-11-methyl-2-dodecenoic acid, also known as DSF (autoinducer of the Quorum Sensing system used by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri) was explored as a study model for the cell secreted molecules analysis by electroanalytical techniques. Cell cultures from three different cell lines of the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri were used for this study. A wild type (WT), which produced DSF in naturally observed quantities and two genetically modified ones. One of the lines (ΔC) had a genetic modification that resulted in an elevated production of DSF, and the other (ΔF) had a modification that stopped DSF production. Main analytical techniques used were: cyclic voltammetry, capillary electrophoresis and liquid chromatography (with UV-Vis detection and coupled with mass spectrometry), this last one was used with comparison purposes. Liquid-liquid extractions with organic solvents were realized as sample pre-treatment steps aiming the reduction of interfering species and analyte pre-concentration. Three main methodologies were adopted. One based in the differentiation of cell cultures analyzing or the cell culture supernatants or the resulting extracts from the pre-treatment steps. The main focus was the identification of a differential signal between the cultures that corresponded to the DSF quantities, in other words, null for the ΔF line, high intensity for the ΔC line and a an intermediary intensity for the WT line. The second methodology was based in experiments with a model molecule to obtain some data such as physical-chemistry parameters. Lauric acid (dodecanoic acid) was chosen for its structural similarity and easily acquisition. Calibration curves and similar structure molecules separation experiments were realized using capillary electrophoresis. Third and last methodology was developed using standard cis-11-methyl-2-dodecenoic acid (DSF). Calibration curves were obtained with the isolated standard showing great linearities using both capillary electrophoresis and liquid chromatography with UV-Vis detection. Experiments of standard addiction to the samples were also realized. Experiments using the samples did not show the expected results. Problems found were mainly associated with high amount of interfering species and low analyte concentration at the cultures, extraction methods used were not enough to solve this. The failures with the cyclic voltammetric techniques were associated to electrode poisoning, due to the high amount of organic compounds present at the sample, and DSF lack of electroactivity. Difficulties found with capillary electrophoresis were associated with the samples high ionic strength, presence of interfering species and low analyte concentration. Even liquid chromatography coupled with mass spectrometry experiments didn\'t attended the expectations. Making it difficult to elucidate the problems and not allowing the development of a methodology that could achieve the proposed objectives.

A malária é a doença que mais mortes causa no mundo. O uso de fármacos antimaláricos representa a solução mais eficaz para o combate e controle da doença e o interesse pelo desenvolvimento de novos fármacos é grande devido a problemas de resistência. Existe uma grande variedade de fármacos antimaláricos, sendo que muitos deles são quirais, vendidos e administrados como mistura racêmica. Nas últimas décadas, houve um aumento no interesse quanto aos aspectos farmacodinâmicos e farmacocinéticos de fármacos quirais, devido ao conhecimento de que um dos isômeros pode ser mais ativo ou mais tóxico que o outro. Sendo assim, tem-se a necessidade do desenvolvimento de métodos analíticos enantiosseletivos, e a eletroforese capilar tem emergido como uma técnica de separação quiral com alto poder de resolução. Além disso, a inexistência de métodos oficiais para fármacos antimaláricos e os poucos estudos que relatam aplicações na análise de formulações farmacêuticas, demandam o desenvolvimento e validação de novos métodos para tal finalidade. Este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de dois métodos analíticos, não quiral e quiral, para a determinação de fármacos antimaláricos em formulações farmacêuticas por eletroforese capilar. O método não quiral utilizou eletroforese capilar de zona, sendo otimizado para a separação de 7 fármacos antimaláricos (cloroquina, hidroxicloroquina, primaquina, quinidina, quinina, quinacrina e mefloquina) com um eletrólito composto por 45 mmol L-1 de tampão citrato, pH 4,50, e apresentou um tempo de análise de 10 minutos, permitindo a separação dos diastereoisômeros quinina e quinidina sem a adição de aditivos. O método quiral utilizou eletroforese capilar de zona modificada por ciclodextrina e foi otimizado para separação enantiosseletiva de cloroquina, mefloquina, hidroxicloroquina, primaquina, quinina e quinidina com um eletrólito composto por 50 mmol L-1 de tampão citrato, e 2% de S-β-CD, pH 2,7. A separação dos fármacos antimaláricos e seus enantiômeros foi alcançada com tempo de análise de 12 minutos. Os métodos desenvolvidos foram validados de acordo com os protocolos oficiais, apresentando características adequadas e foram aplicados na determinação de cloroquina, hidroxicloroquina e mefloquina em formulações farmacêuticas. Como figuras de mérito para o método não quiral, tem-se: linearidade (R2 > 0,99), LD (7,43 - 24,4 µmol L-1), LQ (22,5 - 73,8 µmol L-1), precisão intermediária (0,76 - 1,7% RSD), recuperação (97,8 - 102,2%). Para o método quiral, tem-se: linearidade (R2 > 0,99), LD (7,43 - 9,58 µmol L-1), LQ (22,8 - 29,0 µmol L-1), precisão intermediária (0,50 - 1,8% RSD), recuperação (97,7 - 102,5%). Um ensaio de robustez para ambos os métodos foi realizado para comparar os resultados obtidos aplicando-se pequenas variações de tensão e temperatura. Observou-se que não existe uma diferença significativa entre os resultados, a um nível de confiança de P = 95 %. / Malaria is a disease that causes a large number of deaths worldwide. The use of antimalarial drugs is the most effective solution to combat and control the disease and interest in the development of new antimalarial drugs is still of great importance due to resistance issues. There is a wide variety of antimalarial drugs, many of which are chiral, sold and administered as racemic mixtures. In recent decades there has been an increased interest regarding the pharmacodynamic and pharmacokinetic aspects of chiral drugs, due to the knowledge that one of the isomers can be more active or more toxic than the other. Thus, there is a need for the development of enantioselective analytical methods, and capillary electrophoresis has emerged as a chiral technique separation with high resolving power. Moreover, the lack of official methods for antimalarial drugs and the few studies reporting applications in the analysis of pharmaceutical formulations, demands the development and validation of new methods for this purpose. This work aims at the development of two analytical methods, non-chiral and chiral, for the determination of antimalarial drugs in pharmaceutical formulations by capillary electrophoresis. The non-chiral method used capillary zone electrophoresis, being optimized for the separation of 7 antimalarial drugs (chloroquine, hydroxychloroquine, primaquine, quinidine, quinine, quinacrine and mefloquine) with an electrolyte consisting of 45 mmol L-1 of citrate buffer, pH 4.50, and had an analysis time of 10 minutes, allowing separation of isolated diasteroisomers quinine and quinidine without any additives. The chiral method used capillary zone electrophoresis modified by cyclodextrin and was optimized for enantioselective separation of chloroquine, mefloquine, hydroxychloroquine, primaquine, quinine and quinidine with an electrolyte consisting of 50 mmol L-1 citrate buffer and 2% S-β-CD, pH 2.7. The separation of the antimalarial drugs and their enantiomers was achieved in less than 12 minutes. The proposed methods were validated following official protocols, with adequate results and were used for determination of chloroquine, hydroxychloroquine, and mefloquine in pharmaceutical formulations. Figures of merit for the non-chiral method include: linearity (R2> 0.99), LD (7.43 to 24.4 µmol L-1), LQ (22.5 to 73.8 µmol L-1), intermediary precision (0.76 to 1.7% RSD), and recovery (from 97.8 to 102.2%). For the chiral method, we have: linearity (R2> 0.99), LD (7.43 to 9.58 µmol L-1), LQ (22.8 to 29.0 µmol L-1), intermediary precision (0.50 to 1.8% RSD), and recovery (from 97.7 to 102.5%). For both methods a robustness test was performed to compare the results obtained by applying slight variations in voltage and temperature. It was observed that there is no significant difference between the results, a confidence level P = 95%.

