Tem sido demonstrado o envolvimento do glutamato, através de diferentes receptores, nos mecanismos excitotóxicos que levam à morte neuronal na maioria das doenças neurodegenerativas do Sistema Nervoso Central (SNC). Adicionalmente, a Parawixina 10 (Pwx 10) tem sido demonstrada possuir efeito neuroprotetor em modelos de lesão atuando sobre o transporte de glutamato. Os objetivos gerais deste trabalho foram: i) estudar, em um curso temporal (24h, 1, 2 e 4 semanas), as alterações na expressão dos receptores AMPA no hipocampo de ratos induzidas pela injeção local de NMDA e ii) estudar o efeito neuroprotetor da Pwx 10 neste modelo. Foram utilizados ratos Wistar machos, submetidos à cirurgia estereotáxica para a microinjeção de salina ou NMDA no hipocampo dorsal. Alguns grupos de animais foram tratados com Pwx 10 a partir de 1h ou 24h após NMDA. O teste comportamental no labirinto aquático de Morris (LAM) e a coloração de Nissl foram realizados para verificar a extensão e eficácia da lesão por NMDA e o efeito neuroprotetor da Pwx 10. A expressão dos receptores foi estudada através do método de imunoistoquímica. Foram também realizados experimentos de imunofluorescência para GFAP e NeuN para avaliação da gliose e presença de neurônios na área lesada. Foi observado comprometimento das funções de aprendizado e memória no LAM, além de intensa perda de células neuronais e proliferação glial na região do CA1 que recebeu o NMDA, comprovando a eficiência da lesão pelo agonista. Observamos um curso temporal de diferentes alterações na expressão das subunidades GluR1 e GluR2 dos receptors AMPA no hipocampo, que podem ser relacionadas ao complexo mecanismo que ocorre em resposta à microinjeção de NMDA resultando em uma lesão local e na ativação da plasticidade neuronal. O tratamento com Pwx 10 apresentou efeito neuroprotetor, sendo este mais pronunciado quando a toxina foi administrada a partir de 1h após o agonista. / It has been shown the involvement of glutamate, through different receptors, on the excitotoxic mechanisms which result on the neuronal death reported in most neurodegenerative disorders of the CNS. In addition, Parawixina 10 (Pwx 10) has been demonstrated to act as neuroprotective in models of injury regulating the glutamatergic neurotransmission through glutamate transporters. The aims of this work were: i) to study, in a time course (24h, 1, 2 and 4 weeks), the changes on the expression of AMPA receptors in rat hippocampus induced by NMDA intrahippocampal injection, and ii) to study the neuroprotective effect of Pwx 10 in this moldel. Male Wistar rats has been used, submitted to stereotaxic surgery for saline or NMDA microinjection into dorsal hippocampus. Some groups of animals were treated with Pwx 10 from 1h or 24h after NMDA. The behavioral test on Morris water maze (MWM) and the Nissl staining were performed for evaluating the extension and efficacy of the NMDA injury and the neuroprotective effect of the Pwx 10 . The expression of the receptors was analyzed by immunohistochemistry. The expression of GFAP and NeuN on the lesioned area has also been investigated by immunofluorescency. It was observed the impaiment of learning and memory functions in the MWM, and intense loss of neuronal cells and glial proliferation in CA1 that received the NMDA, confirming the efficiency of the injury by the agonist. We observed a time course of distinct changes on the expression of GluR1 and GluR2 subunits of AMPA receptors in hippocampus, which may be related to the complex mechanism triggered in response to NMDA injection resulting in a local injury and on the activation of neuronal plasticity. The treatment with Pwx 10 showed neuroprotective effect, being most pronounced when the toxin was administrated from 1h after NMDA.

