Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissPVC.pdf: 931304 bytes, checksum: 56aee4360d52be36ef0d88b8beb6b9b2 (MD5) Previous issue date: 2004-01-01 / Proteins from the inner core of HIV-1 are involved in crucial processes during the virus life cycle. p24 is the major capsid protein of HIV and is initially expressed as part of the gag polyprotein. The association of gag proteins to the cell inner-membrane surface initiates virus assembly and induces budding from the host cell membrane. Thus, p24 plays an active structural role both as part of the Gag protein and in its mature form. In this sense, we have chosen a region from C-terminal of p24, TLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNA, (p24-3) which is part of the major region responsible for protein dimerization. The linear peptide, rp24-3, and its cyclic variant, rp24-3m, were produced by recombinant strategy in Escherichia coli. The gene fragments were obtained by the synthetic gene approach and inserted into pET 32a to produce fusion proteins in the soluble form. The expression products were purified by Ni-affinity chromatography followed by an enzymatic cleavage. The peptides where purified by reverse phase chromatography and their primary sequence and molecular masses where inferred by amino acid sequence analysis and mass spectrometry, respectively. The rp24-3 secondary structure was investigated by circular dichroism and steady state fluorescence, been structured differently in water and in buffer. Besides, its tryptophan is in a partially buried environment and the addition of methanol above 70% caused a highly increase in helical content. In conclusion, this work shows a suitable system for rp24-3 production, providing satisfactory amount for structural studies. / As proteínas do centro do HIV-1 estão envolvidas em processos cruciais durante o ciclo de vida viral. A p24 é a principal proteína do capsídeo do HIV e é inicialmente expressa como parte da poliproteína Gag. A associação das proteínas Gag na superfície da membrana interna da célula hospedeira dá início à montagem viral e desencadeia o processo de brotamento da membrana da célula hospedeira. Dessa forma, a p24 possui um importante papel estrutural tanto no contexto da Gag, como na sua forma madura. Nesse sentido, foi escolhido um peptídeo da região C-terminal da p24, TLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNA, (p24-3) que compõe a região principal responsável pela dimerização da proteína p24. O peptídeo linear, rp24-3, e sua variante cíclica, rp24-3m, foram produzidos em Escherichia coli via estratégia recombinante. Os fragmentos gênicos foram obtidos por meio da montagem de genes sintéticos e foram inseridos no vetor pET 32a para a produção como proteínas de fusão na forma solúvel. Os produtos expressos foram purificados por cromatografia de afinidade em Ni e submetidos a uma clivagem enzimática. Os peptídeos foram então purificados por cromatografia em fase reversa e suas sequências primárias e massas moleculares foram inferidas por meio do sequenciamento de aminoácidos e análises por espectrometria de massa, respectivamente. A estrutura secundária do rp24-3 foi investigada por dicroísmo circular e fluorescência estática, mostrando-se estruturado diferentemente em água e em PBS. Além disso, o triptofano está em um ambiente parcialmente escondido. A adição de metanol acima de 70% causou um grande aumento no conteúdo de hélices. Concluíndo, este trabalho mostra um sistema viável para a produção do rp24-3, proporcionando quantidades necessárias para a realização de estudos estruturais.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6599.pdf: 2881840 bytes, checksum: f0c91115276cbdeae047c039f2676980 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / The sugar cane represents one of the most Important agricultural segments in Brazil, which is the largest producer and exporter of sugar in the world as well the second largest ethanol producer. The Sphenophorus levis (Curculionidae) is an important sugarcane pest which lacks effective methods of control. The larvae of this insect feed the sugar cane plant decreasing productivity and causing the plant death. In view of identify the insect digestive arsenal enzymes, a transcriptome study was previously performed from S. levis larvae. Thereby, an invertase (P-fructofuranosidases class) coding sequence was identified and characterized. Considering the scarcity of functional studies on insect P-fructofuranosidases and their apparent non-occurrence among coleopterans, the aim of the present study was to investigate the occurrence and characterize the P-fructofuranosidase transcript identified. To validate that the P-fructofuranosidase sequence (herein denominated Sl-fi-fruct) is indeed encoded by the S. levis genome, PCRs were performed using genomic DNA extracted from the larval fat body as well as DNA from the midgut with microbial content. Amplification of Sl-fi-fruct gene using larval fat body DNA indicated its presence in the insect's genomic DNA. Quantitative PCR (qRT-PCR) analyses indicated that the production of mRNA only occurs in the midgut and reaches the greatest expression level in 30-day-old larvae, which is the expected