Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-29Bitstream added on 2014-11-10T11:58:43Z : No. of bitstreams: 1 000785259_20151215.pdf: 449253 bytes, checksum: f4a6d6fe60441eb1ed52e51fc3d8994b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-15T10:52:35Z: 000785259_20151215.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-15T10:53:21Z : No. of bitstreams: 1 000785259.pdf: 441624 bytes, checksum: 15f9d5f63f3443d00a9a26ba9b0cd319 (MD5) / O desenvolvimento das plantas depende da atividade de um grupo de células em divisão chamado de meristema. Extensas análises genéticas identificaram os principais reguladores do meristema apical vegetativo (SAM), os quais controlam o desenvolvimento de todos os órgãos aéreos. Dentre eles, há um grupo de homeoproteínas denominadas TALE (three-amino-acid-loop- extension); esta família contém os membros KNOTTED-like homeodomain (KNOX) e BELL-like Homeodomain (BELL), que funcionam como homodímeros ou heterodímeros, para regular a expressão de seus genes alvos mediante sua ligação à sequências especificas no DNA. Em plantas com folhas compostas como o tomateiro (Solanum lycopersicum), genes KNOX da classe I (KNOX I) são expressos no meristema, assim como também em folhas, flores e frutos, sugerindo que eles podem exercer várias funções nestes órgãos. Esta hipótese é corroborada pelos fenótipos intrigantes encontrados em mutantes com ganho de função dos genes KNOX I, cuja expressão ectópica afeta a forma da folha, pétala e frutos. Um exemplo é o tomateiro mutante Mouse ear (Me), que superexpressa o gene TKN2 (KNOX I). Fenótipos semelhantes também foram observados em plantas transgênicas superexpressando o microRNA156 (miR156). Os MicroRNAs são uma nova classe de pequenas moléculas de RNA não codantes (20-25 nucleotídeos) que se encontram amplamente distribuídos no genoma de plantas e animais, regulando a expressão de seus genes alvos principalmente ao nível pós-transcricional. O miR156 regula pós-transcricionalmente membros da família gênica do tipo SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPL ou SBP-box), os quais codificam fatores de transcrição específicos de plantas. Tais genes desempenham papéis importantes em diferentes aspectos do desenvolvimento. Para analisar a possível interação molecular entre o fator de transcrição TKN2 e a via microRNA156/SQUAMOS Promoter-Binding ... / Plant development depends on the activity of a group of dividing cells called meristem. Extensive genetic analyses have identified the major regulators of the shoot apical meristem (SAM), which control the development of all aerial organs. Among them, the three-amino-acid- loop-extension (TALE) class of homeoproteins; this family contains the KNOTTED-like homeodomain (KNOX) and BELL-like Homeodomain (BELL) members, which function as heterodimers or homodimers, to regulate expression of their target genes by binding to specific sequences in DNA. In plants with compound leaves as tomato (Solanum lycopersicum), KNOX I are expressed in the meristem, as well as on leaves, flowers and fruits, suggesting that they may play various roles in these organs. This hypothesis is supported by the intriguing phenotypes found in mutants with gain-of function of KNOX I genes, whose ectopic expression affects leaf, petal and fruit shape. An example, is the tomato mutant Mouse ear (Me), which overexpress the gene TKN2 (KNOX I). Similar phenotypes were also observed in transgenic plants overexpressing microRNA156 (miR156). MicroRNAs are a class of small no-coding RNAs (20-25 nucleotides) that are widely distributed in the genome of plants and animals, regulating the expression of their target genes by acting mainly at the post-transcriptional level. miR156 regulated post-transcriptionally most SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPL or SBP-box) genes, which encode plant-specific transcription factors. These genes play important roles in different aspects of development. To examine a possible molecular interaction between TKN2 transcription factor and microRNA156/SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like module (miR156 node), it was evaluated the expression of miR156, its targets (SBP-box) and several genes downstream of miR156 node in different stages of the development of homozygous Me plants. Moreover, to evaluate the genetic interaction ...