Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-05-03T13:11:41Z No. of bitstreams: 1 AndreMV_TESE.pdf: 15675614 bytes, checksum: fe55971bec8a35c1310c8ede4fbbf2f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-05-04T16:04:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AndreMV_TESE.pdf: 15675614 bytes, checksum: fe55971bec8a35c1310c8ede4fbbf2f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-05-04T16:04:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AndreMV_TESE.pdf: 15675614 bytes, checksum: fe55971bec8a35c1310c8ede4fbbf2f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T16:05:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreMV_TESE.pdf: 15675614 bytes, checksum: fe55971bec8a35c1310c8ede4fbbf2f5 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The gestation period, the characteristics of the reproductive cycle, including the selection of the influence of the male effect, the description of the female reproductive system, placentation, embryonic and fetal development – added of the morphometric analysis - and the expression of sulfated glycosaminoglycans (GAGs) in the reproductive and placental organs were the ways to contribute with the conservation of the species. For this, 45 non-pregnant females were used in the following experiments: 15 females were distributed in three experimental groups, followed by the addition of one male in each group, so that after the copulation and fertilization the females were separeted in accordance with the compatible dates of begining (days 5, 10 and 15), middle (days 20, 25, 30 and 35) and end (days 40, 45, 50 and 55) of gestation. This condition was obtained to obtain fragments of gestational sacs, placentas and organs of the female reproductive system, which were fixed in 4% paraformaldehyde and submitted to light microscopy techniques. The samples fixed in glutaraldehyde were performed in scanning and transmission electron microscopy techniques. In addition, prozima was used for GAG extraction, followed by agarose gel electrophoresis and subsequent quantification by densitometry. The second experiment consisted of the use of five females, housed in a room that contained a male to monitor the duration of gestation. The third experiment aimed to characterize the estrous cycle in a group containing five females plus one male, which was found trapped in a cage and another five, in a box exempt from the latter. The fourth experiment was performed by means of the morphometric analysis of embryos with 20, 25, 30 and 35 days plus fetuses on days 40, 45, 50, 55, 60 and newborns. The results revealed the presence of an incomplete double uterus, formed by two horns, a septate body and a cervix. The organs of the reproductive system presented macroscopic and histological characteristics similar to those reported for other rodents. The duration of gestation showed an average of 59 ± 2,7487 days and the sexual cycle was classified as continuous polystyric, with a mean period of 14.8 ± 0.73 days for females submitted to the male effect and 14.6 ± 0.75 days for those of the other group. In addition, the male presence significantly influenced (D <0.05) the duration of the diestrus, making it longer. The yolk sac inversion occurred on the 14th day of gestation and the visceral endoderm was placed in apposition to the uterine tissues. The chorioallantoic placenta presented a discoidal shape and had well defined regions of spongiotrophoblast, labyrinth and subplacenta from the intermediate gestation. Embryonic development was similar to that observed in histricognatis rodents, being the transition to the fetal phase, occurring at 40 days of gestation. Morphometric data allowed the establishment of correlations with gestational age. Dermatan sulfate was the predominant GAG in samples of uterine tubes, vaginas and placentas, whereas heparam expressed more in the body of the uterus at the beginning of gestation. There were also high concentrations of GAGs in the pregnant uterus and still in the reproductive system in the estrogenic phase when compared to the diestrus. It is concluded that the reproductive events presented characteristics of the species correlated with others of the order Rodentia, fact that indicates a set of evolutionary strategies related to its maintenance / O período de gestação, características do ciclo reprodutivo, incluindo verificação da influência do efeito macho, descrição do sistema reprodutor feminino, placentação, desenvolvimento embrionário e fetal – acrescido de análises morfométricas - e expressão dos glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados nos órgãos reprodutivos e placentários foram caracterizados em fêmeas de preás como forma de contribuir para a conservação da espécie. Para tanto, utilizaram-se 45 fêmeas não gestantes nos seguintes experimentos: 15 fêmeas foram distribuídas em três grupos experimentais, seguido da adição de um macho em cada grupo de modo que após a cópula e fecundação, as fêmeas eram separadas segundo datas compatíveis com início (dias cinco, 10 e 15), meio (dias 20, 25, 30 e 35) e fim (dias 40, 45, 50 e 55) da gestação. Tal condição visou à obtenção de fragmentos dos sacos gestacionais, placentas e órgãos do sistema reprodutor feminino, os quais foram fixados em paraformaldeído 4% e submetidos às técnicas de microscopia de luz. As amostras fixadas em glutaraldeído foram destinadas à realização de técnicas de microscopia eletrônica de varredura e transmissão. Além disto, usou-se a prozima para extração dos GAGs, seguida da eletroforese em gel de agarose e posterior quantificação por densitometria. O segundo experimento consistiu na utilização de cinco fêmeas, alocadas em recinto que continha um macho para o acompanhamento da duração da gestação. O terceiro experimento objetivou a caracterização do ciclo estral em um grupo contendo cinco fêmeas mais um macho, o qual encontrou-se preso em gaiola e outras cinco, em box isento deste último. O quarto experimento foi realizado por meio da análise morfométrica de embriões com 20, 25, 30 e 35 dias além de fetos nos dias 40, 45, 50, 55, 60 e recém-nascidos. Os resultados revelaram a presença de um útero duplo incompleto, formado por dois cornos, um corpo septado e uma cérvice. Os órgãos do sistema reprodutor apresentaram características macroscópicas e histológicas semelhantes as relatadas para outros roedores. A duração da gestação demonstrou média de 59 ± 2,7487 dias e o ciclo sexual foi classificado como poliéstrico contínuo, com período médio de 14,8 ± 0,73 dias para as fêmeas submetidas ao efeito macho e 14,6 ± 0,75 dias para aquelas