Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T02:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Copi_Cecilia_M.pdf: 12156283 bytes, checksum: 93ce542963e020dcfb1af6c2bf9d5283 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante a gestação normal em primatas e em roedores observa-se o acúmulo de linfócitos natural killer no ambiente uterino (uNK). A funções comprovadas das células uNK estão relaciondas com o reconhecimento das células trofoblásticas alogênicas e produção de citocinas imunomoduladoras do ambiente uterino que garantem o sucesso da gestação. Além da produção de citocinas envolvidas na homeostase do ambiente uterino, as uNK produzem e estocam nos seus grânulos moléculas citotóxicas como a perforina e granzimas. Estas moléculas estão envolvidas na resposta imune inata das células NK, com potencial de promover a lise de células alvo. Porém, se ocorre a ativação desta atividade citolítica, ou mesmo se as uNK promovem a secreção deste arsenal de moléculas citolíticas no ambiente uterino em gestação normal, ou em casos de interrupção da gestação, não são conhecidas. Os conhecimentos nesta área não avançam pelas limitações éticas de estudar experimentalmente o ambiente uterino em gestantes humanos e a falta de modelos experimentais estabelecidos em animais laboratoriais. No presente trabalho, propos-se utilizar o modelo experimental de indução de lesões embrionárias para provocar o desequilíbrio do ambiente uterino e avaliar as alterações nas células uNK. Para tanto, foram utilizados camundongos prenhes no 9° dia de gestação que foram submetidas à procedimentos cirúrgicos de lesão do embrião. Amostras uterinas dos sítios de desenvolvimento embrionários de animais de gestação normal, dos animais com embriões lesionados nos intervalos de 10, 30 e 60 minutos póslesão, e dos animais manipulados cirurgicamente sem a lesão embrionária foram coletados e processados para avaliações através de métodos citoquímicos e imunocitoquímicos em microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os sítios uterinos de embriões lesionados apresentaram reação hiperêmica na região mesometrial já aos 10 minutos pós-lesão, que se acentuava nos períodos mais longos de pós-lesão. As células uNK presentes nesta região apresentaram alteração na reatividade pela citoquimica de lectina DBA e immunocitoquímica com a anti-perforina, sendo evidente a gradual redução na intensidade das reações no decurso do tempo pós-lesão. Na análise ultra-estrutural verificou-se a desestruturação dos grânulos lisossomo-secretores, sendo notória a perda do conteúdo do compartimento secretor evidenciada pela reação com o azul-cuprolínico. O compartimento lisossomal do grânulo embora sofra também uma desestruturação pronunciada, mantêm a reatividade para anti-catepsina D, sugerindo a preservação de parte da sua funcionalidade. A perda do conteúdo do compartimento secretor, notadamente a perforina e os proteoglicanos no período de 10 minutos pós-lesão, sugere a degranulação das uNK e portanto a ativação da atividade citotóxica destas células, numa resposta aguda frente ao desequilíbrio do ambiente uterino afetado pela lesão embrionária. Porém, não foi constatado qualquer indício morfológico da ocorrência da degranulação através do mecanismo exocitose-símile ou ainda, o efeito da ação citolítica sobre as células circunjacentes às uNK ativadas / Abstract: In the uterine environment during normal pregnancy of primates and rodents is seen the accumulation of natural killer lymphocites (uNK). The confirmed functions of uNK cells are related to recognition of allogeneic trophoblast cells and production of immunomodulating cytokines of uterine environment that assure the successful pregnancy. Besides the production of cytokines related to homeostasis of uterine environment, the uNK produce and store citotoxic molecules of perforin and granzymes in their granules. These molecules are involved in the innate immune response of NK cells with potential to promote lysis of target cells. However, whether the lytic activity is triggered or even the uNK promotes the secretion of these sets Df cytolitic molecules into the uterus of normal pregnancy or in the miscarriages are not known. The advances of knowledge in this field are slow down due to ethical limitation of experimental studies with human pregnant uterus and lack of well established experimental models in laboratory animal. In the present work it was proposed to use the experimental model of induction of embryo lesions to promote the unbalance of uterine environment and evaluated the changes in uNK cells. Pregnant mice on 9° gestational day were submitted to surgical procedure of embryo lesion and uterine samples from these embryo lesioned sites were collected after 10, 30 and 60 minutes, as did the normal pregnant and sham operated animais. The samples were processed for cytochemical and immunocytochemical evaluations in light and transmission electron microscopy. The embryo lesioned uterine sites showed hyperemic reaction in the mesometrial region as soon as 10 min after lesion which increased as increased the time lapse after lesion. The uNK cells found in these regions showed reactivity changes with DBA lectin cytochemistry and with anti-perforin immunocytochemistry, being noticed the gradual reduction on reaction intensities on course of time after lesion. In the ultrastructural analysis were seen the disruptions of secretory-Iysosomes granules with notorious lost of secretory compartment contents as were evidenced by cuprolinic blue cytochemical reaction. In spite of structural organization of lysosome compartment of the granules was also affected it was maintained