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-27Bitstream added on 2014-11-10T11:57:54Z : No. of bitstreams: 1 000790886_20150130.pdf: 519812 bytes, checksum: bc9fe1349c41992791b6912b937f3897 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-04T11:39:25Z: 000790886_20150130.pdf,Bitstream added on 2015-02-04T11:40:11Z : No. of bitstreams: 1 000790886.pdf: 4471637 bytes, checksum: 719bf442a98affa2f654603ac2d00a13 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Helicobacter pylori (H. pylori) é o principal patógeno associado ao câncer, devido mudanças inflamatórias e atróficas na mucosa gástrica, que por meio de progressão pode culminar no adenocarcinoma gástrico. A erradicação da H. pylori é considerada um tratamento de primeira linha para reverter as lesões préneoplásicas e prevenir a progressão maligna. Poucos estudos avaliaram a ocorrência de alterações genéticas antes e após a erradicação da bactéria, que possam evidenciar mudanças importantes relacionadas à resposta a terapia. Portanto, os objetivos deste estudo foram: avaliar a expressão do RNAm de genes que atuam na resposta inflamatória e imune e processos biológicos como proliferação celular, migração, invasão, apoptose, regeneração e angiogênse (TLR2, TLR4, IL-8, TGF-β, REG3A, PLAT, PAI-1 e IFITM1) em pacientes com lesões gástricas antes e após a terapia de erradicação da H. pylori; investigar a expressão proteica dos respectivos genes; avaliar a influência dos genótipos bacterianos CagA e VacA na resposta à erradicação da bactéria e nos níveis de expressão gênica, e avaliar a cinética celular, como o índice de proliferação celular (PI) e o índice apoptótico (AI). Foram estudadas 38 biópsias gástricas de pacientes com gastrite crônica-Hp+ (GC-Hp+) antes do tratamento padrão de erradicação da bactéria e, 3 meses após a terapia. Como controle, foram obtidas quatro biópsias de mucosa gástrica normal-Hp- (MN-Hp). A quantificação relativa (RQ) do RNAm foi avaliada pelo ensaio TaqMan e a expressão proteica, proliferação celular e apoptose por imuno-histoquímica. Antes do tratamento foram observados níveis de expressão relativa aumentados do RNAm de TLR2, TLR4, IL-8, TGF-β, REG3A e IFITM1 em pacientes GC-Hp+ em relação a MNHp- (p< 0,0001), exceto para PLAT e PAI-1, que apresentaram expressão reduzida (p< 0,0001). Os receptores TLR2 e TLR4, assim como TGF-β e IFITM1 ... / Helicobacter pylori is the main pathogen associated with cancer due inflammatory and atrophic changes in the gastric mucosa, which through of progression may result in gastric adenocarcinoma. The eradication of H. pylori is considered a first-line treatment to reverse precancerous lesions and prevent malignant progression, but a portion of patients has no effective response to therapy. Few studies have evaluated the occurrence of genetic changes before and after eradication of the bacteria, which can evidence important changes related to response to therapy. Therefore, the objectives of this study were to assess the mRNA expression of genes that participate in the inflammatory and immune response and biological processes such as cell proliferation, migration, invasion, apoptosis, regeneration and angiogenesis (TLR2, TLR4, IL-8, TGF-β, REG3A, PLAT, PAI-1 and IFITM1) in dyspeptic patients before and after eradication therapy of H. pylori; to investigate the protein expression of the respective genes; to evaluate the influence of bacterial CagA and VacA genotypes in response to H. pylori eradication and levels of gene expression, and assess cell kinetics, as cell proliferation index (PI) and apoptotic index (AI). 38 gastric biopsies from patients with chronic gastritis-Hp+ (CG-Hp+) before the standard treatment for eradication of the bacteria, and 3 months after therapy were studied. As control, four biopsies from normal gastric mucosa without infection (NM-Hp-) were obtained. Relative quantification (RQ) of mRNA was assessed by TaqMan assay and protein expression, cell proliferation and apoptosis by immunohistochemistry. Before treatment increased mRNA relative expression levels of TLR2, TLR4, IL-8, TGF-β, REG3A and IFITM1 were observed in CG-Hp+ compared to NM-Hp- (p <0.0001), except for PLAT and PAI-1, which showed reduced expression (p <0.0001). The TLR2 and TLR4 receptors, as well as TGF-β and IFITM1 showed increased expression of ... / FAPESP: 12/15036-8

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-24Bitstream added on 2014-11-10T11:57:53Z : No. of bitstreams: 1 000790767_20150601.pdf: 444707 bytes, checksum: 830665f133c6d3cdd131f8ffb76781ba (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:33Z: 000790767_20150601.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:01Z : No. of bitstreams: 1 000790767.pdf: 2134328 bytes, checksum: 89d2a1a1d1daf534470cf52e0d1f3cda (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O carcinoma de colo de útero, também denominado câncer cervical, é o segundo tipo de câncer mundialmente mais frequente em mulheres, sendo a quarta causa de morte em países em desenvolvimento. A carcinogênese de colo de útero está relacionada com alterações genéticas, infecção pelo Papilomavirus Humano (HPV), angiogênese e processos inflamatórios. A idéia de que a inflamação está envolvida na tumorigênese é apoiada pela observação de que surge frequentemente em áreas de inflamação crônica. Por outro lado, a resposta inflamatória é controlada pela ação de mediadores anti-inflamatórios, que atuam para manter a homeostasia da resposta imunológica e prevenir a lesão tecidual. Entre esses mediadores destacamos a anexina-A1 (ANXA1), proteína de 37 kDa, que é expressa pelas células tumorais e atua como moduladora do processo inflamatório. Diante dessas considerações, investigamos, in vitro, a influência dessa