Submitted by Maicon Juliano Schmidt (maicons) on 2015-04-28T17:49:44Z No. of bitstreams: 1 Cíntia Pavani Motta Rocha.pdf: 2143957 bytes, checksum: a39c6afb16de8c40eab2fc47d70b93cb (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-28T17:49:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cíntia Pavani Motta Rocha.pdf: 2143957 bytes, checksum: a39c6afb16de8c40eab2fc47d70b93cb (MD5) Previous issue date: 2013-10-30 / UNISINOS - Universidade do Vale do Rio dos Sinos / O modelo atual da sociedade que interfere diretamente no Direito, leva a reflexões à respeito de como o poder se estabelece em relação à vida humana. Para esta análise busca-se desenvolver uma abordagem a partir dos conceitos de biopolítica e biopoder, adequando-os a realidade jurídica brasileira. A Ação Direta de Inconstitucionalidade n.º 3510, que colocou em pauta o uso de células-tronco embrionárias humanas para pesquisa, foi escolhida para demostrar como os poderes são exercidos e legitimados pela ação humana. Caberá demostrar como o Direito surge como um dispositivo legitimador do poder normatizador. O conflito existente entre o que pode ser considerado vida humana ou mera vida são debatidos ao longo do presente trabalho, que destaca a importância da compreensão do ser para a determinação do que pode ou não ser considerado como ser humano. E, além disso, pretende-se compreender como esses conceitos passam a fazer parte da sociedade e diretamente influenciando as decisões judiciais no país. / The current model of society that interferes directly in the law, leads to reflections about how the power is drawn in relation to human life. For this analysis we sought to develop an approach based on the concepts of biopolitics and biopower in brazilian legal reality. The Direct Action of Unconstitutionality nº. 3510, which put in question the use of human embryonic stem cell research, was chosen to demonstrate how the powers are exercised and legitimized by human action. It will be demonstrate how law arises as a legitimating device of normalizing power. The conflict between what can be considered human life or mere life are discussed throughout this work, which highlights the importance of understanding the being to determine what may or may not be considered as a human being. And furthermore, how these concepts become part of society and directly influencing judicial decisions in the country.

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-25. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:55:02Z : No. of bitstreams: 1 000858340.pdf: 1640939 bytes, checksum: fc02bd8ed0c9991ee8bbed594e41a5a7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Esta pesquisa pretendeu estabelecer estratégias para aumentar a eficiência da produção in vitro de embriões (PIVE) bubalinos. Neste contexto, avaliou a eficiência de protocolos de sincronização de doadoras de oócitos bubalinas visando aumentar a disponibilidade e qualidade dos oócitos obtidos pela aspiração folicular guiada por ultrassom (OPU) e o efeito da fonte de obtenção dos oócitos sobre a quantidade e qualidade dos mesmos. Além disso, analisou-se o efeito do fotoperíodo sobre a quantidade e qualidade do oócitos disponíveis, além da competência destes expressos pelas taxas de PIVE. Por fim, avaliou-se o efeito da adição do óleo essencial de Lippia origanoides (OELO) nas concentrações de 2,5; 5,0 e 10μg/mL, no meio de maturação in vitro (MIV) sobre as taxas de maturação oocitária, qualidade embrionária e PIVE em bovinos e bubalinos. Ovários e oócitos de animais não protocolados, protocolados por aspiração prévia dos folículos e protocolados com uso de hormônios esteróides e gonadotróficos, foram avaliados ultrassonograficamente e de acordo com a qualidade dos oócitos recolhidos por OPU. Demonstrou-se não haver variação na população folicular, no número e na qualidade dos oócitos recuperados por sessão, exceto uma redução dos folículos e oócitos Grau A foi notada quando o ciclo estral foi sincronizado por aspiração prévia dos folículos(p<0,05). Em relação a fonte de obtenção, para todos parâmetros avaliados, foi notada superioridade quando oócitos são recuperados de ovários de frigorífico(p<0,05). A qualidade dos oócitos recolhidos por OPU e a PIVE bubalinos foi influenciada pelo fotoperíodo na região estudada, elevando-se durante os meses de baixa