pattern for digestive enzymes. Chromatography of glycosidases from S. levis midguts showed two enzymes acting as P-fructofuranosidase, indicating the presence of a Sl-fi-fruct isoform or a P-fructofuranosidase from insect intestinal microbiota. Moreover, it was found that a-glucosidases do not act on sucrose hydrolysis. Phylogenetic analyses indicated this enzyme to be similar to enzymes found in other coleopteran and lepidopteran P-fructofuranosidases, but also closely similar to bacterial enzymes, suggesting potential horizontal gene transfer. Despite this, the enzyme seems to be restricted to different groups of bacteria, which suggests distinct origin events. The Sl-fi-fruct gene was cloned in Pichia pastoris to produce the recombinant enzyme (rSl-P-fruct). Molecular weight of the recombinant protein was about 64 kDa, indicating possible glycosylation, since the theoretical weight was 54.8 kDa. The substrate specificity test revealed that rSl-P-fruct hydrolyzes sucrose and raffinose, but not melibiose or maltose, thereby confirming invertase activity. The pH curve revealed greatest activity at pH 5.0, demonstrating rSl-P-fruct to be an acidic P-fructofuranosidase. The enzymatic characterization was done and the optimum temperature was 50 °C, thermal resistance at 36 °C and pH maximum resistance at 6.0. The Michaelis-Menten curve showed Km=20.02 μM, Kcat=520.9 s-1 and Vmax=105.7 μM.s-1. 5 mM of SDS and MgCl2 cause inhibition of rSl-β-fruct activity. The present study expands the concept of the occurrence of P-fructofuranosidase in insects. Despite the few descriptions of this gene in the animal kingdom, it is possible to state that P-fructofuranosidase is crucial to the establishment of some insects throughout their evolutionary history, especially members of the Lepidoptera and Coleoptera clades. Considering the rSl-P-fruct potential to industrial application, they are promising if the thermal properties are improved. / O coleóptero Sphenophorus levis é uma Importante praga da cana-de-açúcar, para o qual ainda não existe um método de controle adequado. Considerando a Importância da cultura canavieira no Brasil, maior produtor e exportador de açúcar e segundo maior produtor de etanol no mundo, um estudo transcriptômico das larvas do inseto foi realizado anteriormente a este trabalho para a identificação do seu arsenal digestivo. Dentre as prováveis enzimas digestivas, foram identificadas sequências que codificam uma enzima da classe das P-frutofuranosidases. O sequenciamento do clone de cDNA foi totalizado e verificou-se a presença de sinal de poliadenilação e cauda poli-A característica de eucariotos, bem como uma região codificadora para um provável peptídeo sinal para secreção da enzima. A comparação da sequência proteica deduzida com o banco de dados do NCBI aponta maior similaridade com invertases bacterianas. A amplificação do gene da P-frutofuranosidase de S. levis (Sl-fi-fruci) por PCR a partir de DNA genômico, livre de contaminação bacteriana, sugere que S. levis realmente codifica uma P-frutofuranosidase. Comparando-se sequências de aminoácidos de P-frutofuranosidases de coleópteros, observam-se regiões conservadas entre membros da família Curculionidae. O ensaio bioquímico das glicosidases intestinais de S. levis mostrou que existem provavelmente duas P-frutofuranosidases responsáveis pela digestão de sacarose. Portanto, o inseto pode apresentar uma isoforma da Sl-fí-fruct ou se beneficiar de uma invertase produzida pela própria microbiota. As análises de expressão via PCR quantitativo em tempo real revelaram que o gene é expresso em intestino médio, nas fases de alimentação do inseto, característica de uma enzima digestiva. As análises filogenéticas indicaram que Sl-P-fruct é similar a outras P-frutofuranosidases de lepidópteros e coleópteros, mas se apresenta mais próxima das enzimas bacterianas. Essa proximidade se dá a grupos distintos de bactérias, quando comparada com enzimas de lepidópteros, levando-nos a propor um evento de transferência horizontal independente do que ocorreu em lepidópteros. A fase aberta de leitura (ORF) codificadora da enzima, excluindo o peptídeo sinal, foi clonada no plasmídeo pPICZa-A para sua produção heteróloga em Pichia pastoris. A enzima produzida (rSl-P-fruc) apresentou-se glicosilada, com massa molecular aproximada de 65 kDa. Os ensaios de especificidade ao substrato confirmaram que a enzima é uma P-frutofuranosidase. A rSl-P-fruc apresentou pH de maior atividade próximo a 5,0 e temperatura de atividade máxima próxima a 50 °C. Os ensaios de termoestabilidade e resistência térmica sugerem uma baixa capacidade térmica para rSl-P-fruc, que se desnatura com facilidade. Os sais Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) e MgCl2 provocam inibição da rSl-P-fruc na concentração de 1 mM. As constantes cinéticas estimadas para a rSl-P-fruct foram Km = 20,02 mM, Vmax = 105,7 |iM.s-1 e kcat = 520,9 s-1. O presente estudo expande o conceito da ocorrência de P-frutofuranosidases em coleópteros. Apesar dos poucos relatos desse gene no reino animal, é possível afirmar que a P-frutofuranosidase é importante e vem sendo mantida entre algumas espécies de lepidópteros e coleópteros. Tratando-se das potencialidades que a rSl-P-fruct apresenta para uma aplicação industrial, observa-se um potencial positivo caso haja melhorias em sua estabilidade térmica.