proteína nas células SiHa sobre a morfologia, proliferação e expressão gênica e proteica. Para isso foi cultivada a linhagem celular SiHa em meio completo e tratada com o peptídeo ANXA1Ac2-26 para avaliar o efeito dessa proteína nos tempos de 2, 4, 24, 48 e 72 horas na morfologia e proliferação celular. Os resultados mostraram que o peptídeo não alterou a morfologia das células SiHa, no entanto diminuiu a proliferação celular, evidenciando o tempo de 72 horas como o mais significante pelas análises estatísticas, seguido de um novo cultivo para posterior análise imunocitoquímica ultraestrutural, extração de RNA e desenvolvimento da técnica de Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH). A validação dos seis genes diferencialmente expressos foi realizada por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). A expressão da proteina ANXA1 foi observada diminuida nas células SiHa tratadas com o peptídeo pelas análises imunocitoquímicas ultraestruturais. A técnica de RaSH resultou em 82 genes .. / Carcinoma of the cervix, also called cervical cancer is the second most common cancer in women worldwide and is the fourth leading cause of death in developing countries. The cervical carcinogenesis is related to genetic alterations, infection with Human Papillomavirus (HPV), angiogenesis and inflammation. The idea that inflammation is involved in tumorigenesis is supported by the observation that often arises in areas of chronic inflammation. Furthermore, the inflammatory response is controlled by the action of anti- inflammatory mediators that act to maintain homeostasis of the immune response and prevent tissue damage. Among these mediators is included annexin A1 (ANXA1), a protein of 37 kDa, which is expressed by tumor cells and acts as a modulator of the inflammatory process. Given these considerations, we investigated in vitro the influence of this protein in SiHa cells on the morphology, proliferation and gene and protein expression. In order to realize this aim, the cell line SiHa was cultured in complete medium and treated with the peptide ANXA1Ac2 -26 to evaluate the effect of this protein on times 2, 4, 24, 48 and 72 hours in morphology and cell proliferation. The results showed that the peptide did not alter the morphology of SiHa cells, but decreased cell proliferation, indicating the time 72 hours as the most significant by statistical analysis, followed by a further cultivation for subsequent ultrastructural immunocytochemical analysis, RNA extraction, and development of technical Rapid Subtractive Hybridization (RaSH). The validation of six differentially expressed genes was performed by quantitative real-time PCR (RT- qPCR). The expression of ANXA1 was decrease in cells treated with the peptide observed by ultrastructural immunocytochemical analysis. The RaSH technique resulted in 82 differentially expressed genes after treatment with ANXA1Ac2 -26. Six of these genes (HIF1A, ID1, LDHA, NCOA3, RAB13, TPT1), because their ... / FAPESP: 12/08177-4

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2014-11-10T11:57:53Z : No. of bitstreams: 1 000791419.pdf: 1434246 bytes, checksum: 1849bc5793379ee01767a6f8895f18e9 (MD5) / Doses de sêmen enriquecidas com espermatozoides portadores do cromossomo X são utilizadas na inseminação artificial (IA) e na produção in vitro de embriões (PIVE). Todavia ensaios de campo, utilizando este tipo de sêmen, demonstraram redução na taxa de prenhez, que pode ser justificada pelas injúrias espermáticas durante o processo de sexagem, além de alterações no DNA, interferindo na expressão de genes paternos, afetando o desenvolvimento embrionário e acarretando perda gestacional após 90 dias. Assim, os objetivos desse trabalho foram: comparar a taxa de clivagem e de blastocistos produzidos in vitro utilizando sêmen convencional e sêmen com espermatozoides sexados por citometria de fluxo e verificar a existência de diferenças na expressão de genes relacionados ao reconhecimento da gestação (AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-1, mPGES-2, TNF-α) em embriões produzidos in vitro utilizando os dois tipos de sêmen. Os embriões bovinos foram produzidos por fecundação in vitro, quarenta e oito horas após a fecundação foi avaliada a taxa de clivagem, e no sétimo dia após a fecundação foi avaliada a taxa de blastocisto. Posteriormente esses blastocistos foram submetidos à extração de RNA para a avaliação da expressão gênica. Não foi observada diferença significativa (P>0,05) para as taxas de clivagem e blastocisto entre os grupos experimentais. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo não alterou os níveis de transcritos dos genes AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-2 e TNF-α sugerindo que embriões produzidos com espermatozoides sexados por citometria de fluxo não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação. Porém o gene mPGES-1 foi 4,54 vezes menos expresso nos embriões produzidos com espermatozoides sexados por citometria de fluxo, sugerindo a possibilidade de ocorrência de perda gestacional, pois estudos ... / Doses of semen enriched with carriers of X chromosome sperm are used in artificial insemination (AI) and in embryos produced in vitro (PIVE). However, field studies using this type of semen demonstrated a reduction in pregnancy rate, which can be justified by injuries during sperm sexing and alterations in DNA, interfering with the expression of paternal genes affecting embryonic development and resulting in pregnancy loss after 90 days. The aims of this study were to compare the cleavage and blastocyst rates produced in vitro using conventional semen and sexed semen by flow cytometry, and check differences in the expression of genes related to pregnancy recognition (AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-1, mPGES-2, TNF-α ) in embryos produced in vitro using the two types of semen. Bovine embryos were produced by in vitro fertilization, forty eight hours after fertilization the cleavage rate was evaluated, and on the seventh day after fertilization the blastocyst rate was performed. Subsequently, these blastocysts were subjected to RNA extraction for evaluation of gene expression. No significant differences (P>0.05) for cleavage and blastocyst rates between the experimental groups were observed. Related to the expression pattern, the flow cytometry did not alter the transcript levels of AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-2 e TNF-α genes, suggesting that embryos produced with sexed semen by flow cytometry do not have detrimental changes in genes involved in pregnancy recognition. However the mPGES-1 gene was expressed 4,54 times less in embryo produced with sexed semen by flow cytometry, suggesting the possibility of pregnancy loss, since studies suggest that are required levels of expression of mPGES for maintenance and recognition of pregnancy

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-25Bitstream added on 2014-11-10T11:57:53Z : No. of bitstreams: 1 000791601.pdf: 5196368 bytes, checksum: 46c71a27daf8bd5155dd2567bf2fb936 (MD5) / O transcriptoma é o conjunto e a quantidade de transcritos de uma célula em um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica. Estudar o transcriptoma é essencial para interpretar os elementos funcionais do genoma e revelar os constituintes moleculares de células e tecidos. Levando em consideração a grande importância do mercado da carne de bovinos e a necessidade e dificuldade de melhoria da qualidade da carne, o presente projeto objetivou traçar um panorama completo do transcriptoma do músculo longissimus dorsi (LD) de bovinos da raça Nelore, bem como identificar genes com diferentes perfis de expressão associados ao crescimento muscular por meio da técnica de RNA-seq. Foram utilizadas amostras de 10 animais da raça Nelore com dois diferentes perfis de crescimento muscular provenientes de um rebanho participante do programa de melhoramento genético. Amostras de mRNA do músculo LD foram coletadas para extração, processamento do RNA, sequenciamento e posterior análise do transcriptoma. No total, foram sequenciados aproximadamente 453 milhões de fragmentos e identificados 14.876 genes conhecidos, 45.938 potenciais novos genes e 10.960 potenciais novas isoformas de transcritos. Foi calculado o nível de expressão de 12.082 genes e 110 tiveram valor de expressão diferencial signicativo entre os grupos (p ≤ 0,01). Por meio da análise de relevância de termos ontológicos foram identificados 52 termos relevantes entre os genes diferentemente expressos, dos quais 12 estavam associados ao desenvolvimento muscular. Neste estudo, foi caracterizado o transcriptoma do músculo longissimus dorsi de bovinos da raça Nelore por meio de sequenciamento de nova geração, fornecendo assim, uma valiosa fonte de entendimento do genoma do boi / The transcriptome is the set and the amount of transcripts in a cell at a specific developmental stage or physiological condition. Understanding the transcriptome is essential for interpreting the functional elements of the genome and to reveal molecular constituents of cells and tissues. Considering the great importance of the beef market, the need and difficulty of improving meat quality, this research aimed to provide an overview of the complete longissimus dorsi (LD) transcriptome of Nellore cattle and to identify genes with differential expression profiles associated with muscle growth using RNA-seq. Ten mRNA samples of Nellore breed steers with two different muscle growth profiles from a herd participating of a breeding program were used. LD muscle samples were collected for RNA extraction and processing, sequencing and subsequent transcriptome analysis. In total, approximately 453 million fragments were sequenced and 14,876 known genes, 45,938 potential new genes and 10,960 potential new transcripts isoforms were identified. The expression levels of 12,082 genes were calculated and 110 have signicant differential expression values between the groups (p ≤ 0.01). The ontology terms relevance analysis identified 52 relevant terms among the differentially expressed genes, which 12 were associated with muscle development. In this study, we obtained the transcriptome of Nellore cattle longissimus dorsi muscle through next-generation sequencing, providing a valuable source of information about the bovine genome

