Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-15Bitstream added on 2014-08-27T15:57:17Z : No. of bitstreams: 1 000779820.pdf: 7636663 bytes, checksum: 221e2960f370d289d0928952e2d4eb9c (MD5) / É sabido que alguns patógenos podem desencadear o processo de apoptose em determinadas células do organismo, entretanto, o BHV-5 inibe a apoptose em embriões bovinos com sete dias de desenvolvimento. Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi investigar a interação vírus-embrião no mecanismo de morte celular programada. Oócitos bovinos foram divididos em dois grupos, sendo: I (controle) e II (exposto ao BHV-5). Após 24 horas de maturação in vitro, 100 oócitos de cada grupo foram desnudados e observados em microscópio invertido para verificação da extrusão do primeiro corpúsculo polar, sendo o restante dos oócitos incubados com espermatozoides, por 18 a 20 horas, para que ocorresse o processo de fertilização in vitro. Transcorrido este período, os prováveis zigotos foram desnudados e transferidos para gotas contendo meio de cultivo (mSOF), até o dia sete pós-inseminação. Os embriões produzidos in vitro foram submetidos à técnica de PCR em tempo real para pesquisa do BHV-5 e análise da transcrição dos genes Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 e Apaf-1 relacionados à apoptose, além do teste de MTT ((3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), para avaliação da atividade mitocondrial. A análise estatística para a taxa de maturação nuclear dos oócitos foi feita pelo teste de x2. A produção in vitro de embriões, MTT e transcrição gênica foi avaliada pelo teste t não pareado. Observou-se que o BHV-5 não interferiu na taxa de maturação nuclear dos oócitos e no desenvolvimento embrionário, entretanto os embriões do grupo I apresentaram maior viabilidade mitocondrial e os embriões do grupo II tiveram a expressão dos genes Bax e caspase-2 diminuídos, comprovando que o vírus inibiu o processo de morte celular programada nos embriões bovinos sete dias pósinseminação, a fim de favorecer a disseminação viral / It is known that some pathogens can initiate apoptosis in certain cells of the organism, however, BHV-5 inhibits apoptosis in bovine embryos after seven days of development. Therefore, the aim was to investigate the interaction virus-embryo in the mechanism of programmed cell death. Bovine oocytes were divided into two groups: I (control) and II (exposed to BHV-5). After 24 hours of in vitro maturation, 100 oocytes of each group were denuded and observed under inverted microscope to check the extrusion of the first polar body, and the other oocytes were incubated with spermatozoa for 18 to 20 hours, for in vitro fertilization. After this period, presumptive zygotes were denuded and transferred to drops containing culture medium (mSOF), until day seven postfertilization. In vitro produced embryos were submitted to real time PCR to evaluated the presence of BHV-5 and expression of Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 and Apaf-1 related to apoptosis, also the MTT assay ((3 - [4,5-dimethylthiazol 2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide)) was performed for the evaluation of mitochondrial activity. Statistical analysis for nuclear maturation of oocytes was performed by x2 test. In vitro embryo production, MTT and gene expression were analyzed by unpaired t test. It was observed that BHV-5 did not influence nuclear maturation rate of oocytes or embryonic development, however embryos of group I showed greater mitochondrial viability, and embryos of group II had a decrease in genes expression of Bax and caspase-2, suggesting that the virus inhibited the process of programmed cell death in bovine embryos seven days post-fertilization, in order to promote viral spread

Resumo: O objetivo do trabalho foi acompanhar os efeitos durante o resfriamento, em quatro estádios de desenvolvimento embrionário de pacu, Piaractus mesopotamicus, em dois tempos de estocagem, seis e 10 horas. Embriões em quatro estádios de desenvolvimento (blastoderme, 64 células - 1,4-horas pós-fertilização, hpf; 25% do movimento de epibolia - 5,2-hpf; fechamento do blastóporo - 8-hpf e; aparecimento da vesícula óptica - 13,3-hpf) foram expostos a uma solução crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M). A seguir, os embriões passaram por curva de resfriamento de 1°C por minuto até -8°C, onde foram mantidos nos dois períodos de estocagem. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, as taxas de eclosão dos embriões foram avaliados para cada tratamento, com seis repetições, comparando-se com o controle que não foi resfriado. O número total de larvas estimadas para as duas primeiras fases do desenvolvimento ontogenético (1,4- e 5,2- hpf) foi estatisticamente menor que nas demais fases. Entretanto, os estádios de 8 e 13,3- hpf não diferiram entre si (49,90%±6,71 e 55,24%±6,71), respectivamente, encontrando-se mais próximas ao controle (90,67%±6,56). Além disso, a permeabilidade das membranas, estimada através do diâmetro dos embriões, variou estatisticamente do controle para seis e 10 horas de estocagem, quando utilizado os estádios de 1,4 e 5,2-hpf, enquanto para os demais não houve diferença. Da mesma forma, pode-se verificar que houve correlação negativa entre o número total de larvas e o diâmetro do embrião. Sendo assim, a utilização dos estádios embrionários de 8 e 13,3-hpf são os mais recomendados para o resfriamento de embriões de pacu estocados até 10 horas, a -8°C. / Abstract: The objective of this research was to verify the effects of cooling of embryos of pacu, Piaractus mesopotamicus, in four stages of development, for two stocking periods. The stages of embryo development were: at blastoderm, ~64 cells - 1.4 hours after fertilization (haf); at 25% of the epiboly movement - 5.2 haf; at blastoporous closing - 8.0 haf; and at optical vesicle appearing - 13.3 haf. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution containing methanol (10%) and sucrose (0.5M). After that, embryos were submitted to a cooling curve (-1oC/min) until -8oC and then kept at -8oC for six or ten hours. Also, for each stage of embryo development a control group with not cooled embryos was used to compare the eclosion rates. The total number of larvae estimated for the first two stages of ontogenetic development (1.4 and 5.2-haf) was lower compared to the other stages. There was no difference for the total number of larvae between the stages 8.0 e 13.3-haf (49.90%±6.71 and 55.24%±6.71, respectively). Therefore, the utilization of the embryonary stages of 8.0 and 13.3-haf are recommended for cooling pacu embryos stored up to 10 hours at -8 ° C. / Orientadora: Elizabeth Romagosa / Coorientador: DaniloPedro Streit Junior / Banca: Luis David Solis Murgas / Banca: Sérgio Ricardo Batlouni / Mestre

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA11MA079.pdf: 1198872 bytes, checksum: 45c625202a482ee64b00347aef9f38a0 (MD5) Previous issue date: 2011-06-30 / The Flemish cattle breed, originarily from the Northeast region of France, was imported to Brazil from Argentina in 1945, being allocated to an experimental Station in Lages, State of Santa Catarina (SC). The Flemish is a double purpose breed very well adapted to the altiplane. Such features contributed to a quick dissemination of this breed in the Southern region of Brazil. However, the introduction of more specialized breeds in the past decades caused a loss of interest in the Flemish breed, resulting in a drastic reduction in the herd size, with only about fifty animals still remaining, all located at the EPAGRI Experimental Station in Lages, SC. The high risk of extinction imposed to this small herd, along with its importance to biodiversity, justifies the need for its preservation. For that, the Ovum Pick Up (OPU)/in vitro embryo production (IVP) and the multiple ovulation and embryo transfer (MOET) procedures are among the available reproductive biotechnologies that could be readily applied for the maintenance and expansion of the breed. However, data regarding the oocyte retrieval efficiency by OPU and embryo yield either by IVP or MOET for Flemish cattle are still lacking. The aim of this study was to compare the efficiency of the in vivo and in vitro embryo production systems for the Flemish breed, using Holstein females as control counterparts. Eight multiparous Flemish females and eight Holstein females were allocated to two subgroups of four animals per breed. Each subgroup was subjected to 10 OPU sessions, at weekly intervals, or two MOET protocols, for two periods of 63 days. After the conclusion of one 63-days long period of OPU and MOET sessions, both procedures were repeated in a second period of 63 days, inverting the subgroups of animals for each procedure. The OPU was performed by ultrasonography for the transvaginal aspiration of &#8805;3 mm follicles. Recovered oocytes were morphologically graded and subjected to IVP procedures, including the in vitro maturation, fertilization and culture steps, up to Day 7 of development. For the MOET subgroups, a standard decreasing FSH dose treatment was used followed by AI, with embryo recovery performed by nonsurgical procedures on Day 7 after AI. Frozen semen from the same Flemish bull was used for the entire experiment. Quantitative data were analyzed using the PROC MIXED or by the Friedman test (SAS), whereas qualitative data were analyzed by the &#967;2 test, and data on the embryonic morphology and kinetics of development by the Kruskal-Wallis test (Minitab), for P<0.05. After 20 OPU sessions per breed, a total of 635 viable oocytes were obtained from Flemish females, with 8.0 ± 0.7 oocytes/animal/section, which was significantly higher than from Holstein cows (543 viable oocytes, 7.3 ± 0.7 oocytes/animal/section). The mean number of blastocysts per IVP procedure (3.9 ± 1.5 vs. 2.1 ± 1.2) and blastocyst rates (11.8% vs. 7.2%) were higher in Flemish than in Holstein females, respectively. After four MOET sessions (total of 32 flushings), Flemish females yielded more viable embryos than Holstein animals (111 vs. 48 viable embryos, with 7.5 ± 1.8 vs. 3.7 ± 1.4 embryos/female, respectively). In conclusion, Flemish females yielded more viable oocytes by OPU and more viable embryos by IVP or MOET than Holstein females. Also, MOET procedures were more efficient than OPU/IVP for the production of embryos, irrespective of the breed. Nevertheless, both reproductive biotechnologies, OPU/IVP and MOET procedures, were efficient as useful tools for the genetic conservation of Flemish cattle / Bovinos da raça Flamenga, originários da França, chegaram ao Brasil em 1945 oriundos da Argentina, sendo alocados em Lages, no Estado de Santa Catarina. Esta raça é de dupla aptidão e que, devido à perfeita adaptação às condições edafoclimáticas regionais, acabou compondo inúmeros rebanhos na região Sul do Brasil. Porém, a introdução de raças especializadas no decorrer das últimas décadas ocasionou desinteresse pela raça Flamenga, resultando na redução drástica do rebanho, com cerca de cinqüenta animais ainda remanescentes e lotados na EPAGRI de Lages. O risco de extinção imposto a este rebanho e sua importância para a biodiversidade justificam a necessidade de sua preservação. Dentre as biotécnicas reprodutivas que podem ser utilizadas para a expansão desta raça destacam-se a Ovum Pick Up (OPU)/produção in vitro de embriões (PIV) e a produção in vivo de embriões pela múltipla ovulação, inseminação artificial (IA) e transferência de embriões (TE). Informações sobre a eficiência de recuperação de oócitos obtidos por OPU para a PIV ou mesmo de