luminosidade(p<0,05), fato não observado em bovinos. Por fim, a partir de avaliações da cromatina com DAPI, encontrou-se uma elevação da taxa de maturação nuclear em bovinos quando utilizou-se concentrações de... / This study aimed to develop strategies to increase the efficiency of buffalo in vitro embryo production (IVEP). In this context, we evaluated the efficiency of synchronization protocols on buffalo oocyte donor aimed at increasing the availability and quality of oocytes obtained by ovum pick-up (OPU) and the effect of the source of obtaining oocytes on the quantity and quality. In addition, we analyzed the effect of photoperiod on the quantity and quality of oocytes available on ovary, beyond the competence of those expressed by the blastocyst rate. Finally, we evaluate the effect of essential oil of Lippia origanoides (EOLO) added at concentrations of 2.5, 5.0 and 10μg/ml, on in vitro maturation (IVM) media over oocyte maturation rate, embryo quality and IVEP on cattle and buffalo. Ovaries and oocytes of animals without protocol, protocol by prior aspiration of follicles and protocol with use of steroids and gonadotropic hormones were evaluated by ultrasonography and according to the of oocyte quality. It was demonstrated not vary the follicular population, number and quality of oocytes retrieved per session between the protocols but a reduction of follicles and Grade A oocytes was noted when the follicles were aspirated previously OPU. Regarding the oocyte source (live animals and abattoir ovaries), all evaluated parameters showed superiority when oocytes were derived from abattoir ovaries. The quality of oocytes collected by OPU and IVEP buffaloes was influenced by photoperiod in the region studied, increased when daylight decreases, which was not observed in cattle. Finally, from evaluations of chromatin stained with DAPI, it was found that bovine nuclear maturation rate increased when used concentrations of 2,5μg/ml EOLO. The quality of oocytes, expressed by cell number, increased when used concentrations of 2.5 and 5μg/ml of EOLO in buffaloes. Although it has not changed the blastocyst rate of PIVE in both species, the EOLO has ...

Orientador: Marco Antonio Alvarenga / Resumo: A administração de antiinflamatórios não esteroides (AINEs) no momento da transferência de embrião em éguas é empregada usualmente para conter a inflamação uterina e produção de prostaglandina F2α (PGF2α), na tentativa de evitar a luteólise. No entanto, estes fármacos podem prejudicar a produção de prostaglandinas pelo concepto e alterar o mecanismo de mobilidade embrionária e reconhecimento materno fetal. Nesse estudo foi avaliada a ação do flunixin meglumine (FM) em um grande número de receptoras de embrião (n=409) em um centro comercial de reprodução equina, verificando estatisticamente a ação deste medicamento na taxa de prenhez e perda gestacional precoce. Os animais foram divididos em dois grupos (FM e controle), recebendo uma única aplicação de FM na dose de 1,1mg/kg imediatamente após a transferência de embrião em éguas alternadas para correta randomização. A taxa de prenhez aos 15 dias do grupo controle foi de 70,95% e a do grupo tratado 75,22%, sem diferença entre os grupos (p=0,3337). Aos 60 dias o grupo controle apresentou taxa de prenhez de 65,22% e o grupo tratado de 65,92%, sem diferença estatística (p>0,05). No entanto, foi observado que a perda embrionária até 60 dias do grupo controle foi 5,03% e no grupo tratado 10,0%, havendo tendência (p=0,0578) para perda gestacional precoce. Em um segundo experimento, AINEs de outras categorias como COX-2 seletivo: firocoxibe e COX-2 preferencial: Meloxicam foram determinados a fim de tentar estabelecer um tratamento an... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2011 / Bibliografia: f. 134-140 / Em 24 de Março de 2005, foi aprovada pelo poder Legislativo e promulgada pelo então Presidente, Luís Inácio "Lula" da Silva, a Lei nº. 11.105/2005, que ficou conhecida como a Lei de Biossegurança Brasileira. Embora tratasse de regulamentar a produção, man / El 24 de marzo de 2005, fue aprobado por el Poder Legislativo y promulgada por el presidente Luís Inácio "Lula" da Silva, la Ley nº. 11.105/2005, que se conoce como la Ley de Bioseguridad de Brasil. Aunque se trata de reglamentar la producción, manipulaci