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-09-09Bitstream added on 2014-06-13T19:04:34Z : No. of bitstreams: 1 lew_bj_dr_jabo.pdf: 803674 bytes, checksum: 26bd8d6fbb0fe66f7ba4f4436385b283 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Dietas com níveis energéticos elevados e suplementação com bST a novilhas pré-púberes diminuem a idade ao primeiro mas podem causar alterações de móleculas envolvidas no processo de desenvolvimento mamário. No presente trabalho objetivou-se examinar a expressão diferencial de genes relacionados ao desenvolvimento parenquimal de novilhas em crescimento acelerado e suplementadas com bST. Conduziu-se dois experimentos em fatorial 2x2, com 32 amostras de tecidos coletados de novilhas abatidas na fase pós-púbere inicial. Num experimento, aplicou-se a técnica de microarranjos com uma biblioteca de cDNA específica para bovinos (NBFGC) aonde avaliou-se simultaneamente a expressão de 18.263 diferentes ESTs. O segundo experimento analisou a expressão gênica de leptina e seu receptor no parênquima com a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR). Adicionalmente, foi realizado um experimento in vitro com linhagem de células mamárias MAC-T para verificação de possíveis interações entre a IL-6 e IGF-1 na proliferação celular. A administração de bST estimulou a expressão de diversos genes positivamente relacionados ao desenvolvimento parenquimal e inibiu a expressão de genes negativamente relacionados a esse processo, inclusive da leptina. A dieta causou poucas alterações nesses genes, mas aumentou a expressão de leptina no parênquima. A IL-6 diminuiu a proliferação celular induzida pelo IGF-1. Os resultados obtidos demonstraram alterações na expressão de genes relacionados ao desenvolvimento tecidual em ambos os tratamentos, sendo que o bST atenuou os efeitos da dieta em genes negativamente relacionados a esse processo. / High-energy diet and bST administration during pre-pubertal phase decrease age at first calving. However, these managements modify mammary development altering the expression of several genes related to parenchyma development. The objective of the present study was to analyze the effects of a highenergy diet and bST administration in the expression of genes related to tissue development in heifer mammary parenchyma. Two experiments were conducted in a 2X2 factorial, with 32 samples collected from animals killed during early post-pubertal phase. In the first experiment, the microarray technique was performed with a bovine specific cDNA library containing 18.263 ESTs. The second experiment focused in the expression of leptin and leptin-receptor in mammary parenchyma, using the qRT-PCR technique. Additionally, an in vitro experiment was conducted using an immortalized mammary epithelial cell line (MAC-T) to check possible interactions between IL-6 and IGF-1 in cell proliferation. bST administration stimulated the expression of several genes positive related to tissue development and inhibited the expression of genes negative related to this process, including leptin. High-energy diet altered the expression of few genes, but increased the expression of leptin in mammary parenchyma. IL-6 decreased IGF-1 induced cell-proliferation. The results point to alteration in expression of genes related to tissue development in both treatments and suggest that bST administration attenuates the effects of high-energy diet in genes negative related to tissue development.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-27Bitstream added on 2014-06-13T20:26:11Z : No. of bitstreams: 1 derussi_aap_dr_botfmvz_parcial.pdf: 278460 bytes, checksum: c548ab3874a6050b11ce0ea59427ce09 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-12-19T18:32:45Z: derussi_aap_dr_botfmvz_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-12-19T18:33:33Z : No. of bitstreams: 1 000714514.pdf: 6158132 bytes, checksum: 4200f8ab8ae717221756a68f1f123a5e (MD5) / Este trabalho teve como objetivo investigar a expressão dos receptores hormonais: estrógeno beta (ER-β), estrógeno alpha (ER- α), progesterona (PR), ocitocina (OTR) e também do fator inibidor de leucemia (LIF) e seu receptor (LIFR) e da osteopontina (OPN) em embriões e tecido materno durante diestro gestacional e cíclico, realizar a análise ultra-estrutural de embriões e tecido materno e avaliar o perfil protéico de lavados uterinos e tubáricos de fêmeas gestantes e não gestantes. Foram utilizadas 24 fêmeas separadas em – GRUPO I- subdividido em: Grupo IA - 05 fêmeas submetidas à OSH aos 8 dias de gestação; Grupo IB - 05 cadelas submetidas à OSH aos 12 dias de gestação e Grupo IC - 05 cadelas submetidas à OSH 21 dias de gestação e Grupo ID- 4 cadelas submetidas a cesariana 60 dias de gestação. O GRUPO II- 05 cadelas, não inseminadas, que foram submetidas a OSH, 12 dias após a onda pré-ovulatória de LH. Para a expressão gênica foi usada a técnica de qRT- PCR, em tecido materno e em embriões dos Grupos I e II. Para a caracterização eletroforética das proteínas do lavado uterino e tubárico foi utilizada a