do outro grupo. Além disto, a presença do macho influenciou significativamente (P<0,05) a duração do diestro, tornando-o mais longo. A inversão do saco vitelino ocorreu no décimo quarto dia de gestação e o endoderma visceral situou-se em aposição aos tecidos uterinos. A placenta corioalantoide apresentou forma discoidal e possuiu regiões bem definidas de espongiotrofoblasto, labirinto e subplacenta a partir da gestação intermediária. O desenvolvimento embrionário foi semelhante ao observado em roedores histricognatis, sendo a transição para a fase fetal, ocorrida aos 40 dias de gestação. Os dados morfométricos possibilitaram o estabelecimento de correlações com a idade gestacional. O dermatam sulfato foi o GAG predominante em amostras de tubas uterinas, vaginas e placentas, ao passo que o heparam expressou-se mais no corpo do útero, no início da gestação. Houve ainda elevadas concentrações de GAGs no útero gestante e no sistema reprodutor na fase estrogênica quando comparada ao diestro. Conclui-se que os eventos reprodutivos apresentaram características da espécie correlacionáveis com outras da ordem Rodentia, fato este que indica um conjunto de estratégias evolutivas relacionadas com a sua manutenção / 2017-05-03

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:26Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00228.pdf: 734554 bytes, checksum: 03a62f6cd8681b4c0355ed94322eac86 (MD5) / Objetivo: verificar a relacao entre as concentracoes no meio de cultura dos aminoacidos glutamina, alanina, do dipeptideo alanil-glutamina e da amonia com a qualidade embrionaria, a ocorrencia de gravidez e a relacao com o estimulo hormonal administrado. Metodo: foi realizado um estudo prospectivo caso controle com o meio de cultura de 62 embrioes produzidos por 20 mulheres que foram submetidas ao programa de Reproducao Assistida da UNIFESP. Como criterios de inclusao foram considerados idade (igual ou inferior a 37 anos), de um a quatro embrioes transferidos no 3o dia de cultivo, desde que tenha realizado o protocolo da ICSI e que tenham recebido hCG recombinante. Os grupos experimentais foram subdivididos de acordo com a qualidade morfologica dos embrioes no 2o e 3o dia de cultivo, evolucao homogenea (embrioes classificados como bons no 2o e 3o dia de cultivo) ou heterogenea, hormonio administrado durante o estimulo (FSH ou FSH e LH), e ocorrencia ou nao de gravidez, avaliada de acordo com o ƒÀ-hCG serico. As aliquotas dos meios de cultura foram coletadas apos a transferencia dos embrioes e analisadas por cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC) para quantificar os aminoacidos glutamina e alanina, o dipeptideo alanil-glutamina e amonia presentes em cada amostra. As variaveis numericas foram comparadas entre os grupos utilizando o teste T de Student para amostras nao-pareadas (variaveis heterocedasticas foram transformadas), e frequencias utilizando Qui-quadrado de Pearson ou um teste exato de Fisher. Um modelo logistico foi construido utilizando idade das pacientes, hormonios utilizados para a estimulacao, qualidade embrionaria, e os metabolitos mensurados, uma vez que maximizasse a preditibilidade da ocorrencia de gravidez. Os dados estao apresentados como media; desvio padrao. Resultados: no grupo de embrioes que foram transferidos para mulheres que atingiram a gravidez, quando comparado com aquelas que nao atingiram, foram observados niveis menores de glutamina normalizada (1.4; 0,7 e 1.9; 0.7, respectivamente, p=0,004) e amonia (0.2; 0.01 e 0.3; 0.1, respectivamente, p=0,008). Niveis maiores de alanil-glutamina normalizada foram observados nos embrioes com melhor qualidade morfologica no 2o e 3o dia e naqueles com evolucao homogenea. Embrioes de pacientes que receberam FSH e LH, quando comparados com aquelas pacientes que receberam somente FSH, apresentaram maiores concentracoes de alanil-glutamina absoluta (334.9; 95.2 e 282.9; 62.4, respectivamente, p=0.017). Na regressao logistica, o melhor modelo preditivo para gravidez incluiu todos os valores normalizados de alanina, glutamina, idade, tipo de hormonio na estimulacao, e evolucao embrionaria (77.4%, p=0.00005). Conclusao: nas condicoes deste estudo, nossos resultados permitem concluir que, (i) embrioes que possuem um desenvolvimento homogeneo e com boa qualidade no segundo e terceiro dia de cultivo embrionario apresentam maior quantidade de alanil-glutamina no meio de cultura, (ii) niveis menores de amonia absoluta e glutamina normalizada no meio de cultura durante o cultivo embrionario estao relacionados com maior ocorrencia de gestacao e (iii) pacientes que receberam como estimulo hormonal FSH e LH apresentam niveis maiores de alanil-glutamina absoluta no meio de cultura. / Objective: to verify the relations between culture media concentrations of ammonia, alanine, glutamine, and alanyl-glutamine and embryo quality, pregnancy, and type of hormonal stimulation. Methods: a prospective case-control study was carried out including 62 embryos from 20 women submitted to assisted reproduction at the Sao Paulo Federal University. Inclusion criteria were age (up to 37 years old), one to four embryos transferred at day 3 of embryo culture, couples submitted to ICSI, and LH peak achieved through hCG administration. Experimental groups were subdivided according to embryo morphologic quality on days 2 and 3, homogenous (good embryos on days 2 and 3) or heterogeneous evolution, type of hormonal stimulation used (FSH or FSH and LH), and occurrence of pregnancy evaluated by serum ƒÒ-hCG. Culture media aliquots were collected after the embryos were transferred. Analysis of alanine, glutamine, alanyl-glutamine, and ammonia concentrations was performed using HPLC. Numerical variables were compared between groups using unpaired Student¡¦s T-test (heteroscedastic variables were transformed), and frequencies using Pearson¡¦s Chi-square or Fisher¡¦s exact test. Logistic models were constructed using female age, type of hormone used for stimulation, embryo quality, and the measured metabolites, in order to maximize predictability of occurrence of pregnancy. Data are presented as mean; standard deviation. Results: In the embryos transferred to women who achieved pregnancy, when compared to those who did not achieve pregnancy, lower levels of normalized glutamine (1.4; 0.7 and 1.9; 0.7, respectively, p=0.004) and ammonia (0.2; 0.01 and 0.3; 0.1, respectively, p=0.008) were observed. Higher levels or normalized alanyl-glutamine were observed in higher quality embryos on days 2 and 3, and on those who presented homogeneous evolution. Embryos from patients who received FSH with LH, when compared to those from patients who received only FSH, presented higher absolute values of alanyl-glutamine (334.9; 95.2 and 282.9; 62.4, respectively, p=0.017). In logistic regression, the model which best predicted pregnancy included all the normalized values of alanine, glutamine, age, type of hormone, and evolution (77.4% correct, p=0.00005). Conclusion: Our results allow us to conclude that, in our conditions: (i) embryos with better quality on days 2 and 3 and with a homogenous evolution are associated with higher contents of alanyl-glutamine in their culture media, (ii) lower levels of ammonia and glutamine in the culture media are associated to higher pregnancy rates, and (iii) FSH with LH during hormonal stimulation is associated to higher levels of alanyl-glutamine in the culture media. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Acredita-se que os primeiros progenitores da hematopoese definitiva surjam da diferenciação do endotélio da aorta dorsal, na altura da região da Aorta-Gônada-Mesonefros (AGM). Com o intuito de estudar esta região e o fenótipo das células do endotélio da aorta dorsal nesta posição topográfica, ovos galados de Gallus gallus domesticus L. foram incubados em chocadeira, classificados em estádios de E16 a E25 e processados histotecnologicamente para obtenção de secções seriadas na altura da região AGM. Estas passaram por coloração por Hematoxilina-Eosina, histoquímica para PAS, PAS-diastase e Alcian Blue pH 1.0 e pH 2.5, histoquímica por lectinas fluoresceinadas e imunofluorescência para moléculas de superfície, citoesqueleto e matriz extracelular. Foi observada hipertrofia endotelial no assoalho da aorta nos estádios observados, o qual se apresentava positivo ao PAS, com ocorrência frequente de vacuolizações basais PAS negativas, e o surgimento ocasional de grupamentos celulares intravasculares. Nestes, as células que se destacavam da membrana basal do endotélio expressavam progressivamente mais material PAS positivo, o qual, no entanto, em nenhum momento pareceu se tratar de glicogênio. Em relação às glicosaminoglicanas, notamos a presença predominante de ácido hialurônico por todo o mesênquima da região e em outras estruturas como periferia da notocorda, tubo neural e mesoderma lateral. Ocorreu co-expressão de fibronectina e &#945;-actina de músculo liso em células circunjacentes à aorta, na face ventral do vaso. GFAP e BMP-4 são expressas entre as células do tubo neural e em sua periferia, assim como na notocorda do embrião. As lectinas Abrus precatorius, Lens culinarise Ricinus communis mostraram-se positivas principalmente na região subedotelial do assoalho da aorta nos estádios observados neste trabalho. Bandeiraea simplicifolia exibiu pouca marcação na aorta dorsal e a Arachis hypogeae foi negativa. Outras estruturas da região AGM também expressaram resíduos de açúcares revelados por estas lectinas, tais como: notocorda, tubo neural, mesênquima, intestino primitivo e saco vitelínico. Estes resultados acrescentam elementos morfológicos e bioquímicos ao conhecimento sobre a região AGM de embriões de galinha e sobre o endotélio, possivelmente hemogênico, da aorta dorsal. / Nowadays it is known that firsts definitive hematopoietic progenitors arise from endothelium differentiation of dorsal aorta, at Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) site. In order to study those events and cells phenotype of dorsal aorta endothelium in this topographical site, fertilized eggs of Gallus gallus domesticus L. were incubated, from E16 to E25 and to be processed by histotechonology to obtain serial sections of the AGM site. After this, they were stained with Hematoxilin-Eosin, histochemistry to PAS, diastase PAS and Alcian Blue pH 1.0 and pH 2.5, to obtain a better overview and characterization from cells, also, histochemistry to fluorescein lectins and immunofluorescense to surface molecules, cytoeskeleton andextracellular matrix were performed. Our results showed endothelial hypertrophy of the aorta floor in the stages analyzed, which shown positive for PAS, with frequent appearance of PAS negatives basal vacuolizations and an occasional intravascular cell clusters arise of. It was also observed that cells which were separated from endothelium basal membrane shown progressively were more PAS positive which however in any time seems to be glycogen. Regard of glycosaminoglycans we noted the main presence of hialuronic acid for all the mesenchymes site and in others structures like notochord periphery, neural tube and lateral mesoderm. It was observed fibronectin and smooth muscle &#945;-actin co-expression on aorta surrounding walls, at vessels ventral face. GFAP and BMP-4 are express between the cells of neural tube and surrounding it, as well as at embryo notochord. The lectins Abrus precatorius, Lens culinaris and Ricinus communis showed mostly positive expression on the sub endothelium site of the dorsal aorta floor at the stages analyzed in this work. Bandeiraea simplicifolia showed low expression on dorsal aorta and in Arachis hypogeae it was negative. Other structures of AGMs site also expressed sugar residues revealed by these lectins like: notochord, neural tube, mesenchyme, primitive gut and yolk sac.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In vitro cultured bovine embryos are susceptible to oxidative stress caused by high oxygen concentration, that contributes to free radicals formation. Therefore, antioxidant defense systems are needed to neutralize the reactive oxygen species and their harmful effects. The aim of this study was to evaluate the addition of different concentrations (100, 250 and 500μM) of ascorbic acid (AA) antioxidant to in vitro maturation (IVM, 9 replications) or culture (IVC, 8 replications) media of bovine embryos (Chapter 1). The concentration that provided greatest embryonic development rate and better embryo quality was added to in vitro maturation and/or culture media at different gaseous atmospheres (Chapter 2, 10 replications). Media without antioxidant served as control-groups. Cumulus-oocyte complexes obtained from bovine ovaries at the slaughterhouse were randomly distributed in groups and matured in TCM-199 with addition of pFSH, bLH and 10% estrus cow serum (ECS), for 22 to 24h, in an incubator at 39°C and 5% CO 2 in air and saturated humidity. The in vitro production was performed using 20-40 oocytes/group in 400μL of medium in 4-well dishes (Chap. 1) and 13-32 oocytes/group in 200μL drops of medium under mineral oil (Chap. 2). The in vitro fertilization (D0) was performed with Bos taurus