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2016-04-28T18:31:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Carlos Renato de Freitas Guaitolini.pdf: 792984 bytes, checksum: 55b49c255f7a7e0cb47a61520b8b1901 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-06-06T12:42:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Carlos Renato de Freitas Guaitolini.pdf: 792984 bytes, checksum: 55b49c255f7a7e0cb47a61520b8b1901 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T12:42:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Carlos Renato de Freitas Guaitolini.pdf: 792984 bytes, checksum: 55b49c255f7a7e0cb47a61520b8b1901 (MD5) / O aumento da demanda em reprodução assistida de cães, bem como a crescente preocupação com a preservação de espécies ameaçadas de extinção têm impulsionado as pesquisas com reprodução canina, e o uso do cão como modelo experimental, em muitos casos, é um modelo mais relevante que os tradicionalmente utilizados para humanos. Além disso, a criopreservação de embriões caninos ainda é um desafio para a comunidade científica. Objetivou-se com este estudo avaliar as taxas de reexpansão da blastocele, taxas de eclosão, a viabilidade embrionária pós-descongelação e o desenvolvimento in vitro de blastocistos caninos criopreservados em glicerol 10% (GLI) e em etilenoglicol 1,5M (EG), por congelação lenta. Foram recuperadas 72 estruturas embrionárias e um total de 125 corpos lúteos foram identificados nos ovários, perfazendo uma taxa de recuperação embrionária de 57,6%. As concentrações plasmáticas de progesterona foram de 4,57±3,77 ng/mL no dia 0 (primeira cópula ou inseminação artificial) e 28,56±3,21 ng/mL no dia 12 (dia da colheita dos embriões). Cinquenta e um blastocistos foram separados aleatoriamente em dois grupos, GLI (n=26) e EG (n=25). Cada grupo foi subdividido em três (M0 = avaliação imediatamente após a descongelação, GLI = 9 e EG = 9; M3 = avaliação três dias após a descongelação e cultivo in vitro, GLI = 8 e EG = 8; e M6 = avaliação seis dias após a descongelação e cultivo in vitro, GLI = 9 e EG = 8). A criopreservação dos embriões foi realizada em máquina de congelação programável, em curva de resfriamento decrescente de 0,6°C até a temperatura de -35°C. Imediatamente após a descongelação, os embriões do M0 foram corados com a associação das sondas fluorescentes iodeto de propídeo (125 μg/ml) e Hoechst 33342 (1mg/ml) para avaliação da viabilidade celular; os embriões do M3 e M6 foram descongelados, cultivados in vitro em estufa com umidade saturada e atmosfera de 5% de CO2 em ar a uma temperatura de 38,5ºC, em meio SOFaa acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), por três e seis dias, respectivamente, e corados de forma similar. A taxa de reexpansão da blastocele após 24h de cultivo in vitro não diferiu (P = 0,6196) entre os grupos GLI (76,5%) e EG (68,8%), respectivamente. Não foi observada eclosão embrionária em ambos os grupos. As taxas de viabilidade embrionária pós-descongelação dos grupos GLI e EG foram de 60,6±9,7 e 64,4±9,9, respectivamente, e não diferiram (P = 0, 8275). Além disso, não foi verificada diferença (P = 0, 3105) na viabilidade embrionária entre os momentos M0 (61,1±11,6%), M3 (50,0±12,4%) e M6 (76,4±12,0%). Conclui-se que a taxa de reexpansão da blastocele pode ser um indicativo de viabilidade embrionária pós-descongelação; que não há eclosão de blastocistos caninos criopreservados em glicerol 10% ou etilenoglicol 1,5M por congelação lenta e cultivados in vitro em meio SOFaa por até 6 dias; que blastocistos caninos criopreservados em glicerol 10% ou etilenoglicol 1,5M, por congelação lenta, apresentam viabilidade similar pós-descongelação e mantêm-se viáveis por até seis dias em cultivo in vitro. / The raising necessity of assisted reproduction technology in dogs, as well as the increasing deep concern for preservation of endangered species has urged the research with canine species, and the use of the dog as an experimental model, in many cases, is a more relevant model than the traditionally used for human-being. Moreover, canine embryo cryopreservation is still a challenge for the scientific community. The aim of this study was to evaluate the blastocoele re-expansion rates, hatching rates, post-thawing embryonic viability and the in vitro development of canine blastocysts cryopreserved in glycerol 