Tem sido demonstrado o envolvimento do glutamato, através de diferentes receptores, nos mecanismos excitotóxicos que levam à morte neuronal na maioria das doenças neurodegenerativas do Sistema Nervoso Central (SNC). Adicionalmente, a Parawixina 10 (Pwx 10) tem sido demonstrada possuir efeito neuroprotetor em modelos de lesão atuando sobre o transporte de glutamato. Os objetivos gerais deste trabalho foram: i) estudar, em um curso temporal (24h, 1, 2 e 4 semanas), as alterações na expressão dos receptores AMPA no hipocampo de ratos induzidas pela injeção local de NMDA e ii) estudar o efeito neuroprotetor da Pwx 10 neste modelo. Foram utilizados ratos Wistar machos, submetidos à cirurgia estereotáxica para a microinjeção de salina ou NMDA no hipocampo dorsal. Alguns grupos de animais foram tratados com Pwx 10 a partir de 1h ou 24h após NMDA. O teste comportamental no labirinto aquático de Morris (LAM) e a coloração de Nissl foram realizados para verificar a extensão e eficácia da lesão por NMDA e o efeito neuroprotetor da Pwx 10. A expressão dos receptores foi estudada através do método de imunoistoquímica. Foram também realizados experimentos de imunofluorescência para GFAP e NeuN para avaliação da gliose e presença de neurônios na área lesada. Foi observado comprometimento das funções de aprendizado e memória no LAM, além de intensa perda de células neuronais e proliferação glial na região do CA1 que recebeu o NMDA, comprovando a eficiência da lesão pelo agonista. Observamos um curso temporal de diferentes alterações na expressão das subunidades GluR1 e GluR2 dos receptors AMPA no hipocampo, que podem ser relacionadas ao complexo mecanismo que ocorre em resposta à microinjeção de NMDA resultando em uma lesão local e na ativação da plasticidade neuronal. O tratamento com Pwx 10 apresentou efeito neuroprotetor, sendo este mais pronunciado quando a toxina foi administrada a partir de 1h após o agonista. / It has been shown the involvement of glutamate, through different receptors, on the excitotoxic mechanisms which result on the neuronal death reported in most neurodegenerative disorders of the CNS. In addition, Parawixina 10 (Pwx 10) has been demonstrated to act as neuroprotective in models of injury regulating the glutamatergic neurotransmission through glutamate transporters. The aims of this work were: i) to study, in a time course (24h, 1, 2 and 4 weeks), the changes on the expression of AMPA receptors in rat hippocampus induced by NMDA intrahippocampal injection, and ii) to study the neuroprotective effect of Pwx 10 in this moldel. Male Wistar rats has been used, submitted to stereotaxic surgery for saline or NMDA microinjection into dorsal hippocampus. Some groups of animals were treated with Pwx 10 from 1h or 24h after NMDA. The behavioral test on Morris water maze (MWM) and the Nissl staining were performed for evaluating the extension and efficacy of the NMDA injury and the neuroprotective effect of the Pwx 10 . The expression of the receptors was analyzed by immunohistochemistry. The expression of GFAP and NeuN on the lesioned area has also been investigated by immunofluorescency. It was observed the impaiment of learning and memory functions in the MWM, and intense loss of neuronal cells and glial proliferation in CA1 that received the NMDA, confirming the efficiency of the injury by the agonist. We observed a time course of distinct changes on the expression of GluR1 and GluR2 subunits of AMPA receptors in hippocampus, which may be related to the complex mechanism triggered in response to NMDA injection resulting in a local injury and on the activation of neuronal plasticity. The treatment with Pwx 10 showed neuroprotective effect, being most pronounced when the toxin was administrated from 1h after NMDA.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Monosodium glutamate (MSG) has been the target of research due to its toxicological effects. Neonatal administration of MSG in animals can affect the morphological and electrophysiological organization of the brain, leading to behavioral disorders in adulthood, including increased pain sensitivity. The present study aimed to investigate the mechanism of action by which MSG induces nociception and the effect of diphenyl diselenide (PhSe)2, an organoselenium compound with pharmacological properties already documented, on nociception induced by MSG. Newborn Wistar rats were treated with ten subcutaneous injections of MSG at a dose of 4.0 g/kg or saline, once a day. At the 60th day of life, rats received daily (PhSe)2 (1 mg/kg) or vehicle (canola oil) by intragastric route for 7 days. The behavioral tests (locomotor activity, hot plate, tail-immersion and mechanical allodynia) were carried out. In addition, hippocampal ex vivo assays were performed to determine Na+, K+-ATPase and Ca2+-ATPase activities, cytokines levels and [3H] glutamate uptake. The results demonstrated that MSG increased nociception in the hot plate test, but not in the tail immersion test, and in the mechanical allodynia stimulated by Von-Frey Hair. (PhSe)2 decreased all nociceptive behaviors induced by MSG. MSG increased hippocampal Na+,K+-ATPase and Ca2+-ATPase activities and pro-inflammatory cytokines levels as well as decreased the anti-inflammatory cytokine (IL-10) and the [3H]glutamate uptake in hippocampi of rats. (PhSe)2 treatment protected against these alterations. These results demonstrated the mechanisms of action involved in nociception induced by MSG and the antinociceptive action of (PhSe)2 after neonatal injections of MSG in rats through the decrease hippocampal excitotoxicity and neuroinflammation associated to the administration of MSG in rats. / O Glutamato monossódico (GMS) tem sido alvo de investigação devido aos seus efeitos toxicológicos. A administração neonatal de GMS em animais pode influenciar na organização morfológica e eletrofisiológica do cérebro, levando a distúrbios de comportamento na idade adulta, incluindo o aumento da sensibilidade à dor. O presente estudo teve como objetivo pesquisar o mecanismo pelo qual o GMS induz nocicepção e avaliar o efeito do disseleneto de difenila (PhSe)2, um composto orgânico de selênio com propriedades farmacológicas já documentadas, na nocicepção induzida por GMS. Ratos Wistar recém-nascidos foram tratados com dez injeções subcutâneas de GMS na dose de 4,0 g/kg ou salina, uma vez por dia. Aos 60 dias de vida, os ratos receberam (PhSe)2 (1mg /kg) ou o veículo (óleo de canola), por via intragástrica, uma vez ao dia, durante 7 dias. Testes comportamentais (atividade locomotora, teste da placa quente, imersão da cauda e alodinia mecânica) foram realizados após trinta minutos do último tratamento com (PhSe)2. Além disso, ensaios ex vivo foram realizados para determinar a atividade das enzimas Na+, K+-ATPase e da Ca2 +-ATPase, os níveis de citocinas e a captação de glutamato em hipocampo. Os resultados demonstraram um aumento na nocicepção induzida por GMS no teste da placa quente e no teste de alodinia mecânica, porém não no teste de imersão da cauda. O (PhSe)2 diminuiu todos os comportamentos nociceptivos induzidos pelo GMS. O GMS estimulou a atividade da Na+, K+-ATPase e da Ca2+-ATPase e induziu o aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, bem como a diminuição da citocina anti-inflamatória, IL-10, e da captação de glutamato no hipocampo de ratos. O tratamento com (PhSe)2 protegeu contra estas alterações. Estes resultados demonstraram mecanismos de ação envolvidos na nocicepção induzida pelo GMS e a ação antinociceptiva do (PhSe)2 após injeções neonatais de GMS em ratos através da diminuição da excitotoxicidade e neuroinflamação hipocampal associada à administração de GMS em ratos.

O L-glutamato (L-Glu) é o principal neurotransmissor excitatório em vertebrados e é fundamental para funções primordiais do sistema nervoso central (SNC), tais como aprendizagem e memória. Entretanto, quando este neurotransmissor está em excesso na fenda sináptica, pode provocar uma série de eventos excitotóxicos, que por sua vez, estão associados a muitas neuropatologias. A terapia da maioria dessas doenças é ineficiente e provoca sérios efeitos colaterais. Portanto, é necessário desenvolver fármacos mais efetivos e com menos efeitos colaterais. Assim, peçonhas de artrópodes como a da aranha P. bistriata, se apresentam como fontes alternativas de compostos neuroativos, pois já demonstraram efeitos neuroprotetores in vitro e in vivo, bem como anticonvulsivos. Destarte, o objetivo deste estudo foi investigar um possível efeito neuroprotetor da fração RT10, isolada da peçonha de P.bistriata, em cultura primária de neurônios e glia (CPNGs), do tecido nervoso de ratos recém-nascidos, expostos a concentrações tóxicas de L-Glu (5 mM). As CPNGs foram tratadas durante 3 horas, previamente à lesão, que foi feita por um período de 12h. Ambas as exposições (tratamento e lesão) foram conduzidas no 7.