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-23Bitstream added on 2014-11-10T11:57:42Z : No. of bitstreams: 1 000790896.pdf: 1624782 bytes, checksum: 86f691c9d97bad42fa2588df159f183a (MD5) / O Vírus da Febre amarela (YFV) causa doença com considerável morbidade e mortalidade nas regiões tropicais. Diversos vírus possuem estratégias para a alteração dos processos celulares. Mecanismos de splicing celulares são essenciais para diversificar a expressão dos genes e podem aumentar seu potencial de gerar proteínas. A replicação de YFV e as interações entre proteínas virais e celulares não são totalmente conhecidas. A proteína celular hSlu7 possui sinal de localização nuclear e tem um papel importante nas reações catalíticas do segundo passo do splicing. Estudos demonstram que sob infecção de YFV hSlu7 transloca para o citoplasma. A translocação de proteínas entre o citoplasma e o núcleo pode representar um mecanismo viral da regulação da expressão gênica. Este estudo teve como objetivo a caracterização da interação entre a proteína hSlu7 e NS5 viral, bem como estudar os efeitos de interações sobre os mecanismos de splicing alternativo após a infecção de YFV. Para identificar interação de NS5 de YFV com hSlu7 foi realizado ensaio de co-imunoprecipitação. Para verificar alteração de splicing celular foram utilizados replicons pEGFP-ADAR, pI12-IL7R, pEFGP-FGFR2, bem como a alteração de isoformas de XBP-1 endógenos. Os resultados indicam que NS5 de YFV interage com proteína hSlu7 e que sua interação pode influenciar no metabolismo RNA celular. YFV demonstrou exercer modulação no splicing celular, a avaliação de replicons sugerem que em splicing dependente de hSlu7, bem como a independente ocorre uma regulação viral atuando sobre sítios de splicing fraco e que a interação hSlu7-NS5 pode alterar direta e indiretamente a regulação trans-acting / Yellow fever virus (YFV) causes disease with significant morbidity and mortality in tropical regions. Several viral strategies are avail for recruitment and alteration of the biochemical cellular processes. Cellular splicing mechanisms are essential to diversify the gene expression and increase it’s proteomic potential. Replication of YFV and the interactions between viral and cellular proteins are unknown. The cellular protein hSlu7 has an nuclear localization and an important role in the second catalytic reaction step of the alternative splicing. In our study group demonstrated that under YFV infection hSlu7 translocates to the cytoplasm. The translocation of proteins between nucleus and cytoplasm may represent a viral mechanism of cellular gene expression regulation, interference in the protein availability of the alternative splicing and viral replication control. This study aimed to characterize the interaction between the viral protein hSlu7 and NS5, as well as studying the effects of interactions on the mechanisms of alternative splicing after YFV infection. To identify interaction with YFV NS5 hSlu7 was conducted co-immunoprecipitation assay. To verify changes in cellular splicing replicons were used pEGFP-ADAR, PI12-IL7R, pEFGP-FGFR2 as well as the change of isoforms of XBP-1 endogenous.The results indicated that YFV NS5 protein interacts with hSlu7 and that their interaction may influence cellular metabolism RNA. YFV perform modulation on cellular splicing, the evaluation of replicons suggest that in hSlu7 splicing dependent and independent regulation occurs viral acting on weak splice sites and that the interaction hSlu7-NS5 can change directly or indirectly to regulate trans- acting

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2014-12-02T11:21:23Z : No. of bitstreams: 1 000799483.pdf: 5907887 bytes, checksum: 10be7c238cdd808e25bb62408e42fe13 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Papilomavirus humano (HPV) é um dos vírus mais prevalentes entre as infecções sexualmente transmissíveis e está associado com doenças malignas. Os HPVs de alto risco possuem proteínas, denominadas de E6 e E7, caracterizadas como oncoproteínas devido aos seus papéis na transformação celular e na inativação de supressores de tumor. Um dos mecanismos usados na transformação celular pela proteína E6 do HPV de alto risco é a interação do seu domínio carboxi-terminal, PDZ, com domínios PDZs presentes em algumas proteínas celulares, destinando-as à degradação. Uma proteína que está associada com várias condições patológicas e tem domínio PDZ é a protease HtrA1. Esta proteína é pouco expressa em alguns cânceres, sugerindo um papel supressor de tumor. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da superexpressão de HTRA1 em linhagem celular HPV16 positiva (HF698) e HPV negativa (C33). As linhagens celulares foram transfectadas com vetor contendo a ORF de HTRA1 ou vetor vazio. A superexpressão do mRNA e proteína foi confirmada por qPCR e imuno-histoquímica, respectivamente. As linhagens celulares transfectadas foram submetidas a ensaio de formação de colônia, de viabilidade celular, de apoptose e ciclo celular. As células C33 superexpressando HtrA1 formaram significantemente menos colônias e apresentaram redução de viabilidade celular comparadas as células sem expressão de HtrA1. Diferentemente, na linhagem HPV positiva ocorreu aumento no número de colônias nas células superexpressando HtrA1 e não houve diferença no ensaio de viabilidade celular. Esses resultados sugerem que os diferentes padrões observados nas duas linhagens celulares são decorrentes da presença do HPV na HF698 e da ausência na C33. A fim de confirmar se o aumento do número de colônias nas células HF698 superexpressando HtrA1 é decorrente da interação dessa proteína com E6, foi produzida linhagem estável de C33 com ... / The Human Papillomavirus (HPV) is one of the most prevalent virus among sexually transmitted infections and it is associated with some malignancies. High risk HPVs contain proteins, E6 and E7, characterized by oncoproteins due to their roles in cellular transformation and suppressor tumor inactivation. One of the mechanisms used in cell transformation by E6 protein from high-risk HPVs is the interaction of its carboxy-terminal domain, known as PDZ, with PDZs domains present in some cellular proteins, triggering them to degradation. A protein that is associated with various pathological conditions and has PDZ domain is the protease HtrA1. This protein is poorly expressed in some cancers, suggesting its tumor suppressor role. The aim of this study was to evaluate the effect of the HtrA1 overexpression in HPV 16 positive (HF698) and HPV negative (C33) cell lines. The cell lines were transfected with vector containing the HTRA1 ORF or empty vector. The mRNA and protein overexpression were confirmed by qPCR and immunohistochemical, respectively. The cell lines transfected were subjected to cell proliferation, viability, apoptosis and cell cycle assays. C33 cells expressing HtrA1 presented significantly fewer colonies and showed reduced viability than cells without HtrA1 expression. On the other hand, in HPV-positive cell line there was an increase in the number of colonies in cells expressing HtrA1 and there was no difference in the cell viability assay. These results suggest that the different patterns observed between the two cell lines studied may be due to the HPV presence in HF698 and its absence in C33 cells. To confirm if the increase in the number of colonies in HPV positive cells (HF698) overexpressing HtrA1 arises from the interaction of this protein with E6, stable lines of C33 containing gene E6 were produced and subsequently performed cell proliferation assay. C33 cells overexpressing E6 and HTRA1 showed an increased number of ...

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-25Bitstream added on 2015-01-26T13:30:39Z : No. of bitstreams: 1 000795967.pdf: 970728 bytes, checksum: 1a9dc450a114117aa840a96d9f584e0e (MD5) / Nos últimos anos, tem crescido o interesse pela identificação de compostos naturais com potencial medicinal. O isotiocianato de alila (AITC), encontrado em plantas da família Cruciferae e composto majoritário da semente de mostarda, vem sendo avaliado quanto a sua atividade antineoplásica em bexiga devido à sua alta biodisponibilidade na urina a após ingestão. Neste estudo foram investigadas as atividades toxicogenética e toxicogenômica do AITC em linhagens celulares de carcinoma de bexiga com diferentes status do gene TP53 (RT4 – TP53 selvagem / T24 – TP53 mutado). As concentrações de AITC testadas nos ensaios de citotoxicidade, sobrevivência celular e clonogênica foram 0,005, 0,0625, 0,0725, 0,0825, 0,0925, 0,125 e 0,25 μM; nos testes do cometa, micronúcleo, ciclo celular, apoptose, morfologia e expressão gênica (ANLN, BAX, BCL-2, CDK-1, SMAD4, S100P e TP53) foram utilizadas as concentrações de 0,005, 0,0625, 0,0725, 0,0825 e 0,0925 μM. Os resultados mostraram aumento de danos primários no DNA (teste do cometa) para todas as concentrações testadas do AITC na linhagem T24 e para as concentrações mais altas (0,0725, 0,0825 e 0,0925 μM) na linhagem RT4; não foram observados aumentos nas frequências de células micronucleadas em ambas as linhagens. Nas análises de ciclo celular e apoptose foram observadas a parada do ciclo na fase G2/M para a linhagem T24 e altas taxas de apoptose precoce e necrose na linhagem RT4. Com relação à expressão gênica, houve aumento da expressão de S100P e BAX e diminuição da expressão de BCL-2 na linhagem RT4 e aumento da expressão de BCL-2, BAX e ANLN e diminuição da expressão de S100P na T24. Nenhuma alteração foi identificada para os genes SMAD4 e CDK1 nas duas linhagens tratadas com o AITC. Concluindo, o AITC foi capaz de induzir lesões primárias no DNA de células de ambas as linhagens de carcinoma de bexiga, mas que não se refletiram ... / Compounds obtained from fruits, vegetables and essential oils