10% and ethylene glycol 1.5M, by slow freezing. A total of 72 embryonic structures were recovered and 125 corpora lutea were identified, performing an embryonic recovery rate of 57.6%. Plasmatic progesterone concentrations were 4.57±3.77 ng/ml on day 0 (first mating or artificial insemination) and 28.56±3.21 ng/mL on day 12 (embryo collection day). Fifty-one blastocysts were randomly allocated into two groups, GLY (n=26) and EG (n=25). Each group was subdivided into three subgroups (M0 = embryonic evaluation immediately after thawing, GLY = 9 and EG = 9; M3 = embryonic evaluation three days after thawing and in vitro culture, GLY = 8 and EG = 8; and M6 = embryonic evaluation six days after thawing and in vitro culture, GLY = 9 and EG = 8). For embryo cryopreservation, a programmable freezer was used, with a cooling-rate curve of 0.6°C/min, until -35°C. Immediately after thawing, embryos from M0 were stained with the association of the probes propidium iodide (125 μg/ml) and Hoechst 33342 (1mg/ml) for cellular viability evaluation; embryos from M3 and M6 were thawed and transferred to synthetic oviduct fluid (SOF) + 10% FCS. Dishes were incubated at 38.5ºC under an atmosphere of 5% CO2 with maximum humidity, for three and six days, respectively, and similar stained. Blastocoele re-expansion rates after 24h of in vitro culture did not differ (P = 0.6196) between GLY (76.5%) and EG (68.8%), respectively. No embryonic hatching was observed in both groups. Post-thawing embryonic viability rates were 60.6±9.7 and 64.4±9.9 for GLY and EG, respectively, without significant difference (P = 0. 8275). In addition, there was no significant difference among moments M0 (61.1±11.6%), M3 (50.0±12.4%) and M6 (76.4±12.0%) for embryonic viability. The present study indicates that blastocoele re-expansion serves as an indicator of post-thawing embryonic viability; that canine blastocysts cryopreserved in glycerol 10% or ethylene glycol 1.5M by slow freezing and cultured in SOFaa medium for 6 days do not hatch in vitro; that canine blastocysts cryopreserved in glycerol 10% or ethylene glycol 1.5M by slow freezing present similar post-thawing viability, and remain viable for up to six days on in vitro culture.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Epigenetic programming is the main mechanism regulating cell function and gene expression, through the activation or repression of transcriptional activity. In addition, epigenetics is closely related to reproductive events such as cell reprogramming and embryo development. In the first study, the effects of the germinal vesicle (GV) oocyte extract alone, or in combination with the deacetylase inhibitor Scriptaid, on porcine somatic cell reprogramming were evaluated. The formation of stem cell-like colonies were observed approximately two weeks after treatment with oocyte extract or oocyte extract plus Scriptaid. The colony number, at the time of appearance and after 48 hours, was similar between treatments. Partial activation of pluripotent, chromatin modifying and DNA methylating genes such as Ezh2 and Dnmt1, was observed three days after the oocyte extract treatment. However, the mRNA expression levels of the previous genes were similar to the control 15 days after treatment. This data suggest that GV oocyte extract is able to induce limited reprogramming in porcine fibroblasts, seen here by the partial activation of these genes. In the second study, brahmarelated gene-1 (BRG1), a cofactor and activator of chromatin modifications, and lysine demethylase 1A (Kdm1A), a repressor of gene expression, were characterized during porcine embryo development. Kdm1A is involved in the demethylation of both mono- and dimethylations, H3K4me and H3K4me2, respectively, on lysine 4 of histone 3. Firstly, we observed that proteins for both factors (BRG1 and Kdm1A) were absent in the nuclei of metaphase II oocytes, however, the proportion of nuclear localization increased on day 3-4 of embryo development. This time point coincides with the embryonic genome activation (EGA) in swine. Furthermore, using a well-established model of embryo developmental competence, based on time of first cleavage, it was verified that these factors were regulated during embryo development and are correlated with mRNA expression of other demethylases and H3K4me and