taurus frozen semen selected by Swim-up (Chap. 1) and Percoll gradient (Chap. 2) with 1x106 spermatozoa/mL in TALP-Fert with heparin and PHE, for 18 to 22h, at the same IVM conditions. The presumptive zygotes were in vitro cultured in SOFaaci medium with 5% ECS under mineral oil, in the bag system at 5% CO2, 5% O2 and 90% N2 and saturated humidity (Chap. 1 and 2), or in an incubator at 5% CO2 in air and saturated humidity (20% O2 in air; Chap 2). To analyze the percentage of embryos on D2, D7 and D9 a randomized block delineation was used, having as blockade criteria the collection day (Chap. 1). In Chap. 2, the cleavage rate on D2 was analyzed considering the effects of AA addition on maturation and culture and the interaction between the two factors. The embryonic development data on D7 and D9 were analyzed after arc sine square root transformation and considered the effects of AA presence on maturation and culture, the gaseous atmosphere and the interaction among these factors, taking into account the routine day in the analyses model. Blastocyst cell number was obtained after base 10 logarithmic transformation of data, using 8 (Chap. 1) and 10 replications (Chap. 2), with a significance level of 5%. In Chapter 1, the cleavage rate and embryonic development on D7 were similar (P>0.05) among the different AA concentrations added to IVM or IVC. However, the 100μM AA addition to IVC tended (P<0.07) to show higher blastocyst production (32.3%) when compared to the 500μM group (19.7%). The blastocyst production on D9 increased significantly when 100μM AA were added to IVM (P<0.05) compared to control-group (38.7 vs 29.0%), or on IVC (P<0.01) compared to 500μM concentration (28.1 vs 14.1%). The blastocyst cell number was similar (P>0.05) among the different AA concentrations and the control-group. In Chapter 2, there was no effect of interaction (P>0.05) among the factors studied (AA on IVM, AA on IVC and atmosphere of culture) on D2, D7 and D9. Cleavage rate and embryonic development on D7 and D9 did not differ (P>0.05) between groups with and without antioxidant addition, independently of the gaseous atmosphere. However, a greater cell number was observed in hatched blastocysts (P<0.05) when the AA was included in the culture medium. The results indicate that 100μM ascorbic acid concentration can be used during IVM or IVC to increase embryo production, especially on D9, and improve the quality of hatched blastocysts, independently of the culture gaseous atmosphere. / Embriões bovinos cultivados in vitro são susceptíveis ao estresse oxidativo causado pela alta concentração de oxigênio, que contribui para a formação de radicais livres. Por isso, sistemas antioxidantes de defesa são necessários para neutralizar as espécies reativas de oxigênio e seus efeitos prejudiciais. Este estudo teve como objetivo avaliar a adição de diferentes concentrações (100, 250 e 500μM) do antioxidante ácido ascórbico (AA) aos meios de maturação (MIV, 9 repetições) ou cultivo (CIV, 8 repetições) in vitro de embriões bovinos (Capítulo 1). A concentração que propiciou maior taxa de desenvolvimento embrionário e melhor qualidade dos embriões foi adicionada aos meios de maturação e/ou cultivo in vitro em diferentes atmosferas gasosas (Capítulo 2, 10 repetições). Meios sem antioxidante serviram como grupos-controle. Complexos cumulus-oócitos obtidos de ovários de frigorífico foram distribuídos aleatoriamente em grupos e maturados em TCM-199 adicionado de pFSH, bLH e 10% de soro de vaca em estro (SVE), por 22 a 24h, em estufa a 39°C e 5% CO 2 em ar e umidade saturada. Para a produção in vitro foram utilizados 20-40 oócitos/grupo em 400μL de meio em placa de quatro poços (Cap. 1) e 13-32 oócitos/grupo em gotas de 200μL de meio sob óleo mineral (Cap. 2). A fecundação in vitro (D0) foi conduzida com sêmen congelado Bos taurus taurus selecionado por Swim-up (Cap. 1) e gradiente de Percoll (Cap. 2), com 1x106 espermatozóides/mL em TALP-Fert com heparina e PHE, por 18 a 22h, nas mesmas condições da MIV. Os prováveis zigotos foram cultivados in vitro em meio SOFaaci com 5% de SVE sob óleo mineral, no sistema de bolsas gaseificadas (bag system) a 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 e umidade saturada (Cap. 1 e 2), ou em estufa a 5% CO2 em ar e umidade saturada (20% O2 em ar; Cap. 2). Para analisar a porcentagem de embriões no D2, D7 e D9 utilizou-se o delineamento blocos ao acaso, tendo como critério de bloqueio o dia da coleta (Cap. 1). No Cap. 2, para analisar a taxa de clivagem no D2 foram considerados os efeitos da adição do AA na maturação, adição do AA no cultivo e a interação entre os dois fatores. Os dados do desenvolvimento embrionário no D7 e D9 foram analisados após transformação arcoseno raiz quadrada e foram considerados os efeitos da presença do AA na maturação, presença do AA no cultivo, a atmosfera gasosa e a interação entre esses fatores, considerando o dia de realização da rotina no modelo de análise. Para contagem de células dos blastocistos os dados foram analisados após transformação logarítmica de base 10, sendo utilizadas 8 repetições (Cap. 1) e 10 repetições (Cap. 2), com nível de significância de 5%. No Capítulo 1, a taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário no D7 foram similares (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA adicionadas na MIV ou CIV. Entretanto, a adição de 100μM de AA no CIV apresentou tendência (P<0,07) de maior produção de blastocistos (32,3%) quando comparado ao grupo com 500μM (19,7%). A produção de blastocistos no D9 aumentou significativamente quando 100μM de AA foi adicionado na MIV (P<0,05) comparado ao grupo-controle (38,7 vs 29,0%), ou no CIV (P<0,01) comparado com a concentração de 500μM (28,1 vs 14,1%). O número de células por blastocisto foi similar (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA e o grupo-controle. No Capítulo 2, não houve efeito da interação (P>0,05) entre os fatores estudados (AA na MIV, AA no CIV e atmosfera de cultivo) sobre o D2, D7 e D9. A taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário no D7 e D9 não diferiram (P>0,05) entre os grupos com e sem antioxidante, independentemente da atmosfera gasosa. No entanto, maior número de células foi observado nos blastocistos eclodidos (P<0,05) quando o AA foi incluído no meio de cultivo. Os resultados indicam que a concentração de 100μM de ácido ascórbico pode ser utilizada durante a MIV ou CIV para incrementar a produção embrionária, especialmente no D9, além de melhorar a qualidade dos blastocistos eclodidos, independentemente da atmosfera gasosa de cultivo.

