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Embryonic stem (ES) cells offer a valuable source for generating insulin-producing cells. However, current differentiation protocols often result in heterogeneous cell populations of various developmental stages. Here we show the activin A-induced differentiation of mouse ES cells carrying a homologous dsRed-IRES-puromycin knock-in within the Sox17 locus into the endoderm lineage. Sox17-expressing cells were selected by fluorescence-assisted cell sorting (FACS) and characterized at the transcript and protein level. Treatment of ES cells with high concentrations of activin A for 10 days resulted in up to 19% Sox17-positive cells selected by FACS. Isolated Sox17-positive cells were characterized by defini- tive endoderm-specific Sox17/Cxcr4/Foxa2 transcripts, but lacked pluripotency-associated Oct4 mRNA and protein. The Sox17-expressing cells showed downregulation of extraembryonic endoderm (Sox7, Afp, Sdf1)-, mesoderm (Foxf1, Meox1)- and ectoderm (Pax6, NeuroD6)-specific transcripts. The presence of Hnf4α, Hes1 and Pdx1 mRNA demonstrated the expression of primitive gut/foregut cell-specific markers. Ngn3, Nkx6.1 and Nkx2.2 transcripts in Sox17-positive cells were determined as properties of pancreatic endocrine progenitors. Immunocytochemistry of activin A-induced Sox17-positive embryoid bodies revealed coexpression of Cxcr4 and Foxa2. Moreover, the histochemical demonstration of E-cadherin-, Cxcr4-, Sox9-, Hnf1β- and Ngn3-positive epithelial-like structures underlined the potential of Sox17-positive cells to further differentiate into the pancreatic lineage. By reducing the heterogeneity of the ES cell progeny, Sox17-expressing cells are a suitable model to evaluate the effects of growth and differentiation factors and of culture conditions to delineate the differentiation process for the generation of pancreatic cells in vitro. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Das Nervensystem von Drosophila melanogaster entwickelt sich aus dem Neuroectoderm entlang der anterior-posterioren Axe des Embryos. Dieses Gewebe unterteilt sich in drei Expressionsdomänen, die von ventral nach dorsal durch Expression der drei Homöobox-Transkriptionsfaktoren vnd, ind und msh charakterisiert sind. Vnd und Ind wurden als notwendig und ausreichend beschrieben, um die Zellidentitäten ihrer jeweiligen Gewebe zu determinieren. Um zu untersuchen, wie diese Transkriptionsfaktoren agieren, um ihre jeweiligen Zelltypen hervorzubringen, habe ich die genomweiten Genexpressionsmuster dieser verwandten Gewebe in Wildtyp-Embryos und in einer vnd-Mutante bestimmt. Ich fand heraus, dass anstelle eines Gewebes, das der IC-Domäne ähnelt, die Vnd-Mutante ein Gewebe hervorbringt, das neuronale Charakteristika zum grossen Teil verloren hat. Ich habe gefunden, dass der Transkiptionsfaktor "eyeless" bei ektopischer Expression in der VC den Vnd-Nervensystemphänotyp phänokopiert und ein ähnliches DNA-Bindemuster aufweist wie Vnd. Unsere Daten lassen vermuten, das Vnd sowohl als direkter Aktivator von VC-spezifischen Genen als auch als direkter Repressor von nicht-neuronalen Genen wirkt. Um die zeitlich-örtliche Auflösung weiter zu erhöhen, habe ich mit Nikolaos Karaiskos kollaboriert, um Einzelzell-Transkriptome von Embryos einer einzigen embryonalen Stufe zu generieren und einen Genexpressions-Atlas des frühen Drosophila-Embryos mit Einzelzellauflösung zu erstellen der die nahezu genomweite Genexpression fast jeder Zelle zu rekapitulieren. Um die Nützlichkeit der Plattform zu demonstrieren, untersuchten wir Expressionsmuster von Genen, die an der Hippo-Signalkaskade beteiligt sind. Wir prognostizierten Hippo-Signalaktivität in bestimmten Bereichen des Embryos und zeigten, dass der Hippo-Signalweg die synchronisierte Zellteilung in diesen Bereichen unterbricht. / The embryonic nervous system of Drosophila melanogaster derives from the neurogenic ectoderm, which is subdivided into three distinct domains. Several key transcription factors show expression exclusive to individual columns and endow their expression domains with characteristic identities. The genes vnd and ind, for example, are homeodomain transcription factors expressed in two columns. Both have been argued to be necessary and sufficient to confer the ventral column or intermediate column fates. To address the question how these transcription factors confer identities