O splicing alternativo é um processo no qual moléculas idênticas de pré-mRNA são processadas de diferentes formas. Ele é fundamental em organismos complexos, pois é responsável por criar uma ampla diversidade de proteínas a partir de um número relativamente pequeno de genes. Contudo, poucas proteínas advindas do splicing alternativo já foram identificadas, visto que a maioria dos espectros de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) não encontra sequências correspondentes nos diversos bancos de dados de proteínas disponíveis. Entre diversos fatores, isso ocorre porque um número reduzido de eventos de splicing alternativo (ASEs) são conhecidos e devidamente estudados. Nesse trabalho, o espectro de eventos observáveis foi ampliado por meio da análise de eventos complexos de splicing alternativo (CASEs), que consideram múltiplos ASEs em um ou diferentes transcritos. Foi desenvolvido um novo método de análise utilizando expressões regulares (regexes) associada a uma sintaxe baseada em caracteres intuitivos. O método de análise e a sintaxe foram implementados em uma ferramenta web denominada de SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) que também apresenta ferramentas extras de análise. Adicionalmente, os subestimados eventos do tipo retenção de íntron (IR) foram explorados em busca de evidências funcionais por meio de análises de MS/MS. Como resultado, eventos bastante incomuns foram observados no proteoma humano, sugerindo que muito pouco ainda é conhecido sobre a complexidade transcriptômica e proteômica humana. Portanto, com base nesses dados, esse trabalho representa um grande avanço no estudo de fenômenos de splicing alternativo ainda pouco explorados. / Alternative splicing is defined, basically, as a process in which identical pre-mRNA molecules are processed in different ways in terms of usage of exon/introns borders. It is a fundamental process in complex organisms, and is responsible for creating a large diversity of proteins from a relatively small number of genes. However, just a few proteins resulted from alternative splicing were already identified, since only a small part of \\emph mass spectrometry (MS/MS) spetras match proteins in sequence databases. Among different factors, it occurs because a reduced number of alternative splicing events (ASEs) are known and properly studied. In this work, the landscape of observable events was amplified through the analysis of complex alternative splicing events (CASEs), which consider different ASEs within the same or different transcripts. A method of analysis was developed using regular expressions (regexes) associated with a syntax composed of intuitive characters. Those features were implemented in a web tool called SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) that also has extra analysis tools.Furthermore, the understudied events known as intron retention (IR) were explored using MS/MS analyses as a strategy to identify functional roles. As result, very uncommon events were observed in human proteome, suggesting that little is currently known about the complexity of the human proteome and transcriptome. Based on those data, it can be concluded that this work represents a significant advance in the study of uncommon and understudied alternative splicing events.

As proteínas são consideradas importantes alvos para os oxidantes, devido à abundância em sistemas biológicos e às altas constantes de reações com estas espécies. Adicionalmente, têmse demonstrado que o triptofano (W) é um aminoácido extremamente susceptível a oxidação, inclusive pelo oxigênio singlete (1O2). A reação do W com o 1O2 tem despertado o interesse de diversos pesquisadores. Recentemente, esta reação tem atraído mais atenção, uma vez que produtos de oxidação do W tais como N-formilquinurenina (FMK) e quinurenina (kn) têm sido associados com algumas condições patológicas, tais como o desenvolvimento de catarata e a formação de agregados covalentes da superóxido dismutase envolvidos na esclerose lateral amiotrófica. Entretanto, há poucos trabalhos enfocando detalhadamente as reações, com estudos de estabilidade, identificação de subprodutos e propostas mecanísticas. Desta forma, pretendemos com este trabalho contribuir no esclarecimento do mecanismo de oxidação do triptofano pelo 1O2, através da análise e caracterização de produtos de oxidação gerados. Com este intuito, dois hidroperóxidos de triptofano isômeros (WOOH cis e trans, em relação ao grupamento carboxila) foram completamente caracterizados por análises de HPLC/espectrometria de massa e RMN como os principais produtos de oxidação do W pelo 1O2. Estes hidroperóxidos demonstraram ser relativamente estáveis às temperaturas ambiente e fisiológica, decompondo lentamente para os alcoóis correspondentes. O aumento do pH e/ou o aquecimento