embriões produzidos por TE na raça Flamenga são praticamente inexistentes. O objetivo deste estudo foi comparar as eficiências de produção in vitro vs. in vivo de embriões da raça Flamenga, utilizando-se a raça Holandesa como controle. Oito fêmeas da raça Flamenga e oito da raça Holandesa foram subdivididas em dois subgrupos de quatro animais/raça. Cada subgrupo foi submetido a um bloco de 10 seções de OPU/PIV com intervalo semanal ou a duas seções de TE, em um intervalo de 63 dias. Passado este primeiro período de 63 dias, ambos os procedimentos (OPU/PIV e TE) foram repetidos em um segundo período de 63 dias, invertendo-se os subgrupos de animais para cada procedimento. A OPU foi realizada por ultrassonografia transvaginal para a aspiração de folículos com diâmetro acima de 3 mm. Todos os CCOs foram avaliados morfologicamente e submetidos à PIV, a qual incluiu as etapas de maturação, fecundação e cultivo in vitro até o Dia 7 de desenvolvimento. Para a TE, realizou-se protocolo padrão com doses decrescentes de FSH, seguida de IA, com recuperação de embriões realizados por procedimento não-cirúrgico no dia 7 após a inseminação. Sêmen congelado do mesmo touro da raça Flamenga foi utilizado em todo o experimento. Os dados quantitativos foram analisados pelo PROC MIXED ou pelo teste de Friedman (SAS). Os dados qualitativos foram analisados pelo teste do &#967;2, e analisou-se os dados de morfologia embrionária e cinética de desenvolvimento pelo teste de Kruskal-Wallis (Minitab), para P<0,05. Após 20 seções de OPU/raça, o número total de oócitos viáveis e a média de oócitos/animal/seção na raça Flamenga (n=635 e 8,0 ± 0,7) foram superiores à raça Holandesa (n=543 e 7,3 ± 0,7), respectivamente. O número médio de blastocistos obtidos por rotina de PIV (3,9 ± 1,5 vs. 2,1 ± 1,2) e a taxa de blastocistos pela PIV (11,8% vs. 7,2%) foram maiores para fêmeas da raça Flamenga se comparadas a fêmeas da raça Holandesa, respectivamente. Após quatro seções de TE (32 coletas/recoletas totais), produziram-se 111 embriões viáveis na raça Flamenga, com média de 7,5 ± 1,8 embriões/fêmea, sendo superior à raça Holandesa, a qual obteve um total de 48 estruturas viáveis, com média de 3,7 ± 1,4 embriões viáveis/fêmea. Desta maneira, conclui-se que as fêmeas Flamengas forneceram mais oócitos viáveis por OPU e mais embriões viáveis por PIV ou TE do que fêmeas Holandesas. Além disso, o procedimento de TE apresentou maior eficiência que a OPU/PIV para a produção de embriões, independente da raça. Contudo, ambas as biotécnicas se mostraram eficazes como ferramentas úteis para a conservação genética de animais da raça Flamenga

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Dennys Eduardo Werlichl.pdf: 510119 bytes, checksum: aac5246620094e985b2b81198a4a18fb (MD5) Previous issue date: 2005-12-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to determine the viability of bovine IVP expanded blastocysts (Bx) submitted to four different cryoprotectant solutions (Experiment 1) and two cooling rate speeds (Experiment 2), and vitrified in OPS. Hatching rate was considered as viability parameter. In the first experiment (12 replications), IVP Bx (n=720) were randomly allocated in to groups: Group I (20% EG + 20% DMSO), Group II (25% EG + 25% GLY), Group III (7,0M EG), Group IV (20% EG + 20% PRO) and Group V (control not vitrified). After 72 hours of culture, the hatching rate of control group (84.0%) was higher (P<0.05) than that observed with the vitrified experimental groups. There were no differences among hatching rates observed in Groups I (53.5%), and IV (52.8%), and both were higher than Groups II (38.9%) and III (38.9%). In the second experiment (5 replications) 244 Bx were randomly exposed to EG+DMSO (GI and GII) or EG+PRO (GIII and GIV) solutions in order to evaluate the use of super-cooled liquid nitrogen by vacuum submission. There were no differences among the hatching rates of embryos vitrified with super-cooled (GII = 50.2%; GIV = 54.0%) or normal nitrogen (GI = 50.1%; GIII = 56.0%), independently of the solutions. In conclusion, the EG+DMSO and EG+PRO solution are similar in promoting IVP Bx survival, after vitrification, and they are more efficient than the EG+GLY and EG solutions. The use of super cooled liquid nitrogen does not improve embryo survival after vitrification. / Com o objetivo de determinar a viabilidade de blastocistos expandidos (Bx) bovinos produzidos in vitro (PIV) e vitrificados em OPS, dois experimentos avaliaram o efeito de quatro soluções crioprotetoras e duas velocidades de resfriamento. A taxa de eclosão foi utilizada como parâmetro de viabilidade. No primeiro experimento, 720 Bx (12 repetições) foram aleatoriamente distribuídos em 5 grupos: Grupo I (20% EG + 20% DMSO), Grupo II (25% de EG + 25% de GLI), Grupo III (7,0M EG), Grupo IV (20% de EG + 20% de PRO) e Grupo V (controle não vitrificado). A taxa de eclosão do grupo controle (84%) foi superior (P<0,05) aos grupos vitrificados. Não houve diferença nas taxas de eclosão dos grupos I (53,5%) e IV (52,8%), que foram superiores aos grupos II (38,9%) e III (38,9%). No segundo experimento avaliou-se o uso de nitrogênio líquido super-resfriado por ação de vácuo. Utilizou-se 244 Bx (5 repetições), aleatoriamente distribuídos, usando as soluções EG+DMSO (GI e GII) e EG+PRO (GIII e GIV). Não foram observadas diferenças entre as taxas de eclosão dos embriões vitrificados com nitrogênio super-resfriado (GII = 50,2%; GIV = 54,0%) ou nitrogênio normal (GI = 50,1%; GIII = 56,0%), independente da solução empregada. Conclui-se que a solução EG+DMSO e EG+PRO possibilitam taxas de eclosão similares e são mais eficientes que as soluções EG+GLI e EG. O emprego do nitrogênio superresfriado pelo vácuo não proporciona aumento da viabilidade de blastocistos bovinos PIV vitrificados em OPS.