Neste trabalho, foram desenvolvidos métodos para determinação de espécies neutras por eletroforese capilar (CE) com detecção condutométrica sem contato (CCD). Estratégias baseadas em eletroforese capilar em solução livre (FSCE) e cromatografia micelar eletrocinética (MEKC) foram utilizadas em três casos: misturas de álcoois alifáticos, misturas de açúcares e salbutamol. Estas substâncias foram escolhidas por apresentarem ampla distribuição de características químicas. Os n-álcoois possuem regiões polares e apoIares distintas ao longo da cadeia carbônica, sendo que em solução aquosa se apresentam invariavelmente como espécies neutras. Os açúcares, apesar das longas cadeias carbônicas, possuem grande número de hidroxilas uniformemente distribuídas e podem ser ionizados a valores elevados de pH. Já o salbutamol, pode ser encontrado como espécie catiônica, neutra ou aniônica, dependendo do pH do meio. A melhor aproximação para os álcoois foi MEKC, que permitiu a separação e detecção da ordem de 10-4 mol·L-1 para cinco isômeros de pentanol. A utilização de eletrólito de corrida com pH 12,1 permitiu a determinação de frutose, glicose, galactose e sacarose da ordem de 10-5 moI&middotL-1 por FSCE em capilares de 20 µm. Salbutamol pode ser detectado como cátion e ânion em FSCE em limites de detecção da ordem de dez vezes menores que aquele obtido para a espécie neutra por MEKC. Como o mecanismo pelo qual ocorre a detecção condutométrica em MEKC não era ainda bem conhecido, foram desenvolvidos experimentos que ajudassem a elucidá-Io. Medidas de condutividade, viscosidade e análise de impedância de soluções tampão com dodecilsulfato de sódio (SDS) com n-álcoois e experimentos com soluções similares em MEKC demonstraram que a resposta observada com CCD é bastante complexa, pois vários fenômenos contribuem para o comportamento da condutividade na região dos analitos. Os principais fenômenos, os quais não estavam sendo devidamente considerados em modelos anteriores, são a dissociação e a ionização provocadas pelos analitos sobre as micelas. Estes fenômenos seriam particularmente significativos para as mobilidades das espécies envolvidas nas micelas, provocando a propagação de vacâncias que seriam então detectadas. / In the present work, analytical methods for determination of neutral species based on capillary electrophoresis (CE) with contactless conductivity detection (CCD) were developed. Free solution capillary electrophoresis (FSCE) and micelar electrokinetic chromatography (MEKC) were applied to three cases: mixtures of aliphatic alcohols, mixtures of sugars, and salbutamol. These substances were selected due to their distinctiveness. The alcohols have well-defined polar and apoIar regions in their carbonic chain and are typical non-ionic species in aqueous medium. The sugars have a great number of hydroxyl groups along the carbonic chain, which give a polar nature and can be ionized at high pH values. The salbutamol is amphoteric. The best approach for the alcohols was MEKC that allowed separation of five pentanol isomers with limit of detection of 10-4 mol·L-1. A running electrolyte with pH 12.1 allowed determination of 10-5 mol·L-1 of fructose, glucose, galactose, and sucrose, using FSCE with 20-µm inner diameter capillary. The sensitivity for the cationic and anionic forms of albuterol in FSCE was about ten times greater than that one achieved by MEKC for the neutral species. Since the conductivity detection in MEKC was not clearly understood, some experiments were carried out in order to improve the knowledge about it. Conductivity and viscosity measurement as well as impedance analysis of buffered sodium dodecyl sulfate solution with n-alcohols and experiments using similar conditions in MEKC showed that CCD response is complex, because several phenomena contribute to the solution conductivity in the region of the analytes. The main phenomena, which are not properly considered in the previous models, are the effects of the analytes on the dissociation and ionization of the micelles. These phenomena would be responsible for the vacancies detected as negative peaks, which would be formed by the augment of the mobilities of the species involved in the micelle formation.