das soluções contendo os WOOH leva a decomposição quimiluminescente dos WOOH à FMK. Utilizando hidroperóxidos isotopicamente marcados com [18O] (W18O18OH) foi possível confirmar que a FMK formada durante esta decomposição era marcada com dois átomos de oxigênio. Este resultado demonstra que os dois átomos da FMK são derivados do grupamento hidroperóxido. Em adição, estas reações são quimiluminescentes, sugerindo o envolvimento de um intermediário dioxetano. Este mecanismo foi confirmado uma vez que o espectro de quimiluminescência da decomposição dos WOOH pode ser sobreposto ao espectro de fluorescência da FMK, inequivocamente identificado a FMK como a espécie emissora. Dioxindoilalaninas diastereoisoméricas também foram caracterizadas como produtos de oxidação do triptofano pelo 102; uma possível via radicalar foi excluída. Em suma, este estudo contribuiu na elucidação das bases químicas envolvidas na oxidação do triptofano por 102, através da caracterização dos produtos formados e da investigação detalhada dos mecanismos de decomposição destes produtos. / Proteins have been considered important targets for reactive oxygen species. Indeed, tryptophan (W) has been shown to be a highly susceptible amino acid to many oxidizing agents, including singlet molecular oxygen (1O2). The reaction of 1O2 with W has long been a matter of concern, and has recently attracted considerably more attention because W-derived oxidation products such as N-formylkynurenine (FMK) and kynurenine (kn) have been associated with some pathological conditions such as the development of cataracts and the formation of covalent aggregates of superoxide dismutase, which has been implicated in amyotrophic lateral sclerosis. Despite the intense interest in the mechanism of W oxidation, there are a lot of gaps that remains to be elucidated. In this context, the current study was undertaken to investigate the chemical basis involved in W oxidation by 1O2. We are concerned about the chemistry of the initially formed hydroperoxides, their stability, further reactions and the mechanism leading to FMK conversion. With this purpose, two cis and trans tryptophan hydroperoxide (WOOH) isomers were completely characterized by HPLC/mass spectrometry and NMR analyses as the major W-oxidation photoproducts. Also, they were shown to be relatively stable at ambient and physiological temperatures, leading to a slow decomposition to the corresponding alcohols. Increasing the pH or heating the solutions gives rise to a luminescent decomposition of the WOOH to FMK. Using 18O-labeled hydroperoxides (W18O18OH), it was possible to confirm the formation of a two-oxygen-labeled FMK molecule derived from W18O18OH decomposition. This result shows that both oxygen atoms in FMK are derived from the hydroperoxide group. In addition, these reactions are chemiluminescent (CL), indicating a dioxetane cleavage pathway. This mechanism was confirmed since the CL spectrum of the WOOH decomposition matched the FMK fluorescence spectrum, unequivocally identifying FMK as the emitting species. Diastereoisomeric dioxindoyalanine were also characterized as oxidation products derived from the reaction of W with 1O2. The involvement of radicals in this reaction was excluded. In summary, this work offers further insights into the chemistry involved in W-oxidation, through the characterization of photoproducts and the detailed investigation about the decomposition mechanism of these products.

Metodologia proteômica baseada em eletroforese bi-dimensional (2D-PAGE) foi usada para auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na injúria renal induzida pelo flúor (F) e definir biomarcadores potenciais para fluorose. Três grupos de ratos Wistar machos recém-desmamados (21 dias de vida) foram tratados com água de beber contendo 0 (controle), 5 ou 50 ppm F, por 60 dias (n=6/grupo). Durante o período experimental, os animais foram mantidos individualmente me gaiolas metabólicas, a fim de que o consumo de água e ração fosse avaliado, bem como as excreções urinária e fecal de F. Os animais foram mortos e o rim esquerdo e o soro foram coletados para análises histopatológica e de F, respectivamente. Para análise proteômica foram coletados o rim direito e a urina (no dia anterior ao sacrifício, num coquetel contendo inibidores de protease em gelo). Após o isolamento das proteínas, os perfis proteômicos renal e urinário foram examinados usando 2D-PAGE e coloração com azul de Coomassie brilhante. Foi possível detectar uma doseresposta em relação à ingestão e excreção de F, bem como em relação aos níveis de F presentes no soro e nos rins dos animais. As análises histológicas não revelaram danos aos rins induzidos pelo F, com exceção de uma congestão vascular no grupo de 50 ppm F. Para os rins, a análise quantitativa de intensidade (software Image Máster Platinum, alterações de 2 vezes) revelou 30 e 17 proteínas diferencialmente expressas, respectivamente, entre os grupos controle X 50 ppm F e controle X 5 ppm F. Para a urina, 9, 10 e 13 proteínas aumentaram ou diminuíram nos grupos controle X 5 ppm F, 5 ppm F X 50 ppm F e controle X 50 ppm F, respectivamente. Nove proteínas foram identificadas satisfatoriamente por MALDI-TOF TOF MS. As proteínas identificadas estão relacionadas principalmente ao metabolismo, desintoxicação e housekeeping. Esses dados indicam que a análise proteômica de rim e urina de animais tratados com F é capaz de identificar proteínas diferencialmente expressas, mesmo em casos de baixas doses de F. Assim, essa ferramenta pode contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na fluorose, apontando proteínas-chave que deveriam ser melhor investigadas, bem como potenciais biomarcadores de toxicidade. / Two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) based proteomics approach was used to better understand the molecular mechanisms of renal injury induced by fluoride (F) and define potentials biomarkers of fluorosis. Three groups of weanling male Wistar rats (21 days old) were treated with drinking water containing 0 (control), 5, or 50 ppm F for 60 days (n=6/group). During the experimental period, the animals were kept individually in metabolic cages, in order to analyze the water and food consumption, as well as fecal and urinary F excretion. Animals were killed and left kidney and serum were collected for histopathological examination and F analysis, respectively. For proteomic analysis, right kidney and urine (one day before sacrifice, in protease-inhibitors cocktail for 8 hours in ice box) were collected. After protein isolation, renal and urinary proteome profiles were examined using 2D-PAGE and coomassie brilliant blue staining. It was possible to detect a dose-response regarding F intake and F excretion, as well as F levels in serum and kidneys. The histological analysis revealed no damage in kidneys induced by F, except for a vascular congestion in the 50 ppm F group. For kidney, quantitative intensity analysis (Image Master Platinum software, 2-fold changes) revealed 30 and 17 differentially expressed proteins between control X 50 ppm F, and control X 5 ppm F groups, respectively. As for urine, 9, 10 and 13 proteins increased or decreased in control X 5 ppm F, 5 ppm F X 50 ppm F and control X 50 ppm F groups, respectively. Nine proteins were successfully identified by MALDI-TOF TOF MS. The identified proteins are mainly related with metabolism, detoxification and housekeeping. These data indicate that proteomic analysis in kidney and urine of F-treated animals is able to identify differentially expressed proteins, even in cases of low F doses. Thus, this approach can contribute for the understanding of the mechanisms underlying fluorosis, by indicating key-proteins that should be better addressed, as well as potential toxicity biomarkers.

Orientador: Mario Henrique Gonzalez / Coorientador: Ana Rita de A. Nogueira / Banca: Márcia Cristina Bisinoti / Banca: Edilene Cristina Ferreira / Resumo: O mercado de pescados no Brasil tem se expandido muito nos últimos anos e com previsão de um crescimento ainda maior. A busca crescente por essa fonte de alimento no país leva à uma preocupação associada a qualidade do pescado, principalmente se tratando de metais tóxicos presentes nas águas e sedimentos dos rios. Os peixes, assim como outros frutos do mar, têm a capacidade de bioacumular estes metais em seu organismo, seja por contato direto ou indireto. O arsênio é um destes contaminantes e está presente naturalmente em águas e sedimentos, e também advindo de atividades antropogênicas como queima de combustíveis fósseis e agrotóxicos. A concentração de arsênio total nos principais tecidos da tilápia foram determinados e uma estimativa dos riscos associados ao consumo deste peixe na região Noroeste de São Paulo foi realizada, levando em conta as diretrizes estabelecidas pela FAO/OMS. As análises foram realizadas por espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) no modo de discriminação de energia cinética (KED). Materiais de referência certificados foram analisados com recuperações de 101, 110 e 80% de NIST 1640a, NIST 1566b e DORM-3, respectivamente. Na parte consumível (o tecido muscular dos peixes), a concentração média encontrada foi de 0,030 ± 0,008 μg g-1, que é inferior ao valor máximo permitido de arsênio estabelecido pelas agências reguladoras nacionais e internacionais. A concentração média encontrada nas vísceras (estômago, brânquias e fígado... / Abstract: Seafood market in Brazil has expanded greatly in recent years and is expected to grow even more. The search for this food source in the country leads to a concern