técnica de eletroforese unidimensional. Na avaliação ultraestrutural dos embriões e tecido materno foi realizada a técnica de microscopia eletrônica de transmissão. Os genes ER-, PR, LIF-R foram expressos somente em blastocistos; não houve expressão de ER-, OPN e LIF e o gene OTR esteve presente tanto em mórulas quanto em blastocistos caninos. Os genes ER- α, ER- β, PR, OTR, LIFR, OPN e LIF foram expressos em tubas e útero de cadelas gestantes e não gestantes, sendo que somente o LIF-R foi mais expresso em útero e tuba de cadelas não gestantes. Somente a expressão do gene ER- β foi significativamente superior em tubas de... / We aimed to investigate the gene expression of leukemia inhibitory factor (LIF) and it receptor (LIFR), osteopontin (OPN) and hormonal receptors: estrogen beta (ER-β), estrogen alpha (ER-β), progesterone (PR) and oxytocin (OTR) in bicthes embryos and maternal tissue during cyclic and gestational diestrus. We also aimed to performed the ultrastructural analysis of bitches embryos and maternal tissue and evaluate the protein profile of uterine and oviducts washes in pregnant and non pregnant bitches. Twenty-for bitches were placed in: GROUP I subdivided in: Group IA – 05 females submitted to OVH at day 8 of pregnancy; GROUP IB - 05 females submitted to OVH at day 12 of pregnancy; GROUP IC – 05 females submitted to OVH at day 21 of pregnancy and GROUP ID – 05 females submitted to OVH at day 60 of pregnancy. And GROUP II - 05 females, not inseminated submitted to OVH 12 after the LH surge. For gene expression the qRT-PCR was used in embryos and maternal tissue at group I and II. For electrophoretic characterization of protein flushes from uterus and oviduct the unidimensional electrophoresis was used. The transmission electron microscopy technique was performed for the ultrastructural evaluation of embryos and maternal tissue. The ER-, PR, LIF-R genes were expressed only in blastocysts; there were no ER-, OPN e LIF expression and the OTR gene was present in both morula and blastocysts. The ER- α, ER- β, PR, OTR, LIFR, OPN and LIF genes were expressed in oviduct and uterus of pregnant and non pregnant bitches, however the LIF-R was more expressed in non pregnant females. Only the ER- β was more expressed in the oviduct of non pregnant femaleshas opposite to the OPN expression. Ultrastructural changes were observed during the embryo development. The uterine enviroment modified... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:46:31Z : No. of bitstreams: 1 saraiva_nz_dr_jabo.pdf: 2226785 bytes, checksum: ed58cf70cd41ad428b58b7a952966bd3 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Uma das etapas mais críticas do procedimento de transferência nuclear (TN) é a remoção da cromatina do oócito para a produção de citoplastos. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito de diferentes ambientes citoplasmáticos obtidos a partir de três técnicas de enucleação (convencional, assistida quimicamente e induzida quimicamente) sobre o remodelamento nuclear e desenvolvimento embrionário, avaliando-se o perfil de expressão dos genes XIST, G6PD e HSPA1A em embriões bovinos. Para isso, quatro experimentos foram delineados. No primeiro experimento, verificou-se que o processo de enucleação pode ser iniciado a partir de 1,0 h de tratamento com demecolcina nas duas técnicas de enucleação química. A dinâmica nuclear e de microtúbulos de oócitos ativados tratados com demecolcina foi avaliada em um segundo experimento, e oócitos tratados apresentaram redução da densidade dos microtúbulos, porém, essas estruturas não desapareceram completamente na maioria dos oócitos. No experimento III, a demecolcina não apresentou efeitos significativos na atividade do fator promotor de maturação (MPF) e da proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK) quando utilizada na concentração 0,05μg/mL. No último experimento, a demecolcina não prejudicou o desenvolvimento embrionário e também não alterou o perfil de expressão dos genes XIST, G6PD e HSPA1A em embriões reconstituídos com células embrionárias; porém, quando foram avaliados os níveis de transcritos desses genes em embriões reconstituídos com células somáticas, observou-se maior expressão relativa do XIST e do G6PD em embriões oriundos da técnica de enucleação assistida quimicamente em comparação aos embriões produzidos pela técnica convencional. Portanto, conclui-se que a enucleação química não altera a reprogramação nuclear nem... / Removal of the oocyte chromatin for production of cytoplasts is one of the most critical steps of the standard nuclear transfer (NT) procedure. The aim of this work was to study the effect of different cytoplasmic environments from three enucleation techniques (conventional, chemical-assisted, and chemical-induced enucleation) on nuclear reprogramming and embryonic development, evaluating the expression patterns of XIST, G6PD and HSPA1A genes in bovine embryos. Therefore, four experiments were designed. In the first experiment, it was verified that the enucleation procedure can be initiated 1.0 h after starting demecolcine treatment on both chemical enucleation techniques. The nuclear and microtubular dynamics of activated oocytes treated with