Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-12-05T03:13:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349064.pdf: 1109231 bytes, checksum: 83616007deed552bace5999d8777b6df (MD5) Previous issue date: 2017 / O fígado é um órgão central do metabolismo humano, sendo responsável por mais de uma centena de funções que garantem a homeostase do indivíduo. O principal tipo celular que exerce essas funções é o hepatócito. A cirrose é uma condição extrema que acontece quando os hepatócitos começam a morrer e são substituídos por uma matriz de colágeno, que não exerce função nenhuma. Esta morte pode ser causada por diversos fatores, como infecções virais, abuso crônico de álcool, desordens autoimunes entre outros. Nesta condição, o fígado perde a capacidade de realizar suas funções adequadamente, causando graves danos sistêmicos ao indivíduo, levando inclusive a óbito. Neste trabalho foram analisadas amostras de sangue periférico de 62 indivíduos em crise cirrótica, e comparou-se esses resultados com 35 indivíduos saudáveis, a fim de obter resposta se há ou não diferença entre os grupos no que diz respeito a marcadores de dano ao DNA e de estresse oxidativo. Foram encontradas diferenças significativas entre os grupos nos parâmetros Dano Cometa (p < 0,001), Número de Micronúcleos (p = 0,002), Número de Pontes Nucleoplasmáticas (p < 0,001), Número de Brotos Nucleares (p = 0,003) e concentração de Substâncias que Reagem com o Ácido Tiobarbitúrico (TBARS, p = 0,012). Os resultados indicam que os pacientes apresentaram uma instabilidade genômica sistêmica, associada a um desequilíbrio oxidativo e reforça a ideia de que as técnicas utilizadas podem ser bons marcadores a serem utilizados como prognóstico para a condição dos indivíduos cirróticos. / Abstract : The liver is a central organ of metabolism, accounting for more than a hundred functions that guarantee the individual?s homeostasis. The main cellular type that performs these functions is the hepatocyte. Cirrhosis is an extreme condition that occurs when the hepatocytes begin to die and are replaced by a matrix of collagen, which has no function at all. This death can be caused by several factors, such as viral infections, chronic alcohol abuse, autoimmune disorders, among others. In this condition, the liver loses the ability to perform its functions properly, causing serious systemic damage to the individual, leading to death. In the present study, peripheral blood samples from 62 individuals in a cirrhotic crisis were analyzed, and these results were compared with 35 healthy individuals in order to obtain a response whether or not there was a difference between the groups to markers of DNA damage and oxidative stress. Significant differences were found between groups in the Comet Assay (p < 0,001), Number of Micronuclei (p = 0,002), Number of Nucleoplasmic Bridges (p < 0,001), Number of Nuclear Buds (p = 0,003) and values of Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS, p = 0,012). The results show that the patients presented systemic genomic instability, associated with an oxidative imbalance, and reinforces the idea that the techniques used may be good markers of prevention of worsening of the disease in patients with cirrhosis.

O ozônio (O3) troposférico pode ser considerado um dos poluentes atmosféricos mais tóxicos da atualidade. Nas espécies vegetais o O3 penetra através dos estômatos, interferindo nos processos fisiológicos, metabólicos e celulares das plantas. Os efeitos negativos do O3 são desencadeados devido ao fato deste ser um potente agente oxidante capaz de gerar espécies ativas de oxigênio (EAO) no meio intracelular. No entanto, as investigações sobre os impactos da exposição ao O3 na fisiologia e produtividade das principais culturas agrícolas da América do Sul ainda são escassos. Para a maioria das espécies vegetais cultivadas no Brasil, uma análise integrada dos aspectos fisiológicos e bioquímicos relacionados à toxicidade deste ainda é limitada. O objetivo deste trabalho de doutorado foi avaliar as modificações nos parâmetros bioquímicos de estresse oxidativo e do balanço redox celular em resposta à exposição controlada a elevadas concentrações de O3 no tecido foliar de diferentes cultivares subtropicais de feijão (Phaseolus vulgaris L.). As alterações desencadeadas pelo O3 no sistema antioxidante enzimático e não-enzimático foram determinadas através de diferentes abordagens, como a avaliação da extensão do dano oxidativo a lipídios; a quantificação da atividade e dos níveis proteicos da enzima antioxidante catalase; a avaliação dos níveis teciduais dos antioxidantes ácido ascórbico e grupamentos tióis totais; e a produção de espécies ativas de oxigênio. Os resultados indicam que níveis constitutivos mais elevados de espécies ativas de oxigênio (EAO) e de antioxidantes não-enzimáticos (ascorbato), acompanhados da modulação do sistema antioxidante enzimático (aumento na quantidade e atividade da catalase), conferem proteção ao tecido foliar contra insultos oxidativos, como a oxidação de lipídios de membrana e a diminuição dos níveis de pigmentos fotossintetizantes, desencadeados pelo O3. Ao contrário, quando a exposição ao O3 aumenta a geração de EAO, e este aumento está aliado à falta da modulação eficaz tanto do sistema antioxidante enzimático como do não enzimático, a indução de alterações oxidativas severas (aumento de lipoperoxidação e diminuição nos níveis de clorofila a e b) ocasiona perda no conteúdo proteico das folhas, o que compromete a estrutura