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Improving the Histone Replacement System in Drosophila melanogaster for High-Throughput AnalysisGrüblinger, Florian 08 July 2022 (has links)
Eukaryotische DNA ist in Chromatin verpackt, einem Komplex aus DNA und Proteinen. Das ermöglicht Transkriptionsregulation von Genen durch Modulation ihrer Zugänglichkeit. Histone sind evolutionär konservierte Chromatinproteine, die durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) modifiziert sind. Das legt nahe, dass deren Primärstruktur und ihre PTMs funktionellen Beschränkungen unterliegen. Genetische Ansätze zur Entschlüsselung von Struktur-Funktions-Beziehungen für Histone waren auf Einzeller und D. melanogaster beschränkt. Das Histon-Ersatz-System in D. melanogaster, bei dem Histontransgene verwendet werden, um endogene Histone zu ersetzen, war nicht für systematische Untersuchung dieser Beziehungen ausgelegt. In meiner Arbeit habe ich die Funktion von Threonin 11 in Histon H3 (H3T11) untersucht, das phosphoryliert werden kann. Ich analysierte zwei Mutationen in H3T11 (H3T11A und H3T11E) und stellte fest, dass beide zur Derepression von Transposons führen. H3T11E hat in Gegenwart von Wildtyp-Histon H3 einen dominanten Phänotyp mit transkriptomweiten Folgen. Dazu gehören Induktion von Immun-Genen und Unterdrückung von mit DNA-Stoffwechsel in Verbindung stehenden Genen. Die Mutationen wurden unter der Prämisse charakterisiert, ein Analyse-Schema für eine große Anzahl von Histon-Ersatz-Stämmen zu entwickeln und Probleme zu identifizieren, die die Analyse beeinträchtigen. Dabei habe ich das Verfahren zur Erzeugung von Histon-Ersatz-Stämmen optimiert. Dazu gehören die optionale Verwendung größerer Histon-Transgene und zuverlässigere Produktion und optimierte Rekombinations-Strategie dieser. Ich habe das Klonierungsverfahren gestrafft und eine Plasmid-Bibliothek erstellt, die es erlaubt, 178 verschiedene mutierte Histon-H3-Transgene zu erzeugen. Mit den Änderungen am Produktionsschema, ist diese Bibliothek eine wertvolle Ressource und wird dazu beitragen, die Funktion von Histon H3 und seiner PTMs während der Entwicklung eines Vielzellers besser zu verstehen. / Eukaryotic DNA is packaged into chromatin, a complex composed of DNA and proteins. This enables transcriptional regulation of genes through modulation of their accessibility. Histones are chromatin proteins, modified by post-translational modifications (PTMs) and their sequences are conserved in evolution. This suggests functional constraints for the primary structure of histones and their PTMs. Genetic approaches to decipher structure-function relationships for histone proteins were restricted to unicellular organisms and D. melanogaster. The histone replacement system in D. melanogaster, which uses histone transgenes to replace endogenous histones, was not adapted for systematic interrogation of such relationships. Here, I investigated the function of threonine 11 in histone H3 (H3T11), which can be phosphorylated. I analyzed two mutations in H3T11 (H3T11A and H3T11E) and found that both lead to de-repression of transposable elements. I also found that H3T11E, has a dominant phenotype in the presence of wildtype histone H3 with transcriptome-wide consequences. These include induction of immune-related genes and repression of genes associated with DNA metabolism. I characterized both mutations under the premise of establishing an analysis scheme suitable for a large set of histone replacement strains and identifying problems that interfere with this analysis. As a consequence, I optimized the procedure to generate histone replacement strains. These include an option to incorporate larger histone transgenes, a more reliable production of transgenes and an optimized strategy to recombine them. I streamlined the cloning procedure and created a plasmid library allowing for the generation of 178 distinct mutant histone H3 transgenes. Together with my amendments to the production scheme, this library provides a valuable resource to the field and will help to better understand the function of histone H3 and its PTMs during the development of a multicellular organism.