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão da meiose, com progressão do estádio de Vesícula Germinativa (GV) da Prófase I até a Metáfase II (MII), e inclui todos os eventos necessários para que o oócito expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Para avaliarmos a eficiência da maturação in vitro (MIV), utilizamos oócitos classificados em viáveis (graus I, II e III) e inviáveis (atrésico e desnudo), e acompanhamos a progressão nuclear e a distribuição dos grânulos corticais (GC) como indício de maturação citoplasmática, após MIV em TCM 199 com soro fetal bovino, hormônios, antibiótico e piruvato, por 24h em 5% de CO2 em ar. Maturação nuclear (78,4-87,8%) e citoplasmática (GC periféricos; 67,2-79,3%) foram semelhantes entre as diferentes classes de oócitos e apresentaramse como eventos independentes. Para o acompanhamento dos eventos desencadeados pelo espermatozóide, avaliamos a dinâmica nuclear e de microtúbulos, em intervalos de 2h, após fecundação in vitro (FIV), em meio TALP com heparina, PHE e sêmen preparado em gradiente de Percoll. Observamos que o estádio de MII foi predominante de 2 a 8h; MII e Anáfase/Telófase (A/T) predominaram às 10h; MII, A/T e estádio pronuclear (PN) de 14 a 16h; e PN a partir de 18h. A penetração do espermatozóide ocorreu após 4h da inseminação dos oócitos; a diferenciação dos PN 14 masculino e feminino pelo tamanho foi possível de 14 a 18h e a singamia ocorreu a partir de 24h. O período de 10h pode ser suficiente para que a FIV seja efetiva em oócitos bovinos, nas condições aqui descritas. / Abstract: We aimed to evaluate events involved in in vitro maturation, fertilization and development, and parthenogenetic activation of bovine oocytes assessed by nuclear-cytoplasmic interaction and gene expression. Oocyte morphological selection did not affect nuclear maturation (78.4-87.8%) and cytoplasmic cortical granule distribution (67.2-79.3%). Following nuclear and microtubular dynamics after fertilization (IVF), we observed sperm penetration 4h after insemination; male and female pronuclei differentiation by size from 14 to 18h; syngamy after 24h; and sufficient co-incubation of spermatozoa and oocytes for 10h. Pronuclear transfer to study the interaction between nucleus (N) and cytoplasm (C) in parthenogenetic embryos produced by ionomycin followed by strontium (S) or 6-DMAP (D) was assessed by cleavage, eight-cell, and blastocyst development rates: CSND (76.5, 36.4, and 6.8%) and CDNS (69.5, 25.0, and 4.9%). S cytoplasm promoted dominant effect on D nucleus. Higher rates of developmental arrest up to the eight-cell stage were observed by the combination of cytoplasm and nucleus produced by the two different activation treatments. We recovered parthenogenetic D fetuses on Day 35, which were small but normal in formation and in appearance of chorio-alantoic membranes. Genomic imprinting of IGF2 was observed, but XIST was maternally expressed in extra-embryonic tissues. In vitro culture promoted higher expression of IGF2 and H19 genes and also increased IGF2/IGF2r ratio in IVF embryos compared to in vivo produced ones. / Doutor

Orientador: Laura Satiko Okada Nakaghi / Banca: Hugo Pereira Godinho / Banca: Alexandre Ninhaus Silveira / Resumo: O Astronotus ocellatus é originário da Bacia Amazônica, climatizado e disseminado, desde 1938, em açudes e rios do Nordeste brasileiro, pelo Departamento Nacional de Obras Contra as Secas. Trata-se de um peixe de grande potencial, devido a características adequadas para pesca esportiva, cultivado como ornamental e com uma carne saborosa e apreciada pela população do Norte e Nordeste do Brasil. Existem na literatura atual poucos estudos a respeito da biologia reprodutiva dessa espécie. Embora seja de desova parcelada e se reproduza bem em cativeiro, estudos de reprodução artificial têm suma importância para diversas pesquisas de biologia e desenvolvimento embrionário, cujos eventos devem ser acompanhados numa faixa de tempo conhecida e assim contribuir para uma melhor compreensão do cultivo, manejo e controle da espécie. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a resposta do Astronotus ocellatus a aplicação de dois hormônios estimuladores de reprodução (gonadodropina coriônica humana - HCG e extrato de hipófise de carpa - EHC) e estudar a estrutura, ultraestrutura e morfometria de seus ovos e larvas. Foram utilizados 16 casais de reprodutores pertencentes ao Centro de Aqüicultura da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal (SP) e quatro desovas ocorridas naturalmente nos viveiros. Observouse que cinco das dezesseis fêmeas responderam ao estímulo hormonal, sendo três com HCG e duas com EHC. Dos machos, apenas um respondeu positivamente ao HCG. O acará-açu possui ovos demersais, adesivos, pouco resistentes ao tato, de formato ovóide pouco acentuado. "In vivo" apresentaram coloração amarelada, quando fertilizados, e branca opaca, quando não fertilizados, com grande esfera vitelina e pequeno espaço perivitelino. As desovas apresentaram ovos com valores médios variando de 1,75±0,056 a ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Astronotus ocellatus is a fish from the Amazon Basin, adapted and widely reared since 1938 in ponds and rivers of Brazilian northeast region by the Departamento Nacional de Obras Contra as Secas. This fish has a great potential due to appropriate characteristics for sporting fishing, reared as ornamental and owning a very tasty meat being appreciate by the people in north and northeast regions of Brazil. Despite having all these adjectives for aquaculture there are a few studies about reproductive biology of this species. Although spawning does not occur at once and reproduction in captivity is well successful, studies about artificial reproduction are extremely important for several researches in biology and early embryonic development of which events must be followed in a known lack of time and like this to contribute for a better understanding of rear conditions, management and control of the species. Therefore, this present research aimed to assess the Astronotus ocellatus responses to