demecolcine were evaluated in a second experiment, and treated oocytes showed decreased microtubule density, but these structures did not completely disappear in most oocytes. In experiment III, demecolcine at a concentration of 0.05μg/mL had no significant effect on maturation promoting factor (MPF) and mitogen activated protein kinase (MAPK) activity. In the last experiment, demecolcine had no detrimental effects on embryonic development. Also, the expression patterns of XIST, G6PD and HSPA1A were not altered in reconstituted embryos derived from embryonic donor cells; however, evaluation of transcript levels of these genes in embryos reconstituted using somatic donor cells revealed higher relative expression of XIST and G6PD in embryos derived from chemicalassisted enucleation in comparison to embryos those produced by the conventional technique. In conclusion, chemical enucleation has no effect on nuclear reprogramming and embryonic development after nuclear transfer using embryonic donor cells. Also, chemical-assisted enucleation increases XIST and G6PD expression in nuclear transfer embryos... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2015-04-09T12:47:46Z : No. of bitstreams: 1 000814081.pdf: 1987109 bytes, checksum: 47dd59d6b8353b90c284ba6c5e9f8b0a (MD5) / A neoplasia mamária é o tumor mais frequente nas cadelas e seu comportamento biológico assemelha-se com o que ocorre nas mulheres, com isso as cadelas podem ser um excelente modelo natural para estudos em oncologia comparada. A descoberta de proteínas com valor preditivo é importante como alvos terapêuticos específicos para cada tipo de câncer. Os objetivos deste estudo foram avaliar a expressão gênica e proteica de COX-2 e c-KIT em mamas normais, lesões benignas, carcinomas mamários não metastáticos e carcinomas metastáticos de cadelas e correlacioná-las com as variáveis clínicas e epidemiológicas. Para tanto foram utilizadas 124 cadelas portadoras de lesões mamárias e 13 cadelas sem lesões mamárias. Foram formados quatro grupos: G1= mamas normais; G2 = lesões mamárias benignas; G3 = carcinomas mamários não metastáticos e G4= carcinomas mamários metastáticos. A análise de expressão gênica foi realizada pelo método de RT-qPCR e de imunomarcação pelo método de imuno-histoquímica. Foi verificada diferença no nível de transcritos do gene COX-2 nas mamas normais e nos carcinomas metastáticos (p < 0,05) quando comparado com as amostras dos quatro grupos. Na análise do c-KIT não foi verificada diferença estatística do nível de transcritos entre os quatro grupos. Na imunomarcação, quando avaliado o escore final dos grupos na expressão de COX-2 e c-KIT foi observada diferença significativa entre os grupos com p=0,0002 e p=0,0003, respectivamente. A alta expressão de c-KIT ocorreu principalmente nas mamas normais, havendo uma diminuição da expressão do c-KIT com o aumento da malignidade do tecido. O contrário foi observado para a imunomarcação da COX-2 visto que a expressão aumentou com a malignidade do tecido. O marcador COX-2 pode ser um bom indicador prognóstico e preditivo nas neoplasias mamárias de cadelas, porém o c-KIT não pode ser utilizado como marcador independente / Mammary tumors is the most frequent neoplasm in bitches and its biological behavior is similar to those that occur in womens, making bitches an excellent model to comparative studies. Discovery of proteins with predictive value is important to determine specifi therapeutic targets for each tumor type. The aims of this study were to evaluate gene and protein expression of COX-2 and c-KIT in normal mammary glands, benign lesions and mammary carcinomas with and without metastasis to correlate then with clinical and epidemiological variables. To this, were used 124 bitches with mammary lesions and also 13 bitches with no history of mammary tumors. Four groups were formed: G1 = normal mammary glands; G2= benign lesions; G3= non-metastatic mammary carcinomas and G4= metastatic mammary carcinomas. Gene expression analysis was conducted by RT-qPCR method and protein expression was assessed by immunohistochemistry. Difference on transcripts COX-2 level was observed in normal mammary glands and metastatic carcinomas (p<0.05) when compared to other groups. In c-KIT evaluation no difference on transcripts level was observed among groups. The immunostaining for COX-2 and c-KIT among the four groups was significantly different (p=0.0002 and p=0.0003, respectively). High expression of c-KIT was observed mainly in normal mammary glands with a decrease in its expression to malignant tissues. The opposite was observed in COX-2 immunostaining and its expression increased in malignant samples. COX-2 can be a good prognosis and predictive marker in canine mammary tumors, however c-KIT cannot be used as an independent marker