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: César Roberto Esper / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Maria Angélica Miglino / Resumo: A clonagem por transferência de núcleo é freqüentemente associada a resultados insatisfatórios devido à reprogramação nuclear anormal da célula somática doadora de núcleo e à expressão gênica alterada. O primeiro objetivo deste trabalho foi estudar a freqüência dos RNAs mensageiros das DNA metiltransferases (DNMT) 1, 3A e 3B, e do gene de expressão constitutiva gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) em blastocistos bovinos isolados produzidos in vivo e in vitro por transferência nuclear (TN) de célula somática, ativação partenogenética e fertilização in vitro (FIV). O segundo objetivo foi avaliar a expressão das DNMTs e dos genes "imprinted" IGF2, IGF2R e H19 em membranas cório-alantóide e fetos bovinos produzidos in vivo e in vitro por TN, ativação partenogenética e FIV e recuperados entre os dias 33 e 36 de gestação. Houve decréscimo (P<0,05) na freqüência do GAPDH nos blastocistos TN e partenogenéticos quando comparados aos embriões fertilizados, e também diferença entre blastocistos TN produzidos com diferentes protocolos de sincronização celular (células em G0 ou G1 do ciclo celular). Com relação às DNMTs, não foram identificados transcritos da DNMT1 nos blastocistos do grupo TN-G0; ocorreu diminuição na freqüência dos transcritos da DNMT3B nos embriões TN quando comparados aos partenotos. Não se observou diferença na freqüência relativa das DNA metiltransferases em membranas cório-alantóide e fetos. Com relação aos genes "imprinted", o grupo partenogenético apresentou menor nível de expressão de IGF2 em relação aos os demais grupos; baixos níveis de expressão de IGF2 e IGF2R foram observados, respectivamente, em amostras de feto e de cório-alantóide derivadas de animais clonados por TN, quando comparadas aos grupos fertilizados in vivo e in vitro. / Abstract: Cloning by nuclear transfer is often associated with poor results due to abnormal nuclear reprogramming of somatic cell donor and altered gene expression. The first objective of this study was to evaluate the frequency of DNA methyltranferases (DNMT) 1, 3A and 3B, and the housekeeping glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNAs in single bovine blastocysts produced in vivo or in vitro by somatic cell nuclear transfer (SCNT), parthenogenetic activation and in vitro fertilization (IVF). The second objective was to evaluate the expression of DNMTs and imprinted genes IGF2, IGF2R and H19 in chorio-alantois membrane of bovine fetuses produced in vivo or in vitro by SCNT, parthenogenetic activation and IVF, and recovered between days 33 and 36 of gestation. There was strong GAPDH downregulation (P<0.05) in parthenogenetic and cloned by SCNT blastocysts when compared to fertilized ones, and also differences between cloned blastocysts produced with different cell synchronization (G0 or G1) protocol. Regarding DNMTs expression, we did not identify DNMT1 transcrips in SCNT-G0 derived blastocysts, and observed DNMT3B downregulation in SCNT-derived embryos when compared to parthenotes. No differences in DNA methyltransferase relative frequency were seen in chorio-alantois membrane and fetuses. Regarding imprinted genes expression, downregulation of IGF2 in the parthenogenetic group was observed in comparision to all other groups, and also, downregulation of IGF2 and IGF2R in the cloned-derived fetuses and chorio-alantois samples, respectively, were observed comparing to in vivo and in vitro fertilized groups. / Doutor

A nutrição está intimamente relacionada com a reprodução nos animais e ainda há muito a se estudar sobre essa inter-relação, principalmente porque ainda há muita controvérsia na literatura sobre este tema. Por exemplo, alguns estudos sugerem ser benéfico o uso do \"flushing\" nutricional na produção de embriões em ruminantes. Entretanto, a maioria dos trabalhos mostra resultados negativos da alta ingestão de matéria seca (IMS). Dessa forma, existe a necessidade em se avançar nos estudos comparando a fisiologia reprodutiva e produção de embriões em fêmeas sob diferentes níveis nutricionais. Foram utilizadas 33 vacas Nelores não lactantes recebendo um dos quatro tratamentos a seguir: Os grupos Mantença (M), Restrição (0,7M) e Alta IMS (1,5M) receberam a mesma dieta padrão variando a quantidade oferecida. O grupo Alta ingestão de energia (E), recebeu uma dieta com alto teor de amido, com a mesma energia do grupo 1,5M, porém, com a mesma IMS do grupo M. Todas as vacas passaram por todos os tratamentos, em um modelo crossover. Estes animais tiveram o ciclo estral sincronizado e acompanhamento ovariano diário, por meio de ultrassonografia até confirmação da ovulação. Posteriormente, nos dias 7 e 10 do ciclo estral foi avaliado o volume do corpo lúteo (CL). Concentrações circulantes de hormônios esteróides (progesterona [P4] e estradiol [E2]) foram mensuradas em dias estratégicos. Os animais foram submetidos à aspiração intrafolicular (OPU) por volta do dia 12 do ciclo estral e dois dias após a OPU, os animais foram superestimulados e avaliou-se a resposta superovulatória e a qualidade embrionária entre os grupos, assim como a taxa de prenhez de 273 receptoras após transferência em tempo fixo dos embriões vitrificados. As análises foram realizadas de acordo com o Proc GLIMMIX do SAS, com nível de significância de P < 0,05. Os resultados estão apresentados na forma de média dos quadrados mínimos ± erro padrão. Este estudo englobou duas áreas principais: fisiologia e concentrações hormonais (Experimento 1) e produção in vivo de embriões (Experimento 2). Apesar de, no Experimento 1, terem sido avaliadas 33 vacas nas quatro repetições, totalizando 132 sincronizações, houve apenas 75 ovulações, as quais foram consideradas para as análises subsequentes. A taxa de ovulação não variou entre os tratamentos (~57%). O folículo ovulatório foi maior conforme a IMS aumentou para a dieta padrão nos grupos 1,5M, M, 0,7M (14,4 ± 0,3a vs 12,8 ± 0,3b vs 12,0 ± 0,3c nos grupos 1,5M, M e 0,7M, respectivamente). Apesar disso, o E2 circulante não diferiu entre os grupos. O volume do CL no Dia 7 do ciclo estral foi semelhante entre os grupos, todavia o grupo 1,5M apresentou menor concentração de P4 circulante (2,4 ± 0,2 ng/mL) em relação aos grupos M e 0,7M (2,9 ± 0,2 vs 3,0 ± 0,3 ng/mL, respectivamente). No Experimento 2, a concentração de insulina plasmática foi maior no grupo E (8,7 ± 0,86 ?UI/mL) comparado com os grupos 0,7M (4,6 ± 0,87) e M (5,3 ± 0,85), não diferindo do grupo 1,5M (6,6 ± 0,9). Houve maior resposta superovulatória (CL) nas doadoras que receberam a dieta padrão, 0,7M (13,0 ± 1,3a); M (14,2 ± 1,2ª) e 1,5M (13,9 ± 1,2ª) comparado às alimentadas com alta energia (9,7 ± 1,2b), devido à correlação negativa entre resposta superovulatória e insulina (r = -0,32). Apesar disso, não houve diferença entre os grupos para o número total de ovócitos/embriões colhidos (~6 estruturas), embriões viáveis (~3 embriões), ou congeláveis (~2,7 embriões). Independente de tratamento, a insulina circulante ao início da superovulação, apresentou correlação negativa com o número de