º dia in vitro (DIV). Para analisar quantitativamente e qualitativamente os efeitos dos tratamentos, bem como demonstrar a composição das CPNGs foram realizados ensaios de viabilidade celular, com o sal sódico de resazurina (SSR) e, imunomarcações com anticorpos primários para MAP2, NeuN e GFAP. A fração RT10 foi neuroprotetora, pois diminuiu a perda celular nos testes com o SSR em 10%, nas CPNGs, expostas ao L-Glu, além de apresentarem efeito maior (5%), que o do fármaco Riluzol (RIL). A neuroproteção da RT10 também foi observada nos ensaios de imunocitoquimica. Os neurônios tratados com RT10 e RIL, que foram marcados com anti-MAP2 tiveram maior prolongamentos dos dendritos em relação aos neurônios não tratados. Portanto, a intensidade da fluorescência de anti-MAP2 para os neurônios tratados com esta fração foi 38% maior em relação aos não tratados; e 21% maior quando comparados ao grupo RIL. Deste modo, podemos considerar a RT10, como uma ferramenta para a prospecção de novos fármacos contra neurodegenerações, in vitro e principalmente estudos de mecanismo de ação, cujas variáveis podem ser mais bem controladas. / L-Glutamate (L-Glu), the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system of vertebrates, is essential to the occurrence of cognitive functions. However, when L-Glu is over-accumulated in a synaptic cleft it can provoke excitotoxicity (EXT), which has been implicated in many neurological disorders (NDs). The current therapies against NDs are undereffective and can provoke side effects, so it is necessary to develop new treatments. In this regard, neuroactive compounds obtained from Parawixia bistriata spider venom are an alternative source of neuroactive compounds, because they showed neuroprotective effects in vitro and in vivo. Thus, the main aim of this work was to evaluate a possible neuroprotective effect of RT10 fraction obtained from P. bistriata venom in primary culture of neuron and glial cells (PCNGCs) from cerebral tissue of newborn Wistar rats, after the exposition to L-glu toxic concentration (5mM). The PCNGCs were submitted to the neuroprotection treatments for 3 hours and previously to the neurotoxic treatment, which the L-glu stayed for 12h in the PNGCs. The both expositions were conducted on the 7th day in vitro (DIV). The Resazurin sodium salt (RSS) and immunocytochemistry (MAP2, NeuN e GFAP primary antibodies) trials were utilized to measure quantitatively and qualitatively the treatments, as well as to prove the culture composition. In the RSS trial, the RT10 was neuroprotector, since avoided the cell death in 10%, under the PCNGCs which were exposed to L-Glu. in addition, RT10 demonstrated higher effect than rilozole (5%). RT10 attenuated the toxic effects of L-Glu under the neuromorphology, consequently the fluorescence intensity of MAP2 at PCNGC treated with RT10 was 38% higher than untreated group and it was 21% higher than riluzole group. Thus, we can consider that RT10 compounds are valuable tools to the prospection of new drugs against NDs.

Muitos estudos demonstram que a abertura de canais de K+ mitocondriais sensíveis à ATP (mitoKATP) previnem contra danos promovidos por isquemia/reperfusão em coração. Em geral, esta proteção envolve mudanças no estado redox mitocondrial. Em cérebro, sabe-se que agonistas farmacológicos de mitoKATP também protegem em modelo de isquemia/reperfusão. Entretanto, os mecanismos envolvidos na prevenção de danos em cérebro ainda não estão claros. O objetivo principal deste trabalho é compreender os efeitos de canais de K+ mitocondriais ATP-sensíveis em tecido cerebral e os mecanismos pelos quais a sua ativação pode proteger contra danos promovidos por excitotoxicidade, uma das principais conseqüências de um evento isquêmico em cérebro. Neste contexto, demonstramos a proteção pelo mitoKATP em modelo de excitotoxicidade induzida pela ativação direta de receptores NMDA, utilizando cultura de células granulosas de cerebelo. Paralelamente a essa proteção, verificamos que a ativação de mitoKATP reduz a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Em mitocôndrias isoladas, observamos que ROS geradas pela mitocôndria ativam mitoKATP cerebral, resultando em um aumento da captação de K+ para a matriz, medida através da técnica de inchamento mitocondrial. Em condições de baixa geração de ROS, a adição de H2O2 exógeno ativa o inchamento mitocondrial em resposta à entrada de K+ de modo prevenido por catalase, assim, confirmando que a atividade desses canais é redox-sensível. A ativação de mitoKATP por agonistas farmacológicos, como diazóxido, também é maior na presença de alta geração de ROS, conforme indicado por uma leve diminuição no potencial de membrana mitocondrial. Interessantemente, a adição de um redutor tiólico, 2-mercaptopropionilglicina (MPG) previne a ativação de mitoKATP. A ativação de mitoKATP não alterou a capacidade de captar Ca2+ pela mitocôndria, demonstrando que este não é o mecanismo pelo qual esses canais previnem morte