to their expression domains I determined the transcriptomic profile of these tissues in wild type and a Vnd mutant embryos. In order to do this, I established a protocol that allowed me to sequence the transcriptomes in developing embryos with spatio-temporal resolution. I found that upon knockout of Vnd, the ventral column largely looses its neurogenic identity rather than converting its fate, as models would predict. I identified Eyeless as a novel candidate transcription factor that shapes early nerve cord identities. Furthermore the data indicates that in Vnd acts as both, activator and repressor. Excessive co-binding with the GAGA-factor GAF suggests a mechanism by which this activation might be achieved. To push spatio-temporal resolution towards the single cell level, I collaborated with Nikolaos Karaiskos to extract single cell transcriptomes of a single developmental stage. This has allowed us to establish a digital single-cell resolved transcriptomic map of a single developmental stage. We used this map to predict expression patterns of thousands of genes with striking accuracy. We identified the Hippo signaling pathway as a spatially regulated pathway in early embryos and showed that it directs the interruption of cell cycle synchronicity in specific areas of the embryo.

Die vorliegende Studie über den Alterseinfluß bei der Honigbiene (Apis mellifera) besteht aus drei Hauptteilen. Der erste Teil befasst sich mit den Charakteristiken des Spermathekeninhalts alter und junger Bienenköniginnen. Im zweiten Teil geht es um die Auswirkungen des maternalen Alters auf die embryonale Mortalität und die juvenile Entwicklung der Brut. Im dritten Studienteil werden die Auswirkungen der Verweildauer in der Spermatheca auf die embryonale Mortalität, Embryonenqualität und Larvenentwicklung der Nachkommen untersucht. Der Samen aus den Spermatheken älterer Bienen weist andere Bewegungsmuster, eine geringere Geschwindigkeit und eine anderen Enzymaktivität auf als der Samen, der aus den Spermatheken junger Königinnen gewonnen wurde. Ein altersbedingtes Nachlassen der Fertlität ist daraus zu erklären. Im Laufe von zwei Jahren wurde die embryonale Entwicklung und das Larvenwachstum von Nachkommen unterschiedlich alter Königinnen untersucht (2-jährige bis frisch begattete Königinnen). Ältere Königinnen legten kleinere Eier und deren Nachkommen zeigten eine signifikant höhere Mortalitätsrate und kleinere Entwicklungsstadien als die Nachkommen jüngerer Königinnen. In einer weiteren Studie wurde die embryonale Mortalität und die Embryonalentwicklung von Nachkommen, die aus älteren Samen entstanden, untersucht. Dabei wurde der Samen aus den Spermatheken von alten und jungen begatteten Königin entnommen und jungfräuliche Königinnen übertragen. um das Alter der Königin auszugleichen. Bei der Untersuchung wurde eine höhere embryonale Mortalität und generell, zu gewissen Entwicklungszeiten signifikant, kleine Entwicklungsstadien bei den Königinnen festgestellt, die mit dem älteren Samen befruchtet wurden. Der relative Anteil an früher und später embryonaler Mortalität war auch zwischen den beiden Spermien-Alterlassen signifikant unterschiedlich. Die insgesamt hohe embryonale Mortalität auch in der Kontrollgruppe (Königinnen besamt mit Sperma aus den Spermathecen junger Königinnen) belegt, dass die Methode der Samenextraktion und Reinsemination einen großen Einfluß auf die Embryonalentwicklung hatte. Auch das Phänomen „leerer Eier“, welches in beiden Gruppen in gleicher Frequenz vorgefunden wurde, ist möglicherweise durch diese Methode bedingt. / This study on the honey bee, Apis mellifera, consists of three major parts. The first involves the characteristics of the spermathecal content of old and young honey bee queen. The second examines maternal age effects on embryonic mortality and juvenile development of offspring in the honey bee. The third investigates on the impact of semen age on early embryonic mortality, embryo quality and larvae development in the honey bee. Semen collected from the spermatheca of old queen bees show different sperm movement patterns and slower speed than sperm from the spermathecae of young queens. This ability is possibly related to different enzyme activities and metabolisms found in the spermathecal contents of differently aged queens. The embryonic development and larval growth rate have been examined with regard to queen honey bees