embriões viáveis (r = -0,22). A prenhez aos 23 e 53 dias após a transferência dos embriões não diferiu entre os tratamentos, entretanto, a insulina circulante das doadoras teve correlação negativa com a prenhez das receptoras aos 60 dias de gestação (r = -0,16). Em conclusão, diferentes níveis de IMS alteraram o tamanho das estruturas ovarianas e/ou as concentrações circulantes de hormônios esteróides. Apesar disso, houve um efeito muito discreto de dieta na resposta superovulatória e qualidade embrionária das vacas. Independente de tratamento, alta insulina circulante das doadoras foi associada a menor resposta superovulatória, número de embriões viáveis e prenhez das receptoras aos 60 dias de gestação. / Nutrition is closely related to reproduction and there is still much to learn about this relationship, mainly because there is so much controversy in the literature on this topic. For example, some studies propose beneficial use of nutritional \"flushing\" on embryo production in ruminants. However, most studies show negative results of high dry matter intake (DMI). Thus, there is a need to advance in studies comparing reproductive physiology and embryo production in females under different nutritional levels. A total of 33 non-lactating Nelore cows received one of the following treatments: Groups maintenance (M), Restriction (0.7M) and High DMI (1.5M) received the same standard diet with variations in the amount offered. The group High intake of energy (E) received a diet with high starch content, but the same amount of energy as group 1.5M, however, with the same DMI as Group M. All cows underwent all treatments in a crossover model. These animals had their estrus synchronized and ovarian dynamics was monitored daily by ultrasound until confirmation of ovulation. Subsequently, on days 7 and 10 of the estrous cycle the volume of the corpus luteum (CL) was estimated. Circulating concentrations of steroid hormones (progesterone [P4] and estradiol [E2]) were measured in strategic days. The cows underwent intrafollicular aspiration (OPU) on day 12 of the estrous cycle, and two days after OPU, the cows ovaries were supererstimulated. The superovulatory response and embryo quality was compared among groups, as well as pregnancy rate of 273 recipients after receiving fixed-time transfer of vitrified embryos. Analyses were performed according to the Proc GLIMMIX of SAS, with a significance level of P < 0.05. Results are presented as least squares means ± standard error. This study included two main areas: physiology and hormone concentrations (Experiment 1) and in vivo embryo production and pregnancy rate (Experiment 2). Although, in Experiment 1, 33 cows were evaluated in four repetitions, totaling 132 synchronizations, there were only 75 ovulations, which were considered for subsequent analyzes. The ovulation rate did not vary between treatments (~57%). The size of the ovulatory follicle incresed as the DMI of the standard diet increased (14.4 ± 0.3a vs 12.8 ± 0.3b vs 12.0 ± 0.3c for groups 1.5 M, M and 0.7M, respectively). Nevertheless, the circulating E2 did not differ between groups. The volume of the CL on Day 7 of the estrous cycle increased as the DMI of the standard diet increased, but the 1.5M group had lower circulating concentrations of P4 (2.4 ± 0.2 ng/mL) than groups M and 0.7M (2.9 ± 0.2 and 3.0 ± 0.3 ng/mL, respectively). In Experiment 2, plasma insulin concentration was higher in the E group (8.7 ± 0.86 ?IU/mL) compared with groups 0.7 M (4.6 ± 0.87) and M (5.3 ± 0.85) not differing from group 1.5M (6.6 ± 0.9). There was a higher superovulatory response (CL) in donors receiving the standard diet [0.7M (13.0 ± 1.3), M (14.2 ± 1.2) and 1.5M (13.9 ± 1.2)] compared with those fed high energy (9.7 ± 1.2 CL) due to the negative correlation between superovulatory response and circulating insulin (r = - 0.32). Nevertheless, there was no difference between groups for the total number of oocytes/embryos collected (~6 structures), viable embryos (~3 embryos), or freezable (~2.7 embryos). Regardless of treatment, circulating insulin at the beginning of superovulation, was negatively correlated with the number of viable embryos (r = -0.22). Pregnancies at 23 and 53 days after embryo transfer did not differ between treatments, however, circulating insulin of the donor cows had a negative correlation with pregnancy of recipients at 60 days of gestation (r = -0.16). In conclusion, different levels of DMI changed the size of ovarian structures and/or the concentrations of circulating steroid hormones. Nevertheless, there was a very minor effect of diet on superovulatory response and embryo quality in cows. Regardless of treatment, high circulating insulin of the donors was associated with lower superovulatory response, lower number of viable embryos and less pregnancies of recipients at 60 days of gestation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-21Bitstream added on 2014-06-13T18:55:54Z : No. of bitstreams: 1 frade_cs_me_araca.pdf: 946830 bytes, checksum: 2ebd66c2e30b659729f39b6245809148 (MD5) / A produção in vitro (PIV) de embriões e a transferência de embriões (TE) tratam-se de biotecnologias da reprodução, as quais são rotineiramente aplicadas no melhoramento genético da espécie bovina. No entanto, resta determinar até que ponto sua utilização implica na disseminação de patógenos no rebanho. A fim de elucidar a possibilidade de transmissão do BoHV-5 através de células germinativas e/ou embriões, após exposição experimental in vitro, uma série de 3 experimentos foram realizados. Estes consistiram na exposição de oócitos, espermatozóides e embriões bovinos ao BoHV-5, tendo como critério de avaliação o desenvolvimento embrionário, bem como a detecção do vírus através de emprego da técnica de hibridização in situ (ISH) e PCR, além da apoptose, determinada pelo teste de TUNEL e pela imunomarcação dos fatores pro-apoptóticos (anexina-V, caspase-2 e -3) e antiapoptóticos (BCl-2). O experimento I foi realizado durante o período de maturação oocitária, sendo dividido em I (controle + 10% SFB), II (vírus + 10% SFB; BoHV-SFB) e III (vírus + 1 mg/mL PVA; BoHV-PVA); o experimento II foi realizado na etapa de fertilização, sendo dividido em I (controle) e II (exposto; BoHV-SPTZ); e o experimento III foi feito no período de cultura embrionária, sendo dividido em I (controle) e II (exposto; BoHV-PZ). A análise estatística para os resultados de desenvolvimento embrionário será feita pela ANOVA e teste-t de Bonferroni para os dados dos oócitos infectados e pelo teste t não pareado para os resultados de espermatozóides e embriões infectados, já para a análise da apoptose e marcadores apoptóticos será empregado o teste de Kruskal-Wallis e Dunn, diferenças serão consideradas significativas quando p<0,05. / The in vitro production (IVP) of embryos and embryo transfer (ET) are reproduction biotechnologies, which are routinely applied in breeding bovine. However, it remains to determine if these techniques can promote spread of pathogens in the herd. In order to elucidate the possibility of transmission of BoHV-5 by germ cells and/or embryos after in vitro experimental exposure, a total of 3 experiments were performed. These