A combinação sinérgica da análise por injeção em fluxo com eletroforese capilar, FIA-CE, é um novo campo em rápida expansão, que se estende da simples justaposição de equipamentos (FIA-CE at-line) ao verdadeiro interfaceamento ou hifenação (FIA-CE in-line ou on-line). Tipicamente, circuitos FIA construídos nos laboratórios são interfaceados com equipamentos comerciais de eletroforese capilar providos com detecção espectrofotométrica UV-Vis, e operam sob injeção (ou melhor, transferência) eletrocinética de amostra do circuito FIA para o capilar, vez que esta é mais simples para implementar que a transferência hidrodinâmica. Um novo sistema FIA-CE que combina a detecção condutométrica sem contato elétrico, DCSC, com transferência hidrodinâmica ou eletrocinética de amostra foi projetado e construído no laboratório utilizando-se material de baixo custo, além de uma fonte de alta tensão, uma bomba peristáltica e um microcomputador. No circuito FIA, utilizou-se um único solenóide na construção de injetor multicanal com válvulas de estrangulamento de dimensões reduzidas. O DCSC foi anteriormente desenvolvido por outros componentes do grupo. A interface FIA-CE consiste de uma agulha hipodérmica de aço inoxidável conectada à saída do circuito FIA, atuando como eletrodo aterrado, traspassada pelo capilar. Quatro diferentes eletrólitos podem ser chaveados por intermédio do microcomputador para alimentar o circuito FIA. Na CE, três níveis de pressão podem ser aplicados ao reservatório contendo o eletrodo ao qual se aplica a alta tensão, correspondente ao extremo do capilar mais próximo do detetor: a) potente aspiração, durante o procedimento de limpeza rápida; b) pequena pressão sub-ambiente (ajustada com um pressiostato simples) para a transferência sincronizada de amostra da interface; e c) pressão ambiente, durante a aquisição de dados do eletroferograma. O sistema opera sob controle de um flexível software de código aberto, aceitando procedimentos FIA usuais. As avaliações mostraram, afora a comodidade de uso do sistema, freqüência analítica maior, limites de detecção similares e melhor repetibilidade da área e posição dos picos em comparação a CE operada manualmente. / The synergistic combination of flow injection analysis with capillary electrophoresis, FIA-CE, is a new and rapidly evolving field, comprising juxtaposition of equipments (at-line FIA-CE) and true interfacing or hyphenation (in-line or on-line FIA-CE). Typically, FIA circuits assembled in the laboratory are interfaced to commercial electrophoresis equipments provided with UV-Vis detection and operated under electrokinetic sample injection (or better, transfer from the FIA circuit), that is simpler to implement than hydrodynamic transfer. A new FIA-CE system that combines contactless conductivity detection, CCD, with hydrodynamic and electrokinetic sample transfer was designed and constructed in the laboratory from low cost parts, besides a high voltage supply, a peristaltic pump and a PC. In the FIA circuit, a solenoid actuated multi-channel pinch-valve injector was downsized from a previous prototype. The oscillometric CCD was formerly developed by other components of the group. The interface consists of a hypodermic needle, connected to the FIA circuit and serving as grounded electrode, trespassed by the capillary. Four different electrolytes can be switched by the PC and three levels of pressure can be applied to the vial with the HV electrode and the tip of the capillary near the detector (opposite to the FIA-CE interface): a) strong aspiration, during fast cleansing procedure; b) slightly sub-ambient pressure (adjusted with a simple pressurestat) for synchronized sample transfer at the interface; and c) ambient pressure, during data acquisition of the electropherogram. The system runs under control of flexible, open-code software, accepting usual FIA procedures. Evaluations showed, besides convenience of use, higher analytical frequency, similar detection limits and better repeatability of peak positions and areas in comparison with manually operated CE.

A eletroforese capilar em microchips (µCE ou MCE) é uma forma diferente de eletroforese capilar que tem se desenvolvido muito nos últimos anos. Essa técnica usa microdispositivos feitos em placas que podem ser de vidro ou polímero contendo canais de dimensões micrométricas ao invés de um capilar de sílica. Ganhos significativos têm sido obtidos em termos de tempo de análise, volume manipulado, dimensões físicas, consumo energético e integrabilidade com outros sistemas. Neste trabalho foi empregada uma técnica diferente de microfabricação, usando toner de impressora laser e folhas de transparência para a construção de dispositivos para microfluídica. A técnica se mostra simples, rápida e excelente para prototipagem. Visando a aplicação desses microchips de toner-poliéster, esse trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de instrumentação para separações químicas usando microdispositivos de toner-poliéster. Fontes de alta-tensão e de corrente foram desenvolvidas usando módulos conversores de baixa para alta-tensão elétrica. As programações das fontes foram feitas usando tensões elétricas geradas por uma placa de aquisição de dados ou por um conversor