H3K4me2 levels during EGA. It was also observed that BRG1 and Kdm1A levels are correlated with embryo cell numbers during EGA. These data suggest that BRG1 and Kdm1A participate in the regulation of H3K4 methylation during embryonic genome activation, and consequently, embryo development in swine. / A epigenética tem se destacado como a principal moduladora das funções celulares e reguladora da expressão gênica, seja pela ativação ou repressão da atividade transcricional. Além disso, a epigenética está relacionada diretamente a processos reprodutivos como a reprogramação celular e o desenvolvimento embrionário. Em um primeiro estudo, foi avaliado o efeito do extrato de oócitos em vesícula germinativa (VG), isoladamente, ou em associação com o inibidor de deacetilase, Scriptaid, sobre o potencial de reprogramação celular em células somáticas suínas. Foi observada a formação de colônias semelhantes à células-tronco pluripotentes aproximadamente duas semanas após o tratamento com o extrato de oócitos ou extrato de oócitos associado ao Scriptaid. O número de colônias, no dia de aparecimento e 48 horas após esse período, foi semelhante entre as células tratadas somente com o extrato de oócitos ou em associação com Scriptaid. Foi observada ainda a ativação parcial de genes de pluripotência celular e de genes reguladores de modificações de cromatina e de metilação de DNA, como o Ezh2 e o Dnmt1, três dias após o tratamento com extrato de oócitos. No entanto, 15 dias após o tratamento, esses níveis retornaram aos níveis do controle. Esses dados sugerem que o extrato de oócitos em estádio de VG é capaz de induzir uma reprogramação parcial nos fibroblastos suínos, caracterizada pela indução parcial de pluripotência e modulação de modificadores epigenéticos. Em um segundo estudo, foram caracterizados o co-fator ativador e remodelador de cromatina (BRG1), e a lisina demetilase 1 A (KDM1A), durante o desenvolvimento embrionário de suínos. A KDM1A atua na desmetilação da mono e dimetilação da lisina 4 da histona 3 (H3K4m3 e H3K4me2, respectivamente). Primeiramente, foi verificado que as proteínas desses fatores não estão presentes no núcleo de oócitos no estádio de metáfase II, porém estão presentes no núcleo da maioria dos embriões durante os dias 3-4 do desenvolvimento embrionário, o que coincide com o momento da ativação do genoma embrionário (EGA), na espécie suína. Além disso, utilizando um modelo de alta e baixa competência para o desenvolvimento, foi verificado que a expressão de RNAm desses fatores são regulados durante o desenvolvimento embrionário e estão correlacionados com a expressão de RNAm de outras enzimas demetilases de lisinas e com níveis de metilação da H3K4me e H3K4me2 durante a EGA. Observou-se ainda que os níveis proteicos dos fatores BRG1 e KDM1A parecem ter relação com o numero de células por embrião durante a EGA. Esses dados sugerem que esses fatores podem apresentar um envolvimento na regulação da H3K4 durante a ativação do genoma e consequente no desenvolvimento embrionário.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-15Bitstream added on 2014-06-13T18:46:17Z : No. of bitstreams: 1 lucio_ac_dr_jabo.pdf: 8403632 bytes, checksum: 32d25390bda4a085595ac038827009d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente estudo foi verificar se existem diferenças no desenvolvimento de embriões produzidos com sêmen sexado por centrifugação em gradiente de densidade e por citometria de fluxo e também quantificar a expressão relativa de genes importantes para o desenvolvimento embrionário. Após a sexagem os espermatozóides foram submetidos a produção de embriões in vitro. Foram avaliadas as taxas de clivagem e blastocisto para verificar a influência do método de sexagem no desenvolvimento in vitro de embriões. Os blastocistos foram coletados nos dias 7 e 8 de desenvolvimento, e submetidos a extração de RNA para a avaliação da expressão de genes relacionados a qualidade do embrião: AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8 (desenvolvimento de placenta e reconhecimento da gestação), MnSOD e GPX1 (estresse oxidativo), SCL2A1 (metabolismo) e TP53 (apoptose). Os resultados não mostraram diferenças no desenvolvimento in vitro de embriões (taxas de clivagem e blastocisto) produzidos com sêmen sexado. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo reduz os níveis de mRNA dos genes AKR1B1(P=0,023), COX2 (P=0,016). A centrifugação em gradiente de densidade aumentou os níveis de transcritos dos genes PLAC8 (P=0,007), MnSOD (P=0,013) e GLUT1 (P=0,028). Ambas as técnicas reduzem os níveis de expressão do gene TP53 (P<0,05). A técnica de sexagem por citometria de fluxo altera a expressão de genes envolvidos no processo de implantação, prejudicando o nascimento de uma cria viável. A sexagem produz embriões que não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação e formação da placenta, os quais são muito importantes para o processo de implantação; aumenta o padrão de expressão dos genes envolvidos no processo de resposta da célula ao estresse... / The purpose of this work was evaluate differences on development of embryos produced in vitro using sorted semen by density gradient centrifugation and flow cytometry, and differences in relative abundance of important genes for embryo development. Cleavage and blastocyst rates were used to evaluate the influence of the sorting procedure on embryo development. Blastocysts of day 7 and 8 of development were collected, and expression levels quantification AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8, MnSOD, GPX1, SCL2A1 and TP53, genes related to embryo quality were evaluated. The results showed no differences between the experimental groups in terms of embryo development (cleavage and blastocyst rates). In the expression pattern, flow citometry methodology reduced mRNA abundance of AKR1B1 (P=0.023) and COX2 (P=0.016). Density gradient centrifugation increased the transcripts levels of PLAC8 (P=0.007), MnSOD (P=0.013) and GLUT1 (P=0.028). Both sorting process reduced mRNA of TP53 (P<0.05). Flow citometry affects the expression pattern of genes involved in pregnancy recognition and placenta formation, resulting in poor quality embryo. Density gradient centrifugation methodology do not alter the expression of genes involved in embryo implantation, increases the expression pattern of genes related to oxidative response and metabolism, resulting in viable embryos. These results suggesting that density gradient centrifugation can be an alternative to flow citometry, for produce viable embryos

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:46:32Z : No. of bitstreams: 1 perecin_f_dr_jabo.pdf: 591625 bytes, checksum: f3212bddc59577b0aa73b9d7ef9f1d91 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A clonagem por transferência de núcleo é freqüentemente associada a resultados insatisfatórios devido à reprogramação nuclear anormal da célula somática doadora de núcleo e à expressão gênica alterada. O primeiro objetivo deste trabalho foi estudar a freqüência dos RNAs mensageiros das DNA metiltransferases (DNMT) 1, 3A e 3B, e do gene de expressão constitutiva gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) em blastocistos bovinos isolados produzidos in vivo e in vitro por transferência nuclear (TN) de célula somática, ativação partenogenética e fertilização in vitro (FIV). O segundo objetivo foi avaliar a expressão das DNMTs e dos genes imprinted IGF2, IGF2R e H19 em membranas cório-alantóide e fetos bovinos produzidos in vivo e in vitro por TN, ativação partenogenética e FIV e recuperados entre os dias 33 e 36 de gestação. Houve decréscimo (P<0,05) na freqüência do GAPDH nos blastocistos TN e partenogenéticos quando comparados aos embriões fertilizados, e também diferença entre blastocistos TN produzidos com diferentes protocolos de sincronização celular (células em G0 ou G1 do ciclo celular). Com relação às DNMTs, não foram identificados transcritos da DNMT1 nos blastocistos do grupo TN-G0; ocorreu diminuição na freqüência dos transcritos da DNMT3B nos embriões TN quando comparados aos partenotos. Não se observou diferença na freqüência relativa das DNA metiltransferases em membranas cório-alantóide e fetos. Com relação aos genes imprinted, o grupo partenogenético apresentou menor nível de expressão de IGF2 em relação aos os demais grupos; baixos níveis de expressão de IGF2 e IGF2R foram observados, respectivamente, em amostras de feto e de cório-alantóide derivadas de animais clonados por TN, quando comparadas aos grupos fertilizados in vivo e in vitro. / Cloning by nuclear transfer is often associated with poor results due to abnormal nuclear