consisted of exposure of oocytes, sperm and embryos to BoHV-5, with the evaluation embryonic development, and detection of the virus through use of the technique of in situ hybridization (ISH) and PCR, in addition to apoptosis, determined by TUNEL test and by immunostaining of the factors pro-apoptotic (annexin-V, caspase-2 and -3) and anti-apoptotic (Bcl-2). The first experiment was conducted during the period of oocyte maturation and was divided into I (control + 10% FBS), II (virus + 10% fetal calf serum; BoHV-SFB) and III (virus + 1 mg / ml PVA, BoHV-PVA ), the second trial was conducted at the stage of fertilization, was divided into I (control) and II (exposure, BoHV-SPTZ), and experiment III was done during the growing stage, and divided into I (control) and II (exposure; BoHV-PZ). Statistical analysis for the results of embryo development will be made by ANOVA and Bonferroni-t test to the data from exposed oocytes and the unpaired t test for the results of sperm and embryos exposed, as for the analysis of apoptosis will be used the Kruskal-Wallis and Dunn, differences are considered significant when p <0.05.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The common bean (Phaseolus vulgaris L.), besides having high protein food, is also an excellent source of minerals for consuming. However, genetic variability for minerals contents has been observed and the accumulation of minerals occurs differently in the embryo and seed coat of bean seeds. It was not found studies on the genetics levels of potassium and copper in common bean seeds and a little about the potential of genetic improvement to increase in these minerals. Therefore, the aims of this study were: (1) investigate the accumulation of potassium, calcium, copper, iron and zinc in the seed coat and embryo of beans seeds; (2) examine the occurrence of maternal effect in the expression levels of potassium and copper in common bean seeds; (3) to estimate heritability and gain by selection for potassium and copper contents in early generations. Thus, the seed coats of two cultivars BRS Expedito and Carioca were separated from the embryo and minerals were determined in each fraction. Also, crosses were made between IAPAR 44 x Guapo Brilhante and BRS Expedito x BRS Valente, to study the genetics of potassium, and between IAPAR 44 x IAPAR 31 and Diamante Negro x TPS Bonito, to study copper amount. In the embryo was concentrated more than 80% of potassium, 64% copper and 68% zinc and the tegument has accumulated more than 94% of calcium and 51.06% to 60.12% of iron in the seeds of BRS Expedito and Carioca cultivars. There was no significant maternal effect on the expression levels of potassium and copper in common bean seeds. Estimates of broad sense heritability of 44.08% and 79.97%, and in the narrow sense of 33.26% and 43.05% were obtained for potassium content in IAPAR 44 x Guapo Brilhante and BRS Expedito x BRS Valente crossing, respectively. For copper content was observed estimates of heritability in the broad sense of 71.90% and 79.65%, and in the narrow sense of 51.98% and 61.99% for IAPAR 44 x IAPAR 31 and Diamante Negro x TPS Bonito crossing, respectively. The increase in potassium content, for breeding, may be difficult due to the significant effect of the environment variance. For copper content, it was possible an increased of 46.78% for breeding. / O feijão (Phaseolus vulgaris L.), além de ser um alimento altamente protéico, também é uma excelente fonte de minerais para a utilização na alimentação humana. Todavia, variabilidade genética para os teores de minerais tem sido constatada e a acumulação dos minerais pode ocorrer de maneira diferenciada no tegumento e no embrião das sementes de feijão. Não foram encontrados estudos sobre a genética dos teores de potássio e de cobre em sementes de feijão e sobre o potencial do melhoramento genético para o aumento desses minerais. Sendo assim, os objetivos desse trabalho foram: (1) investigar a acumulação de potássio, cálcio, cobre, ferro e zinco no tegumento e no embrião das sementes de feijão; (2) verificar a ocorrência de efeito materno na expressão dos teores de potássio e de cobre em sementes de feijão; (3) obter estimativas de herdabilidade e de ganho por seleção para os teores de potássio e de cobre em gerações precoces. Para tanto, o tegumento foi separado do embrião das sementes de duas cultivares de feijão BRS Expedito e Carioca e os minerais foram determinados em cada fração. Também, foram realizados cruzamentos dirigidos entre as cultivares IAPAR 44 x Guapo Brilhante e BRS Expedito x BRS Valente, para o estudo da genética do teor de potássio, e entre as cultivares IAPAR 44 x IAPAR 31 e Diamante Negro x TPS Bonito, para o estudo da genética do teor de cobre. No embrião se concentraram mais de 80% do potássio, 64% do cobre e 68% do zinco e no tegumento acumularam-se mais de 94% do cálcio e de 51,06% a 60,12% do ferro nas sementes de feijão das cultivares BRS Expedito e Carioca. Não foi observado efeito materno significativo na expressão dos teores de potássio e de cobre em sementes de feijão. Estimativas de herdabilidade em sentido amplo de 44,08% e de 79,97% e em sentido restrito de 33,26% e de 43,05% foram obtidas para o teor de potássio, nos cruzamentos IAPAR 44 x Guapo Brilhante e BRS Expedito x BRS Valente, respectivamente. Para o teor de cobre, foram observadas estimativas de herdabilidade em sentido amplo de 71,90% e de 79,65% e em sentido restrito de 51,98% e de 61,99% para os cruzamentos IAPAR 44 x IAPAR 31 e Diamante Negro x TPS Bonito, respectivamente. O aumento do teor de potássio, por melhoramento genético, poderá ser dificultado em função do expressivo efeito da variância do ambiente. Para o teor de cobre foi possível um aumento de 46,78%, por melhoramento genético.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Acredita-se que os primeiros progenitores da hematopoese definitiva surjam da diferenciação do endotélio da aorta dorsal, na altura da região da Aorta-Gônada-Mesonefros (AGM). Com o intuito de estudar esta região e o fenótipo das células do endotélio da aorta dorsal nesta posição topográfica, ovos galados de Gallus gallus domesticus L. foram incubados em chocadeira, classificados em estádios de E16 a E25 e processados histotecnologicamente para obtenção de secções seriadas na altura da região AGM. Estas passaram por coloração por Hematoxilina-Eosina, histoquímica para PAS, PAS-diastase e Alcian Blue pH 1.0 e pH 2.5, histoquímica por lectinas fluoresceinadas e imunofluorescência para moléculas de superfície, citoesqueleto e matriz extracelular. Foi observada hipertrofia endotelial no assoalho da aorta nos estádios observados, o qual se apresentava positivo ao PAS, com ocorrência frequente de vacuolizações basais PAS negativas, e o surgimento ocasional de grupamentos celulares intravasculares. Nestes, as células que se destacavam da membrana basal do endotélio expressavam progressivamente mais material PAS positivo, o qual, no entanto, em nenhum momento pareceu se tratar de glicogênio. Em relação às glicosaminoglicanas, notamos a presença predominante de ácido hialurônico por todo o mesênquima da região e em outras estruturas como periferia da