administration of two kinds of reproductive hormones (Human Chorionic Gonadotropin - HCG and carp hypophysis extract - CHE) and studying the structure, ultrastructure and morphometry of its eggs and larvae. Sixteen couples from Centro de Aqüicultura of Universidade Estadual Paulista, Campus of Jaboticabal (SP) and four spawnings occurred naturally in ponds were also catched. Five of sixteen females responded to hormonal stimuli, three of them with HCG and two with CHE. In relation to males, only one responded favorably to HCG. Acará-açu females have demersal and adhesive eggs, somewhat resistant to the touch, discreet egg shape-like, yellowish colour "in vivo" and when fertilized and white opalescent without fertilization, with a large vitelline sphere and a small space between yolk and chorion. The spawnings presented eggs with average values of 1,75±0,056 ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Helena Lage Ferreira / Banca: Vera Claúdia Magalhães Curci / Banca: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Resumo: É sabido que alguns patógenos podem desencadear o processo de apoptose em determinadas células do organismo, entretanto, o BHV-5 inibe a apoptose em embriões bovinos com sete dias de desenvolvimento. Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi investigar a interação vírus-embrião no mecanismo de morte celular programada. Oócitos bovinos foram divididos em dois grupos, sendo: I (controle) e II (exposto ao BHV-5). Após 24 horas de maturação in vitro, 100 oócitos de cada grupo foram desnudados e observados em microscópio invertido para verificação da extrusão do primeiro corpúsculo polar, sendo o restante dos oócitos incubados com espermatozoides, por 18 a 20 horas, para que ocorresse o processo de fertilização in vitro. Transcorrido este período, os prováveis zigotos foram desnudados e transferidos para gotas contendo meio de cultivo (mSOF), até o dia sete pós-inseminação. Os embriões produzidos in vitro foram submetidos à técnica de PCR em tempo real para pesquisa do BHV-5 e análise da transcrição dos genes Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 e Apaf-1 relacionados à apoptose, além do teste de MTT ((3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), para avaliação da atividade mitocondrial. A análise estatística para a taxa de maturação nuclear dos oócitos foi feita pelo teste de x2. A produção in vitro de embriões, MTT e transcrição gênica foi avaliada pelo teste t não pareado. Observou-se que o BHV-5 não interferiu na taxa de maturação nuclear dos oócitos e no desenvolvimento embrionário, entretanto os embriões do grupo I apresentaram maior viabilidade mitocondrial e os embriões do grupo II tiveram a expressão dos genes Bax e caspase-2 diminuídos, comprovando que o vírus inibiu o processo de morte celular programada nos embriões bovinos sete dias pósinseminação, a fim de favorecer a disseminação viral / Abstract: It is known that some pathogens can initiate apoptosis in certain cells of the organism, however, BHV-5 inhibits apoptosis in bovine embryos after seven days of development. Therefore, the aim was to investigate the interaction virus-embryo in the mechanism of programmed cell death. Bovine oocytes were divided into two groups: I (control) and II (exposed to BHV-5). After 24 hours of in vitro maturation, 100 oocytes of each group were denuded and observed under inverted microscope to check the extrusion of the first polar body, and the other oocytes were incubated with spermatozoa for 18 to 20 hours, for in vitro fertilization. After this period, presumptive zygotes were denuded and transferred to drops containing culture medium (mSOF), until day seven postfertilization. In vitro produced embryos were submitted to real time PCR to evaluated the presence of BHV-5 and expression of Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 and Apaf-1 related to apoptosis, also the MTT assay ((3 - [4,5-dimethylthiazol 2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide)) was performed for the evaluation of mitochondrial activity. Statistical analysis for nuclear maturation of oocytes was performed by x2 test. In vitro embryo production, MTT and gene expression were analyzed by unpaired t test. It was observed that BHV-5 did not influence nuclear maturation rate of oocytes or embryonic development, however embryos of group I showed greater mitochondrial viability, and embryos of group II had a decrease in genes expression of Bax and caspase-2, suggesting that the virus inhibited the process of programmed cell death in bovine embryos seven days post-fertilization, in order to promote viral spread / Doutor

Alterações morfogênicas do aparelho cardiorespiratório de bovinos provenientes de fecundação in vitro e transferência nuclear são um dos principais fatores responsáveis pela alta incidência de mortalidade embrionária, fetal e pós-natal. Utilizamos técnicas empregadas em microscopia de luz para estudar o desenvolvimento do coração e pulmão nestes animais. Verificamos que em embriões provenientes de fecundação in vitro, aos 28 dias de gestação, aparece o tubo laringotraqueal e sua septação através da prega traqueoesofágica. Neste mesmo período os embriões apresentaram cavidade pericárdica, átrio dividido em direito e esquerdo, cone cardíaco, seio venoso, camada de miocárdio e epicárdio. O brônquio traqueal foi observado em embriões com idade gestacional de 36 dias a partir de um brotamento na porção lateral direita da traquéia, cranial a sua bifurcação. Aos 44 dias de gestação os brotos pulmonares dos embriões apresentaram brônquios principais originando brotamentos de brônquios segmentares. O mesênquima de sustentação em diferenciação continha vasos sangüíneos dispersos, diferentemente de embriões provenientes de TN, que com 68 dias de gestação apresentou pulmão em fase pseudoglandular contendo brotos de bronquíolos e poucos vasos sangüíneos nos cortes obtidos e analisados. Com 70 dias, o coração do feto apresentava ventrículo significativamente grande, pequeno átrio e pulmão não desenvolvido. A partir dos nossos resultados, concluímos que alterações genéticas, incompletas