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-24Bitstream added on 2015-04-09T12:47:34Z : No. of bitstreams: 1 000811282_20150601.pdf: 131221 bytes, checksum: 37d9e5b1bc0273fa6cc2ce6f5bf00d58 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:44Z: 000811282_20150601.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:10Z : No. of bitstreams: 1 000811282.pdf: 1753519 bytes, checksum: 7f919a5df0f18678b466896d5ce5923c (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O carcinoma epidermóide de laringe é um dos mais comuns a atingir a região da cabeça e pescoço, representando cerca de 25% dos tumores malignos que acometem essa área e 2% de todas as doenças malignas. Os recursos terapêuticos utilizados são as cirurgias, terapias por irradiação e quimioterapia, porém são considerados altamente invasivos. Por isso, algumas plantas vêm sendo utilizadas no tratamento do câncer, na tentativa de amenizar os danos causados pelos métodos convencionais. Uma dessas tem despertado interesse científico, a Euphorbia tirucalli, conhecida popularmente como aveloz. Essa planta é utilizada no tratamento de asma, úlceras, verrugas e possui princípios ativos com atividades biológicas comprovadas cientificamente como, antimutagênica, anti-inflamatória e anticancerígena. Em função da importância da fração antitumoral do látex da E. tirucalli, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desse fitoterápico nas células de carcinoma epidermóide de laringe (Hep-2), sobre a morfologia, proliferação celular e expressão gênica. As células Hep-2 foram cultivadas em meio completo (MEM 10%), e tratadas nas seguintes concentrações do aveloz (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL), para avaliar o possível efeito dessa planta nos tempos de 1, 3, 5 e 7 dias. Após análises estatísticas do teste de proliferação celular, foi efetuado um novo cultivo para extração do RNA e realização da técnica de Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH). Os genes com expressão alterada, encontrados na técnica de RaSH, foram analisados por bancos de dados Gene Ontology (GO) e Ingenuity Systems© (IPA). A validação de cinco genes encontrados como diferencialmente expressos foi realizada por PCR quantitativo em tempo real. Após o tratamento com o aveloz, a morfologia das células não sofreu alterações, quando comparada com amostras controles. No teste de proliferação celular, as células apresentaram ... / The larynx squamous cell carcinoma is the most common to hit the head and neck, representing about 25% of malignant tumors that affect this area and 2% of all malignancies. Therapeutic resources used are surgery, chemotherapy and radiation therapies, but are considered highly invasive. Therefore, some plants had been used in the treatment of cancer, in an attempt to soften the damage caused by conventional methods. One of these has attracted scientific interest, the Euphorbia tirucalli, known popularly as aveloz. This plant is used in the treatment of asthma, ulcers, warts and has active principles with activities scientifically proven as antimutagenic, anti-inflammatory and anticancer. Due of the importance the antitumoral fraction of the latex the E. tirucalli, the present study aimed to evaluate the influence of herbal of the larynx squamous cell carcinoma (Hep-2), on the morphology, cell proliferation and gene expression. The Hep-2 cells were cultured in complete medium (MEM 10%), and treated in the following concentrations of the aveloz (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL) to evaluate the possible effects of this plant in 1, 3, 5 and 7 days. After statistical analysis of the test cell proliferation, was made a new culture for RNA extraction and realization of the Rapid Subtractive Hybridization technique (RaSH). The genes with altered expression, found in RaSH technique, were analyzed databases Gene Ontology (GO) and Ingenuity Systems© (IPA). The validation of the five differentially expressed genes found was performed by real time quantitative PCR. The aveloz treatment did not change the cell morphology compared with control samples and decreased the cell growth, with results more statistically significant on day 3 at a concentration of 25 μg/mL. Therefore, these parameters were chosen to continue with the methods. The RaSH approach detected change in expression of some genes, including ANXA1, TCEA1, NGFRAP1, ITPR1 and CD55, which are ... / FAPESP: 2012/07853-6

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-24Bitstream added on 2015-04-09T12:47:32Z : No. of bitstreams: 1 000817597.pdf: 602569 bytes, checksum: 8a5bad0d9f0fee18f559f8b1fdd34387 (MD5) / A utilização de plantas na produção de medicamentos deve estar amparada na correta escolha das plantas de onde serão coletados os metabólitos vegetais, isso é de vital importância, posto que a utilização incorreta de uma espécie como provocar sérios danos a saúde do usuário. Em relação ao gênero Lippia, muitas espécies dentro do gênero, produzem metabolitos secundários de inegável importância farmacológica, no entanto apresentam muitas vezes características morfológicas muito similares o que tem concorrido para a identificação errônea da espécie. Nesse trabalho o objetivo foi utilizar técnicas moleculares (Differential Display – PCR e cDNA-AFLP) para auxiliar a identificação dessas espécies através de marcadores moleculares, também se buscou a identificação dos genes que participam nas vias de produção dos metabolitos secundários majoritários dessas espécies. Os resultados obtidos com o Differential Display não detectaram genes envolvidos com a síntese dos metabólitos, porém