of different ages (2-year-old to freshly mated queens) during two years (2005 and 2006). Early embryonic mortality “EEM” has been found to be higher within the eggs from old queens than in those from younger queens. Egg volume, consequently embryo size, reduces as queen’s age. A further investigates embryonic mortality in offspring originating from older semen. This has been carried out by extracting the semen from the spermatheca of an old or/and young mated queen and re-inseminating it into a virgin queen, in order to adjust for queen age. The investigation show higher embryonic mortality in the offspring from virgin queens inseminated with semen extracted from older queens than with semen from younger queens. The relative percentage of early and late embryonic mortality within the groups was different between queens re-inseminated with aged semen. High embryonic mortality in the control semen ages may be affected by the method of extracting from semen out of the spermatheca and re-inseminating it into a virgin queen. Empty egg phenomenon, which has been found in both groups, may be related to this technique

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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Aspekten der frühen Entwicklung der Phoronida („Hufeisenwürmer“). An drei Arten wird der Furchungsprozess untersucht (Phoronis pallida, Phoronis muelleri, Phoronis vancouverensis). Dies erfolgt sowohl mithilfe der 4D-Mikroskopie als auch anhand von immunocytochemischen Markierungen der Mitosespindeln und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Verschiedene morphologische Merkmale des Furchungsprozesses werden quantitativ erfasst und innerhalb sowie zwischen den Arten verglichen. Die Ergebnisse zeigen eine weitgehend übereinstimmende Furchung bei P. pallida und P. muelleri Embryonen: Ab dem dritten Zellzyklus teilen sich die Blastomeren meist schräg – und alternierend dextral und sinistral – zur animal-vegetativ Achse. Dieses Muster zeigt überraschende Übereinstimmungen mit dem Muster der Spiralfurchung. Dies kann als morphologische Unterstützung molekular-phylogenetischer Befunde einer Stellung der Phoronida innerhalb der Spiralia/Lophotrochozoa interpretiert werden. Die Furchung bei P. vancouverensis unterscheidet sich von der Furchung der anderen beiden Arten; sie weist jedoch auch Unterschiede zu einer Radiärfurchung auf. Generell zeigt die Furchung aller drei Arten einen gewissen Grad an Variabilität. Anhand von in-vivo Einzelzellmarkierungen untersucht die Studie darüber hinaus das Schicksal der Blastomeren früher P. pallida Embryonen bis zu späten Gastrulationsstadien. Diese Analysen zeigen, dass die ersten beiden Furchungsteilungen durch die spätere Achse Blastoporus-Apikalplatte, jedoch in keinem konstanten Orientierungsverhältnis zur Ebene der Bilateralsymmetrie der Gastrula verlaufen. Dies unterscheidet sich von der Situation, wie sie von spiralfurchenden Tieren bekannt ist. Die Unterschiede und die beobachtete Variabilität des Furchungsprozesses werden im Licht unterschiedlicher Mechanismen der Spezifizierung von Zellschicksalen und Körperachsen bei verschiedenen Taxa der Spiralia und den Phoronida diskutiert. / This study addresses aspects of the early development of Phoronida (“horseshoe worms”). The cleavage process is analyzed for three species (Phoronis pallida, Phoronis muelleri, Phoronis vancouverensis). These investigations are performed using 4D-microscopy as well as immunocytochemical stainings of the mitotic spindle apparatuses in combination with confocal laser-scanning microscopy. Different morphological features of the cleavage process are quantified and compared within as well as between the species. The results reveal a highly consistent cleavage of P. pallida and P. muelleri embryos: from the third cell cycle onward, the blastomeres divide mostly obliquely – and alternatingly dextral and sinistral – with respect to the animal-vegetal axis. This cleavage pattern shows surprising correspondences to the pattern of spiral cleavage. The finding can be interpreted as morphological support for recent molecule-based phylogenies, which indicate a position of Phoronida within the Spiralia/Lophotrochozoa clade. The cleavage of P. vancouverensis differs from the cleavage in the other two species; however, it also shows differences to a radial cleavage pattern. In all three species, the cleavage process also