have been widely used to treat many diseases. The allyl isothiocyanate (AITC), also known as mustard essential oil, is found in plants of the cruciferous family and is abundant in the mustard seeds. Due to its high bioavailability in urine, AITC has been considered as a promising antineoplastic agent against bladder cancer. Therefore, the aims of this study were to investigate the toxicogenetic and toxicogenomic effects of AITC in the wild-type (RT4) and in a mutant (T24) TP53 bladder transitional carcinoma cell lines. AITC was tested at concentrations of 0.005, 0.0625, 0.0725, 0.0825, 0.0925, 0.125 and 0.25 μM in the cytotoxicity and cell and clonogenic survival assays; in the comet and micronucleus assays, flow cytometry, apoptosis and gene expression (ANLN, BAX, BCL-2, CDK-1, SMAD4, S100P e TP53) evaluations the concentrations of 0.005; 0.0625; 0.0725; 0.0825 e 0.0925 μM were used. The results showed increased primary DNA damage in T24 (0.005, 0.0625, 0.0725, 0.0825 and 0.0925 μM) and RT4 (0.0725, 0.0825 and 0.0925 μM) cells. However, no significant difference was detected in the frequency of micronucleated cells. A significant increase of cells at sub-G1 phase (0.0625, 0.0725 and 0.0825 μM) and significant decrease at S phase (0.005, 0.0625, 0.0725 and 0.0825 μM) were observed in RT4 cells after AITC treatments. In T24 cells, an increased sub-G1 rate (0.0725 and 0.0825 μM) and cell cycle arrest at G2 phase (0.0625, 0.0725 and 0.0825 μM) were detected. Furthermore, it was observed increased apoptosis and necrosis rates and increase of S100P and BAX and decrease of BCL-2 expression in the wild type TP53 cells. For the mutated TP53 cell line, increased expression of BCL-2, BAX and ANLN and decreased expression S100P were observed. No change was detected for the SMAD4 and CDK-1 genes. In conclusion, AITC was able to reach DNA and induce primary damage in both bladder ...

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-29Bitstream added on 2015-01-26T13:30:39Z : No. of bitstreams: 1 000795829_20150729.pdf: 90879 bytes, checksum: 3ee660d26bb3b9dddcc85651f3dde8ae (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:21:07Z: 000795829_20150729.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:20Z : No. of bitstreams: 1 000795829.pdf: 452230 bytes, checksum: cdf5d7e5715c64c8ee94bbd4a41efb11 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, apresenta diferentes quadros clínicos que refletem o perfil de resposta imunológica do hospedeiro. As células dendríticas (DCs) possuem um papel crucial na imunidade por induzirem o desenvolvimento da resposta imune adaptativa, porém a interação do M. leprae com estas células ainda é pouco entendida. Neste estudo buscamos contribuir para o entendimento da geração da resposta imune específica na hanseníase tendo como foco o papel das DCs frente ao M. leprae. DCs foram diferenciadas in vitro a partir de monócitos de pacientes tuberculóides e virchowianos, estimuladas com antígeno sonicado do M. leprae e analisadas quanto à expressão de marcadores de diferenciação e maturação. A expressão de genes de citocinas e receptores foi avaliada por qPCR. Paralelamente, monócitos de indivíduos saudáveis foram pré-incubados com o antígeno sonicado do bacilo e submetidos à diferenciação em DCs e à avaliação dos marcadores de superfície. A diferenciação de monócitos em DCs foi similar entre pacientes e controles saudáveis. A estimulação com o antígeno sonicado do M. leprae levou ao aumento na expressão de CD40, CD80, CD86 e HLA-DR tanto nos pacientes hansenianos como em indivíduos saudáveis. Entretato, este estímulo parece ser insuficiente para a completa ativação das DCs uma vez que não resultou em aumento significativo nos níveis de CD83. A análise da expressão gênica também demonstrou estimulação parcial das DCs pelo M. leprae. A pré-incubação de monócitos com o antígeno sonicado do bacilo comprometeu o processo de diferenciação em DCs e a maturação destas. Em conjunto, nossos resultados sugerem que o antígeno sonicado do M. leprae prejudicou a diferenciação de monócitos em DCs e desencadeou uma ativação incompleta das DCs tanto em pacientes quanto em controles saudáveis o que pode contribuir para os mecanismos de escape do bacilo / Leprosy is caused by Mycobacterium leprae and characterized by distinct clinical manifestations that reflect the immune response of the host. Dendritic cells (DCs) play a crucial role in immunity inducing the development of adaptive immune response, however the interaction of DCs with M. leprae is poorly understood. This study aims to contribute to the understanding of the generation of specific immune response in leprosy patients focusing on the role of DCs against the M. leprae. DCs were differentiated in vitro from monocytes of lepromatous and tuberculoid patients, stimulated with sonicated antigen of M. leprae and analyzed for the expression of differentiation and maturation markers. The expression of mRNA to cytokines and receptors was assessed by qPCR. In parallel, monocytes from healthy controls were