associated with the quality of the fish, mainly by the treatment of toxic metals in the waters and sediments of the rivers. Fish, like other seafood, have the ability to bioaccumulate these metals in your body by direct or indirect contact. Arsenic is one of these contaminants and is naturally present in waters and sediments, as well as from anthropogenic activities such as the burning of fossil fuels and agrochemicals. The concentration of total arsenic in the main tissues of tilapia were evaluated and an estimation of the risks associated with the consumption of this fish was done, taking into account the guidelines established by FAO/WHO. The analyses were performed by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) in kinetic energy discrimination mode (KED). Certified reference materials were analyzed with recoveries of 101, 110, and 80% from NIST 1640a, NIST 1566b, and DORM-3 respectively. In the consumable portion (the muscle fish tissue), the average concentration found was 0,030 ± 0,008 µg g-1 which it is below the arsenic maximum level established by international regulatory agencies. The mean concentration found in the viscera (stomach, gills and liver) was in the range of 0,016 - 1,170 μg g-1, demonstrating a higher bioaccumulation capacity of arsenic. Bioaccumulation tests were performed with As(III) (most toxic arsenic species) with laboratory grown tilapia. The assay was divided into 7 days of exposure and 7 days of clearance to the contaminant. The results demonstrated that the stomach and liver play an important role in the absorption and accumulation of this semimetal present in contaminated water. The estimation of the toxicokinetic parameters (absorption, depuration and Bioconcentration ... / Mestre

O extrato pirolenhoso é uma substância orgânica resultante da condensação da fumaça gerada durante a carbonização da madeira ou de outras fontes de matéria-prima vegetal, sendo constituído por, pelo menos, 80% de água e dezenas de compostos, dentre os quais se incluem substâncias fenólicas, aldeídos e ácidos orgânicos. Portanto, não seria utópico supor-se que nessa gama de compostos possam estar incluídas substâncias que apresentem propriedades conservantes para aplicações na área cosmética e de saneantes. É nessa direção que se avaliou o potencial de utilização do extrato pirolenhoso da madeira de eucalipto. Especificamente, houve a intenção de se estudar as características e propriedades do extrato pirolenhoso obtido dessa madeira levando-se em conta duas fontes distintas; avaliar em particular suas propriedades antifúngicas, e as possibilidades do uso do extrato pirolenhoso como conservante, na substituição de ingredientes como, por exemplo, o formaldeído, ainda hoje utilizado na indústria em formulações de produtos cosméticos e atualmente proibido em produtos saneantes, segundo nova resolução RDC 35/08 da ANVISA. Os compostos químicos presentes am ambos os extratos foram identificados mediante análises em cromatógrafo acoplado a espectrômetro de massa (GC/MS). De forma geral, as análises dos extratos demonstraram a presença de uma gama de compostos oxigenados, tais como ácidos carboxílicos, ésteres, éteres e cetonas. Além disso, foram detectados fenol, guaicol e derivados fenólicos. O produto que apresentou o melhor potencial antifúngico foi o extrato pirolenhoso de uma das fontes estudadas. / Pyroligneous extract is an organic substance resulting from the condensation of the smoke generated during the carbonization of wood or other vegetable raw material, consisting of at least 80% of water and many compounds including: phenolic substances, aldehydes and organic acids. It would not be utopian, therefore, to assume that, in this gamma of compounds there could be substances having preservative properties for cosmetic and sanitizing products. This study evaluates the potential of the pyroligneous extract of eucalyptus wood. Specifically, the characteristics and properties of the pyroligneous extract from eucalyptus wood from two distinct sources; to evaluate in particular its antifungal proprieties and the possibility of using the pyroligneous extract as a preservative. This would substitute, for example, the formaldehyde currently used in the cosmetic industry. In fact formaldehyde has now been forbidden in sanitizing products; resolution RDC 35/08 of ANVISA. The chemical compounds of both extracts were identified by analyses of a gaseous chromatograph connected to the mass spectrometer (GC/MS). In general, the analysis of extracts demonstrated the presence of oxygenated components gamma such as carboxylic acids, esters, ethers and ketenes. Moreover, phenol, guaicol and phenol derivatives were detected. The product that showed better potential antifungal results was the pyroligneous extract from one of the studied sources.