informações e comunicações celulares e modificação no metabolismo celular são os prováveis responsáveis pelas anomalias presentes nas técnicas de manipulação de embrião, causando um desenvolvimento mais lento e falho quando comparados com embriões in vivo, explicando o alto índice de perda gestacional / Morphogenetic changes of cardio-respiratory system of bovine from in vitro fertilization and nuclear transfer is a major factor responsible for high incidence of both periods embryonic, fetal and postnatal mortality. We used techniques of light microscopy to study the development of heart and lung in these animals. We found that in embryos derived from in vitro fertilization, at 28 days of gestation, appears the laryngotracheal tube and its fold through tracheoesophageal septation. In the same period the embryos showed pericardial cavity, atrium divided into left and right, cardiac cone, venous sinus, layer of myocardium and epicardium. In embryos with 36 days of gestational age was observed the tracheal bronchus from a bud in the right lateral portion of the trachea, cranial to its bifurcation. At 44 days of gestation, the lung buds of the embryos showed main bronchi giving rise to budding of segmental bronchi. The sustentation mesenchyme in differentiation contained scattered blood vessels, unlike embryos from TN, which with 68 days of gestation showed lung in pseudoglandular stage, containing bronchioles buds and few blood vessels in histological sections obtained and analyzed. With 70 days, the fetal heart ventricle had significantly large, small atrium and lungs not developed. From our results we conclude that genetic alterations, incomplete information in cellular communications and change in cellular metabolism are likely responsible for the anomalies in the techniques of embryo manipulation, causing a slower and flawed development when compared to embryos in vivo, explaining the high rate of pregnancy loss

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-08-11T13:50:55Z No. of bitstreams: 1 Bartira Pastor Andrade Sousa.pdf: 687607 bytes, checksum: 33d9827ebaf5d1b383b9c07059174be5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-11T13:50:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bartira Pastor Andrade Sousa.pdf: 687607 bytes, checksum: 33d9827ebaf5d1b383b9c07059174be5 (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / The aim of the present study was to assess the in vitro and in vivo viability of sperm cells following the addition of diluent in the refrigeration process of sheep semen and the fertilization of oocytes following the insemination of superovulated ewes. In Experiment I, three ejaculates from each of three Dorper breeders were used, collected with an artificial vagina during three repetitions with three-day intervals. The macroscopic and microscopic characteristics of the semen were analyzed before and after the pooling, analyzing sperm concentration, DNA integrity and acrosome integrity as well. The pooled semen was divided into five equal parts. Dilution was performed (1:3, semen:diluent) to establish the diluent groups: Equimix (DI), Laiciphos Green Ovine (DII), FR 4 (DIII), Equimix-Yolk [Equimix with 20% egg yolk (DIV)] and Tris-Yolk (DV; control). Each group was subdivided in quadruplicate, refrigerated and kept at 4 °C until the evaluations (MIP, vigor, DNA integrity and acrosome integrity), corresponding to 0, 12, 24, 36 and 48 hours. In the in vitro assessments, DI exhibited the greatest drop in MIP at 12 h in comparison to the other groups (p<0.05). At 24 h, DII, DIV and DV exhibited the highest MIP (p<0.05), with no significant differences between one another (p>0.05). At 48 h, DII and DV were superior to the other groups (p<0.05). Regarding vigor, DII and DV had higher values (p<0.05) than DI and DIII at 12 hours and DIV had the highest values at 24 hours (p<0.05). In all groups, there was total preservation of DNA integrity and a high number of spermatozoids with intact acrosomes for all the intervals studied. In Experiment II, the same collection method and processing of the ejaculates from the three Dorper breeders were performed. A pool was formed of the threeejaculates of each animal, divided into two equal parts at a 1:3 proportion in order to establish the experimental groups: Equimix-Yolk (DI) and Tris-Yolk (DII; control). Each group was subdivided into two aliquots: fresh – F (F-DI and F-DII), which was used immediately; and refrigerated – R (R-DI and R-DII), which was kept at 4 °C for a storage time of 24 hours. Laparoscopic inseminations were preformed with an inseminate volume of 0.25 mL per uterine horn, which was when the ovary evaluations were performed. Thirty-nine embryo harvesting procedures were performed, 19 using refrigerated semen and (R-DI and R-DII) and 20 using fresh semen (F-DI and F-DII). In the in vivo test, a general rate of 71.0% (237/334) of fertilized structures was obtained, 59.3% (198/334) of which were viable embryos. There was no significant variation (p>0.05) between the types of semen and diluents. Among the total number of embryos, 86.4% exhibited quality Grades I and II, with the refrigerated semen of R-DI obtaining the best percentage (100%)(p<0.05). The ovarian status at the time of insemination affected fertilization, as better results were obtained for the fresh semen of F-DI when the ovary was ovulating. For F-DII, this status exhibited a smaller number of fertilized structures (p<0.05). At the end of the experiments, it was concluded that both the Laiciphos Green Ovine and Tris-Yolk can be used in the conservation of semen at 4 °C for 48 hours, whereas Equimix added with 20% egg yolk is recommended for use in semen storage (4 °C) of up to 24 hours. The refrigeration of ovine semen at 4 °C for 24 hours is viable for use inembryo transference programs. Equimix added with 20% egg yolk resulted in a fertilization rate and embryo quality similar to the traditional Tris-Yolk. / Neste estudo objetivou-se avaliar a viabilidade in vitro e in vivo das células espermáticas após a adição de diluente no processo de refrigeração do sêmen ovino, e na