foram identificadas sequências de microssatèlites e tranposons que podem ser envolvidas na produção desses compostos. Com o cDNA-AFLP não foi possível separar as espécies em relação aos metabólitos secundários produzidos por ela, o que foi observado é uma grande influência do ambiente, bem como de fatores genéticos na produção desses compostos / The use of plants in the production of drugs must be supported in the correct choice of plants from which the plant metabolites will be collected, it is of vital importance, since the misuse of a species can cause serious damage to the user's health. Regarding the genus Lippia, many species within the genus, producing secondary metabolites of undeniable pharmacological importance, however they present very similar morphological characteristics which have contributed to the misidentification of species. In this study the objective was to use molecular techniques (Differential Display - PCR and cDNA-AFLP) to assist in identification of these species using molecular markers, also sought to identify genes involved in production routes of the major secondary metabolites of these species. The results obtained by the Differential Display did not detect genes involved in the synthesis of metabolites, however tranposons and microsatellites sequences were identified that may be involved in the production of these compounds. The cDNA-AFLP could not separate the species in relation to secondary metabolites produced by the plants, what was observed is a great influence of the environment, as well as genetic factors in the production of these compounds

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-28Bitstream added on 2015-05-14T16:59:08Z : No. of bitstreams: 1 000823842_20160728.pdf: 48543 bytes, checksum: 0a0e4c6e3217335eb5c3eedceb8b2a73 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-29T12:53:53Z: 000823842_20160728.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-29T12:54:47Z : No. of bitstreams: 1 000823842.pdf: 2103625 bytes, checksum: bf645c43dd091bc121630fa032a1e708 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivou-se com este estudo comparar os efeitos da congelação lenta vs vitrificação sobre a viabilidade, ultraestrutura e expressão gênica de blastocistos caninos produzidos in vivo. A coleta dos embriões foi realizada por lavagem uterina 12 dias após a primeira IA. A congelação lenta foi realizada em máquina programável e a vitrificação pela técnica do cryotop. O cultivo in vitro (CIV) foi realizado por 24 horas, em meio SOFaa acrescido de 20% de soro fetal bovino. A reexpansão embrionária foi avaliada 24 horas após a CIV e a viabilidade embrionária avaliada com o uso das sondas Hoscht 33342 e Iodeto de propídeo. A extração e amplificação do RNA foram realizadas segundo recomendações do fabricante. Foram utilizados 70 blastocistos separados nos grupos Co, Co24, Cg, Cg24, Vi e Vi24. No experimento I foram utilizados 34 embriões. Não foi evidenciada reexpansão da blastocele após 24 horas de CIV nos grupos Cg24 e Vi24, já no grupo Co24, 100% dos embriões reexpandiram. Não foi verificada diferença na intensidade da fluorescência do Hoescht entre os grupos Co, Cg e Vi, em ambos os momentos de avaliação, 0 e 24 horas. Quando comparada a intensidade do iodeto de propídeo (IP) foi observada diferença significativa entre o grupo Co em relação aos grupos Cg e Vi, independente da metodologia de criopreservação. Observou-se uma redução na quantidade de gotas lipídicas após 24 horas de CIV comparando-se os grupos Co e Co24. No grupo Vi foram observadas mitocôndrias alongadas, integridade da membrana dos blastômeros e nuclear, reticulo endoplasmático liso, vesículas de digestão, microvilosidades, junções do tipo tight e desmossomas. No Experimento II, foram utilizados 36 embriões para a avaliação da expressão gênica. Todos os genes estudados, com excessão do LIF, foram expressos. Entretanto, não houve diferença na expressão dos genes BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 e ... / The purpose of this study was to compare the effects of slow freezing versus vitrification in canine embryo produced in vitro: viability, ultra structure and gene expression. Embryos collection was performed using uterus flush technique 12 days after the first AI. For slow freezing protocol we used a programmed machine and vitrification was performed using cryotop. In vitro culture (IVC) was conducted for 24 hours using SOFaa added with 20% of fetal bovine serum. Embryo expansion was evaluated 24 hours after in vitro culture (IVC) and embryo viability was evaluated using Hoscht 33342 and iodine propidium (PI). Extraction and amplification of the RNA was performed according to manufacturer recommendations. We used 70 blastocysts divided in groups: Co, Co24, Cg24, Vi and Vi24. In experiment I 34 embryos were used. No blastocoele expansion was observed after 24 hr of IVC in groups Cg24 and Vi24, however 100% of embryos expanded in Co24. No difference was observed in Hoescht staining intensity between Co, Cg and Vi groups, which were observed at the 0 and 24 hr periods. The iodine propidium (PI) intensity in Co was different when compared to Cg and Vi, independent of the cryopreservation method used. A reduction in the quantity of lipid drops was observed after 24 hr of IVC when comparing groups Co and Co24. In group Vi, elongated mitochondria, membrane and nuclear integrity of blastomere, smooth endoplasmic reticulum, vesicle digestion, microvilli, tight junctions and types of desmosomes were observed. In experiment II, 36 dog embryos were used for gene expression evaluation. All studied genes, except LIF were expressed. However no difference between gene expression of BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 and LIFr were observed at 0 and 24h in all groups. We concluded that the vitrification technique was the best method to cryopreserve canine embryo when we observe ultrastructure. However, it was not possible ... / FAPESP: 11/08798-6