Orientador: André Gonzaga dos Santos / Banca: Fábio Ferreita Perazzo / Banca: Gustavo Henrique Bianco de Souza / Banca: Taís Maria Bauab / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Resumo: O objetivo geral deste trabalho foi realizar um estudo químico-farmacológico do extrato etanólico de folhas de Casearia sylvestris Swartz (EEtCs), frações obtidas por extração em fase sólida (EFS1: apolar; EFS2: rica em diterpenos clerodânicos; EFS3: polar) e padrões de diterpenos clerodânicos (DC). Os objetivos da parte química foram caracterizar os padrões de DC por espectrometria de massas (full scan e fragmentação) com fonte de ionização por spray de elétrons (ESI-MS e MSn) e identificar DC no EEtCs e na EFS2 por ESI-MS, ESI-MSn e por cromatografia em camada delgada de alta eficiência com detecção por imagem química formada por espectrometria de massas com fonte de dessorção por spray de elétrons (HPTLC-DESI-MS-IMAGING). A parte farmacológica consistiu na investigação da atividade anti-inflamatória e gastroprotetora do EEtCs, frações (EFS1-3) e padrões de DC. A atividade anti-inflamatória foi avaliada por meio de ensaios em ratos, pleurisia induzida pela carragenina e edema de pata induzido por uma fosfolipase A2 de veneno de Bothrops jararacussu (BthTX-II), e os seguintes ensaios in vitro: atividade enzimática das ciclo-oxigenases 1 e 2 (COX-1 e COX-2) e produção de óxido nítrico (NO) e prostaglandina E2 (PGE2) por macrófagos estimulados por lipopolissacarídeo. A atividade gastroprotetora foi avaliada em modelo de lesões gástricas induzidas por indometacina em ratos e ensaio in vitro de atividade anti-Helicobacter pylori. Os resultados levaram às conclusões a seguir. A caracterização dos padrões de DC por espectrometria de massas permitiu estabelecer o padrão de fragmentação dos DC com anel diacetálico do tipo das casearinas, o qual representa uma importante fonte de informação para desreplicação em estudos metabolômicos de extratos vegetais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to carry out a chemical-pharmacological study of the ethanol extract from leaves of Casearia sylvestris Swartz (EtECs), fractions obtained by solid phase extraction (SPE1: nonpolar; SPE2: rich in clerodane diterpenes; SPE 3: polar) and standards of clerodane diterpenes (CD). The objectives of the chemical step was to characterize standards of CD by mass spectrometry (full scan and fragmentation) using electrospray ionization (ESI-MS and MSn) and to identify CD in EtECs and SPE2 by ESI-MS, ESI-MSn and high performance thin layer chromatography/desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging (HPTLC-DESI-MS-IMAGING). The pharmacological study consisted in investigation of anti-inflammatory and gastroprotective activities of EtECs, fractions (SPE1-3) and CD standards. The anti-inflammatory activity was assessed in rats through pleurisy induced by carrageenan and paw edema induced by phospholipase A2 from Bothrops jararacussu venom (BthTX-II), and the following in vitro assays: enzymatic activity of cyclooxygenases 1 and 2 (COX-1 and COX-2) and macrophage stimulation by lipopolysaccharide to investigate the production of nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2). The gastroprotective activity was assessed in a model of indomethacin-induced gastric lesions in rats and in vitro assay of anti-Helicobacter pylori activity. The results led to the following conclusions. The characterization of the standards of CD by mass spectrometry demonstrated that it was possible to establish the fragmentation pattern of CD with diacetalic ring like casearins, which is an important source of information for dereplication in metabolomics studies of plant extracts... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / O feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata) Ã uma leguminosa bastante utilizada na alimentaÃÃo de famÃlias de baixa renda da regiÃo nordeste do Brasil. Embora suas sementes sejam ricas em proteÃnas, estas sÃo deficientes em aminoÃcidos sulfurados na sua composiÃÃo. Dessa forma, um aumento na qualidade nutricional dessas sementes tem sido um dos principais objetivos dos programas de melhoramento genÃtico para essa espÃcie. AlÃm de determinar o padrÃo de deposiÃÃo de proteÃnas durante o desenvolvimento de embriÃes zigÃticos e somÃticos, nÃs pretendemos identificar genes com padrÃes especÃficos de expressÃo durante a embriogÃnese com a finalidade de utilizÃ-los em programas de melhoramento genÃtico. Utilizando a tÃcnica de eletroforese bidimensional (2D-PAGE) foi comparado o padrÃo protÃico de sementes em desenvolvimento com 10 dias apÃs a antese (DAA), sementes maduras e de suspensÃes celulares embriogÃnicas (SCE) obtidas de calos embriogÃnicos friÃveis (CEF) de feijÃo-de-corda. Para cada estÃgio de desenvolvimento da semente e para as SCE foram obtidos mapas de referÃncia proteÃmicos altamente