the anti-cathepsin D positive reaction which suggest the preservation of part of its functionality. The secretory compartment contents lost, notably the perforin and proteoglycans at 10 min after embryo lesion suggest degranulations of uNK and therefore an acute response of these cells by activation of citotoxic activity, under effects of unbalance of uterine environment affected by embryo lesion. However, it was not detected any morphological evidence of degranulation by exocytosis-like mechanism or even, the cytolitic effect on neighbor cells around the activated uNK cells / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Níveis elevados de proteína bruta (PB) na dieta de ruminantes têm sido associado com comprometimento na fertilidade devido, principalmente, a elevação da concentração do nitrogênio uréico plasmático (NUP). Objetivou-se no presente estudo avaliar o efeito do fornecimento de dietas contendo nitrogênio não-protéico (NNP) sem prévia adaptação, durante curto espaço de tempo e em diferentes fases do ciclo estral, a fêmeas bovinas superovuladas quanto à produção, qualidade e ao grau de desenvolvimento de embriões recuperados. Sessenta e oito vacas da raça Nelore com escore corporal de 7,56 e peso médio de 557,6 kg foram distribuídas em três tratamentos: controle (C), uréia antes do dia 0 (UA; fornecimento de dieta com uréia do dia -5 ao dia 0) e uréia depois do dia 0 (UD; fornecimento de dieta com uréia do dia 0 ao dia 5). As vacas foram mantidas em piquetes com pastagem de Brachiaria brizantha cv. Marandu e receberam diariamente, 3,0 kg/animal de concentrado durante 16 dias. Foram formulados dois concentrados, sendo que as dietas totais (concentrado + consumo estimado de pastagem) continham 12,0% (dieta controle) e 14,6% de PB (dieta com NNP). A diferença na PB entre as dietas foi o acréscimo de 100g/vaca/dia de uréia. Os animais foram sincronizados, superovulados e inseminados. Sete dias (dia 7) após a inseminação (dia 0), realizou-se a colheita e análise dos embriões quanto à qualidade a ao grau de desenvolvimento. Amostras de sangue foram coletadas nos dias -5, 0 e 5 para mensurações das concentrações de NUP, glicose, insulina e progesterona. Houve efeito significativo dos tratamentos sobre a concentração médias de NUP no dia -5 (C = 16,18ab, UA = 17,72a e UD = 14,47b mg/dL; P = 0,0007), no dia 0 (C = 18,95b, UA = 22,71a e UD = 21,15 ab mg/dL; P = 0,0010) e no dia 5 (C = 20,93a, UA = 19,08b e UD = 21,51a mg/dL; P = 0,0022). Quanto às concentrações de glicose, insulina e progesterona não houve efeito dos tratamentos. Não houve efeito significativo nem da inclusão da uréia e nem do momento da inclusão da uréia sobre o total de estruturas recuperadas, total de estruturas fecundadas e de embriões viáveis. Porém, houve efeito do momento de inclusão da uréia sobre a porcentagem de estruturas fecundadas em relação ao total de estruturas recuperadas (UA = 75,3 vs. UD = 50,7%) e sobre a porcentagem de embriões viáveis em relação ao total de estruturas recuperadas (UA = 73,2 vs. UD = 39,4%). O tratamento UD acarretou em menor capacidade de fecundação do oócito em relação ao tratamento UA, havendo redução de aproximadamente 32,7% na proporção de oócitos fecundados sobre o total de estruturas recuperadas deste tratamento. / High levels of crude protein (CP) in ruminant diets were associated with detrimental effect on fertility, mainly, due to the rise of plasmatic urea nitrogen (PUN) concentration. The aim of this study was to verify the effects of short term non-protein nitrogen feeding at different periods of the oestrus cycle in superovulated cows without previous adaptation on yield, quality and development degree of recovered embryos. Sixty eight Nelore cows with body condition score of 7.56 and body weight of 557.6 kg were divided in three different groups: control (C), urea before day 0 (UB; urea supply from day -5 to day 0) and urea after day 0 (UA; urea supply from day 0 to day 5). Animals were grazing in Brachiaria brizantha cv. Marandu pasture and received 3.0 kg/animal/day of concentrate during 16 days. Two concentrates were formulated and the total diets (concentrate + estimate forage intake) had 12.0% (control diet) and 14.6% of CP (NPN diet). The difference in CP between diets was the addition of 100g/cow/day of urea. Animals were synchronized, superovulated and inseminated. The embryos were collected seven days (day 7) after insemination (day 0) and quality and development degree were also evaluated. Blood samples were collected on day -5, 0 and 5 for measurement of PUN, glucose, insulin and progesterone. There was significant effect of treatments on average PUN concentration at day -5 (C = 16.18ab, UB = 17.72a and UA = 14.47b mg/dL; P = 0.0007), at day 0 (C = 18.95b, UB = 22.71a and UA = 21.15ab mg/dL; P = 0.0010) and at day 5 (C = 20.93a, UB = 19.08b and UA = 21.51a mg/dL; P = 0.0022). For glucose, insulin and progesterone there was no effect of treatments. It was observed neither effect of urea inclusion nor the moment of urea inclusion in diet on the total number of recovered structures, total number of fertilized structures and total number of viable embryos. However, it was observed effect of the moment of urea inclusion on the rate of fertilized structures in relation to the total number of recovered structures (UB = 75.3 vs. UA = 50.7%) and on the rate of viable embryos in relation to the total number of recovered structures (UB = 73.2 vs. UA = 39.4%). The UA treatment lead to lowest fertilizing oocyte capacity in relation to UB treatment with an approximate reduction of 32.7% on oocytes fertilized proportion over the total recovered structures in this treatment.

A indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima, produzida pelas células trofoblásticas e, por sua capacidade de catabolizar o triptofano, inibe a proliferação das células T maternas, participando desta forma como importante mecanismo da tolerância materno-fetal. Contudo, pouco se sabe se a ação da IDO é influenciada por outras substâncias presentes no micro-ambiente uterino e, por esta razão, formulou-se a hipótese de que esta enzima poderia ter sua ação alterada nesse contexto e, desta forma, avaliou-se o comportamento da expressão da IDO frente à adição de alguns desses componentes presentes no útero gestante. Neste trabalho, células uterinas, de placentas e de embriões de ratas e camundongos fêmeas prenhes e não prenhes foram mantidas em cultivo e a elas adicionadas estradiol, progesterona, interferon , triptofano e 1-metil-D- triptofano, avaliando-se a expressão da IDO pela técnica de citometria de fluxo nos períodos de 4, 24 e 48 horas. Os resultados demonstraram que as diferenças mais significativas na expressão da IDO entre as ratas prenhes e não prenhes, foram observadas após a adição de progesterona (19,24%), interferon (11.22%) e triptofano (23,53%), nas ratas prenhes. Já nos camundongos fêmeas prenhes e não prenhes, as maiores expressões de IDO foram observadas no primeiro grupo pela adição de progesterona (11,33%), estradiol (9,98%) e interferon (21,78%). Considerando esses resultados, podemos concluir que a expressão da IDO pelas células uterinas, placentárias e embrionárias em cultivo sofre influência dos fatores testados, o que permite novas hipóteses para melhor compreensão da participação dessa enzima na tolerância materno-fetal, particularmente em relação a sua interação com hormônios e citocinas presentes no útero gestante. Além disso, poderá colaborar na elaboração de possíveis tratamentos de enfermidades, relacionadas à manutenção e sucesso da gestação onde haja envolvimento do sistema imunológico materno e dos mecanismos de tolerância. / Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) is an enzyme produced by trophoblast cells and due to its ability to catabolize tryptophan, inhibits the proliferation of maternal T cells, thus playing an important role as one of the mechanisms of maternal-fetal tolerance. However, little is known whether the action of IDO is influenced by substances present in the pregnant uterine microenvironment. This study evaluated the behavior of the IDO expression in cultured placental and embryonic cells from mice and rats in face of the addition of estradiol, progesterone, interferon, tryptophan and 1-methyl-D-tryptophan, by flow cytometry, at 4, 24 and 48 hours periods. The results showed that high expressions of IDO were observed in pregnant rats cells after the addition of progesterone (19.24%), interferon (11.22%) and tryptophan (23.53%). In mice, high expressions of IDO were observed in the pregnant group cells by the addition of progesterone (11.33%), estradiol (9.98%) and interferon- (21.78%). Considering these results, we may conclude that the expression of IDO by cultured placental and embryonic cells from mice and Wistar rats is indeed influenced by factors present in pregnant uterus, which provides additional information to better understand IDO role in the maternal-fetal tolerance, particularly on its interactions with reproductive hormones and cytokines. Additionally, it may contribute to the establishment of possible treatments for pregnancy-losses related to the maternal immune system response and mechanisms of tolerance.

O saco vitelino desempenha um importante papel no desenvolvimento embrionário de todos os mamíferos. Sua função está sendo estudada, demonstrando ser um dos lugares iniciais da hematopoiese. No período em que a placenta verdadeira ainda não esta formada, durante o desenvolvimento embrionário, o saco vitelino é a principal fonte de nutrição do embrião, constituindo um sitio de transferência e síntese de proteínas. As proteínas são moléculas que governam praticamente todas as funções celulares e são do ponto de vista químico as moléculas biológicas estruturalmente mais complexas. A proteômica é o estudo em grande escala de proteínas de uma amostra biológica complexa. O objetivo deste trabalho foi realizar a analise estrutural e bioquímica inicial das proteínas presentes no saco vitelino de embriões bovinos por eletroforese bidimensional 2D-PAGE. A partir dos géis obtidos em 2D-PAGE as amostras de proteínas contidas no saco vitelino de 37 dias de gestação apresentaram cerca de 1230 proteínas, e os géis das amostras de 23 dias de gestação apresentaram cerca de 970 proteínas. O saco vitelino de 23 dias apresentou proteínas essenciais diferencialmente expressas nos estágios de desenvolvimento, como Hemogen, proteína expressa neste estagio, responsável pelo controle da proliferação e diferenciação de células hematopoiéticas; a proteína Glicoproteína-N-acetilgalactosamina 3-beta-galactosiltransferase-1, envolvida nos processos de angiogênese, trombopoiese e no desenvolvimento da homeostase nos rins; a proteína fator de transcrição Corion-especifico (GCMa) fator de transcrição necessário para o desenvolvimento da placenta. Enqueanto que o saco vitelino de 37 dias apresentou proteinas essenciais deste estágio como a apolipoproteína E (APOE) que medeia à ligação, inter-sinalização e catabolismo das partículas de lipoproteína, podendo servir como uma ligação para o receptor de LDL (apo B/E) e para receptores específicos de apo-E dos tecidos hepáticos durante a embriogênese. Estas proteinas serão de vital importância para o desenvolvimento do embrião até a formação da placenta. / The yolk sac plays an important role in embryonic development of all mammals. Its function is being studied, proving to be one of the initials of haematopoiesis. In the period when the placenta is not real yet formed during embryonic development, the yolk sac is the main source of nutrition of the embryo, providing a place for the transfer and synthesis of proteins. Proteins are molecules that govern all cellular functions and are from a chemical structurally the most complex biological molecules. The proteomics is the large-scale study of proteins in a complex biological sample. The aim of this work was make the analisys of present proteins in the yolk sac of bovine embryos by 2D-PAGE two-dimensional electrophoresis. The gels obtained from 2D-PAGE of protein samples contained in the yolk sac of 37 days of pregnancy had about 1230 proteins, and gels of samples from 23 days of pregnancy had about 970 proteins. The yolk sac of 23 days showed essential proteins differentially expressed in stages of development, as Hemogen, protein expressed in stage, responsible for controlling the proliferation and differentiation of hematopoietic cells, the protein acetylgalactosamine glycoprotein-N-3-beta-galactosyltransferase-1, involved in the process of angiogenesis, trombopoiese homeostasis and development of the kidney, the protein factor chorion-specific transcription (GCMa) transcription factor necessary for the development of the placenta. The yolk sac of 37 days showed essential proteins differentially expressed in stages of development , as apolipoprotein E (APOE), which mediates the binding, intersignaling and catabolism of lipoprotein particles, and can serve as a link to the receptor to LDL (apo B/E) and specific receptors for apo E in the liver tissue embryogenesisThese proteins are of vital importance to the development of the embryo until the formation of the placenta.