fertilização de oócitos após inseminação de fêmeas ovinas superovuladas. No Experimento I foram utilizados três ejaculados de cada um dos três reprodutores Dorper, coletados com vagina artificial a intervalo de 3 dias, em três repetições. As características macro e microscópicas do sêmen foram analisadas antes e após a formação de um pool, além da concentração espermática, integridade do DNA e do acrossoma. O pool foi dividido em cinco partes iguais, procedeu-se com a diluição (1:3, sêmen:diluente) para constituir os respectivos grupos de diluentes: Equimix (DI), Laiciphos Green Ovine (DII), FR 4 (DIII), Equimix-Gema – Equimix com 20% gema de ovo (DIV) e Tris-Gema (DV; controle). Cada grupo foi subdividido em quadruplicata, refrigerado e mantido a 4 °C até as avaliações (MIP, vigor, integridade do DNA e do acrossoma) correspondendo a 0, 12, 24, 36 e 48 horas. Nas avaliações in vitro do sêmen o DI apresentou maior queda de MIP às 12 h em relação aos demais grupos (p<0,05). Às 24 h os grupos DII, DIV e DV apresentaram a melhor MIP (p<0,05), não divergindo (p>0,05) entre si, enquanto que às 48 h o DII e o DV foram superiores (p<0.05) aos demais. Com relação ao vigor, os grupos DII e o DV apresentaram valores superiores (p<0,05) ao DI e DIII a partir das 12 horas e ao DIV a partir das 24 horas (p<0,05). Em todos os grupos de diluentes houve a preservação total da integridade do DNA e alto índice de espermatozóides com acrossoma intacto, para todos os intervalos avaliados.Para o Experimento II foi utilizada a mesma técnica para colheita e processamento dos ejaculados de três reprodutores Dorper. Formou-se um pool com três ejaculados de cada animal, dividiu-se em duas partes iguais diluídas na proporção 1:3 para constituir os respectivos grupos experimentais: Equimix-Gema (DI) e Tris-Gema (DII; controle). Cada grupo foi subdividido em outras duas alíquotas: fresco – F (F-DI e F-DII), que foi usado imediatamente, e refrigerado – R (R-DI e R-DII), mantido a 4 °C por 24 horas de armazenamento. Foram realizadas inseminações laparoscópicas, com volume inseminante de 0,25 mL por corno uterino, momento em que foram realizadas as avaliações dos ovários. Foram realizados 39 procedimentos de colheitas de embriões, em 19 foram utilizados sêmen refrigerado (R-DI e R-DII) e em 20 sêmen fresco (F-DI e F-DII). No teste in vivo obteve-se uma taxa geral de estruturas fertilizadas de 71,0% (237/334), sendo 59,3% (198/334) de embriões viáveis, o que não variou significativamente (p>0,05) entre os tipos de sêmen e de diluentes. No total dos embriões, 86,4% apresentaram qualidade de grau I e II, sendo o sêmen refrigerado do R-DI o de melhor percentual (100%) (p<0,05). O “status” ovariano no momento da inseminação interferiu na fertilização, observado-se melhores resultados para o sêmen fresco do F-DI quando o ovário se encontrava em ovulação. Para o F-DII, este status foi o que apresentou menor quantidade de estruturas fertilizadas (p<0,05). Ao final dos experimentos pode-se concluir que: o diluente Laiciphos Green Ovine, da mesma forma que o Tris-gema, pode ser utilizado na conservação do sêmen a 4 °C por 48 horas; enquanto o Equimix, acrescido de 20% de gema de ovo, recomenda-se que seja utilizado no armazenamento do sêmen (4 °C) por até 24 horas. É viável a refrigeração do sêmen ovino a 4°C por 24 horas para a utilização em programas de transferência de embriões; e que o diluidor Equimix, acrescido de 20% gema de ovo, resultou em taxa de fertilização e qualidade embrionária similares ao tradicional Tris-Gema.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-21T12:27:30Z No. of bitstreams: 1 Paula Fernanda Barbosa Araujo Lemos.pdf: 3078966 bytes, checksum: 8a115f68bff79f88ab9763ce148e7321 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-21T12:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula Fernanda Barbosa Araujo Lemos.pdf: 3078966 bytes, checksum: 8a115f68bff79f88ab9763ce148e7321 (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The possibility of using a practical, fast and effective protocol for embryo cryopreservation such as glazing, may stimulate the application of the technique associated with embryo transfer by a larger number of teams at field level. However, it is necessary to develop specific protocols that result in increased embryonic viability. The objective of this study was to identify the damage caused by cryopreservation, assessing the morphological and ultrastructural feasibility of goat and sheep embryos undergoing cryopreservation of classic and vi trification in OPS (Open Pulled Straw). In experiment 1, embryos (N = 246) were obtained from superovulated Boer goats. The embryos were randomly divided into three groups: control group (n = 75) - freezing the classic method, DMSO group (n = 74) - vitrification and Group DF (n = 74) - vitrification. Embryos in the classic metod group were frozen using automatic freezing. Before freezing the embryos were left five minutes in the stabilizing solution of Ethylene glycol (EG). The embryos of the second group were placed in a DMSO solution containing 10% EG and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% DMSO +0.5 sucrose. The embryos ofthe third group were placed in a balanced so lution containing 10% EG and 10% Dimethylformamide (DF) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% sucrose +0.5 DF. In experiment 2, sheep embryos (N = 186) were obtained from superovulated Santa Ines ewes. The embryos were randomly divided into three groups: control group (n = 55) - freezing the classic method, DMSO group (n = 54) - vitrification and Group DF (n = 55) - vitrification. Embryos in the classic metod group were frozen using automatic freezing. Before freezing the embryos were left five minutes in the stabilizing solution of Ethylene glycol (EG). The embryos of the second group were placed in a DMSO solution containing 10% EG and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% DMSO+0.5 sucrose. The embryos of group three were placed in a balanced solution containin g 10% EG and 10% Dimethylformamide (DF) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% sucrose +0.5 