preincubated with the sonicated antigen of M. leprae, differentiated into DCs and evaluated in respect to the expression of surface markers. Differentiation of monocytes into DCs was similar between patients and healthy controls. After stimulation with sonicated antigen of M. leprae DCs from leprosy patients and healthy controls showed increased expression of CD40, CD80, CD86 and HLA-DR but this stimulation seems to be insufficient for complete activation of DCs since it was not observed an increase in the level of CD83. The analysis of gene expression also showed partial stimulation of DCs by M. leprae. The pre-incubation of monocytes with sonicated antigen of M. leprae resulted in impairment in the differentiation into DCs and maturation. Altogether our results suggest that the sonicated antigen of M. leprae impaired differentiation of monocytes into DCs and triggered an incomplete activation of DCs both in patients and healthy controls that may contribute among the mechanisms of escape used by M. leprae / FAPESP: 09/01436-1

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-03Bitstream added on 2015-01-26T13:30:31Z : No. of bitstreams: 1 000795832.pdf: 314304 bytes, checksum: b6077bd7a50cb6eb686277acd319024f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O oviduto possui papel essencial na reprodução de mamíferos, promovendo um microambiente favorável para a maturação oocitária, estocagem e capacitação do espermatozoide, fertilização, transporte dos gametas e desenvolvimento inicial do embrião. Anatomicamente e funcionalmente, o oviduto é dividido em três regiões principais: infundíbulo, ampola e istmo. O oócito e o espermatozoide entram nos lados opostos do oviduto, respectivamente no infundíbulo e istmo, e são transportados até a ampola, local onde ocorre a fertilização. O sucesso reprodutivo está diretamente ligado a temporização apropriada do transporte dos gametas ao local da fertilização, bem como, a precisão no tempo de transporte do embrião até o útero, para a aquisição da capacidade de implantação. A coordenação e regulação das funções do oviduto são complexas e estão sob efeitos endócrinos, parácrinos e autócrinos, os quais alteram temporalmente e espacialmente a transcrição e tradução de diversos fatores. Diante disso, o presente trabalho visou avaliar o efeito de biotecnologias reprodutivas, especificamente da superestimulação ovariana, bem como de características genéticas e fisiológicas reprodutivas no perfil transcricional de diversos fatores no oviduto bovino. Para tanto, foram avaliados os efeitos da indução de múltiplas ovulações em vacas da raça Nelore (dados apresentados no primeiro manuscrito), bem como os efeitos da influência da seleção genética de animais com alta contagem folicular em novilhas da raça Nelore e Aberdeen Angus, no período inicial pós ovulação (dados apresentados no segundo manuscrito), na expressão de genes relacionados ao transporte de gametas e fertilização. Os resultados demonstram que a superestimulação ovariana modula a expressão de alguns genes relacionados à contratilidade do oviduto em vacas da raça Nelore e que a ovulação é principal fator responsável por controlar ... / The oviduct has an important role in mammal reproduction, promoting a favorable microenvironment for oocyte maturation, sperm storage and capacitation, fertilization, transport of gametes and early embryo development. Anatomically and functionally, the oviduct is divided in three regions: infundibulum, ampulla and isthmus. The oocyte and the sperm enter in opposite sides of the oviduct, respectively infundibulum and isthmus, and are transported to the fertilization site, the ampulla. Reproductive success is directly related to appropriate timing of gamete transport to the fertilization site, as well as a precise time of embryo transport to the uterus, to obtain the capacity of implantation. The coordination and regulation of oviductal functions are complex and under endocrine, paracrine and autocrine effects, which temporally and spatially alter the transcription and translation of several factors. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of reproductive biotechnologies, specifically ovarian superstimulation, as well as genetic and physiological reproductive characteristics in the transcriptional profile of several factors in the bovine oviduct. To do so, we evaluated the effects of inducing multiple ovulation in Nelore cows (data presented in the first manuscript), and the effects of the influence of genetic selection of animals with high follicle count in Nellore and Aberdeen Angus heifers, in the initial period post-ovulation (data presented in the second manuscript), in gene expression related to gametes transport and fertilization. The results demonstrated that ovarian superstimulation modulates the expression of some genes related to oviductal contractility in Nelore cows and ovulation is the main factor responsible for transcriptional control in bovine oviduct, with less or no impact of breed and ovarian follicle count / FAPESP: 12/09498-9