O cristalino se origina de um epitélio simples e cuboidal que recobre a vesícula óptica. Neste estádio, os filamentos de actina são distribuídos ao longo do eixo apicobasal. As células do ectoderma pré- placodal, em contato com a vesícula óptica, formam um epitélio pseudoestratificado, chamado de placóide do cristalino, com acúmulo de actina no domínio apical. Nós propusemos estudar o papel da proteína PAR3 e sua fosforilação no estabelecimento de actina apical. A superexpressão de PAR3 no placóide forma pontos ectópicos de PAR3 na membrana baso-lateral e induz o recrutamento de actina ectópica para esses pontos. O recrutamento de actina e aPKC ectópicos é independente do estado de fosforilação da treonina 833, resíduo localizado no domínio de ligação do PAR3 ao aPKC. Além disso, no ectoderma peri-placoidal, onde a actina localiza-se baso-lateralmente, PAR3 induz o recrutamento ectópico de actina apical e esse recrutamento é independente da fosforilação da treonina 833. Esses dados nos sugerem que PAR3 é suficiente para recrutar actina no placóide do cristalino. / The lens originates from a simple cuboidal epithelium that overlies the optic vesicle. At this stage, the actin filaments are distributed along its apical-basal sides. The pre-placodal ectoderm, in contact with the optic vesicle, forms a pseudostratified tissue, the lens placode, with accumulation of actin network at the apical domain. Here, we focused on the role of the polarity protein PAR3 and its phosphorylation in the establishment of this apical actin network. Overexpression of PAR3 in the lens placode, induced formation of ectopic actin clusters in the basolateral membrane of the lens placode. The formation of these actin clusters, as well as recruitment of aPKC was independent of Threonine 833 phosphorylation at the PAR3 aPKC-binding site. In addition, PAR3 induced ectopic actin networks in the apical membrane of the periplacodal ectoderm independent of the Threonine 833 phosphorylation. Taken together, these data suggest that PAR3 is sufficient for actin recruitment in the lens placode.

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: César Roberto Esper / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de maturação com roscovitina, butirolactona I, cisteamina e b-mercaptoetanol na maturação oocitária e suas conseqüências na fecundação e desenvolvimento embrionário bovino in vitro, além da variabilidade da freqüência de danos ao DNA embrionário. Oócitos foram maturados a 38,8oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199 suplementado com 0,6% BSA, 0,5 mg FSH, 100 UI hCG e 1 mg estradiol/mL (controle - C), adicionado de 50 æM de cisteamina (CC) ou 50 æM de bmercaptoetanol (CM). O grupo padrão do laboratório (S) foi suplementado com 10% de SFB como fonte protéica. Os oócitos em meio suplementado com butirolactona I ou roscovitina foram pré-maturados por 24 horas em meio TCM-199 suplementado com 0,3% BSA, antibiótico e piruvato, de acordo com os grupos: 100 æM de butirolactona I (CB), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de cisteamina (CBC), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de b-mercaptoetanol (CBM), 25 æM de roscovitina (CR), 25 æM de roscovitina + 50 æM de cisteamina (CRC) e 25 æM de roscovitina + 50 æM de b-mercaptoetanol (CRM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para gotas com meio controle para maturação por 8, 16 e 24 horas, para avaliação da maturação nuclear e citoplasmática, e dosagem da [GSHi]. A fecundação foi realizada após 24 horas do início do cultivo de maturação (grupos sem inibidores), e 20 horas (grupos com inibidores). O cultivo de desenvolvimento foi realizado em meio SOF-Modificado suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% de SFB à temperatura de 38,8ºC por 192 horas. Observou-se que a butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de maneira reversível e mais eficiente que a roscovitina, e que os antioxidantes não interferiram na retomada da maturação nuclear...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this work was to evaluate the effects of maturation media supplementation with roscovitine, butyrolactone I, cysteamine and - mercaptoethanol on oocyte maturation and the consequences on fertilization and bovine embryo development in vitro, and also DNA damage frequency in embryos. Oocytes were matured at 38.8°C under a 5% CO2 in air environment, in TCM-199 medium supplemented with 0.6% BSA, 0.5 mg FSH, 100 IU hCG and 1 mg estradiol/mL (control group - C) and with either 50 æM cysteamine (CC group) or 50 æM b-mercaptoethanol (CM group). The standard group of the laboratory (S group) was supplemented with 10% FCS as protein source. The oocytes in which groups were pre-incubated for 24 hours with butyrolactone I and roscovitine in TCM-199 medium supplemented with 0.3% BSA, antibiotic and pyruvate were culturedaccording to the groups: 100 æM butyrolactone I (CB), 100 æM butyrolactone I + 50 æM cysteamine (CBC), 100 æM