celular e o processo fotossintético. Sendo assim, pode-se concluir que, nas cultivares estudadas, a capacidade de resistir aos efeitos negativos do O3 está relacionada com as diferenças bioquímicas constitutivas capazes de manter homeostase do estado redox celular no tecido foliar. / Tropospheric ozone (O3) can be considered one of the most toxic air pollutants today. In plant species O3 penetrates through leaf stomata, interfering with physiological, metabolic and cellular processes in plants. The negative effects of O3 are triggered due to the fact that this is a potent oxidizing agent capable of generating reactive oxygen species (ROS) in the intracellular environment. However, research on the impacts of exposure to O3 in physiology and productivity of major crops in South America are still scarce. For most plant species grown in Brazil an integrated analysis of the physiological and biochemical aspects related to toxicity of this contaminant is still limited. The aim of this study was to evaluate the changes in oxidative stress parameters and cellular redox balance in response to controlled exposure to high O3 concentrations in the leaf tissue of different subtropical cultivars of common bean (Phaseolus vulgaris L.). Changes triggered by O3 in enzymatic and non-enzymatic antioxidant system were determined by different approaches, such as the extent of oxidative damage to lipids, the quantification of protein levels and activity of the antioxidant enzyme catalase; evaluation of tissue levels of the antioxidants ascorbic acid and total thiol groups, and the production of reactive oxygen species. The results indicate that constitutive higher levels of ROS and non-enzymatic antioxidants (ascorbate) accompanied by modulation of enzymatic antioxidant system (enhanced catalase activity and content) confer protection against oxidative insults triggered by O3 in leaf tissue, such as the oxidation of membrane lipids and decreased levels of photosynthetic pigments. In contrast, when the O3 exposure increases ROS generation, and this increase is coupled with the lack of an effective modulation of the antioxidant (both enzymatic and non-enzymatic), the induction of severe oxidative changes (increase in lipoperoxidation levels and decrease in the levels of chlorophyll a and b) leads to protein content loss on leaves, which compromises the cellular structure and the photosynthetic process. Thus, it can be concluded that in the studied cultivars the ability to resist the negative effects of O3 relies on the constitutive biochemical differences that are capable of maintaining the cellular redox homeostasis of leaf tissue.

Endofenótipos são características mensuráveis que se encontram entre a doença e o genótipo e podem ser medidas neurofisiológicas, bioquímicas, endocrinológicas, neuroanatômicas ou cognitivas. Gottesman e Shields propuseram pela primeira vez o conceito em transtornos psiquiátricos, em 1973. Endofenótipos têm sido estudados em familiares de pacientes com transtornos psiquiátricos e servem para correlacionar os fenótipos e risco genético. O objetivo do nosso estudo foi caracterizar possíveis endofenótipos em uma população brasileira com os riscos genéticos para a esquizofrenia (SZ). Nós medimos dois grupos de possíveis endofenótipos: marcadores de estresse oxidativo e de defesa antioxidante (artigo 1) e domínios cognitivos (artigo 2). A fim de examinar os marcadores de estresse oxidativo no soro, foram selecionados 37 irmãos de pacientes com SZ e 37 controles saudáveis sem história de transtorno psiquiátrico. Medimos TBARS, carbonilação proteica e níveis da glutationa peroxidase. Encontramos aumento significativo do estresse oxidativo proteico em irmãos de pacientes com esquizofrenia (p = 0,03). Não foram encontradas diferenças de TBARS (p = 0,73) e dos níveis da glutationa peroxidase (p = 0,53) (artigo 1). Para caracterizar funções cognitivas como possíveis endofenótipos, medimos memória verbal (VM), memória de trabalho (WM) e função executiva (EF) em 90 participantes (45 irmãos de pacientes com SZ e 45 controles saudáveis pareados). Não foram encontradas diferenças na EF (p = 0,42) e WM (p = 0,19 para sequencia de números e letras e p = 0,43 para Digit Span). No entanto, em VM, irmãos de pacientes tiveram desempenho pior do que os controles no teste de memória tardia (p <0,01, d = 0,6) e no teste de memória verbal total (p <0,05, d = 0,5) (artigo 2). Nossos resultados sugerem que a prejuízos em memória verbal e estresse oxidativo proteico podem ser considerados endofenótipos de SZ. / Endophenotypes are considered measurable components along the pathway between disease and genotype and could be neurophysiological, biochemical, endocrinological, neuroanatomical, cognitive, or neuropsychological. Gottesman and Shields first proposed the concept for psychiatry disorders in 1973. Endophenotypes have been studied in relatives of patients with psychiatry disorders to correlate phenotypes and genetic risk. The aim of our study was characterize possible endophenotypes in a Brazilian population with genetic risks to schizophrenia (SZ). We measured two groups of possible endophenotypes: oxidative stress and antioxidant defense serum markers (article 1) and cognitive domains (article 2). In order to examine serum oxidative stress markers, we selected 37 siblings and 37 healthy controls without actual or past psychiatry disorder. We measured TBARS, Protein Carbonyl Content, and Glutathione Peroxidase levels. We found significant increase in protein