reprogramming of somatic cell donor and altered gene expression. The first objective of this study was to evaluate the frequency of DNA methyltranferases (DNMT) 1, 3A and 3B, and the housekeeping glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNAs in single bovine blastocysts produced in vivo or in vitro by somatic cell nuclear transfer (SCNT), parthenogenetic activation and in vitro fertilization (IVF). The second objective was to evaluate the expression of DNMTs and imprinted genes IGF2, IGF2R and H19 in chorio-alantois membrane of bovine fetuses produced in vivo or in vitro by SCNT, parthenogenetic activation and IVF, and recovered between days 33 and 36 of gestation. There was strong GAPDH downregulation (P<0.05) in parthenogenetic and cloned by SCNT blastocysts when compared to fertilized ones, and also differences between cloned blastocysts produced with different cell synchronization (G0 or G1) protocol. Regarding DNMTs expression, we did not identify DNMT1 transcrips in SCNT-G0 derived blastocysts, and observed DNMT3B downregulation in SCNT-derived embryos when compared to parthenotes. No differences in DNA methyltransferase relative frequency were seen in chorio-alantois membrane and fetuses. Regarding imprinted genes expression, downregulation of IGF2 in the parthenogenetic group was observed in comparision to all other groups, and also, downregulation of IGF2 and IGF2R in the cloned-derived fetuses and chorio-alantois samples, respectively, were observed comparing to in vivo and in vitro fertilized groups.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-19Bitstream added on 2014-06-13T19:24:36Z : No. of bitstreams: 1 niciura_scm_dr_jabo.pdf: 1029270 bytes, checksum: 8a93cc4207fdb3426be68df4fa064ef9 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão da meiose, com progressão do estádio de Vesícula Germinativa (GV) da Prófase I até a Metáfase II (MII), e inclui todos os eventos necessários para que o oócito expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Para avaliarmos a eficiência da maturação in vitro (MIV), utilizamos oócitos classificados em viáveis (graus I, II e III) e inviáveis (atrésico e desnudo), e acompanhamos a progressão nuclear e a distribuição dos grânulos corticais (GC) como indício de maturação citoplasmática, após MIV em TCM 199 com soro fetal bovino, hormônios, antibiótico e piruvato, por 24h em 5% de CO2 em ar. Maturação nuclear (78,4-87,8%) e citoplasmática (GC periféricos; 67,2-79,3%) foram semelhantes entre as diferentes classes de oócitos e apresentaramse como eventos independentes. Para o acompanhamento dos eventos desencadeados pelo espermatozóide, avaliamos a dinâmica nuclear e de microtúbulos, em intervalos de 2h, após fecundação in vitro (FIV), em meio TALP com heparina, PHE e sêmen preparado em gradiente de Percoll. Observamos que o estádio de MII foi predominante de 2 a 8h; MII e Anáfase/Telófase (A/T) predominaram às 10h; MII, A/T e estádio pronuclear (PN) de 14 a 16h; e PN a partir de 18h. A penetração do espermatozóide ocorreu após 4h da inseminação dos oócitos; a diferenciação dos PN 14 masculino e feminino pelo tamanho foi possível de 14 a 18h e a singamia ocorreu a partir de 24h. O período de 10h pode ser suficiente para que a FIV seja efetiva em oócitos bovinos, nas condições aqui descritas. / We aimed to evaluate events involved in in vitro maturation, fertilization and development, and parthenogenetic activation of bovine oocytes assessed by nuclear-cytoplasmic interaction and gene expression. Oocyte morphological selection did not affect nuclear maturation (78.4-87.8%) and cytoplasmic cortical granule distribution (67.2-79.3%). Following nuclear and microtubular dynamics after fertilization (IVF), we observed sperm penetration 4h after insemination; male and female pronuclei differentiation by size from 14 to 18h; syngamy after 24h; and sufficient co-incubation of spermatozoa and oocytes for 10h. Pronuclear transfer to study the interaction between nucleus (N) and cytoplasm (C) in parthenogenetic embryos produced by ionomycin followed by strontium (S) or 6-DMAP (D) was assessed by cleavage, eight-cell, and blastocyst development rates: CSND (76.5, 36.4, and 6.8%) and CDNS (69.5, 25.0, and 4.9%). S cytoplasm promoted dominant effect on D nucleus. Higher rates of developmental arrest up to the eight-cell stage were observed by the combination of cytoplasm and nucleus produced by the two different activation treatments. We recovered parthenogenetic D fetuses on Day 35, which were small but normal in formation and in appearance of chorio-alantoic membranes. Genomic imprinting of IGF2 was observed, but XIST was maternally expressed in extra-embryonic tissues. In vitro culture promoted higher expression of IGF2 and H19 genes and also increased IGF2/IGF2r ratio in IVF embryos compared to in vivo produced ones.