butyrolactone I + 50 æM b-mercaptoethanol (CBM), 25 æM roscovitine (CR), 25 æM roscovitine + 50 æM cysteamine (CRC) and 25 æM roscovitine + 50 æM bmercaptoethanol (CRM). After the pre-incubation, the oocytes were transferred to the control maturation medium for 8, 16 and 24 hours for evaluation of nuclear and cytoplasmic maturation and [GSHi] dosage. For IVF, the oocytes were fertilized at 24 hours after the beginning of maturation (groups without inhibition), or 20 hours (groups with inhibition). Embryo culture was in SOF-Modified medium supplemented with 0.5% BSA and 2.5% FCS at 38.8ºC for 192 hours. We observed that butyrolactone I is capable of reversibly blocking meiotic maturation more effectively than roscovitine, and that addition of antioxidants did not interferewith resumption of nuclear maturation...(Complete abstract, acess undermentioned eletronic address) / Doutor

Angiogênese é a formação de novos capilares a partir de vasos pré-existentes, mediada por eventos de sinalização bioquímica que determinam proliferação, migração, diferenciação e morte celular e controlam crescimento e remodelação tecidual. A beta2-glicoproteína I (beta2GPI) é uma proteína plasmática com ação sobre a função vascular e a aterogênese. Monomêros de beta2GPI apresentam efeito anti-inflamatório e anticoagulante; a clivagem enzimática favorece sua dimerização e induz o aparecimento de efeitos opostos. Resultados anteriores mostraram que monômeros e dímeros de beta2GPI têm efeitos diferentes sobre a proliferação e a diferenciação de células endoteliais em culturas bidimensionais utilizadas como modelo de angiogênese. Os monômeros e dímeros de beta2GPI foram obtidos por purificação fracionada e caracterizada por SDS-PAGE e ELISA, como descrito. Neste trabalho, foram utilizadas culturas tridimensionais de células humanas vasculares de cordão umbilical (HUVEC) sobre Matrigel foram utilizadas para identificar efeitos de monômeros e dímeros da beta2GPI sobre a proliferação, migração e formação de estruturas de interação celular in vitro. O monômero de ?2GPI atuou como um fator de diferenciação endotelial dependente da densidade de plaqueamento, induzindo nas culturas tridimensionais de HUVECs a formação de fenótipos alongados, prolongamentos e estruturas de interação célula-célula. A fração dimérica modulou negativamente a proliferação de HUVECs. A membrana corioalantóide (CAM) de embriões de galinha foi empregada para estudar efeitos da beta2GPI sobre a angiogênese. In ovo, o dímero de beta2GPI impediu a angiogênese e induziu a morte embrionária 48h após a exposição, enquanto o monômero permitiu o desenvolvimento do embrião até o 10º dia, apesar de induzir mudanças precoces no desenvolvimento dos vasos da membrana corioalantóide. As estruturas da microvasculatura foram analisadas através de uma abordagem morfológica quantitativa, baseada na classificação de padrões binários locais (LBP). Alvos moleculares de beta2GPI relatados anteriormente foram considerados como fonte dos efeitos observados in vitro e in ovo. Os resultados obtidos suportam dados anteriores sobre a inibição da via de sinalização de anexina-2/Akt pela beta2GPI. Adicionalmente, sugere-se a via de sinalização Notch como um alvo do efeito antiangiogênico de da beta2GPI / Angiogenesis is the formation of new capillaries from pre-existing vessels, mediated by biochemical signaling events that determine proliferation, migration, differentiation and cell death, and control of tissue growth and remodeling. beta2-glycoprotein I (beta2GPI) is a plasma protein active on vascular function and atherogenesis. ?2GPI monomers present anti-inflammatory and anticoagulant effects. Enzymatic cleavage favors beta2GPI dimerization and induces the appearance of opposing effects. Previous results have shown that beta2GPI monomers and dimers induce different effects upon the proliferation and differentiation of endothelial cells in two-dimensional cultures used as an angiogenesis model. beta2GPI monomers and dimers were obtained by fractioned purification and characterized by SDS-PAGE and ELISA, as described. In this work, three-dimensional Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) cultures on Matrigel were used to investigate the effects of beta2GPI monomers and dimers upon proliferation, migration and in vitro formation of cellular interaction structures. The beta2GPI monomer performed as a density-dependent endothelial differentiation factor, inducing the formation of elongated phenotypes, membrane extensions and cell-cell interaction structures in three-dimensional HUVEC cultures; the dimeric fraction negatively modulated the proliferation and differentiation of HUVECs. The chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos was employed to study the effects of beta2GPI upon angiogenesis. In ovo, the beta2GPI dimer prevented angiogenesis and induced embryonic death after 48h exposure, while the monomer allowed embryo development up to the 10th day, despite it induced early changes in the development of chorioallantoic membrane vessels. Microvasculature structures were evaluated through a quantitative morphology approach, based on local binary pattern classification. Previously reported molecular beta2GPI targets were then considered as the source of the observed effects in vitro and in ovo. The obtained results support previous data on the inhibition of the annexin-2/Akt signaling pathway by beta2GPI. Additionally, the Notch signaling pathway is suggested as a target of the antiangiogenic effect of beta2GPI