oxidative stress in siblings of patients with schizophrenia (higher Protein Carbonyl Content levels) (p=0.03). We haven’t found differences in TBARS (p=0.73) and Glutathione Peroxidase (p=0.53) levels (article 1). To characterize cognitive deficits as possible endophenotypes, we measured verbal memory (VM), working memory (WM) and executive function (EF) in 90 subjects (45 unaffected siblings of patients with SZ and 45 matched healthy controls). No differences were found in EF (p = 0.42) and WM (p = 0.19 to Letter-Number Sequencing and p=0.43 to Digit Span). However, in VM, siblings of patients performed worse than controls in the delayed recall test (p<0.01, d=0.6) and in the total recall test (p<0.05, d=0.5) (article 2). Our results suggest that verbal memory impairment and protein oxidative stress could be considered endophenotypes of SZ.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-03-15T04:05:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337675.pdf: 1273481 bytes, checksum: e7d6c6e404a92d9706940b7057478e65 (MD5) Previous issue date: 2015 / A espécie Plinia peruviana é uma árvore conhecida popularmente como ?jabuticaba de cabinho?, cujos frutos são utilizados no preparo de geleias, licores, destilados e vinhos. Este estudo teve como objetivo investigar o efeito de extratos brutos obtidos das cascas do fruto da Plinia peruviana sobre o tônus vascular em aorta de rato, e identificar os mecanismos de ação envolvidos neste efeito in vitro. Neste trabalho revelou-se que o efeito vasodilatador do extrato preparado a partir das cascas do fruto da Plinia peruviana, obtidos pelo método de extração assistida por micro-ondas e rotaevaporação (EBM-1) é totalmente dependente do endotélio em anéis de aorta de rato previamente contraídos por fenilefrina. Este efeito induzido pelo EBM-1 foi abolido em preparações incubadas com os inibidores das enzimas óxido nítrico sintase L-NAME, ou da guanilato ciclase ODQ, bem como sequestrador de NO carboxi-PTIO. O inibidor não seletivo de canais de K+ ativados pelo Ca+2 e de canais de K+ ativados por voltagem tetraetilamonio TEA, assim como o sequestrador de ânions superóxido tempol, reduziram o Emax vasorrelaxante do EBM-1 em aproximadamente 35 e 26%, respectivamente. O efeito vasodilatador do EBM-1 em anéis de aorta também foi significativamente reduzido na presença de wortmanin (um inibidor da fosfatilinositol 3-cinase (PI3K), ou do inibidor da proteína cinase B (Akt 1/2). Deste modo os resultados obtidos neste trabalho revelam que as cascas do fruto da plinia peruviana apresentam componentes capazes de causar relaxamento vascular in vitro. Este efeito é decorrente da ativação das vias do óxido nítrico/guanilato ciclase e, pelo menos em parte, da PI3K/Akt. Também parece envolver uma regulação da produção ou biodisponibilidade de espécies reativas de oxigênio, bem como da abertura de canais de K+ ativados por voltagem. Estudos adicionais devem ser realizados para explorar a importância desses achados na regulação do tônus vascular em modelos in vivo, bem como o potencial de preparações obtidas a partir de extratos das cascas do fruto da jabuticaba em doenças envolvendo o sistema cardiovascular, como a hipertensão arterial sistêmica, angina e aterosclerose.<br> / Abstract : Plinia peruviana is a tree popularly known as ?jabuticaba de cabinho?. Its fruits are commercialized and used to prepare jams, liqueurs and wines. Using rat aortic rings maintained in organ baths for experimentation, this study discloses the endothelium-dependent vasodilatory effect induced by a crude hydroalcoholic extract prepared using the fruit peel?s of Plinia peruviana, which was obtained by microwave-assisted extraction method followed by rotavap (EBM-1). The ability of EBM-1 to induce vasodilation was abolished by L-NAME (a nitric oxide synthase inhibitor), ODQ (a guanylyl cyclase inhibitor), as well as by the NO scavenger carboxy-PTIO. The non-selective blocker of the Ca+2-activated and voltage dependent K+ channels, tetraethylammonium (TEA), and the superoxide anion scavenger tempol, reduced the maximum relaxation elicited by EBM-1 by around 35% and 25%, respectively. In addition, wortmannin (a phosphoinositide 3-kinase inhibitor) reduced EBM-1-induced relaxation in aortic rings by 75%. The incubation of preparations with the protein kinase B inhibitor (Akt1/2) also impaired the relaxation generated by EBM-1. On the other hand, the mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor, rapamycin, as well dorsomorphin (an inhibitor of adenosine monophosphate activated protein kinase; AMPK) did not alter the vascular relaxation induced by EBM-1. Taken together, our results show that the fruits peel of Plinia peruviana presents one or more compounds able to induced in vitro vascular relaxation. This effect depends on activation of the nitric oxide/guanylate cyclase pathway in endothelial cells, and seems to involve the regulation of production or bioavailability of reactive oxygen species, such as superoxide, as well the opening of Ca+2-activated and voltage dependent K+ channels. In addition, our data also reveals that activation of PI3K plays a major role in this effect, at least in part through protein kinase B (Akt) enzymes. Further studies, including in vivo approaches, must be carried out for a better comprehension of the effects of preparations obtained from ?jabuticaba? peel on the cardiovascular system, in both physiological and pathological conditions.