notocorda, tubo neural e mesoderma lateral. Ocorreu co-expressão de fibronectina e &#945;-actina de músculo liso em células circunjacentes à aorta, na face ventral do vaso. GFAP e BMP-4 são expressas entre as células do tubo neural e em sua periferia, assim como na notocorda do embrião. As lectinas Abrus precatorius, Lens culinarise Ricinus communis mostraram-se positivas principalmente na região subedotelial do assoalho da aorta nos estádios observados neste trabalho. Bandeiraea simplicifolia exibiu pouca marcação na aorta dorsal e a Arachis hypogeae foi negativa. Outras estruturas da região AGM também expressaram resíduos de açúcares revelados por estas lectinas, tais como: notocorda, tubo neural, mesênquima, intestino primitivo e saco vitelínico. Estes resultados acrescentam elementos morfológicos e bioquímicos ao conhecimento sobre a região AGM de embriões de galinha e sobre o endotélio, possivelmente hemogênico, da aorta dorsal. / Nowadays it is known that firsts definitive hematopoietic progenitors arise from endothelium differentiation of dorsal aorta, at Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) site. In order to study those events and cells phenotype of dorsal aorta endothelium in this topographical site, fertilized eggs of Gallus gallus domesticus L. were incubated, from E16 to E25 and to be processed by histotechonology to obtain serial sections of the AGM site. After this, they were stained with Hematoxilin-Eosin, histochemistry to PAS, diastase PAS and Alcian Blue pH 1.0 and pH 2.5, to obtain a better overview and characterization from cells, also, histochemistry to fluorescein lectins and immunofluorescense to surface molecules, cytoeskeleton andextracellular matrix were performed. Our results showed endothelial hypertrophy of the aorta floor in the stages analyzed, which shown positive for PAS, with frequent appearance of PAS negatives basal vacuolizations and an occasional intravascular cell clusters arise of. It was also observed that cells which were separated from endothelium basal membrane shown progressively were more PAS positive which however in any time seems to be glycogen. Regard of glycosaminoglycans we noted the main presence of hialuronic acid for all the mesenchymes site and in others structures like notochord periphery, neural tube and lateral mesoderm. It was observed fibronectin and smooth muscle &#945;-actin co-expression on aorta surrounding walls, at vessels ventral face. GFAP and BMP-4 are express between the cells of neural tube and surrounding it, as well as at embryo notochord. The lectins Abrus precatorius, Lens culinaris and Ricinus communis showed mostly positive expression on the sub endothelium site of the dorsal aorta floor at the stages analyzed in this work. Bandeiraea simplicifolia showed low expression on dorsal aorta and in Arachis hypogeae it was negative. Other structures of AGMs site also expressed sugar residues revealed by these lectins like: notochord, neural tube, mesenchyme, primitive gut and yolk sac.

A domesticação dos cães produziu-se simultaneamente em várias partes do globo o que ocasionou, o aparecimento por seleção de várias raças. Desde então o cão passou a ser utilizado para várias e diferentes tarefas, dentre elas acompanhar o homem, que usufruiu da sua conveniência, descobrindo que muitas vezes ambos podem sofrer dos mesmos males. Cães da raça Golden Retriever apresentam uma doença geneticamente degenerativa, homóloga a distrofia muscular de Duchenne (DMD) no homem; ambas doenças afetam o gene que produz a distrofina; uma proteína citoesquelética múscular. Uma possível forma de fornecer uma cópia normal do gene para os grupos musculares afetados de um indivíduo consiste no transplante de células tronco os quais podem ser obtidas de células embrionárias, células germinativas, células do sangue de cordão umbilical, células de medula óssea e células de sangue periférico. Estudos com modelos animais tem mostrado que transplante de células tronco fetais ou células tronco pluripotentes podem ter sucesso no tratamento de muitas doenças crônicas, sendo assim, objetivamos delinear uma linha de tratamento para distrofia muscular em cães da raça Golden Retriever, mediante caracterização e uso das células germinativas embrionárias para terapia celular. Foram utilizados 16 fêmeas sem raça definida (SRD), e as cadelas foram selecionadas a partir do exame citológico; as fêmeas foram inseminadas artificialmente, e após 30 dias de gestação os animais foram castrados pela técnica de ovário-salpingohisterectomia. Os embriões coletados possibilitaram a obtenção e estabelecimento de células tronco germinativas embrionárias, de fibroblastos fetais, de células musculares, os quais analisamos através de citometria de fluxo, interação no co-cultivo de células musculares caninas e células germinativas embrionárias e a imunopositividade das células na detecção de Oct-4. Os resultados nos possibilitam afirmar que em embriões com 22 dias de idade gestacional a região paramesonéfrica apresenta-se indiferenciada, diferentemente do que encontramos com 24 dias de idade, no qual o rim primitivo apresenta-se visível diferenciado. As células tronco germinativas embrionárias apresentaram colônias compactas e com alta proliferação de células mononucleares indiferenciadas e que as células tronco germinativas embrionárias apresentaram como principal problema a manutenção das culturas por períodos significativos. / The canine domesticity generated simultaneously in different parts of the World, that created, the begin of selection of many breeds. Since that time, dogs become to be used for different works, since follow men, that usufructed their convinience discovering most of the time that both are soffering the same ill. Dogs from the Golden Retriever breed presented a degenerative and genetically disease, homologous to Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) in human, the dystrophin gene affection; a muscle citosckeletical protein. A possibility way to supply a correct gene shape for the affected muscle could be from the stem cell therapy from embrionic stem cell, germ cells, umbilical cord blood cells, bone marrow and perific blood. Researches with animal models are showing sucess on the treatment with fetal stem cells or pluripotents ones in different types of cronic illness, then, we aimed a treatment of the Golden Retriever Muscular Dystrophy using embrionic germ cells meantime characterization and their use on cell therapy. Were uses 16 females crossbreed (SRD), bitches were selected by the vaginal cytology exams; females were artificially inseminated and after 30 days of pregancy, the animals were histectomized. Embryos were collected to stabilish embrionic germ cells, canine fibroblasts, muscle cells, which were analysed by flow cytometre, co culture and OCT-4 detection. The results showed the paramesonephic region of embryos with 22 days of pregnancy presents undifferentiate cells(germ cells), what differs from embryos with 24 days, which primitive kidneys presented differentianted types of cells. Under culture conditions, these cells formed compact colonies with high proliferative potential, but without capacity of maintenance after 30 days.