involves some degree of variability. Furthermore, the study traces the cell fates of early P. pallida embryos up to the state of late gastrulation, by the use of fluorescent in-vivo single cell markings. These analyses reveal that the first two cleavage divisions both pass through the later axis blastopore-apical plate of the gastrula, yet they do not pass in a constant relationship with respect to the later plane of bilateral symmetry. This differs from the situation known from spiral cleaving animals. The differences and the encountered variability of the cleavage process are discussed with respect to different mechanisms of the specification of cell fates and body axes in different taxa of the Spiralia and the Phoronida.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bildgebung magnetisch markierter Stammzellen im ZNS mittels Magnetresonanztomographie. Dazu wurden Stammzellen mit Eisenoxidnanopartikeln (VSOP, very small superparamagnetic iron-oxide particles) in vitro effizient und ohne zusätzliche Lipofektionsagenzien magnetisch markiert. Es zeigte sich keine wesentliche Beeinflussung der Vitalität, Proliferation und Differenzierungsfähigkeit sämtlicher untersuchter Zellpopulationen. Zur Evaluierung der Grenzen der zellulären MR-Bildgebung wurde das Detektionslimit magnetisch markierter embryonaler Stammzellen in vivo nach intrastriataler Injektion im Gehirn der Ratte untersucht. Es ließen sich bei einer Feldstärke von 17,6 T weniger als 100 magnetisch markierte Zellen sicher vom Hirnparenchym abgrenzen. Die histologische Korrelation bestätigte den zellulären Ursprung der beobachteten T2*-Hypointensitäten. In einem Rattenmodel des Morbus Parkinson konnte eine spezifische Detektion der intrastriatal injizierten magnetisch markierten embryonalen Stammzellen über einen Zeitraum von 6 Monaten erreicht werden. Es konnte keine signifikante Migration der Zellen festgestellt werden, jedoch fanden sich große interindividuelle Unterschiede in ihrer räumlichen Verteilung. In der histologische Analyse stellten sich auch sechs Monate nach der Transplantation im Bereich des Stichkanals eisenoxidmarkierte Stammzellen dar. In einem Mausmodell der cerebralen Ischämie wurde erstmals die Anreicherung systemisch injizierter magnetisch markierter mononukleärer Zellen kernspintomographisch erfasst. 24 - 48 h nach der Injektion magnetisch markierter Zellen stellten sich T2*-gewichtete Signalhypointensitäten im Randbereich der Ischämie dar. Insgesamt zeigte sich in dieser Studie die zelluläre Magnetresonanztomographie zu einem nicht-invasiven Nachweis einer geringen Anzahl magnetisch markierter Zellen über einen langen Zeitraum mit hoher Sensitivität in der Lage. / This thesis is dealing with the imaging of magnetically labeled stem cells in the CNS using magnetic resonance imaging (MRI). Stem cells were efficiently magnetically labeled with very small superparamagnetic iron-oxide particles (VSOP), without any lipofection agents. No significant impact on vitality, proliferation and ability to differentiate could be observed after the magnetic labeling of all cell populations investigated. Magnetically labeled embryonic stem cells were injected into the striatum of rats to evaluate their detection limit by MRI. At field strengths of 17.6 T, less than 100 cells could be discriminated from the brain parenchyma as T2*-weighted hypointensities. Histology proved the cellular origin of MRI-signal changes. In a rat model of Parkinsons’s Disease, magnetically labeled embryonic stem cells could be detected by MRI after intrastriatal injection for a time period of more than 6 months. No significant migration of transplanted cells could be observed, however significant inter-individual differences concerning the spatial distribution of cells could be found. Histologically, transplanted iron-oxide-labeled cells could still be detected in the vicinity of the injection tract six months after transplantation. In a mouse model of cerebral ischemia, the enrichment of systemically injected magnetically labeled mononuclear cells was detected non-invasively by MRI. 24 to 48 hours after injection of magnetically labeled cells, T2*-weighted hypointense signal changes could be observed in the border zone of the ischemia. Over all, this study showed that cellular MRI is capable of the sensitive non-invasive detection of small numbers of magnetically labeled cells over a long period of time.