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-03-04T18:34:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 308803.pdf: 1883293 bytes, checksum: 58d4895d549f873309b93e600132bb86 (MD5) / Zinco na sua forma ionica livre e mantido em concentracoes muito baixas nas celulas de mamiferos. Em algumas vesiculas sinapticas de neuronios glutamatergicos, porem, ele pode ser encontrado em altas concentracoes, aonde atua como um modulador ionico. Em situacoes patologicas, porem, o zinco livre pode se acumular no citosol nas celulas neurais provocando diversos efeitos toxicos, tais como a inibicao de enzimas. O zinco e capaz de inibir as enzimas antioxidantes gluationa redutase (GR) e tioredoxina redutase (TrxR), duas enzimas envolvidas na defesa celular contra oxidantes. Essa inibicao, portanto, pode resultar em um decrescimo na degradacao de peroxidos, levado a uma maior vulnerabilidade a danos oxidativos. O presente trabalho tem como objetivo investigar a relacao da inibicao das enzimas antioxidantes GR e TrxR, pela exposicao de celulas neurais ao zinco, com a susceptibilidade destas celulas quando desafiadas com agentes oxidativos. Celulas derivadas de neuroblastoma (N2a), astroglioma (C6) e fatias de hipocampo de ratos adultos foram pre-incubadas com 100 uM de ZnCl2 por 30 min, e em seguida expostas por uma hora a 100 uM de H2O2 ou 100 uM de peroxido de cumeno. O tratamento com ZnCl2 provocou uma queda na atividade da GR nos 3 modelos, sendo que as celulas C6 foram mais afetadas (77% de inibicao comparado com 30-35 % nos outros modelos). A enzima TrxR tambem foi inibida em 30% nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a e fatias de hipocampo, esse efeito nao foi observado. O tratamento com ZnCl2 diminuiu a taxa de consumo de H2O2 e CHP nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a somente o consumo de H2O2 foi afetado. Em celulas N2a, tanto o tratamento com ZnCl2 como com H2O2 provocaram uma diminuicao na viabilidade celular, porem a combinacao de ambos nao aumentou esta toxicidade. As celulas C6 foram resistentes aos efeitos toxicos dos peroxidos e ZnCl2, porem, o pre-tratamento com ZnCl2 aumentou a susceptibilidade dessas celulas a toxicidade de ambos os peroxidos, diminuindo a viabilidade, aumentando a permeabilidade celular e o dano ao DNA. O ZnCl2 nao aumentou a vulnerabilidade das fatias de hipocampo a toxicidade dos peroxidos, porem, quando estas foram expostas a 1 mM de H2O2, em combinacao com ZnCl2, houve queda na viabilidade celular na mesma proporcao causada pelo pre-tratamento com BCNU, um inibidor da GR. Neste caso, supoe-se que esta queda na viabilidade e devido a inibicao da GR. Em conclusao, os dados apresentados demonstram que, apesar da alta susceptibilidade das células neuronais (N2a) ao ZnCl2 e aos peróxidos, a inibição da GR não aumentou esta sensibilidade. Por outro lado, as células derivadas de astrócitos (C6) foram mais resistentes ao ZnCl2 e aos peróxidos, porém a inibição da GR e da TrxR pelo tratamento com zinco aumentaram a citotoxicidade de ambos os peróxidos. Nas células C6, o sinergismo entre a inibição das enzimas antioxidantes e a toxicidade aos peróxidos, provavelmente se deve a menor capacidade em degradar peróxidos. Desta forma, nosso dados indicam que a inibição de enzimas antioxidantes GR e TrxR é um fator importante associado a sua toxicidade em células neurais. / Zinc in its free, ionic form is kept in very low concentrations in mammalian cells. In some synaptic vesicles in glutamatergic neurons, however, it can be found in high concentrations where it acts as an ionic modulator. In pathological situations, however, this free zinc can accumulate in the cytosol of neural cells producing a myriad of toxic effects, such as the inhibition of enzymes. Zinc can inhibit glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR), both antioxidant enzymes that are crucial for cell protection against oxidants. Therefore, a disturbance in the activity of these enzymes hinder peroxide degradation and increases vulnerability to oxidative damage. The present work aims to investigate the relation between the inhibition of these enzymes by zinc and the susceptibility of neuronal and astrocytic cells, as well as hippocampal slices, to H2O2 and cumene peroxide (CHP). Cells derived from neuroblastoma (N2a), astroglyoma (C6) and hippocampal slices were pre-incubated with 100 uM of ZnCl2 for 30 min, and then exposed to 100 uM of H2O2 or CHP for 1h. Treatment with ZnCl2 decreased GR activity in the three models, but this effect was higher in C6 cells (70 % of inhibition in comparison to 30-35 % of inhibition in the other models). TrxR was inhibited by 30 % in C6 cells, while in N2a and hippocampal slices this effect was not observed. Treatment with Zn decreased H2O2 and CHP consumption rate in C6 cells, but only H2O2 consumption rate was reduced in N2a cells. Both ZnCl2 and H2O2 treatment induced a decrease in cellular viability in N2a cells, but their combination did not enhance this toxicity. C6 cells were more resistant to toxic effects of ZnCl2 and peroxides, however, the preincubation with ZnCl2 increased cell vulnerability to both peroxides, decreasing cell viability, increasing membrane permeability and DNA damage. ZnCl2 did not increased vulnerability of hippocampal slices to toxic effects of peroxides, but when these cells were exposed to 1 mM of H2O2 after the ZnCl2 pre-treatment, a decrease in cell viability was observed in the same proportion as the effect caused by the pretreatment with BCNU, an inhibitor of GR, indicating that this effect is