celular excitotóxica. Não foram observados efeitos desses canais em modelo de excitotoxicidade in vivo e em modelo de doença neurodegenerativa, acidose metilmalônica. Juntos, nossos resultados demonstram que mitoKATP cerebrais agem como sensores de ROS mitocondrial, que quando ativados reduzem a liberação de ROS por um leve desacoplamento, prevenindo morte neuronal por excitotoxicidade NMDA-induzida / Several studies have shown that mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening prevents ischemia/reperfusion injuries in heart, in a manner involving changes in redox state. In brain, mitoKATP agonists also protect against ischemia/reperfusion. However, the exactly mechanism that mitoKATP protects the brain is still unclear. The purpose of this work is to understand the effects of mitochondrial ATP-sensitive K+ channels in brain and how this channel can protect against excitotoxic cell death, the main consequence of a cerebral ischemia. In this context, we demonstrate that mitoKATP protects against excitotoxicity promoted by NMDA receptor activation in cultured cerebellar granule cells. In paralell, we verified that mitoKATP activation also decreases reactive oxygen species (ROS). In isolated mitochondria, we observed that mitochondrially-generated ROS can activate brain mitoKATP, resulting in enhanced K+ uptake into the matrix, measured as swelling of the organelle. Under conditions in which mitochondrial ROS release is low, exogenous H2O2 activated swelling secondary to K+ entrance, in a manner prevented by catalase, confirming that the activity of this channel is redox-sensitive. Activation of mitoKATP channels by the pharmacological agonist diazoxide was also improved when endogenous mitochondrial ROS release was enhanced, as indicated by mild decreases in mitochondrial membrane potentials. Interessantly, mitoKATP activation was preveted by the thiol reductant 2-mercaptopropionylglycine (MPG). Mitochondrial Ca2+ uptake was not modified by opening mitoKATP, suggesting that this is not the mechanism through which this channel prevents excitotoxic cell death. In an in vivo excitotoxicity model and also neurodegenerative disease model, methylmalonic acidemia, the effects of mitoKATP agonists were not observed. Together, our results demonstrate that brain mitoKATP acts as a mitochondrial ROS sensor, which, when activated, prevents ROS release by mildly uncoupling respiration from oxidative phosphorylation, decreasing excitotoxic cell death

Muitos estudos demonstram que a abertura de canais de K+ mitocondriais sensíveis à ATP (mitoKATP) previnem contra danos promovidos por isquemia/reperfusão em coração. Em geral, esta proteção envolve mudanças no estado redox mitocondrial. Em cérebro, sabe-se que agonistas farmacológicos de mitoKATP também protegem em modelo de isquemia/reperfusão. Entretanto, os mecanismos envolvidos na prevenção de danos em cérebro ainda não estão claros. O objetivo principal deste trabalho é compreender os efeitos de canais de K+ mitocondriais ATP-sensíveis em tecido cerebral e os mecanismos pelos quais a sua ativação pode proteger contra danos promovidos por excitotoxicidade, uma das principais conseqüências de um evento isquêmico em cérebro. Neste contexto, demonstramos a proteção pelo mitoKATP em modelo de excitotoxicidade induzida pela ativação direta de receptores NMDA, utilizando cultura de células granulosas de cerebelo. Paralelamente a essa proteção, verificamos que a ativação de mitoKATP reduz a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Em mitocôndrias isoladas, observamos que ROS geradas pela mitocôndria ativam mitoKATP cerebral, resultando em um aumento da captação de K+ para a matriz, medida através da técnica de inchamento mitocondrial. Em condições de baixa geração de ROS, a adição de H2O2 exógeno ativa o inchamento mitocondrial em resposta à entrada de K+ de modo prevenido por catalase, assim, confirmando que a atividade desses canais é redox-sensível. A ativação de mitoKATP por agonistas farmacológicos, como diazóxido, também é maior na presença de alta geração de ROS, conforme indicado por uma leve diminuição no potencial de membrana mitocondrial. Interessantemente, a adição de um redutor tiólico, 2-mercaptopropionilglicina (MPG) previne a ativação de mitoKATP. A ativação de mitoKATP não alterou a capacidade de captar Ca2+ pela mitocôndria, demonstrando que este não é o mecanismo pelo qual esses canais previnem morte celular excitotóxica. Não foram observados efeitos desses canais em modelo de excitotoxicidade in vivo e em modelo de doença neurodegenerativa, acidose metilmalônica. Juntos, nossos resultados