digital-analógico (DAC) com uma interface de comunicação I2C. Todo o controle foi desenvolvido em sistema GNU/Linux. Um sistema de injeção hidrodinâmico também foi desenvolvido usando um compressor de ar de diafragma juntamente com um sistema de amortecimento pneumático de pulsações e tendo sua pressão interna estabilizada por uma coluna d\'água. Um medidor de pressão eletrônico foi desenvolvido, usando um sensor de pressão, e calibrado com um manômetro de coluna d\'água. Registros de pressão de -10, -1, +1 e +10cm de coluna d\'água em função de diferentes tempos de injeção foram feitos usando um software controlando o acionamento do injetor hidrodinâmico e efetuando leituras do medidor de pressão eletrônico. Os dados mostram que colunas d\'água de 10cm e tempos de injeção maiores que 3 segundos exibem um desvio padrão relativo (RSD) de aproximadamente 0,5% em módulo. uUma proposta diferente de construção de reservatórios é apresentada. Tal proposta usa mantas de silicone e um bloco de acrílico para a definição dos reservatórios. Observou-se que essa configuração promove o estrangulamento dos canais nas microestruturas de toner-poliéster. Assim, a configuração de colagem de reservatórios por pedaços de tubos, mostrou-se melhor para uso com dispositivos de toner-poliéster descartáveis. Uma nova forma de confecção de eletrodos para detecção condutométrica sem contato acoplada capacitivamente (C4D) foi desenvolvida usando placas de circuito impresso (PCB). Após a confecção dos eletrodos pelo processo de corrosão de PCB a placa foi recoberta com uma resina para que os espaços entre os eletrodos ficassem da mesma altura da camada de cobre. Essa configuração é simples e permite uma maior integração de circuitos eletrônicos. Testes de separação eletroforética foram feitos usando a instrumentação desenvolvida neste trabalho. Soluções de 100µM dos cloretos de K+, Na+ e Li+ dissolvidos em tampão HLac/His 2mM foram usadas para os testes. Essas espécies foram injetadas eletrocineticamente e separadas usando tampão HLac/His 20mM. A quantificação não foi possível por apresentar irreprodutibilidade no processo de injeção devido ao uso de espécies de elevada mobilidade, juntamente com longos canais de injeção. Também foram realizados testes com amostras de sangue permitindo a separação de K+ e Na+ sem pré-tratamento. Separações isotacoforéticas de 1mM dos cloretos de K+, Na+ e Li+ e 1mM de HCl, como eletrólito líder, e 1mM de cloreto de tetrametilamônio, como terminador, foram realizadas para demonstrar a funcionalidade do sistema em sistemas isotacoforéticos. / The Microchip Capillary Electrophoresis (µCE or MCE) is a different kind of capillary electrophoresis that has been growing. This technique uses devices made with small plates of glass or polymer with a microchannel instead of a silica capilar. Improvements in time analysis, sample volumes, physical dimensions, power consume, and integrability with diferent systems have been archieved. A diferent microfabrication technique using laser printer toner and polyester sheets was used to build devices for microfluidic devices. This tecnique is simple, fast and suitable for prototyping. In this work were developed instruments for use with these toner-polyester microdevices. High-voltage and current sources were developed using high-voltage conversors (DC/HVDC). The programming was obtained by electric voltages from a data acquisition board and a digital-analogic conversor (DAC) with a I2C interface communication. Its control was made in a GNU/Linux System. An hidrodynamic injector was developed using an air compressor with a pulse dumper. The internal pressure was regulated by water column. An electronic manometer was built and calibrated with a water manometer. Recording of pressure using -10, -1, +1, and +10cm water column using different injection times were acquired with a data acquisition system. The data show that when water columns of ca. 10cm and injection times greater than 3 seconds are used, the relative standard deviation (RSD) is about 0.5% in modulus. A different way to build vials is presented. This method uses a silicone mantle and plastic glass block with holes. As a result, channels are stragled due to the poliester sheets. A new way to build electrodes for capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D) using printed circuit boards (PCB) is shown. After the corrosion of the copper board, varnish is applied on the board to planify its surface. This configuration is simple and allows good integrability with the electronic circuit. Electrophoretic tests using the instrumentation developed was performed by separation of 100µM K+, Na+ and Li+ solutions in 2mM HLac/His buffer. This solutions were injected by electrokinetic method and separated using 20mM HLac/His buffer under high-voltage. The three species were detected but not quantified due to irreprodutibilities of the electrokinetic injection with high mobility ions. Demonstrative separations of K+ and Na+ were made with the same chemical system and blood samples without pretreatment. Isotacophoretic separations of 1mM K+, Na+, and Li+ in 1mM HCl (leader electrolyte) and 1mM tetramethylammonium (terminate electrolyte) were carried outto demonstrate the system functionality.