likely due to GR inhibition. In conclusion, this data demonstrate that despite the high susceptibility of N2a cells to ZnCl2 and H2O2, the zincinduced GR inhibition did not increased this vulnerability. In contrast, C6 cells were more resistant to ZnCl2 and peroxides, but the inhibition of GR and TrxR by zinc treatment highly increased the citotoxicity of both peroxides. Hippocampal slices were more resistant than the cell cultures to the toxic effects of the treatments, but when exposed to higher doses of H2O2, Zn was able to sensitize the cells to peroxide toxicity. In C6 cells, the synergism between the inhibition of enzymes and peroxide toxicity probably is related to the decreased capacity to metabolize peroxides. Therefore our data suggest that the inhibition of the antioxidant enzymes GR and TrxR by zinc is an important factor associated with its toxicity in neural cells.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Farmácia, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317557.pdf: 1330917 bytes, checksum: 93e905f6e7542b036c55bb0fca30b398 (MD5) Previous issue date: 2013 / Sugere-se que a exposição ocupacional a agrotóxicos pode levar a uma grande diversidade de alterações bioquímicas que podem ser correlacionadas ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. Nosso estudo investigou as alterações bioquímicas induzidas pela exposição aguda (in vitro) ou crônica (durante o período gestacional e lactacional) ao herbicida Roundup® sobre fatias de hipocampo de ratos de 15 dias de idade. Para o tratamento in vivo as ratas prenhas receberam 1% de Roundup® (0,36% glifosato) na água de beber desde o 5º dia gestacional até os filhotes completarem 15 dias de vida pós-natal, sendo que os controles receberam apenas água durante o mesmo período. Para o tratamento in vitro, fatias de hipocampo de ratos imaturos foram incubadas por 30 minutos com ou sem 0,01% de Roundup® (0,0036% de glifosato). Agonista e antagonistas de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (NMDA/glicina, AP-5 e MK-801), inibidores das vias de sinalização da CaMKII, ERK/MAPK, PKA e PLC/PKC (KN-93, PD98059, H89, Ro31-8220 e U73122, respectivamente) e bloqueador de canal de cálcio dependente de voltagem do tipo-L (nifedipina) foram utilizados para determinar os mecanismos envolvidos na neurotoxicidade do Roundup® no hipocampo de ratos. Também foram determinados marcadores bioquímicos e de dano oxidativo, assim como a possível indução de excitotoxicidade glutamatérgica, através do estudo das alterações no influxo de 45Ca2+, bem como na captação, liberação e metabolismo do glutamato em fatias de hipocampo. Os resultados obtidos após o tratamento in vivo mostraram que a exposição ao Roundup® durante os períodos pré- e pós-natal aumentou o influxo de 45Ca2+; diminuiu captação de [3H]-glutamato e os níveis de GSH; promoveu acúmulo de 14C-MeAIB; aumentou atividade das enzimas gama glutamil transferase (?-GT) e aspartato aminotransferase (AST), assim como inibiu a atividade da glicose-6-P desidrogenase (G6PD), alanina aminotransferase (ALT) e glutamina sintetase (GS) no hipocampo de ratos imaturos. Além disso, observou-se que o pesticida induziu a ativação/fosforilação da ERK1/2, JNK1/2, Akt e GSK3?. No tratamento in vitro os resultados demonstraram que a exposição ao glifosato-Roundup® aumentou o influxo de 45Ca2+; diminuiu a captação e aumentou a liberação de [3H]-glutamato; diminuiu os níveis de GSH; aumentou a lipoperoxidação; promoveu acúmulo de 14C-MeAIB; inibiu a atividade enzimática da ?-GT, AST/ALT, G6PD e GS no hipocampo de ratos imaturos. Além disso, observou-se que o mecanismo de toxicidade do agrotóxico induz o influxo de Ca2+ via ativação do receptor NMDA para glutamato e abertura dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L. Além disso, o mecanismo do Roundup® também envolve a modulação das vias de sinalização da CaMKII, ERK/MAPK e PLC/PKC. Em conjunto, nossos resultados sugerem o envolvimento de excitotoxicidade glutamatérgica, estresse oxidativo e de cascatas de sinalização celular nos efeitos do Roundup® sobre o hipocampo de ratos. O entendimento dos alvos celulares e moleculares de ação do Roundup®, assim como das vias de sinalização celular moduladas por este agrotóxico poderão indicar futuros alvos para intervenção preventiva, terapêutica e/ou diagnóstica em prol da saúde dos indivíduos expostos.<br> / Abstract : It has been suggested that occupational exposure to pesticides may lead to biochemical changes which might be related to neurodegenerative conditions. Our study investigated the biochemical changes induced by acute (in vitro) or chronic (during the pre- and post-pregnancy) exposure to Roundup® on hippocampal slices from 15 days old rats. For in vivo treatment, pregnant females received 1% Roundup® (glyphosate 0.36%) in drinking water from gestational day 5 until the day of the experiments, which were carried out by using 15-day old pups. Control groups received only water during the same period. For in vitro treatment, hippocampal slices from immature rats were exposed to 0.01% Roundup® (0.0036% glyphosate) for 30 minutes. Glutamate receptor agonist and antagonists (NMDA/Gly, AP-5, MK-801), inhibitors of CaMKII, ERK/MAPK, PKA e PLC/PKC (KN-93, PD98059, H89, Ro31-8220 e U73122, respectivelly) and L-type voltage-dependent calcium channel blocker (nifedipine) were used in order to investigate the mechanisms underlying Roundup® neurotoxicity in rat hippocampus. The effect of the pesticide on 45Ca2+ influx, enzymatic activities, as well as on the uptake, release and metabolism of glutamate were determined in hippocampal slices in order to investigate the participation of oxidative damage and glutamatergic excitotoxicity in the mechanism of Roundup® neurotoxicity. The results obtained after treatment in vivo showed that exposure to Roundup® during gestational and lactational period increased 45Ca2+ influx; decreased glutamate uptake and GSH levels; promoted 14C-MeAIB accumulation; increased the activity of the enzymes aspartate aminotransferase (AST) and gamma glutamyl transferase (?