Daten des humanen Genomprojektes zeigen, dass ca. 8% des gesamten humanen Genoms aus retroviralen Sequenzen besteht. Der überwiegende Teil dieser Proviren ist aufgrund verschiedener Mutationen defekt. Im Gegensatz zu allen anderen HERV Proviren scheinen einige HERV-K Proviren intakt zu sein und besitzen offene Leserahmen für alle viralen Proteine. Die Familie des humanen endogenen Retrovirus K HML2 umfasst ca. 30 eng verwandte Proviren. Zusätzlich zu den Strukturproteinen Gag und Env und der Reversen Transkriptase, exprimiert HERV-K zwei regulatorische Proteine, Rec und Np9. Beide sind im Nukleus lokalisiert und tumorigene Eigenschaften bzw. eine Expression in Assoziation mit Tumorgeweben wurde nachgewiesen. Neben Zelllinien, wie die Teratokarzinomzelllinie GH und einigen Brustkrebszelllinien, für die die Expression von HERV-K mRNA und die Produktion von Viruspartikeln bekannt ist, konnte die Expression von HERV-K Proteinen und Partikeln für Melanomzellen gezeigt werden. Volllängen mRNA von HERV-K war in allen untersuchten humanen Proben nachweisbar. Gespleißtes env und rec war in 39% der Gewebe und in 38% der Melanomzelllinien exprimiert. Zusätzlich werden HERV-H, -R und -W exprimiert. Von den auf spezifische Antikörper gegen HERV-K Proteine untersuchten Seren der Melanompatienten waren 16% positiv für das transmembrane Hüllprotein, jedoch reagierte kein Serum mit Re oder Np9. Da im Zuge der Entstehung von Tumoren immer auch eine Dedifferenzierung der entarteten Zellen diskutiert wird, wurde die Expression von HERVs in undifferenzierten, embryonalen Stammzellen bestimmt. In den untersuchten embryonalen Stammzellen lässt sich Volllängen mRNA, sowie gespleißte env, rec und np9 mRNA nachweisen. Während der Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen sinkt die Expression jedoch wieder auf ein mit normalen Zellen vergleichbares Niveau. Obwohl gespleißte RNA und virale Proteine von HERV-K vor allem in Tumoren und Tumorzelllinien exprimiert werden, ist deren Funktion während der Tumorentstehung noch immer ungeklärt. Auch die Bedeutung der HERV-K Expression in humanen Stammzellen ist noch unklar, insbesondere in Hinblick auf eine mögliche Tumorigenität. / In contrast to all other human endogenous retroviruses, proviruses of the human endogenous retrovirus family HERV-K have maintained open reading frames for all viral proteins. Although most proviruses are defective, structural proteins Gag and Env, the reverse transcriptase and two regulatory proteins, Rec and Np9, have been described. Rec resembles the Rev protein of HIV and tumourigenic potential was confirmed. Np9 as well is located in the nucleus and expression in association with tumour tissues was observed. Additionally to cell lines known to produce HERV-K virus particles, such as the teratocarcinoma cell line GH and breast cancer cell lines, recently melanoma cells were described to express HERV-K proteins and particles. In order to study the expression of HERV-K, -H, -R and -W, in melanoma cell lines and biopsies primer sets were used. Antisera specific for HERV-K proteins were used for immunohistochemistry and sera from melanoma patients were investigated for HERV-K specific antibodies. Full length mRNAs of all HERVs were found in all human cells. Spliced env and rec of HERV-K were detected in 39% of the melanoma biopsies and in 38% of the melanoma cell lines. Expression of HERV-K in situ was shown by immunohistochemistry. In addition, 16% of the patients sera tested showed antibodies against the HERV-K transmembrane envelope protein, but no antibodies against Np9 or Rec