Um dos grandes problemas que afetam a produção in vitro de embriões é a variação entre touros em relação à fertilidade e o maior nascimento de embriões do sexo masculino. Muitos fatores podem alterar a razão de 1:1 entre os gêneros tanto na produção in vitro de embriões, como no método de Inseminação Artificial. No sentido de tentar alterar esta proporção sexual in vitro, estudamos em um primeiro momento, a variação entre touros no desenvolvimento de embriões machos e fêmeas, distribuídos nas fases de blastocisto jovem, blastocisto, blastocisto expandido e blastocisto eclodido, bem como, a proporção macho: fêmea em relação a fase do blastocisto. Para tanto, oócitos foram coletados de ovários oriundos de matadouro e maturados em meio de maturação em incubadora por 24h. Espermatozóides viáveis de 17 touros do Programa de Melhoramento Genético da Raça Nelore, obtidos por centrifugação em gradiente de Percoll, foram utilizados para Fecundação in vitro. Após 12h, os supostos zigotos foram cultivados em meio de cultivo e células do cumulus em incubadora. Ao sétimo dia após a fertilização in vitro foi feita a seleção dos blastocistos viáveis que foram sexados com a utilização de primers Y-específico bovino e autossômico bovino, com visualização dos fragmentos amplificados em gel de agarose. Posteriormente, para obtenção de maior conhecimento a respeito dos animais testados, coletamos dados de progênie a campo destes animais e verificamos a proporção sexual de seus filhos nascidos pelo método da inseminação artificial, monta natural e possíveis correlações com características quantitativas. Diferenças entre touros foram observadas em relação à proporção dos sexos para as fases de blastocisto inicial e blastocisto expandido. Não foi observado desvio da proporção sexual em relação ao touro utilizado na produção in vitro de embriões e progênie a campo. Nosso dados sugerem que é possível alterar a proporção macho:fêmea em sistemas de produção in vitro de embriões pela seleção do estágio do blastocisto para transferência, e ainda, sugerem que touros apresentam variação em relação ao desenvolvimento in vitro de embriões machos e fêmeas de acordo com o estágio do blastocisto. / Some of the main problems that affect the in vitro production of embryos is the variation among bulls in relation to fertility and the greater birth of male embryos. Many factors can change the ratio 1:1 between the genders, both in the in vitro production of embryos and in the method of artificial insemination. To try to change this sex ratio in vitro, we studied at first, the variation among bulls in the development of female and male embryos, the blastocyst-stage distributed in young blastocyst, blastocyst, expanded blastocyst and hatched blastocyst and the proportion male: female in relation to the blastocyst stage. For this, oocytes were collected from slaughterhouse ovaries and matured in maturation medium in an incubator for 24h. Viable sperm from 17 bulls belonging to the Breeding Program of Nellore, obtained by Percoll gradient centrifugation were used for in vitro fertilization. After 12 hours, the presumptive zygotes were cultured in culture medium and cumulus cells in an incubator. After 168 hours of in vitro fertilization the viable embryos in the blastocyst stage were classified. The determination of the sex of the blastocysts was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) using a Y-specific sequence and bovine autosomal sequence visualized in agarose gel. Data analysis was conducted using the Statistical Analysis System software. Later, to obtain more knowledge about the animals tested, data was collected from the field progeny of these animals and established the sex ratio of the offspring produced by the method of artificial insemination, natural mating and possible correlations with quantitative traits. Differences between bulls were observed relating to the proportion of genders at the initial stages of blastocyst and expanded blastocyst. No deviation was observed in the sex ratio in relation to the bull used for in vitro production of embryos and offspring in the field. Our data suggest that it is possible to change the male to female proportion in production systems of in vitro embryos through the selection of the blastocyst stage for transfer, and also suggest that bulls show variation in relation to the in vitro development of male and female embryos, depending on the blastocyst stage.