A cada ano a malária mata cerca de um milhão de pessoas. Segundo a OMS, 3,3 bilhões de pessoas, metade da população mundial, estão expostas à doença, principalmente em países subdesenvolvidos. Os fármacos utilizados no tratamento da malária incluem: cloroquina, primaquina, quinina, mefloquina, doxiclina, clindamicina e artemisina. A extensa resistência do parasita Plasmodium falciparum ao medicamento sintético cloroquina re-estabeleceu a quinina, um alcalóide encontrado na planta do gênero Cinchona, como droga antimalarial. A quinidina, o diastereoisômero da quinina, é usada como droga antiarrítmica e no tratamento de fibrilação arterial. Os estereoisômeros, cinchonina e cinchonidina, não são usados como medicamentos, embora mostrem efeitos similares àqueles da quinina e da quinidina. Os efeitos cardíacos da quinidina impossibilita seu uso como antimalarial. Outro alcalóide presente na espécie Cinchona é a hidroquinidina, que assim como a quinidina também apresenta atividade antiarrítmica. Os extratos vegetais são base para a produção de fitoterápicos, porém sem padronização o produto perde qualidade e a indústria não pode garantir a eficácia apregoada já que desconhece a concentração do princípio ativo no produto à venda. A portaria RDC 48/04 de 16.03.04 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) estabeleceu uma legislação específica, que se baseia na “garantia da qualidade”, exigindo a reprodutibilidade dos fitoterápicos produzidos, que só pode ser garantida com a utilização de extratos padronizados. De acordo com essa tendência, o objetivo do presente trabalho é o desenvolvimento de métodos de análise para os principais alcalóides da Cinchona por eletroforese capilar, podendo ser usada em caracterização de drogas vegetais, no controle de qualidade de extratos, bem como em possíveis adulterações. As determinações dos cinco principais alcalóides da Cinchona foram realizadas por eletroforese capilar de zona (CZE), utilizando como eletrólito TEA (1,1% v/v) com pH ajustado para 2,5 com ácido fosfórico e 20 mmol L-1 de α-ciclodextrina, com tempo total de análise inferior a 12 minutos. A otimização das condições de análise foi realizada através da realização de experimentos de planejamento fatorial 32+1, sendo as variáveis do estudo a concentração de TEA e de α-ciclodextrina. Com o uso de seletores quirais também foi desenvolvido um método para análise confirmatória dos alcalóides através do acoplamento de eletroforese capilar à espectrometria de massas, utilizando a estratégia de “partial filling”. Com objetivo de verificar o efeito do solvente na separação dos presentes alcalóides foi realizado um estudo do mecanismo de separação modulada por solvente em meio micelar (MEKC) e em meio não-aquoso (NACE). / Every year, malaria kills about one million people. According to OMS, 3.3 billion people, half of the world population, are exposed to the disease, mostly in underdeveloped countries. The pharmaceuticals used in the treatment of malaria include: chloroquine, primaquine, quinine, mefloquine, doxyclyne, clindamicina and artemisin. The increased resistance of the parasite Plasmodium falciparum to the synthetic pharmaceutical chloroquine reestablished quinine, an alkaloid found in the genus Cinchona, as antimalarial drug. Quinidine, the diasteroisomer of quinine, is used as antiarrhythmic drug in the treatment of arterial fibrillation. The diastereoisomers cinchonine and cinchonidine are not employed as pharmaceuticals although present similar effects to quinine and quinidine. The cardiac effects of quinidine hinders its use as antimalarial. Another alkaloid found in Cinchona is hydroquinidine, which similarly to quinidine also presents antiarrhythmic activity. Herbal extracts are the basis of phytotherapic production, however, with no standardization, the product lacks quality and the industry cannot guarantee its alleged efficacy, since there is no knowledge of the active principle concentration in the product put to sale. The ANVISA protocol (RDC 48/04 published on March16, 2004) established a specific legislation based on the “guarantee of quality”, which demands the reprodutibility of the produced phytotherapic, only achievable with standardized extracts. Following this tendency, the aim of this work was to develop methods of analysis for the main alkaloids of Cinchona using capillary electrophoresis, to apply in the characterization of herbal drugs, in the quality control of extracts as well as in the searching of possible adulterations. The determinations of five main alkaloids of Cinchona were carried out by capillary zone electrophoresis (CZE) using an electrolyte composed of 1.1% (v,v) TEA adjusted to pH 2.5 with phosphoric acid containing 20 mmol L-1 α-cyclodextrin, providing a less than 12 min total analysis time. The optimization of analytical conditions was conducted experimentally by a 32+1 factorial design where the studied variables were TEA and α-cyclodextrin concentrations. With the use of chiral selectors a confirmatory analytical method for alkaloids was also developed with the coupling of capillary electrophoresis and mass spectrometry employing a strategy called “partial filling”. With the purpose of verifying solvent effects on the separation of the alkaloids under investigation, studies of the separation mechanism as modulated by solvent in micelar medium (MEKC), and non aqueous medium (NACE) were conducted.