demonstram que mitoKATP cerebrais agem como sensores de ROS mitocondrial, que quando ativados reduzem a liberação de ROS por um leve desacoplamento, prevenindo morte neuronal por excitotoxicidade NMDA-induzida / Several studies have shown that mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening prevents ischemia/reperfusion injuries in heart, in a manner involving changes in redox state. In brain, mitoKATP agonists also protect against ischemia/reperfusion. However, the exactly mechanism that mitoKATP protects the brain is still unclear. The purpose of this work is to understand the effects of mitochondrial ATP-sensitive K+ channels in brain and how this channel can protect against excitotoxic cell death, the main consequence of a cerebral ischemia. In this context, we demonstrate that mitoKATP protects against excitotoxicity promoted by NMDA receptor activation in cultured cerebellar granule cells. In paralell, we verified that mitoKATP activation also decreases reactive oxygen species (ROS). In isolated mitochondria, we observed that mitochondrially-generated ROS can activate brain mitoKATP, resulting in enhanced K+ uptake into the matrix, measured as swelling of the organelle. Under conditions in which mitochondrial ROS release is low, exogenous H2O2 activated swelling secondary to K+ entrance, in a manner prevented by catalase, confirming that the activity of this channel is redox-sensitive. Activation of mitoKATP channels by the pharmacological agonist diazoxide was also improved when endogenous mitochondrial ROS release was enhanced, as indicated by mild decreases in mitochondrial membrane potentials. Interessantly, mitoKATP activation was preveted by the thiol reductant 2-mercaptopropionylglycine (MPG). Mitochondrial Ca2+ uptake was not modified by opening mitoKATP, suggesting that this is not the mechanism through which this channel prevents excitotoxic cell death. In an in vivo excitotoxicity model and also neurodegenerative disease model, methylmalonic acidemia, the effects of mitoKATP agonists were not observed. Together, our results demonstrate that brain mitoKATP acts as a mitochondrial ROS sensor, which, when activated, prevents ROS release by mildly uncoupling respiration from oxidative phosphorylation, decreasing excitotoxic cell death

O L-glutamato (L-Glu) é o principal neurotransmissor excitatório em vertebrados e é fundamental para funções primordiais do sistema nervoso central (SNC), tais como aprendizagem e memória. Entretanto, quando este neurotransmissor está em excesso na fenda sináptica, pode provocar uma série de eventos excitotóxicos, que por sua vez, estão associados a muitas neuropatologias. A terapia da maioria dessas doenças é ineficiente e provoca sérios efeitos colaterais. Portanto, é necessário desenvolver fármacos mais efetivos e com menos efeitos colaterais. Assim, peçonhas de artrópodes como a da aranha P. bistriata, se apresentam como fontes alternativas de compostos neuroativos, pois já demonstraram efeitos neuroprotetores in vitro e in vivo, bem como anticonvulsivos. Destarte, o objetivo deste estudo foi investigar um possível efeito neuroprotetor da fração RT10, isolada da peçonha de P.bistriata, em cultura primária de neurônios e glia (CPNGs), do tecido nervoso de ratos recém-nascidos, expostos a concentrações tóxicas de L-Glu (5 mM). As CPNGs foram tratadas durante 3 horas, previamente à lesão, que foi feita por um período de 12h. Ambas as exposições (tratamento e lesão) foram conduzidas no 7.º dia in vitro (DIV). Para analisar quantitativamente e qualitativamente os efeitos dos tratamentos, bem como demonstrar a composição das CPNGs foram realizados ensaios de viabilidade celular, com o sal sódico de resazurina (SSR) e, imunomarcações com anticorpos primários para MAP2, NeuN e GFAP. A fração RT10 foi neuroprotetora, pois diminuiu a perda celular nos testes com o SSR em 10%, nas CPNGs, expostas ao L-Glu, além de apresentarem efeito maior (5%), que o do fármaco Riluzol (RIL). A neuroproteção da RT10 também foi observada nos ensaios de imunocitoquimica. Os neurônios tratados com RT10 e RIL, que foram marcados com anti-MAP2 tiveram maior prolongamentos dos dendritos em relação aos neurônios não tratados. Portanto, a intensidade da fluorescência de anti-MAP2 para os neurônios tratados com esta fração foi 38% maior em relação aos não tratados; e 21% maior quando comparados ao grupo RIL. Deste modo, podemos considerar a RT10, como uma ferramenta para a prospecção de novos fármacos contra neurodegenerações, in vitro e principalmente estudos de mecanismo de ação, cujas variáveis podem ser mais bem controladas. / L-Glutamate (L-Glu), the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system of vertebrates, is essential to the occurrence of cognitive functions. However, when L-Glu is over-accumulated in a synaptic cleft it can provoke excitotoxicity (EXT), which has been implicated in many neurological disorders (NDs). The current therapies against NDs are undereffective and can provoke side effects, so it is necessary to develop new treatments. In this regard, neuroactive compounds obtained from Parawixia bistriata spider venom are an alternative source of neuroactive compounds, because they showed neuroprotective effects in vitro and in vivo. Thus, the main aim of this work was to evaluate a possible neuroprotective effect of RT10 fraction obtained from P. bistriata venom in primary culture of neuron and glial cells (PCNGCs) from cerebral tissue of newborn Wistar rats, after the exposition to L-glu toxic concentration (5mM). The PCNGCs were submitted to the neuroprotection treatments for 3 hours and previously to the neurotoxic treatment, which the L-glu stayed for 12h in the PNGCs. The both expositions were conducted on the 7th day in vitro (DIV). The Resazurin sodium salt (RSS) and immunocytochemistry (MAP2, NeuN e GFAP primary antibodies) trials were utilized to measure quantitatively and qualitatively the treatments, as well as to prove the culture composition. In the RSS trial, the RT10 was neuroprotector, since avoided the cell death in 10%, under the PCNGCs which were exposed to L-Glu. in addition, RT10 demonstrated higher effect than rilozole (5%). RT10 attenuated the toxic effects of L-Glu under the neuromorphology, consequently the fluorescence intensity of MAP2 at PCNGC treated with RT10 was 38% higher than untreated group and it was 21% higher than riluzole group. Thus, we can consider that RT10 compounds are valuable tools to the prospection of new drugs against NDs.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Glutaric acidemia type I (GA-I) is an inborn error of metabolism (EIM) biochemically characterized by the main accumulation of glutaric acid (GA) and 3- hydroxyglutaric acid (3-OH-GA), and pathologically by a characteristic striatal degeneration. Due the absence of effective therapeutic strategies for this acidemia, several studies have investigated new therapies, since that one in three children subject to current treatments show striatal degeneration. In this context, the present work aimed in the first part, to investigate the effects of acute treatment with creatine (Cr), an endogenous compound guanidine which has shown neuroprotective effects in a variety of experimental models of neurodegenerative diseases and also in organic acidemias, on the GA-induced behavioral and neurochemical changes in vivo. Our results demonstrated that acute administration of Cr prevented the GA-induced behavioral and electrographic seizures, the carbonyl protein content increased and the Na+,K+-ATPase enzyme activity reduction in rats. Moreover, the Cr also protected the GA-induced sinaptossomal L-[3H]glutamate uptake reduction in vitro. As was observed in this first part, that the GA in a low concentration (10 nM) was able to reduce the L-[3H]glutamate uptake in striatal sinaptossomas of rats, and since that responsible mechanisms for striatal degeneration observed in patients are still poorly understood, we decided to evaluate in a second step, a primary action mechanism for the neurotoxic effects this low concentration of GA, which possibly may be present at the beginning of GA-I. We find that the GA reduced the L-[3H]glutamate uptake and increased the reactive species (ER) formation in sinaptossomas the striatum of rats in all times tested. Furthermore, we observed for the first time that the GA reduced the efficacy (VMax), but not the affinity (KD) of L-[3H]glutamate uptake in striatal sinaptossomas, suggesting a non-competitive inhibition. The addition of both the L-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylate (PDC), a glutamate transporters inhibitor, with the GA did not alter the inhibitory effect on the of L-[3H]glutamate uptake induced by organic acid, indicating the involvement of glutamate transporters in the GA-induced uptake reduction. Since the glutamate transporters activity can be inhibited by oxidation, we show that although the antioxidant trolox protects against GA-induced ER formation increase, it did not protect against GA-induced glutamate uptake reduction in the synaptosomes of cerebral structure studied, suggesting that ER formation may be a late event in the neurotoxicity observed in GA-I. Moreover, we can not exclude the possibility