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-01-19Bitstream added on 2015-05-14T16:59:08Z : No. of bitstreams: 1 000828398_20151120.pdf: 49172 bytes, checksum: 37877bd4281c51b89052cc8b1594b906 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-11-27T16:10:05Z: 000828398_20151120.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-11-27T16:10:44Z : No. of bitstreams: 1 000828398.pdf: 549205 bytes, checksum: c1d0695fe73602a07a20eab8411b29e4 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / BEPE-Itália / Esta pesquisa visou avaliar o perfil de expressão de determinados genes e o potencial de desenvolvimento in vitro de complexos cumulus-oócitos (COCs) de ovinos temporariamente bloqueados no estadio de vesícula germinativa (GV) com uso da roscovitina. Neste contexto, diferentes composições de meio (com e sem soro fetal bovino e gonadotrofinas), tempos (0, 6, 12 e 20 horas) e métodos de cultivo (com e sem cobertura de óleo mineral) foram testados com intuito de garantir a máxima eficiência de inibição meiótica promovida pela roscovitina a 75μM. A avaliação do grau de expansão das células do cumulus, em estereomicroscópio, e do estadio da maturação nuclear, por meio da coloração com Hoescht 33342, revelou que a presença ou ausência de LH, FSH e soro fetal bovino não interferiu no potencial de ação da roscovitina. No entanto, máxima eficiência inibitória foi observada em meio suplementado apenas com soro fetal bovino. Foi constatado ainda que, na ausência de óleo mineral, quantidade significativamente maior de oócitos tratados com roscovitina foi mantida em GV o que reforça a hipótese de lipossolubilidade do referido inibidor. Embora o potencial de inibição meiótica da roscovitina tenha se mantido nos diferentes tempos de cultivo, a exposição prolongada dos COCs ao inibidor afetou de maneira irreversível a expansão do cumulus. Em todas as situações, a inibição meiótica foi completamente reversível após cultivo por 18 horas em meio de maturação livre de inibidor. Sendo assim, para análise da expressão gênica e desenvolvimento embrionário in vitro, foi preconizado o tratamento com roscovitina a 75μM por 6 horas na presença de soro e sem óleo mineral. Nestas condições assim como após a reversibilidade por 18 h, a quantidade relativa da maioria dos genes investigados nas células do cumulus e nos oócitos foi similar ao observado nos COCs não inibidos (controle). Do mesmo modo, não foi ... / This study aimed to evaluate the expression profile of certain genes and the potential of in vitro development of sheep cumulus-oocytes complexes (COCs) temporarily arrested at germinal vesicle (GV) stage using roscovitine. In this context, different medium compositions (with and without fetal bovine serum and gonadotropins), times (0, 6, 12 and 20 hours) and methods of culture (with and without mineral oil overlay) were tested in order to ensure maximum efficiency of meiotic inhibition promoted by 75μM roscovitine. The evaluation of cumulus expansion degree, under stereomicroscope, and nuclear maturation stage, by staining with Hoechst 33342, revealed that the presence or absence of LH, FSH and fetal bovine serum did not influence the action potential of roscovitine. However, maximum efficiency of meiotic inhibition was observed in medium supplemented with fetal bovine serum. It was also found that, in the absence of mineral oil overlay, significantly higher quantity of oocytes treated with roscovitine was kept at GV, which reinforces the hypothesis of liposolubility of this inhibitor. Although the potential of meiotic inhibition of roscovitine had remained at different culture times, the prolonged exposure of COCs to inhibitor irreversibly affect the cumulus expansion. In all cases, the meiotic arrest was completely reversible after culture for a further 18 h in inhibitor-free medium. Therefore, for analysis of gene expression and in vitro embryo development, it was chosen the treatment with 75μM roscovitine for 6 h under serum-supplemented medium and without mineral oil overlay. Under these conditions as well as after the reversibility for 18 h, the relative amount of most investigated genes in cumulus cells and oocytes was similar to that observed in the uninhibited COCs (control). Similarly, no difference was found between roscovitine treatment and control with respect to blastocyst rate and quality of embryos obtained. Therefore, ... / FAPESP: 2011/14041-5 / BEPE-Itália: 2013/05564-0