O interesse de plantas, do ponto de vista medicinal e cosmetológico, tem levado a necessidade de eficientes métodos de extração. A preparação da amostra é uma das mais importantes fases no desenvolvimento de uma metodologia analítica em preparações herbais. O presente trabalho teve como objetivo propor metodologias alternativas para a análise de metabólitos vegetais em produtos naturais, com ênfase em procedimentos de extração. As seguintes plantas foram avaliadas: soja (Glycine Max, Fabaceae), capsicum (Capsicum anuum, Solanaceae), camomila (Matricaria chamomilla, Compositae), guaraná (Paullinia cupana, Sapidaceae) e erva mate (Ilex paraguariensis, Aquifoliaceae). As principais classes de metabólitos vegetais estudadas foram os compostos fenólicos e metilxantinas, sendo utilizada a eletroforese capilar, como técnica de análise, em solução livre e em meio micelar. A otimização da metodologia de extração isoflavonas da soja, em cápsulas farmacêuticas, incluiu o uso de diferentes solventes, o tempo de extração, bem como a escolha do melhor solvente para a dissolução dos analitos para posterior injeção. A identificação tentativa de grupos derivados de malonil foi obtida a partir dos espectros de UV, tempo de migração e por hidrólise da amostra. Um estudo da composição de diferentes metabólitos primários e secundários da folha de soja, a saber: flavonóides, ácidos orgânicos, açúcares, cátions, ânions e ácidos graxos livres, foi realizado por variadas formas de extrações. Para o capsicum explorou-se a extração de capsaicinas por dispersão de matriz em fase sólida (MSPD). Os sorventes testados foram florisil, C-18 e sílica, sendo avaliados diferentes solventes para eluição. Um estudo de otimização da extração de cafeína em amostras de guaraná em pó foi realizado, utilizando-se, como referência, um extrato obtido em Soxhlet. Os polifenóis da camomila foram extraídos em ultrassom em diferentes tempos e temperaturas, comparada a análise por maceração e processador industrial, utilizando como extrator, o meio hidroglicólico. / The interest for plants of medicinal and cosmetic application demands methods with efficient extraction. Sample preparation is one of most important steps in the development of an analytic methodology in herbal preparation. The present work proposes methodologies for the analysis of the secondary metabolites in natural products, with emphasis in extraction procedures. The following plants were evaluated: soy (Glycine max), capsicum (Capsicum anuum), chamomile (Matricaria chamomilla), guaraná (Paullinia cupana), mate (Ilex paraguariensis) by the use of capillary electrophoresis. The first proposed method was applied to the determination of isoflavones in soy germ capsules from four different pharmaceutical laboratories. Peak assignment of unknown isoflavones in certain samples was assisted by hydrolysis procedures, migration behavior and UV spectra comparison. A study of the composition of metabolites and nutrients as flavonoids, organic acids, carbohydrates, cations, anions and fatty acids were evaluated in soy leaf. An easy, rapid method of extraction was performed for capsicnoids in Capsicum anuum by Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD). Different solid phases C18, silica and florisil were tested. To guaraná different methodologies of extraction were tested (ultrasound, turrax) compared to exhaustive Soxhlet extract. The influence of operating parameters (temperature, time) on the extraction efficiency of chamomile by ultrasound was studied, compared extract by maceration and processing. The mixture of water and glycol was used.