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Zellbiologische Untersuchung α-Mannosidase-defizienter und Enzym-behandelter Mäuse / Cell-biological characterisation of α-mannosidase-deficient and enzyme-treated miceDamme, Markus 26 June 2009 (has links)
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Real impossible worlds : the bounds of possibilityKiourti, Ira Georgia January 2010 (has links)
Lewisian Genuine Realism (GR) about possible worlds is often deemed unable to accommodate impossible worlds and reap the benefits that these bestow to rival theories. This thesis explores two alternative extensions of GR into the terrain of impossible worlds. It is divided in six chapters. Chapter I outlines Lewis’ theory, the motivations for impossible worlds, and the central problem that such worlds present for GR: How can GR even understand the notion of an impossible world, given Lewis’ reductive theoretical framework? Since the desideratum is to incorporate impossible worlds into GR without compromising Lewis’ reductive analysis of modality, Chapter II defends that analysis against (old and new) objections. The rest of the thesis is devoted to incorporating impossible worlds into GR. Chapter III explores GR-friendly impossible worlds in the form of set-theoretic constructions out of genuine possibilia. Then, Chapters IV-VI venture into concrete impossible worlds. Chapter IV addresses Lewis’ objection against such worlds, to the effect that contradictions true at impossible worlds amount to true contradictions tout court. I argue that even if so, the relevant contradictions are only ever about the non-actual, and that Lewis’ argument relies on a premise that cannot be nonquestion- beggingly upheld in the face of genuine impossible worlds in any case. Chapter V proposes that Lewis’ reductive analysis can be preserved, even in the face of genuine impossibilia, if we differentiate the impossible from the possible by means of accessibility relations, understood non-modally in terms of similarity. Finally, Chapter VI counters objections to the effect that there are certain impossibilities, formulated in Lewis’ theoretical language, which genuine impossibilia should, but cannot, represent. I conclude that Genuine Realism is still very much in the running when the discussion turns to impossible worlds.
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Entwicklung immunchemischer Methoden zur Spurenanalytik der Sprengstoffe Nitropenta und TrinitrotoluolHesse, Almut 04 May 2017 (has links)
Der Sprengstoff PETN ist äußerst schwer zu detektieren. Ein verbesserter anti-PETN-Antikörper wurde durch Anwendung des Bioisosterie-Konzepts entwickelt. Diese polyklonalen IgGs sind sehr selektiv und sensitiv. Die Nachweisgrenze des ELISAs beträgt 0,15 µg/L. Der Messbereich des Immunoassays liegt zwischen 1 und 1000 µg/L. Die Antikörper sind recht pH-stabil als auch robust gegen Lösungsmittelzusätze. Für die Umweltanalytik von TNT wurde eine HPLC-kompatible Affinitätssäule mit porösem Glas als Trägermaterial hergestellt. Um die anti-TNT-Antikörper selektiv aus den TNT-Seren zu isolieren, wurde eine Trennung an einer Dinitrophenyl-Affinitätssäule durchgeführt. Zur Optimierung der Kopplungsmethode wurden orangefarbene Dabsyl-Proteine synthetisiert und auf der Oberfläche gebunden. Die Färbung wurde als Indikator für die Ligandendichte verwendet. Wegen der hohen Affinitätskonstanten der anti-TNT-IgGs lässt sich TNT nicht reversibel von der TNT-Affinitätssäule eluieren. Daher wurde eine neuartige Elutionsmethode entwickelt, die thermische Online-Elution. Die maximale Kapazität einer TNT- Affinitätssäule betrug 650 ng TNT bzw. 10 µg/mL Säulenvolumen. Um die Ligandendichte der TNT-Affinitätssäulen zu bestimmen, wurde ein neues Verfahren entwickelt, da die spektroskopischen Proteinbestimmungsmethoden nicht geeignet waren. Zur Proteinbestimmung wurde eine HPLC-Trennung der Aminosäuren Tyr und Phe ohne vorherige Derivatisierung entwickelt. Die Proteinhydrolysezeit wurde durch Einsatz einer Mikrowelle von 22 h auf 30 min verkürzt. Zur internen Kalibrierung wurden HTyr und FPhe verwendet. Die Nachweisgrenze bei 215 nm ist sowohl für Tyr als auch für Phe 0,05 µM (~ 10 µg/L). Dieses neue Verfahren, das als Aromatische Aminosäureanalyse (AAAA) bezeichnet werden kann, wurde zur Proteinbestimmung von homogenen Proben mit NIST-BSA validiert, wobei die Nachweisgrenze für Proteine 16 mg/L (~ 300 ng BSA) ist. Die relative Standardabweichung incl. der Hydrolysestufe beträgt 5%. / The explosive Pentaerythritol tetranitrate (PETN) is extremely difficult to detect. An improved antibody against PETN was developed by using the bioisosteric concept. These polyclonal antibodies are highly selective and sensitive. The limit of detection (LOD) of the ELISA was determined to be 0.15 µg/L. The dynamic range of the assay was found to be between 1 and 1000 µg/L. The antibodies are sufficiently pH-stable and resistant to solvent additives. An HPLC-compatible TNT-affinity column with porous glass as support material was prepared for the environmental analysis. In order to isolate the anti-TNT antibodies of the TNT sera a separation was carried out on a dinitrophenyl-affinity column. To optimize the immobilization method, orange-coloured dabsyl proteins were synthesized and bound to the surface. The colour intensity was found to be an indicator for the immobilization rate. In consequence of the high affinity constants of the anti-TNT antibodies, TNT can''t elute by a typical acidic elution step. Therefore, a novel separation approach, the thermal online-elution was developed. The maximum capacity of an affinity column was 650 ng TNT or 10 µg/mL of column volume. To quantify the immobilization rate of proteins, a new method has been developed, because the usual protein determination methods were unsuitable. Therefore an HPLC separation method of Tyr and Phe was developed without prior derivatization. Two internal standard compounds, HTyr and FPhe, were used for calibration. The LOD was estimated to be 0.05 µM (~ 10 µg/L) for Tyr and Phe at 215 nm. The protein hydrolysis time was reduced from 22 h to 30 min using microwave technique. This procedure, that was termed aromatic amino acid analysis (AAAA), has been validated for protein determination of homogeneous samples with NIST-BSA. The LOD for proteins was calculated to be below 16 mg/L (~ 300 ng BSA absolute). The relative standard deviation, including the hydrolysis step, is 5%.
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Therapie osteochondraler Defekte des Kniegelenks unter Verwendung des Knorpel-Knochen-Ersatzmaterials (TruFit®) in Kombination mit einer einzeitigen autologen Knorpelzelltransplantation im Langzeittierversuch / Treatment of osteochondral lesions in the knee joint using scaffolds for cartilage and bone (TruFit®) in combination with a single-step autologous chondrocyte transplantation in a long-term animal experimentMichalak, Milosch 15 April 2015 (has links)
Knorpeldefekte des Kniegelenks zeichnen sich durch eine sehr begrenzte spontane Heilungstendenz aus und führen im Verlauf häufig zur Arthrose. Trotz intensiver Forschungsbemühungen konnte bisher keine neue Therapieoption eine zufrieden-stellende Alternative zu den bisherigen Therapien hervorbringen. Eine ACI in Kombination mit einem künstlich hergestellten Knorpel-Knochen-Ersatzmaterial scheint jedoch großes Potential für die Therapie von Knorpel-Knochen-Schäden zu besitzen.
Im vorliegenden Langzeittierversuch mit Kaninchen wurde eine einzeitige ACI mit einem biphasischen Ersatzmaterial (TruFit®) und platelet-rich-plasma (PRP) kombiniert. Zu diesem Zweck wurde in der medialen Femurkondyle ein critical-size-Defekt mit einem Durchmesser von 4,5 mm gesetzt. In der ersten Versuchsgruppe blieb der Defekt unbehandelt (Leer). Bei der zweiten Gruppe wurde die Defekthöhle mit einem TruFit®-Zylinder aufgefüllt (TFP). Gruppe drei erhielt zusätzlich PRP (TFP+PRP) und Gruppe vier wurde darüber hinaus mit einer einzeitigen ACI kombiniert (TFP+PRP+C), bei der Chondrozyten mit Hilfe eines speziellen Kollagenase-Schnellverdaus isoliert werden konnten.
Die Auswertung der Knorpel-Knochen-Regeneration erfolgte nach 12 Monaten durch eine Mikroradiographie, eine intravitale Fluoreszenzmarkierung des Knochens und durch Toluidinblau-O- und Safranin-O-Färbungen. Verwendet wurden die Scores nach Wakitani und O’Driscoll.
Dabei konnte gezeigt werden, dass eine TruFit®-Therapie die Knochenregeneration positiv beeinflussen kann. Die Zugabe von PRP bewirkte die Bildung von zahlreichen dünnen Trabekeln mit einer erhöhten Anzahl trabekulärer Verbindungen, allerdings auch eine schlechtere Rekonvaleszenz der subchondralen Knochenschicht. Bezüglich der Knorpelheilung schnitt die Gruppe TFP+PRP+C am besten ab, wobei die Unterschiede nicht signifikant waren. Insgesamt zeigten alle Versuchsgruppen eine unzureichende osteochondrale Regeneration, so dass für die Therapie am Menschen zunächst weitere Studien nötig sind, die sowohl ossär als auch chondral eine verbesserte Heilungspotenz demonstrieren können. Bisher fehlen groß angelegte Studien um Therapieempfehlungen bezüglich des Ersatzmaterials, der genauen Durchführung der einzeitigen ACI und Zusätzen wie Wachstumsfaktoren zu machen.
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FauxtopiaKampf, Raymond William 01 January 2004 (has links)
To all who come to this fictitious place:Welcome.Fauxtopia is your land. Here, age relives distorted memories of the past, and here, youth may savor the challenge of trying to understand the present. Fauxtopia is made up of the ideals, the dreams and the fuzzy facts which have re-created reality... with the hope that it will be a source of edutainment for all the world.Ray KampfFauxtopia DedicationApril 1st, 2004
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