that the GA may also directly stimulate the glutamate receptors, since the GA-induced ER formation was reduced by the non-NMDA glutamate receptor antagonist, the CNQX, but not by MK-801, suggesting that these receptors contributed, at least partly, to the GA-induced oxidative stress. Also determined GA, in this low concentration, did not show oxidant activity per se. Therefore, from results in this study it was observed the protective effect of Cr administration in the deleterious actions caused by the GA. Furthermore, we show for the first time that a GA low concentration cause primary excitotoxicity, and oxidative stress in brain structure predominantly affected in this disease. Therefore, we believe that this work may help explain the genesis of GA-I, as well as the development of effective adjuvant therapeutic strategies in the treatment this acidemia. / A acidemia glutárica tipo I (GA-I) é um erro inato do metabolismo (EIM) caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo principal de ácido glutárico (GA) e ácido 3-hidroxiglutárico (3-OH-GA), e patologicamente por uma característica degeneração estriatal. Devido à escassez de medidas terapêuticas efetivas para essa acidemia, vários estudos têm investigado novas terapias, já que uma em cada três crianças submetidas aos atuais tratamentos sofre degeneração estriatal. Nesse contexto, o presente trabalho teve por objetivo em sua primeira parte, investigar os efeitos do tratamento agudo com creatina (Cr), um composto guanidínico endógeno que tem mostrado efeitos neuroprotetores em uma variedade de modelos experimentais de doenças neurodegenerativas e também em acidemias orgânicas, sobre as alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo GA in vivo. Nossos resultados demonstraram que a administração aguda de Cr preveniu as convulsões comportamentais e eletrográficas, o aumento do conteúdo de proteína carbonil e a redução da atividade da enzima Na+,K+-ATPase induzidos pelo GA em ratos. Além disso, a Cr também protegeu da redução da captação de L-[3H]glutamato sinaptossomal induzida pelo GA in vitro. Como foi observado nesta primeira parte, que o GA em uma baixa concentração (10 nM) foi capaz de reduzir a captação de L-[3H]glutamato em sinaptossomas estriatais de ratos, e desde que os mecanismos responsáveis pela degeneração estriatal observada nos pacientes glutaricoacidêmicos ainda não estão bem esclarecidos, decidimos avaliar em uma segunda etapa, um provável mecanismo de ação primário para os efeitos neurotóxicos desta baixa concentração de GA, que possivelmente pode estar presente no início da GA-I. Verificamos que o GA reduziu a captação de L-[3H]glutamato e aumentou a formação de espécies reativas (ER) em sinaptossomas de estriado de ratos em todos os tempos testados. Além disso, observamos pela primeira vez que o GA reduziu a eficácia (VMax), mas não a afinidade (KD) da captação de L-[3H]glutamato em sinaptossomas estriatais, sugerindo uma inibição do tipo não competitiva. A adição simultânea do L-trans-pirrolidina-2,4-dicarboxilato (PDC), um inibidor dos transportadores de glutamato, com o GA não alterou o efeito inibitório sobre a captação de L-[3H]glutamato induzido pelo ácido orgânico, indicando a participação dos transportadores de glutamato na redução da captação desse neurotransmissor induzida pelo GA. Desde que a atividade dos transportadores de glutamato pode ser inibida por oxidação, evidenciamos que embora o antioxidante trolox proteja do aumento da formação de ER induzidas pelo GA, ele não protege da redução da captação de L-[3H]glutamato induzida por este ácido orgânico em sinaptossomas de estriado. Estes achados sugerem que a formação de ER pode ser um evento tardio na neurotoxicidade observada na GA-I. Além disso, não podemos excluir a possibilidade de que o GA também possa estimular diretamente os receptores de glutamato, desde que a formação de ER induzidas pelo GA foi atenuada pelo antagonista de receptor de glutamato não-NMDA, o CNQX, mas não pelo MK-801 e o GA, nessa baixa concentração, não apresentou atividade oxidante per se. Portanto, os resultados apresentados no presente estudo demonstram que a administração previa de creatina protege das ações deletérias ocasionadas pelo GA. Além disso, evidenciamos, pela primeira vez, que uma baixa concentração de GA causa ações excitotóxicas primárias, bem como, estresse oxidativo na estrutura cerebral predominantemente afetada nesta doença. Assim, acreditamos que este trabalho possa auxiliar na elucidação da gênese da GA-I, bem como no desenvolvimento de estratégias terapêuticas adjuvantes eficazes no tratamento desta acidemia.