-GT) and inhibited the activity of glucose-6-P dehydrogenase (G6PD), alanine aminotransferase (ALT) and glutamine synthetase (GS) in immature rat hippocampus. Furthermore, it was observed that the pesticide induced activation/phosphorylation of ERK1/2, JNK1/2, Akt and GSK3ß. On the other hand, the acute (in vitro) exposure do the pesticide increased 45Ca2+ influx; decreased [3H]-glutamate uptake and increased its release; decreased GSH levels; increased lipid peroxidation; promoted 14C-MeAIB accumulation; inhibited the enzymatic activity of ?-GT, AST/ALT, GS and G6PD in immature rat hippocampus. Moreover, it was observed that Roundup® exposure leads to calcium overload through NMDA receptor activation and L-type voltage dependent Ca2+ channels opening. Also, the mechanism of pesticide toxicity involves activation of kinase cascades such as CaMKII, ERK/MAPK and PLC/PKC. Taken together, our results suggested the involvement of glutamatergic excitotoxicity, oxidative stress and the modulation of signaling pathways in mechanism of Roundup®. The knowledge of the molecular and cellular targets of Roundup®, as well as the signaling pathways modulated by this pesticide may indicate future targets for clinical intervention of exposed individuals.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-25T03:10:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 342281.pdf: 3917692 bytes, checksum: 553502147fd443b69253761feabb6bab (MD5) Previous issue date: 2016 / Introdução. Evidências indicam um promissor efeito antitumoral das quinonas juglona, fenilaminonaftoquinona-7 (Q7) e fenilaminonaftoquinona-9 (Q9), especialmente quando associadas ao ascorbato. Objetivo. Dar continuidade aos estudos sobre o efeito antitumoral das naftoquinonas juglona, Q7 e Q9 em associação ao ascorbato de sódio, bem como avaliar a melhor associação para o tratamento do câncer a partir dos efeitos obtidos in vitro e in vivo. Metodologia. Foram analisados os efeitos das quinonas juglona, Q7 e Q9 associadas ou não ao ascorbato de sódio sobre o CT-DNA (Calf Thymus-DNA). Em células MCF-7 (carcinoma de mama) foram avaliados a viabilidade celular, os níveis de EROs intracelular, os danos ao DNA e a proliferação celular. Proteínas oriundas dos lisados de células MCF-7 foram utilizados para os ensaios de imunoeletroforese para verificar a integridade da proteína poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), gama-H2AX (?H2AX) e pAkt. A atividade antitumoral in vivo das quinonas associadas ou não ao ascorbato de sódio foi inicialmente analisada através de parâmetros de sobrevida e crescimento tumoral de camundongos portadores do tumor ascítico de Ehrlich. Posteriormente, amostras do tumor foram coletadas e utilizadas para análise de marcadores de estresse oxidativo como: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteína carbonilada, glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa-S-transferase (GST). Ainda em amostras do tumor ascítico de Ehrlich foram avaliados danos ao DNA, parada do ciclo celular, influência na captação de glicose e tipo de morte celular induzida pelos tratamentos. As mesmas amostras foram utilizadas para a análise de imunoeletroforese de proteínas envolvidas no dano ao DNA e proliferação celular (?H2AX e pAkt, respectivamente), na progressão do ciclo celular (p53, p16 e ciclina A), na captação de glicose (HIF-1a e GLUT1) e proteínas envolvidas na sinalização da morte celular (PARP, Bax, Bcl-xL). Resultados. As quinonas, quando associadas ao ascorbato, causaram um aumento na intercalação e clivagem oxidativa do CT-DNA. Em células MCF-7, a associação com ascorbato diminuiu significativamente a viabilidade celular. As associações juglona/ascorbato e, principalmente Q7/ascorbato, aumentaram os níveis de EROs intracelulares e os danos ao DNA. As três associações testadas causaram diminuição no número de colônias, porém, juglona/ascorbato e Q7/ascorbato foram capazes de inibir a proteína Akt fosforilada (pAkt). Os resultados in vitro foram reproduzidos in vivo. Juglona/ascorbato e Q7/ascorbato inibiram significativamente o desenvolvimento do tumor e aumentaram o tempo de sobrevida dos animais. Os marcadores de estresse oxidativo foram alterados, indicando uma indução na geração de EROs pelos tratamentos, aumentando assim a peroxidação lipídica e a carbonilação de proteínas, danificando o DNA das células do tumor ascítico de Ehrlich e promovendo também, a parada do ciclo celular em G1/S, redução da captação de glicose e morte celular por apoptose. Conclusão. Os resultados apresentados mostraram que o ascorbato de sódio potencializou o efeito antitumoral das quinonas juglona e, principalmente da Q7, também in vivo, evidenciando que estas associações são promissores agentes para o tratamento do câncer.