INTRODUÇÃO: Sabe-se que as técnicas de reprodução assistida estão associadas com potenciais riscos, principalmente relacionados às gestações múltiplas, em torno de 20 a 25%, em consequência da estimulação ovariana associada à transferência de vários embriões. As gestações múltiplas apresentam maior incidência de complicações maternas e neonatais, além de aumentarem consideravelmente a proporção de partos cesarianos. Frente a esta realidade, as gestações múltiplas podem ser evitadas pela transferência eletiva de embrião único (eSET, do inglês elective Single Embryo Transfer), uma prática que vem crescendo em todo mundo. Apesar dos diversos estudos publicados, o grande desafio ainda é comprovar os benefícios da eSET aplicada corretamente, impactando na incidência das complicações sem comprometimento do sucesso do tratamento. O objetivo deste estudo foi comparar as taxas de sucesso cumulativas da transferência eletiva de até dois embriões transferidos um a um (eSET), versus a taxa de sucesso da transferência eletiva de dois embriões em um único evento (DET, do inglês Double Embryo Transfer), em casais inférteis de bom prognóstico. MÉTODOS: Estudo retrospectivo avaliou 610 casais inférteis de bom prognóstico submetidos às TRA, divididos em dois grupos: grupo SET: pacientes submetidas à transferência eletiva de um único embrião de boa qualidade e que possuíam ao menos um embrião excedente congelado (grupo SET, n=237), possibilitando uma segunda transferência eletiva de um embrião descongelado em caso de não ocorrência de gestação; e grupo DET: pacientes submetidas a transferência eletiva de dois embriões de boa qualidade e que possuíam ao menos um embrião excedente (grupo DET, n=373). RESULTADOS: As taxas de gestação clínica acumulada após a transferência de dois embriões foram semelhantes (DET: 46.6% e SET acumulado: 45,9%; p=0,898). Por outro lado, a taxa de gestação múltipla foi significantemente inferior no grupo que recebeu transferência de dois embriões um a um versus a transferência eletiva de dois embriões em um único evento (DET: 32,2% e SET acumulado: 6,1%; p < 0,001). CONCLUSÕES: A política de SET deve ser estimulada para casais de bom prognostico, já que resulta em taxas de gestação clínica acumulada semelhantes a DET, evita gestações múltiplas e consequentemente as complicações materno-fetais, levando a reduzido custo indireto do tratamento quando considera-se os gastos obstétricos e neonatais / INTRODUCTION: It is known that Assisted Reproductive Techniques are associated with potential risks, mainly related to multiple pregnancies, which are around 20 to 25% due to ovarian stimulation associated with high number of embryos transferred. Multiple pregnancies lead to higher incidence of complications for mother and newborns, as well as a significant increase in the proportion of cesarean deliveries. This way, iatrogenic multiple pregnancies can be avoided by the elective single embryo transfer (eSET), a growing practice worldwide. Despite the several published studies, adequately applied eSET, which impact on the incidence of complications without compromising treatment success, is still a challenge. The aim of this study was to compare the cumulative success rates of elective transfer of two embryos when transferred one by one (eSET), versus the success rates of elective double embryos transfer (DET) in a single procedure, in a good prognosis population. METHODS: This retrospective study evaluated 610 good prognosis infertile couples undergoing ART, split into two groups: SET group included those receiving elective single good quality embryo transfer and having at least one spared good quality embryo cryopreserved (SET group, n=237). For those who did not become pregnant, they could receive a second frozen-thawed elective embryo transfer; and DET group (n=373) who received elective transfer of two good quality embryos in the first transfer and had at least one spared good quality embryo cryopreserved. RESULTS: The accumulated clinical pregnancy outcomes after a transfer of two embryos were similar between groups (DET: 46.6% vs accumulated SET: 45.9%; p=0.898). On the other hand, the multiple pregnancy rate was significantly lower in the group receiving transfer of two embryos, one by one, compared to DET in a single procedure (DET: 32.2% vs accumulatedSET: 6.1%; p < 0.001). CONCLUSIONS: The SET policy should be stimulated for good prognosis couples, as it maintain the accumulated clinical pregnancy rates, avoid multiples pregnancies and consequently the maternal and neonates complication and indirect costs of treatment when considering obstetrics spends are reduced

O imprinting genômico é um processo epigenético essencial para o desenvolvimento normal de mamíferos com placenta e refere-se à expressão gênica alelo-específica, de acordo com a origem parental. A expressão dos genes marcados por imprinting é controlada por regiões diferencialmente metiladas (DMRs), situadas em regiões controladoras de imprinting (ICRs). O cromossomo 29 de Bos taurus possui dois domínios cromossômicos semelhantes à região 11p15.5 de humanos, que são denominados KvDMR1 (na ICR2) e H19DMR (na ICR1). Essas ICRs controlam um cluster de genes importantes para o crescimento e desenvolvimento, sendo a KvDMR1 metilada no alelo materno e a e H19DMR metilada no alelo paterno. No presente trabalho, foi verificado o padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em oócitos não maturados (Vg) e maturados in vitro (MII) e nos blastocistos inicial (Bi) e expandido (Bx) bovinos e em placentas bovinas e humanas de primeiro trimestre. Foram coletados oócitos e embriões pré-implantação no estágio de blastocisto produzidos pela técnica de Fertilização in vitro. Também foram coletados o tecido placentário e de um feto bovino de 49 dias e de uma placenta humana, com idade gestacional de 12 semanas. O DNA genômico foi extraído e modificado com bissulfito de sódio. O padrão de metilação das regiões KvDMR1 e H19DMR foi verificado por meio de clonagem e seqüenciamento do DNA modificado