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:46:13Z : No. of bitstreams: 1 barretto_lss_dr_jabo.pdf: 796760 bytes, checksum: 1b897563a911eb0bb996aa629ab300d1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de maturação com roscovitina, butirolactona I, cisteamina e b-mercaptoetanol na maturação oocitária e suas conseqüências na fecundação e desenvolvimento embrionário bovino in vitro, além da variabilidade da freqüência de danos ao DNA embrionário. Oócitos foram maturados a 38,8oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199 suplementado com 0,6% BSA, 0,5 mg FSH, 100 UI hCG e 1 mg estradiol/mL (controle - C), adicionado de 50 æM de cisteamina (CC) ou 50 æM de bmercaptoetanol (CM). O grupo padrão do laboratório (S) foi suplementado com 10% de SFB como fonte protéica. Os oócitos em meio suplementado com butirolactona I ou roscovitina foram pré-maturados por 24 horas em meio TCM-199 suplementado com 0,3% BSA, antibiótico e piruvato, de acordo com os grupos: 100 æM de butirolactona I (CB), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de cisteamina (CBC), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de b-mercaptoetanol (CBM), 25 æM de roscovitina (CR), 25 æM de roscovitina + 50 æM de cisteamina (CRC) e 25 æM de roscovitina + 50 æM de b-mercaptoetanol (CRM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para gotas com meio controle para maturação por 8, 16 e 24 horas, para avaliação da maturação nuclear e citoplasmática, e dosagem da [GSHi]. A fecundação foi realizada após 24 horas do início do cultivo de maturação (grupos sem inibidores), e 20 horas (grupos com inibidores). O cultivo de desenvolvimento foi realizado em meio SOF-Modificado suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% de SFB à temperatura de 38,8ºC por 192 horas. Observou-se que a butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de maneira reversível e mais eficiente que a roscovitina, e que os antioxidantes não interferiram na retomada da maturação nuclear... / The aim of this work was to evaluate the effects of maturation media supplementation with roscovitine, butyrolactone I, cysteamine and - mercaptoethanol on oocyte maturation and the consequences on fertilization and bovine embryo development in vitro, and also DNA damage frequency in embryos. Oocytes were matured at 38.8°C under a 5% CO2 in air environment, in TCM-199 medium supplemented with 0.6% BSA, 0.5 mg FSH, 100 IU hCG and 1 mg estradiol/mL (control group - C) and with either 50 æM cysteamine (CC group) or 50 æM b-mercaptoethanol (CM group). The standard group of the laboratory (S group) was supplemented with 10% FCS as protein source. The oocytes in which groups were pre-incubated for 24 hours with butyrolactone I and roscovitine in TCM-199 medium supplemented with 0.3% BSA, antibiotic and pyruvate were culturedaccording to the groups: 100 æM butyrolactone I (CB), 100 æM butyrolactone I + 50 æM cysteamine (CBC), 100 æM butyrolactone I + 50 æM b-mercaptoethanol (CBM), 25 æM roscovitine (CR), 25 æM roscovitine + 50 æM cysteamine (CRC) and 25 æM roscovitine + 50 æM bmercaptoethanol (CRM). After the pre-incubation, the oocytes were transferred to the control maturation medium for 8, 16 and 24 hours for evaluation of nuclear and cytoplasmic maturation and [GSHi] dosage. For IVF, the oocytes were fertilized at 24 hours after the beginning of maturation (groups without inhibition), or 20 hours (groups with inhibition). Embryo culture was in SOF-Modified medium supplemented with 0.5% BSA and 2.5% FCS at 38.8ºC for 192 hours. We observed that butyrolactone I is capable of reversibly blocking meiotic maturation more effectively than roscovitine, and that addition of antioxidants did not interferewith resumption of nuclear maturation...(Complete abstract, acess undermentioned eletronic address)