could be detected. A certain dedifferentiation of cells as a consequence of tumour development is discussed. Therefore the expression of HERV-K in undifferentiated embryonic stem cells was investigated. The investigated stem cells showed expression of HERV-K full length, env, rec and np9 mRNA. Although the expression decreased with differentiation to neuronal precursor cells. Even though HERV-K mRNA and proteins were expressed in a high percentage of melanomas their function in tumour development is still unclear. As well as the meaning of the HERV-K expression in embryonic stem cells, particularly for a tumourigenic potential.

Mammals have two orthologs, Mll and Trx2, for the Drososphila protein Trithorax (TRX), which is the founding member of the trithorax group (TrxG) of epigenetic regulators. TrxG proteins are characterized by an evolutionary conserved SET domain. A major function of all SET domain- containing proteins is to modulate gene activity, but the underlying mechanisms are poorly understood. Apparently TRX, Mll and Trx2 are histone H3 lysine 4 specific methyltransferases. So far all evidence points to roles in expression of specific target genes. However, target genes and function of the epigenetic regulator Trx2 were still unknown. Homozygous trx2 mutant embryos arrest in development because of severe and widespread defects {Glaser, 2005 #296}. Thus mouse embryonic stem (ES) cells carrying a null mutation of trx2 were used as an alternative model system to address the implication of Trx2 in differentiation. This study showed that Trx2 is redundant for ES cell self-renewal. Homozygous trx2 knockout ES cells did not exhibit cell cycle defects. However, loss of Trx2 resulted in reduced proliferation and increased apoptosis rates in trx2-/- ES cells. Due to the fact that differentiation requires an appropriate rate of population growth, trx2-/- cells were affected adversely upon in vitro differentiation. Neurogeneic differentiation of trx2 mutant cells generated fewer mature neurons than wild type cells. Moreover a temporal delay in the developmental progression to differentiation became apparent. Cardiac differentiation of trx2-/- cells confirmed the developmental defect and temporal delay. Notably differentiation of trx2-/- cells was merely delayed or impaired but it was not absent, implying that Trx2 is not required for gene expression programs specific for neurons or cardiac myocytes. We propose that differentiation of trx2-/- ES cells is impaired because apoptosis is disturbing differentiation. Apart from analyzing the phenotype of trx2 mutant cells, this work was focused on the identification of Trx2 target genes. Oligonucleotide expression arrays were used to identify genes whose expression levels were affected by the absence of Trx2. In general, loss of Trx2 function resulted in more genes with decreased than increased expression levels. This is consistent with the hypothesis that Trx2 functions as a transcriptional activator. Comparison of gene expression profiles for constitutive and conditional trx2 mutant cells enabled a distinction between direct and indirect target genes for Trx2. As a result Magoh2 was identified as the key candidate target gene for Trx2. Interaction between Trx2 and Magoh2 suggested a potential regulatory role for Trx2 in alternative splicing. Furthermore this work provided evidence that Trx2 could be involved in the maintenance of CpG island promoter gene expression, thus providing a potent regulatory mechanism for ubiquitously expressed genes.

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