com bissulfito de sódio. Para as análises de expressão gênica nos oócitos e blastocistos, foi realizada a extração do RNA e em seguida o cDNA foi produzido para a quantificação relativa da expressão gênica por meio da técnica de PCR em tempo real. Os resultados de metilação para a amostra controle de espermatozóide apresentaram um perfil hipometilado para a KvDMR1 e hipermetilado para a H19DMR. Os oócitos Vg e MII mostraram um perfil hipermetilado para a KvDMR1 e nos Bi e Bx foi observado um perfil hipermetilado e hipometilado, respectivamente. Para a H19DMR, foi observado um perfil hipermetilado para as amostras Vg e MII, sendo que para os Bi foi observado um perfil hipometilado e, para os Bx, um perfil monoalélico de expressão. A expressão dos genes LIT1 e IGF2 foi relativamente baixa nas amostras analisadas, sendo que o gene LIT1 foi expresso nos mesmos níveis para todas as amostras e o IGF2 não foi expresso nos Bi e Bx. Os oócitos MII apresentaram altos níveis de expressão do IGF2 quando comparados com os oócitos Vg. Nas placentas precoces de bovinos, a porcentagem de metilação para a KvDMR1 variou entre os cotilédones de 39,6%. e 88,9%. A porcentagem de metilação para a H19DMR nos cotilédones variou entre 35,0% e 57,0% , sendo que apenas uma amostra apresentava-se completamente demetilada para esta ICR. Nas análises das vilosidades humanas, foi observado um perfil hipermetilado em todas as amostras analisadas, em que as porcentagens de metilação para a KvDMR1 e H19DMR variaram entre 84,4% e 97,9%. Os resultados mostram um perfil alterado de metilação nos oóctios MII para as duas regiões analisadas, e uma alteração nas amostras de oócitos Vg para a H19DMR. Para os blastocistos, o esperado seria um perfil monoalélico para as duas regiões, no entanto, esse resultado só foi encontrado para os Bx na H19DMR. Em bovinos, as DMRs apresentaram um funcionamento antagônico, enquanto a KvDMR1 tende a uma hipermetilação a H19DMR tende a uma hipometilação. O resultado das análises comparativas das placentas bovina e humana não sugerem uma relação do padrão de metilação dessas regiões entre essas duas espécies, no entanto, servem de base para o conhecimento do imprinting na placenta. Os estudos nos oócitos e blastocistos realizados representam um passo inicial na investigação da influencia das tecnologias de reprodução assistida no desenvolvimento embrionário, sendo o primeiro relato do funcionamento dessas DMRs nas amostras de oócitos e embriões pré-implantação bovinos. / Genomic imprinting is an epigenetic process that plays an essential role in the development of placental mammals with a parent-of-origin-specific manner of gene expression, in which only one allele is expressed. The imprinted gene expression is controlled by differentially methylated regions (DMRs), located in imprinting control regions (ICRs). In Bos Taurus, chromosome 29 presents two imprinted domains similar to human 11p15.5 region which are named KDMR1 (in the ICR2) and H19DMR (in the ICR1). Several genes that play an essential role in growth and development are under the control of the ICRs, in which the KvDMR1 is methylated on the maternal allele and the H19DMR is methylated on the paternal allele. In this study, the DNA methylation status of the KvDMR1 and H19DMR was verified in bovine non-matured germinative vesicle (GV) in vitro matured (MII) oocytes, as well in early (EA) and expanded (EX) blastocysts, and in bovine and human early placenta. The oocytes and blastocysts were collected after in vitro fertilization (IVF) techniques. Tissues from bovine placenta and fetus with 49 days of gestational age and human placenta with 12 weeks of gestational age were also collected. The DNA was extracted and modified by sodium bisulfite. The methylation pattern of KvDMR1 e H19DMR was verified by cloning and bisulfite sequencing. RNA extraction and cDNA synthesis for the relative quantification of gene expression by real time PCR were performed for oocytes and blastocysts. The methylation profile for the control sample of sperm was hypomethylated for KvDMR1 and hypermethylated for H19DMR. The GV and MII oocytes showed a hypermethylated pattern for KvDMR1 and in the EA and EX was hypermethylated and hypomethylated, respectively. The H19DMR displayed a hypermethylated pattern for GV and MII oocytes. For EA was observed a hypomethylated profile and EX presented a monoallelic expression. The LIT1 and IGF2 gene expression were low for all samples, however the LIT1 had the same level of expression in all samples while the IGF2 was not expressed in EA and EX. The MII oocytes showed high levels of IGF2 gene expression when compared with GV oocytes. The methylation levels for KvDMR1 in bovine early placenta varied between the cotyledons (39,6% and 88,9%). The percentage of methylation for H19DMR in cotyledons varied between 57.0% to 35.0%. Only one sample was not methylated for this ICR1. In human villous, a hypermethylated profile was observed for all samples, and the percentage of methylation for KvDMR1 and H19DMR varied between 84.4% e 97.9%. The results show an altered methylation profile in MII oocytes for two analysed regions and an alteration of H19DMR in GV oocytes. The expected for blastocysts was a monoallelic profile for KvDMR1 and H19DMR, however these results were observed only in EX for H19DMR. In bovine, the methylation levels of KvDMR1 and H19DMR seems to work antagonistically. While the KvDMR1 tended to hypermethylation, the ICR1 tended to a hypomethylation. The comparative analysis of bovine and human early placentas does not suggest a relationship between the methylation patterns of these regions in these two species. However, these studies provide the basis for the understanding of imprinting in the placenta. The study in oocytes and blastocysts represent an initial investigation in understanding how the assisted reproductive technologies affect the embryo growth and development, and this is the first report on the methylation patterns of KvDMR1 and H19DMR in bovine oocytes and blastocysts.