<br> / Abstract : Introduction. Evidences point to the promising antitumor effect of quinones juglone, phenylaminonaphthoquinone-7 (Q7) and phenylaminonaphthoquinone-9 (Q9), especially when associated to ascorbate. Objective. To continue the studies on the antitumor effect of naphthoquinones juglone, Q7 and Q9 associated with sodium ascorbate, as well as to evaluate the best association for cancer treatment from the effects obtained in vivo and in vitro. Methodology. The effects of quinones juglone, Q7 and Q9 associated or not to sodium ascorbate on Calf Thymus-DNA were analyzed. Cell viability, levels of intracellular ROS, damages on DNA and cell proliferation were evaluated in MCF-7 cells (breast carcinoma). Proteins from MCF-7 cell lysate were used in immunoblotting assays to check the integrity of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), gamma-H2AX (?H2AX) and pAkt. The in vivo antitumor activity of quinones associated or not with sodium ascorbate was firstly analyzed by means of survival parameters and tumor growth of mice carrying Ehrlich ascitic tumor. After that, samples of the tumor were collected and analyzed for oxidative stress markers such as: thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), carbonylation of protein, reduced glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glutathione-S-transferase (GST). Also, of Ehrlich ascitic tumor, DNA damages, cellular cycle arrest, influence in glucose capture and type of cell death induced by the treatments were evaluated. The same samples were used in immunoblotting assays of proteins involved in damage to DNA and cell proliferation (?H2AX and pAkt, respectively), cell cycle progression (p53, p16 and cyclin A) and glucose capture (HIF-1a and GLUT1) and proteins involved in cell death signaling (PARP, Bax, Bcl-xL). Results. When associated to ascorbate, quinones promoted an increase in interleaving and oxidative cleavage of CT-DNA. In MCF-7 cells, the association with ascorbate declined significantly cell viability. The associations juglone/ascorbate and, mainly Q7/ascorbate increased levels of intracellular EROs and damage to DNA. The three assessed associations promoted the decrease in the number of colonies, however, julone/ascorbate and Q7/ascorbate were able to inhibit the protein pAkt. The in vitro results were in vivo reproduced. Juglone/ascorbate and Q7/ascorbate significantly inhibited the growth of the tumor and increased survival time of the animals. The oxidative stress markers were altered pointing to an induction in the generation of ROS by these treatments, thereby increasing lipid peroxidation and protein carbonylation, damaging DNA of cells of Ehrlich ascitic tumor also promoting, cellular cycle arrest in G1/S, reduction of glucose capture and cellular death by apoptosis. Conclusion. The results presented here showed that the sodium ascorbate potentialized the antitumor effect of juglone, especially Q7, also in vivo, evidencing that those associations are promising agents for cancer treatment.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T12:36:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 210227.pdf: 843615 bytes, checksum: 07c918de573264ba089f2ab656de136a (MD5) / O desequilíbrio entre os mecanismos que causam condições oxidativas e as defesas antioxidantes provoca uma variedade de mudanças fisiológicas, chamadas coletivamente de estresse oxidativo. A cardiopatia chagásica é uma patologia com características de inflamação crônica muito próxima a uma doença auto-imune que tem mecanismo de ação ainda obscuro. O objetivo deste trabalho foi analisar as enzimas antioxidantes nos eritrócitos de pacientes cardiopatas chagásicos crônicos puros, classificados em 4 grupos nomeados de I à IV (cada grupo contendo n=10), variando entre estes grupos o grau de comprometimento cardíaco, segundo classificação de Los Andes modificada. Cada um dos quatro grupos chagásicos foi igualado a indivíduos saudáveis pela idade, formando 4 grupos-controle, e ainda, um grupo V formado por 10 pacientes não chagásicos com insuficiência cardíaca de etiologia orovalvar com sobrecarga de pressão e volume, perfazendo um total de 90 pacientes. Foram examinadas as enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e ainda os tióis não proteicos (GSH), (GT) e (GSSG). As atividades da SOD, CAT, GR e os níveis de GT e GSSG essencialmente não apresentaram diferenças entre os grupos chagásicos. A concentração de GSH diminui com a progressão da doença e apresentou aumento em relação aos controles nos grupos I, II e III. As atividades da GST e GPx estiveram aumentadas no grupo III e diminuídas no grupo II e IV, indicando uma diminuição destes antioxidantes com a progressão da doença. O grupo V, exceção às atividades da SOD e da CAT que foram semelhantes, mostrou aumentos das enzimas em relação ao grupo IV, constituindo um comportamento diferenciado neste sentido. Esses resultados sugerem a existência de um quadro de estresse oxidativo com o aumento das condições oxidativas paralelamente à evolução da doença, ou seja, pacientes com grau mais elevado de acometimento cardíaco têm uma capacidade antioxidante diminuída, o que sugere uma perda grande das defesas antioxidantes. Os dados do presente trabalho têm grande importância quanto ao sistema antioxidante relacionado com os mecanismos de agressão do parasita nesta patologia crônica.