Este trabalho de doutorado apresenta o desenvolvimento de novas tecnologias para fabricação de microsistemas analíticos e detecção eletroquímica. Primeiramente, a poliuretana elastomérica, derivada de uma fonte renovável, o óleo de mamona, foi utilizada como um novo e alternativo material para fabricação de microdispositivos. Foram avaliadas as características físicas dos microcanais formados por moldagem, a compatibilidade química com solventes e eletrólitos, as características de superfície através dos ângulos de contato, o EOF em diferentes pHs e a performance analítica em experimentos de eletroforese com detecção eletroquímica. A segunda parte do trabalho apresenta o desenvolvimento de um método para a determinação simultânea de azo-corantes comumente usados na indústria alimentícia. Amaranto, amarelo crepúsculo FCF, amarelo sólido AB, ponceu 4R e vermelho 2G, foram separados e quantificados através de eletroforese em microdispositivos com detecção eletroquímica. Foram estudados e otimizados vários parâmetros que influenciaram a separação eletroforética e detecção eletroquímica, em experimentos realizados usando microdispositivos de vidro e eletrodo de trabalho de carbono vítreo. Finalmente, a terceira parte desse trabalho apresenta o uso das propriedades magnéticas e eletrocatalíticas de nanofios de níquel no desenvolvimento de um detector adaptativo magneticamente modulável para eletroforese em microdispositivos. / The development of microfluidic analytical systems has witnessed an explosive growth during the last 15 years. Particular attention has been given to microchip electrophoresis because of their fast and efficient separation capabilities. Electrochemistry detection offers considerable promise for such microfluidic systems, with features that include remarkable sensitivity, inherent miniaturization and portability, low cost, and high compatibility with microfabrication technologies. This thesis shows the development of new fabrication technologies for miniaturized analytical systems with electrochemical detection and it is presented in four chapters, Chapter I shows an introductory view of the main aspects related to miniaturization of analytical systems and amperometric detection configurations commonly coupled to microchip electrophoresis. In Chapter II, the use of elastomeric polyurethane (PU), derived from castor oil (CO) biosource, as a new material for fabrication of microfluidic devices by rapid prototyping is presented. Including the irreversible sealing step, PU microchips were fabricated in less than 1 h by casting PU resin directly on the positive high-relief molds fabricated by standard photolithography and nickel electrodeposition. Physical characterization of microchannels was performed by scanning electron microscopy (SEM) and profilometry. Polymer surface was characterized using contact angle measurements and the results showed that the hydrophilicity of the PU surface increases after oxygen plasma treatment. The polymer surface demonstrated the capability of generating an electroosmotic flow (EOF) of 2.6 × 10-4 cm2 V-1 s-1 at pH 7 in the cathode direction, which was characterized by current monitoring method at different pH values. The compatibility of PU with a wide range of solvents and electrolytes was tested by determining its degree of swelling over a 24 h period of contact. The performance of microfluidic systems fabricated using this new material was evaluated by fabricating miniaturized capillary electrophoresis systems. We used catecholamines as model analytes that were separated in aqueous solutions and detected with end-channel amperometric detection. In Chapter III, a method based on microchip electrophoresis with electrochemical detection has been developed for the simultaneous determination of Yellow AB, Red 2G, Sunset Yellow, Ponceu 4R, and Amaranth which are azo-dyes frequently added to foodstuffs. Factors affecting both separation and detection processes were examined and optimized, with best performance achieved by using a 10 mM phosphate buffer (pH 11) as running buffer and applying a voltage of 2500 V both in the separation and in the electrokinetic injection (duration 4 s). Under these optimal conditions, the target dye analytes could be separated and detected within 300 s by applying a detection potential of -1,0 V (vs. Ag/AgCl) to the glassy carbon (GC) working electrode. The recorded peaks were characterized by a good repeatability (RSD = 1,8 - 3,2%), high sensitivity, and a wide linear range. Detection limits of 3.8, 3.4, 3.6, 9.1, 15.1 ?M were obtained for Yellow AB, Red 2G, Sunset Yellow, Ponceu 4R, and Amaranth, respectively. Fast, sensitive, and selective response makes the new microchip protocol very attractive for the quantitative analysis of commercial soft drinks and candies Finally, in Chapter IV, we demonstrate for the first time the use of adaptive functional nickel nanowires for switching on demand operation of microfluidic devices. Controlled reversible magnetic positioning and orientation of these nanowires at the microchannel outlet offers modulation of the detection and separation processes, respectively. The former facilitates switching between active and passive detection states to allow the microchip to be periodically activated to perform a measurement and reset it to the passive (\"off\") state between measurements. Fine magnetic tuning of the separation process (post channel broadening of the analyte zone) is achieved by reversibly modulating the nanowire orientation (i.e., detector alignment) at the channel outlet. The concept can be extended to other microchip functions and stimuli-responsive materials and holds great promise for regulating the operation of microfluidic devices in reaction to specific needs or unforeseen scenarios.