reprodutÃveis numa faixa de pH de 3-10 e 4-7. VÃrios âspotsâ foram selecionados baseando-se na quantidade ou volume relativo de cada âspotâ e na taxa de expressÃo. Cerca de 800 (para sementes em desenvolvimento) e 130 (para SCE) âspotsâ protÃicos regulados para cima, para baixo, que se mantÃm constantes ou que sÃo especÃficos durante o desenvolvimento foram retirados dos gÃis 2D para anÃlise por espectrometria de massa. Algumas estratÃgias foram utilizadas para a identificaÃÃo das proteÃnas, como: PMF (peptide mass fingerprinting) e busca atravÃs de dados nÃo processados (MS/MS ion search). Dessa forma, cerca de 400 proteÃnas foram identificadas em sementes e cerca de 70 proteÃnas foram identificadas para SCE. A maioria das proteÃnas fram classificadas como proteÃnas do metabolismo primÃrio, energÃtico, proteÃnas de destinaÃÃo/proteÃnas de reserva e proteÃnas de defesa ou relacionadas a algum tipo de estresse. / Cowpea (Vigna unguiculata) is a leguminous plant highly utilized by low-income earners of Northeastern Brazil. However, proteins found in the crop are highly deficient in sulfur-containing amino acids. In line with this, improvement of nutritional quality of cowpea seeds has been one of the major goals of breeding programs of the crop. A starting point in this respect is a concerted effort to study the basic biochemical and physiological aspects of the development of cowpea seed. Besides determining the protein deposition pattern during the development of zygotic embryos and somatic embryos of the species, we set out to identify genes with specific pattern of expression during the two processes which will be of immense importance in cowpea breeding. Using the technique of two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE), we compared the protein deposition pattern of developing cowpea seeds with 10 days after anthesis (DAA) and mature seeds and embryogenic cell suspension (ECS). From each developmental stage and for ECS, we obtained proteomic reference maps that were highly reproducible within the pH of 3-10 and 4-7. Various spots were selected based on quantity or relative volume and rate of expression. About 800 (for seeds development) and 130 (for ECS) proteins spots up- or down-regulated, remained constantly expressed and were specific for each developmental stage. The spots were removed from the 2-D gels, processed, and subjected to mass spectrometry. Some strategies like peptide mass fingerprinting (PMF) and non-processed data search (MS/MS ion search) were employed for protein identification. Over 400 proteins in seeds and over 70 proteins in ECS were identified. A large number of these proteins were found to be primary metabolism proteins, energy, protein destination and storage and defense proteins and others related to stress.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-05-02T11:42:47Z No. of bitstreams: 1 2012 - Juliana Scofano Barrabin.pdf: 1875258 bytes, checksum: a222dd8183b171aeac5b500db7dbb482 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T11:42:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012 - Juliana Scofano Barrabin.pdf: 1875258 bytes, checksum: a222dd8183b171aeac5b500db7dbb482 (MD5) Previous issue date: 2012-06-06 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Aflatoxins classified by the World Health Organization as carcinogenic to humans and their intake causes many health injuries, from acute toxicities with liver lesions to hepatocellular carcinoma. Many countries already have regulations regarding these contaminants and the European Union is the most critical in relation to food safety. It has a strict regulation not only in relation to maximum permitted levels of aflatoxins in foods, but also concerning the quality of the analytical methods used to measure such contaminants. In Brazil, the National Agency of Sanitary Surveillance (ANVISA) published the resolution RDC N? 7, February 18th, 2011, providing for maximum permitted levels on mycotoxins in food for human consumption and raw materials, setting every two years the limits of these toxins become smaller, tending to be as strict as the European Union. For these goals to be fulfilled high sensitivity, selectivity and accuracy analytical methodologies are needed. This work aimed to develop an analytical method and to calculate validation parameters for determination of aflatoxin in peanuts using ultra performance liquid chromatography and detection by high-resolution mass spectrometry, method equivalent to the analytical quality standards of the European Union, which are worldwide trend. The developed method showed high selectivity and resolution, allowing the unambiguous qualitative analysis of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in peanuts and fulfilled the most rigorous analytical chromatographic criteria established by the EU. The requirements for a quantitative analysis have