DF. The embryos were evaluated by analysis of embryonic viability by the use of fluorescent probes, in this case propidium iodide and Hoechst 33342 Results indicate that in goat embryos, the control group maintained most of its viable cells after thawing with 33 33% of samples injured. Of embryos in the DMSO group, 26.66% had totally damaged cells. The DF group had 60% of samples with lesions. The ultrastructural study by transmission electron microscopy showed that the vitrified embryos had a greater preservation of cells. The vitrified embryos with DMSO had higher rates of in vitro survival (47.36%), followd by embryos glazed with the DF with a lower in vitro survival rate (31.58%), and lastly embryos frozen by the traditional method (25%). In sheep embryos found in theanalysis by fluorescent probe, cells in t he control group remained viable in all embryos analyzed, a similar result occurred with the DF group, where 80% of samples were deemed feasible, other than the DMSO group, which had 50% viability. The ultrastructural study showed that the findings were similar between the control and DF groups. Embryos vitrified with DF had higher rates of in vitro survival (53.33%) and in vivo (45%), the glazed with DMSO had an in vitro survival rate (26.66%) and in vivo (30%) and embryos frozen by the traditional method (33.33%) in vitro and (40%) in vivo. It can be concluded that the vitrification solution containing 20% ethylene glycol + 20% dimethylsulfoxide + 0.5 M sucrose is an effective method for cryopreservation of goat embryos produced in vivo. However, in sheep embryos, the combination of 20% ethylene glycol + 20% dimethylformamide + 0.5 M sucrose was the best cryoprotectant regarding embryo viability, demonstrating to cause less damage to thecytoskeleton and cell organelles, and presenting a satisfactory pregnancy rate. / A possibilidade de utilizar um protocolo de criopreservação prático, rápido e eficaz, como a vitrificação, estimularia a aplicação da técnica associada à transferência de embriões por um maior número de equipes em nível de campo. Porém, faz-se necessário o desenvolvimento de protocolos específicos que resultem no incremento da viabilidade embrionária. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação, avaliando a viabilidade morfológica e ultra-estrutural de embriões caprinos e ovinos submetidos a criopreservação pelo método clássico e pela vitrificação em OPS (Open Pulled Straw). No experimento 1, os embriões (N=246) foram obtidos de cabras da raça Boer superovuladas. Os embriões foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Grupo Controle (n= 75) - congelação pelo método clássico, Grupo DMSO (n= 74) – vitrificação e Grupo DF(n= 74) – vitrificação. Os embriões destinados ao congelamento clássico foram congelados utilizando congelador automático de embriões. Antes da congelação os embriões ficaram cinco minutos estabilizando nasolução de Etilenoglicol (EG). Os embriões do grupo DMSO foram equilibrados em solução de 10% de EG e 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20%DMSO +0,5 sacarose. Os embriões do grupo DF foram equilibrados em solução de 10% de EG e 10% de Dimetilformamida (DF) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DF+0,5 sacarose. No experimento 2, os embriões ovinos (N=186) foram obtidos de ovelhas da raça Santa Inês superovuladas. Os embriões foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Grupo Controle (n= 55) - congelação pelo método clássico, Grupo DMSO (n=54) – vitrificação e Grupo DF (n= 55) – vitrificação. Os embriões destinados ao congelamento clássico foram congelados utilizando congelador automático de embriões. Antes da congelação os embriões ficaram cinco minutos estabilizando na solução de Etilenoglicol (EG). Os embriões do grupo DMSO foram equilibrados em solução de 10% de EG e10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DMSO+0,5 sacarose. Os embriões do grupo DF foram equilibrados emsolução de 10% de EG e 10% de Dimetilformamida (DF) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DF+0,5 sacarose. Os embriões foram avaliados por meio da análise da viabilidade embrionária pelo uso de sondas fluorescentes, utilizou-se Iodeto de Propídeo e Hoechst 33342, verificou-se nos embriões caprinos, que o grupo controle mantiveram grande parte das suas células integras após o descongelamento, 33,33% das amostras apresentaram-se lesionadas. Os embriões do grupo DMSO analisados, 26,66% estavam com suas células totalmente danificadas. O grupo DF apresentou 60% das amostras com lesões. O estudo ultra-estrutural por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou que os embriões vitrificados revelaram uma maior preservação das células. Os embriões vitrificados com DMSO tiveram maiores taxas de sobrevivência in vitro (47,36%), os vitrificados com DF tiveram uma taxa de sobrevivência in vitro (31,58%), os congelados pelo métodoclássico obtiveram in vitro (25%). Nos embriões ovinos verificamos na análise por sonda fluorescente, que as células do grupo controle mantiveram viáveis em todos os embriões analisados, resultado semelhante ocorreu com o grupo DF, onde 80% das amostram foram consideradas viáveis, diferente do grupo DMSO, que tiveram 50% de viabilidade. O estudo ultra-estrutural demonstrou que os achados foram semelhantes entre os grupos controle e DF. Os embriões vitrificados com DF tiveram maiores taxas de sobrevivência in vitro (53,33%) e in vivo (45%), os vitrificados com DMSO tiveram uma taxa de sobrevivência in vitro (26,66%) e in vivo (30%) e os congelados pelo método clássico obtiveram (33,33%) in vitro e (40%) in vivo. Podemos concluir que, a solução de vitrificação contendo 20% de etilenoglicol + 20% de dimetilsulfóxido + 0,5M sacarose é um método eficiente para a vitrificação de embriões caprinosproduzidos in vivo. Entretanto em embriões ovinos, a associação de 20% de etilenoglicol + 20% de dimetilformamida + 0,5M de sacarose, foi o crioprotetor que apresentou melhor viabilidade embrionária, demonstrando causar menos lesões ao citoesqueleto e as organelas celulares, como isso apresentando um índice de gestação satisfatório.