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pos-Graduação em Nutrição. / Made available in DSpace on 2012-10-21T17:56:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 205419.pdf: 776341 bytes, checksum: 85be78a4e58577bf3d5e52f1dfe21144 (MD5) / As espécies reativas de oxigênio (ERO) estão continuamente relacionadas com o consumo de oxigênio nos organismos aeróbicos, incluindo os seres humanos. Sua produção é aumentada em eventos patológicos, como no processo inflamatório, dentre eles a doença periodontal. O principal objetivo do presente estudo foi avaliar a incidência do estresse oxidativo no tecido gengival em indivíduos com doença periodontal crônica. Dezoito indivíduos participaram do estudo e foram divididos em dois grupos (n=9 em cada grupo): controle (pacientes saudáveis # média de idade 46,77 ± 12,94 ), com profundidade de sondagem de até 3mm; e grupo experimental (pacientes com periodontite # média de idade 55,5 ± 11,32), com profundidade de sondagem entre 6-9mm. A avaliação nutricional baseou-se no consumo alimentar e em medidas antropométricas. Fragmentos de tecido gengival foram coletados para análise enzimática de antioxidantes: catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-transferase (GST), glutationa redutase (GR); antioxidantes não enzimáticos: glutationa total (GT), glutationa reduzida (GSH); e biomarcadores do estresse oxidativo, tal como, glutationa oxidada (GSSG) e lipoperoxidação tecidual, avaliado como TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico). A atividade da mieloperoxidase (MPO) também foi analisada. Em relação ao estado nutricional, foram obtidos os seguintes resultados no grupo controle: índice de massa corporal (IMC) = 24,88 ± 3,72; circunferência braquial (CB) = 30,30 ± 3,86; prega cutânea triciptal (PCT) = 14,55 ± 5,56; circunferência muscular do braço (CBM) = 24,23 ± 3,86. No grupo experimental índice de massa corporal (IMC) = 27,65 ± 4,32; circunferência braquial (CB) = 33,56 ± 2,66; prega cutânea triciptal (PCT) = 32,26 ± 10,76; circunferência muscular do braço (CBM) = 23,34 ± 3,12. O consumo alimentar do grupo controle (indivíduos considerados normais em relação ao estado nutricional) mostrou uma presença elevada de antioxidantes comparado ao grupo experimental (considerados indivíduos pré-obesos). Os indivíduos com doença periodontal mostraram um aumento da GSSG e concentrações de TBARS no tecido gengival, comparados ao pacientes saudáveis. Além disso, o grupo experimental, mostrou também um aumento da atividade da GPx, GST e MPO e concentrações de GT nos fragmentos gengivais analisados, quando comparado ao grupo controle. As atividades da CAT e da GR não apresentaram significância estatística entre os grupos. A análise das amostras obtidas em relação estado dos antioxidantes, atividade da MPO e o estado nutricional, sugere uma forte correlação entre biomarcadores do estresse oxidativo e doença periodontal, a qual provavelmente estava associada com o estado nutricional dos indivíduos pesquisados.

Orientador : Dr. Paulo da Cunha Lana / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Zoologia. Defesa: Curitiba, 29/02/2016 / Inclui referências : f. 23-29 / Resumo: Avaliamos experimentalmente respostas in situ do poliqueta Laeonereis culveri à contaminação/descontaminação aguda e crônica por esgoto em um estuário subtropical. Analisamos os níveis de capacidade antioxidante contra radicais peroxil (ACAP) e de lipoperoxidação (LPO) com um experimento envolvendo transplantes recíprocos entre áreas contaminadas e não contaminadas em agudo/curto (24 à 96 horas) e crônico/médio (7 à 14 dias) prazo. No experimento agudo, os níveis de LPO aumentaram significativamente nos animais transplantados da área não contaminada para a área contaminada. Contudo, não houve uma diminuição significativa nos níveis de ACAP entre os animais transplantados e os da área de origem. Não houve decréscimo significativo nos níveis de LPO nos animais transplantados da área contaminada para a área não contaminada, mas os níveis de ACAP diminuíram ao longo do tempo. Variações nas respostas bioquímicas no experimento crônico estavam mais relacionadas à variabilidade de fundo ao longo do tempo e à heterogeneidade entre áreas do que à manipulação experimental. Nossos resultados indicam que as respostas bioquímicas em L. culveri ocorrem na escala de horas a dias após contaminação ou descontaminação abruptas. Palavras-chave: esgoto; estresse oxidativo; peroxidação lipídica; manipulação; recuperação / Abstract: This study experimentally evaluated in situ responses of the polychaete Laeonereis culveri to acute or chronic contamination/decontamination by sewage in a subtropical estuary. We assessed levels of the total antioxidant capacity (ACAP) and lipoperoxidation (LPO) through an experiment involving reciprocal transplants between contaminated and uncontaminated intertidal areas in acute/short term (24 to 96 hours) and chronic/medium term (7 to 14 days) time scales. In the acute assay, LPO levels significantly increased in animals transplanted from an uncontaminated to a contaminated area. However, there was no significant decrease in ACAP levels between transplanted worms and those from origin areas. There was no significant decrease of LPO levels in animals transplanted from contaminated to uncontaminated areas, but ACAP levels surprisingly decreased over time. None of the biochemical variables were affected in the chronic assay. Variations in biochemical responses were more related to background variability over time and heterogeneity among areas than to the experimental manipulation itself. Our results strongly suggest that biochemical responses in L. culveri occur on the time scale of hours to days after abrupt contamination or decontamination. Keywords: sewage; oxidative stress; lipoperoxidation; manipulation; recovery