been partially achieved. Calibration curves were obtained with good linearity, however, was not possible to fix the sensitivity of the method, compromising the accuracy and quantification of the test. / As aflatoxinas s?o atualmente as micotoxinas mais estudadas no mundo. S?o classificadas pela Organiza??o Mundial da Sa?de como carcinog?nicas para humanos e sua ingest?o causa diversos danos ? sa?de, variando de toxicidades agudas com les?es de f?gado ao carcinoma hepatocelular. Muitos pa?ses j? possuem regulamenta??o quanto a estes contaminantes e a Uni?o Europ?ia (UE) ? uma das comunidades mais cr?ticas em rela??o ? legisla??o das micotoxinas com foco na inocuidade alimentar. Possui uma r?gida legisla??o n?o apenas em rela??o aos limites m?ximos permitidos de aflatoxinas em alimentos, mas tamb?m em rela??o ? qualidade dos m?todos anal?ticos utilizados para medir tais contaminantes. No Brasil, a Ag?ncia Nacional de Vigil?ncia Sanit?ria (ANVISA) publicou a resolu??o RDC N? 7 de 18 de fevereiro de 2011, dispondo sobre limites m?ximos tolerados de micotoxinas em alimentos. Essa resolu??o fixa novos limites para aflatoxinas, al?m de ocratoxina A, desoxinivalenol, fumonisinas, patulina e zearalenona em mat?rias primas e alimentos prontos para consumo, estabelecendo metas para que a cada 2 anos os limites dessas toxinas sejam cada vez menores, tendendo a uma maior rigidez, assim como a UE. Para que essas metas possam ser cumpridas s?o necess?rias metodologias anal?ticas de maior sensibilidade, seletividade e exatid?o. Desta forma o presente trabalho visou desenvolver um m?todo anal?tico e avaliar os par?metros de valida??o necess?rios para determina??o de aflatoxinas em amendoim. Utilizou-se cromatografia l?quida de ultra efici?ncia e detec??o por espectrometria de massas (UPLC-MS) de alta resolu??o, metodologia equiparada aos padr?es de qualidade anal?tica da UE. No m?todo desenvolvido obteve-se de 3 a 7 fragmentos para cada aflatoxina permitindo a an?lise qualitativa inequ?voca das AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2 em amendoim e cumpriu-se com os mais rigorosos crit?rios anal?ticos cromatogr?ficos estabelecidos pela UE. O m?todo apresentou uma corrida cromatogr?fica de 5 minutos e menor gasto de solventes org?nicos quando comparado ? t?cnica de HPLC. Os limites de detec??o alcan?ados foram de 1,6; 0,396; 1,608 e 1,396 ?g/kg ?g/kg?g/kg?g/kg para as AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2, respectivamente, e foram obtidas curvas de calibra??o com boa linearidade entre os valores de 1,6 a 12,0 ?g/kg (AFB1 e AFG1) e 0,396 a 2,97 ?g/kg (AFB2 e AFG2). Foram analisadas 10 amostras de amendoim adquiridas em feira livre do Rio de Janeiro e identificados tra?os das aflatoxinas B1, B2 e G2 em duas delas

Orientador: Valéria de Carvalho Santos Ebinuma / Coorientador: André Gonzaga dos Santos / Banca: Eduardo José Crevelin / Banca: André Moreni Lopes / Banca: Fernanda Perpétua Casciatori / Banca: Alvaro de Baptista Neto / Resumo: Colorantes sintéticos têm sido cada vez mais substituídos pelos colorantes naturais em diversos produtos industriais, pois os últimos apresentam efeitos desejáveis à saúde e podem possuir atividades biológicas. Neste cenário, o fungo filamentoso Talaromyces amestolkiae apresenta-se como uma fonte alternativa de colorantes naturais por não ser micotoxigênico. Assim, técnicas eficientes para a extração e/ou purificação destes biocompostos do meio fermentado são de grande interesse visando sua aplicação industrial. O objetivo deste travalho foi definir a estrutura química do colorante produzido por T. amestolkiae e avaliar Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA) como técnica de extração. Em relação a molécula do colorante, esta foi purificada por técnicas espectrométricas e espectroscópicas e apresentou massa de 542 u, absorção máxima em 544 nm e pertence a classe dos policetídeos. Avaliou-se a estabilidade do colorante vermelho presente no meio fermentado de T. amestolkiae e verificou-se que o mesmo é estável na faixa de temperatura de 25 a 65°C, na presença de altas concentrações do surfactante não iônico TX-114 (1-15% m/m) e dos líquidos iônicos da família dos imidazólios (0,1, 0,5 e 1,0M), porém, a molécula foi estável somente em baixas concentrações de LIs da família das colinas (0,1M). Em relação às partições por SMDFA composto por Triton X-114 e LI como surfactante iônico (família dos imidazólios) ou adjuvante (família das colinas), baixas concentrações de LI, in... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Synthetic colorants have been increasingly replaced by natural ones in several industrial products, since the last have lower adverse health effects and may present biological activities. In this scenario, the filamentous fungus Talaromyces amestolkiae is an alternative source of natural colorants for being non-mycotoxigenic. Thus, efficient techniques for the extraction and/or purification of these biocompounds from the fermented medium are of great interest aiming their industrial application. The objective of this work was to purify natural colorants from the fermented medium of T. amestolkiae by liquidliquid extraction with organic solvents in order to determine the chemical structure of these compounds and to evaluate aqueous micellar two-phase systems (AMTPS) as an alternative extraction technique. In relation to the colorant molecule, it has a mass of 542 u, maximum absorption at 544 nm and structure similar to N-GABA-PP-V molecule of the polyketide class, with an additional glutamic acid chain. In the literature, there are no previous reports of this molecule. The stability of the red colorant present in the fermented medium of T. amestolkiae was evaluated and it was found to be stable in temperature range of 25 to 65 °C, in the presence of high concentration of the non-ionic surfactant TX-114 (1 (0.1, 0.5 and 1.0 M) and the ionic liquids (IL) from imidazolium family (0,1, 0,5 e 1,0 M),however,it is only stable at low concentrations of, IL from the choline family (0,1 M). Regarding the colorant partition by AMTP composed of Triton X-114 and IL as ionic surfactant (imidazolium family) or adjuvant (choline family), low concentrations... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Chung Man Chin / Banca: Renato Farina Menegon / Banca: Cleverton Roberto de Andrade / Banca: Eduardo René Perez Gonzalez / Banca: Jean Leandro dos Santos / Resumo: Os glicocorticoides (GCs) são fármacos utilizados amplamente na terapêutica devido suas atividades anti-inflamatória, imunossupressora e antiangiogênica. Possuem a capacidade de reduzir a transcrição de uma série de enzimas/proteínas inflamatórias como a ciclooxigenase-2 (COX-2), lipoxigenases, fosfolipase A2, óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), super expresso em diversas doenças inflamatórias. Porém o seu uso é limitado devido as diversas reações adversas. Derivados ftalimídicos também têm sido relatados na literatura com importante atividade anti-inflamatória. Dessa forma, no presente trabalho, planejou-se através da estratégia de hibridação molecular, novos derivados anti-inflamatórios esteroides moduladores da citocina TNF-alfa, úteis no tratamento de doenças inflamatórias crônicas. Nesse contexto, foram sintetizados e caracterizados seis compostos derivados da prednisolona e budesonida da série Lapdesf GL-FT 1-6. Os compostos finais foram avaliados quanto à atividade anti-inflamatória em modelo de colite ulcerativa distal, atividade imunossupressora e determinação da viabilidade celular necessária para o ensaio de doseamento da citocina TNF-alfa. Além disso, os compostos GLFT 2 e 3 foram avaliados quanto à atividade anti-inflamatória em modelo de edema de pata. No ensaio de colite ulcerativa os compostos Lapdesf GL-FT 5 e 6 foram iguais estatisticamente ao controle negativo e apresentaram at... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glucocorticoids (GCs) are drugs widely used in therapy due their anti-inflammatory, immunosuppressive and antiangiogenic activities. They have the ability to reduce the transcription of a series of inflammatory enzymes / proteins such as cyclooxygenase-2 (COX2), lipoxygenases, phospholipase A2, induced nitric oxide synthase (iNOS) and proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha), over expressed in several inflammatory diseases. However, its use is limited due to the various adverse reactions. Phthalimide derivatives have also been reported in the literature with important antiinflammatory activity. Thus, in the present work, new steroid anti-inflammatory derivatives as TNF-alpha cytokine modulators, useful in the treatment of chronic inflammatory diseases, have been designed through the molecular hybridization strategy. In this context, six compounds prednisolone and budesonide derivatives, Lapdesf GL-FT series, were synthesized and characterized. The final compounds were evaluated for anti-inflammatory activity in a model of distal ulcerative colitis, immunosuppressive activity and cell viability assay required for the TNF-alpha assay. In addition, GLFT 2 and 3 compounds were evaluated for anti-inflammatory activity in paw edema model. In the ulcerative colitis test, Lapdesf GL-FT 5 and 6 compounds were statistically equal to the negative control and showed anti-inflammatory activity with regression of the ulceration caused by the induction with acetic acid. Compound 5 also showed improvement in clinical signs such as weight gain and increased survival of animals and total regression of ulceration in 83.3% of treated animals. GLFT 1 and 3 compounds were statistically different from the positive and negative control groups. They presented antiinflammatory activity with... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor