Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-14. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:22Z : No. of bitstreams: 1 000846657_20170814.pdf: 327624 bytes, checksum: 7ef206fbad82624c5b13293820611818 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-08-18T12:37:00Z: 000846657_20170814.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-08-18T12:37:50Z : No. of bitstreams: 1 000846657.pdf: 655179 bytes, checksum: a3015379981e83babb9b5ebdeb18615d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / GPC3 (Glipican-3) é membro de uma família de proteoglicano de heparina sulfatada (HSPG). O GPC3 pode atuar controlando a migração celular, regulação negativa do crescimento celular e indução de apoptose. Esse gene é relatado por estar hipoexpresso em vários tipos de cânceres, o que pode resultar no crescimento celular descontrolado e contribuir para o fenótipo maligno de alguns tumores. O objetivo desse estudo foi analisar o mecanismo de ação do gene GPC3 em carcinoma renal de células claras (CCRCC). Primeiramente, foi construído o vetor de expressão e transfectado nas linhagens celulares de carcinoma renal ACHN e 786-O. A expressão de GPC3 foi analisada usando qRT-PCR e imunohistoquímica. A proliferação celular foi avaliada usando o MTT e o ensaio de formação de colônia. Análises de apoptose e ciclo celular foram avaliadas por citometria de fluxo. Foi observado que o gene GPC3 estava com baixa expressão em amostras de carcinoma renal de células claras e nas linhagens celulares quando comparado com amostras renais normais. Foi observado que a expressão de RNAm e os níveis de proteína GPC3 aumentaram após a transfecção com o vetor de expressão contendo a ORF de GPC3 nas linhagens celulares. A taxa de proliferação celular diminuiu nas células superexpressando GPC3 em ambas as linhagens, ACHN e 786-O (p<0,01). A apoptose não foi observada nas linhagens celulares de carcinoma renal superexpressando GPC3 (p > 0,05); entretanto, ocorreu um aumento na população de células na fase G1 do ciclo celular (p< 0,05). Esses resultados sugerem que o gene GPC3 reduz a taxa de proliferação celular por meio da parada do ciclo celular na fase G1 em carcinoma renal / Background: GPC3 (Glypican 3) is a member of the family of glypican heparan sulfate proteoglycans (HSPG). The GPC3 gene may play a role in controlling cell migration, negative regulation of cell growth and induction of apoptosis. This gene is reported to be downregulated in several cancers, which can result in uncontrolled cell growth and which can also contribute to the malignant phenotype of some tumors. The purpose of this study was to analyze the mechanism of action of the GPC3 gene in clear cell renal cell carcinoma (CCRCC). Methods: First, we constructed the expression vector and transfected renal carcinoma cell lines. GPC3 expression was analyzed using qRT-PCR and immunohistochemistry. We evaluated cell proliferation using MTT and colony formation assays. Apoptosis and cell cycle analyses were evaluated using flow cytometry. Results: We observed that the GPC3 gene was downexpressed in the clear cell renal cell carcinoma samples and in cell lines, which were both compared to normal renal samples. We observed that GPC3 mRNA expression and protein levels increased after the transfection into ACHN and 786-O cell lines. We found that the cell proliferation rate decreased in cells overexpressing GPC3 in both cell lines, ACHN and 786-O (p < 0.01). Also, apoptosis in the renal cell carcinoma cell line was not observed in cells overexpressing GPC3 (p > 0.05), but there was an increase in the cell population during the G1 phase in the cell cycle (p< 0.05). Conclusion: We suggest that the GPC3 gene reduced the cell proliferation rate through cell cycle arrest during the G1 phase in renal cell carcinoma

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-19. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:53Z : No. of bitstreams: 1 000846322_20151201.pdf: 248574 bytes, checksum: 6755b57b4d6797c9a4f5d72763bc6e05 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-01T09:08:34Z: 000846322_20151201.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-01T09:09:26Z : No. of bitstreams: 1 000846322.pdf: 1137761 bytes, checksum: bbe9bfb094663aef56d7a432ede431ba (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Estamos vivendo uma época onde os avanços das áreas ligadas a biologia são rotineiros, nos levando cada vez mais a nos habituar a experimentos com um grande número de variáveis. A tecnologia de sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e parte deste quadro e as abordagens computacionais aplicadas neste âmbito não estão totalmente estabelecidas e necessitam de análises mais detalhadas. A partir da tabela de contagens, que sumariza cada biblioteca em uma condição experimental, propõe-se a utilização de um método variacional chamado de Suvrel, baseado na minimização de uma função custo que penaliza grandes distâncias entre elementos de mesma classe e favorece pequenas distâncias entre elementos de classes diferentes, para inferência de expressão diferencial. A aplicação do método foi realizada em uma tabela de contagens produzida após o sequenciamento, alinhamento e sumarização de 5 replicatas técnicas de RNA de referência humano juntamente com a mistura ERCC 1 e 5 replicatas técnicas de RNA de referência do cérebro humano juntamente com a mistura ERCC 2. Utilizando curvas ROC produzidas com os dados do projeto do MAQC-II, de nindo os transcritos analisados pelo projeto com log2 do fold-change maior que um limiar que varia de 0,5 a 2,0 como os verdadeiros positivos e os restantes como verdadeiros negativos, e poss vel concluir que o m etodo Suvrel tem maiores valores abaixo das curvas ROC na maior parte dos limiares. Utilizando curvas ROC produzidas com os dados do ERCC, geradas utilizando o logs das mudan cas das propor c~oes prede nidas das misturas ERCC 1 e 2 de 92 oligonucleot dios, e poss vel concluir que o m etodo Suvrel tem a maior area abaixo da curva ROC. Embora as a reas abaixo das curvas ROC sejam compar aveis as de outros pacotes (como por exemplo o edgeR), e importante ressaltar que elas foram produzidas usando um m etodo que não faz nenhum tipo de suposição quanto a distribuição associada aos reads... / We are living in a time where advances in areas related to biology are routine, taking us to accustom to experiments with large number of variables. The RNA sequencing technology (RNA-Seq) is part of this framework and computational approaches applied in this context are not fully established and require more detailed analysis. Generally, in a experiment of analysis of di erential expression, total RNA samples or messengers (mRNA) is extracted, puri ed, fragmented, sequenced, mapped, and nally counted, generating an count table that relates how many reads was aligned to a given gene in a experimental condition. From this stage, it is proposed to use a variational method, called Suvrel (Supervised Variational Relevance), based on the minimization of a cost function that penalizes large distances between the same class of elements and favors small distances between di erent classes of elements to make the inference of relevance of each gene. The application of the method was performed on count table produced after of sequencing, alignment and summarization of 5 technical replicates containing Strategene Universal Human Reference RNA (UHRR) (part of Sequencing Quality Control Consortium, SEQC) together with ERCC 1 mix, and 5 technical replicates containing Ambion's Human Brain Reference RNA (HBRR) (part of SEQC also) together with the ERCC 2 mix. Using the ROC (Receiver Operating characteristic) curves generating from data of MAC-II project, setting the transcripts with log of fold-change greater than a cuto (from 0.5 to 2.0) as true positive and the others as true negative, the curves 6.2 and 6.4 were generated. From these graphs it is possible to conclude that the Suvrel method has higher AUCs in most of cuto s. It is appropriate to note that conclusions were obtained using a method that does not make any assumption about the distribution associated with the reads, using a simple normalization (divide the counts of a gene by its standard ...

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-18Bitstream added on 2014-08-13T18:00:29Z : No. of bitstreams: 1 000758930_20150818.pdf: 1212662 bytes, checksum: b031bf1d8704df644dfe9adcd8ac1f68 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-20T11:58:35Z: 000758930_20150818.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T11:59:12Z : No. of bitstreams: 1 000758930.pdf: 3771682 bytes, checksum: 5c0fc2cb3bf6c39b641b63aa4f2b4bee (MD5) / O câncer de mama (CM) é uma doença heterogênea em relação às alterações moleculares, composição celular e evolução clínica. Pacientes com características clínicas e histopatológicas semelhantes podem apresentar prognósticos distintos. Análises de alterações genômicas em larga escala têm contribuído para identificar regiões e genes associados com os vários estágios da tumorigênese mamária. O presente estudo teve como objetivo avaliar o perfil de alterações no número de cópias genômicas por Hibridação Genômica Comparativa baseada em arrays (aCGH), utilizando a plataforma 4x180K (Agilent Technologies) em 53 carcinomas ductais invasivos (CDI) primários. Os CDI apresentaram 3.849 alterações genômicas, com semelhante proporção de perdas e ganhos genômicos (1.622 e 1.731, respectivamente), 444 ganhos em alto nível (12%) e 52 perdas homozigotas (1%). Foram identificadas 19 alterações genômicas significativamente recorrentes presentes em mais de 20% dos tumores. Foram detectadas perdas em 1p36.32, 8p23.3, 8p23.1, 8p11.23, 11q25, 14q11.1-q11.2, 16q23.3, 16q24.1 e 18q23; e ganhos em 1q21.1, 1q21.2, 1q22, 1q32.1, 1q42.3, 1q44, 8q24.21 e 15q11.2. As alterações mais prevalentes foram ganhos em 8q24.21 (36%) e 1q44 (32%), e a perda em 8p11.23 (28,3%). Ganhos em 1q21.1-1q21.2 foram associados com tumores negativos para o receptor de estrógeno (ER-) (P=0,016). Perda em 8p23.1 foi associada com um maior tempo de sobrevida livre de doença (P=0,027) e perda em 8p23.3 com tumores HER2+ (P= 0,033) e Ki67 alto (P= 0,036). Ganho em 8q24.21 foi associado com menor risco de acometimento de linfonodos (P=0,0199). A perda em 14q11.1-q11.2 associou-se com características de maior agressividade tumoral, como grau III (P=0,0147), Ki67 alto (P=0,0096) e pior evolução clínica, desenvolvimento de metástase (P=0,0375). Perda em 18q23 foi associada com tumores negativos para o receptor de progesterona (PR-) (P=0,0065). A ... / Breast cancer (BC) is a heterogeneous both at molecular and clinical level. Patients with similar clinical and histopathological findings can present different prognosis. Analysis of large scale genomic changes have helped to identify regions and genes associated with the various stages of mammary tumorigenesis. The present study aimed to evaluate the genomic profile by Comparative Genomic Hybridization array-based (aCGH), using the platform 4x180K (Agilent Technologies) in 53 primary invasive ductal carcinomas (IDC). The IDC showed 3849 genomic alterations, with similar proportion of genomic gains and losses (1,622 and 1,731, respectively), 444 alterations were found with high copy number gains (12%) and 52 homozygous losses (1%). We were identified 19 significantly recurrent genomic alterations in more than 20% of tumors. Losses were detected at 1p36.32, 8p23.3, 8p23.1, 8p11.23, 11q25, 14q11.1-q11.2, 16q23.3, 16q24.1 and 18q23, and gains at 1q21.1, 1q21.2, 1q22, 1q32.1, 1q42.3, 1q44, 8q24.21 and 15q11.2. The most frequent alterations were gains at 8q24.21 (36%) and 1q44 (32%), and losses at 8p11.23 (28.3%). Gains in 1q21.1-1q21.2 were associated with negative estrogen receptor (ER-) (P = 0.016) tumors. Loss on 8p23.1 was associated with longer disease-free survival (P = 0.027). Losses on 8p23.3 were associated with HER2 + tumors (P = 0.033) and high level of Ki67 (P = 0.036). Gain at 8q24.21 was associated with lower risk of lymph node involvement (P = 0.0199). Loss at 14q11.1-q11.2 was associated with more aggressive tumor characteristics such as grade III (P = 0.0147), high level of Ki67 (P = 0.0096) and worse clinical outcome, with metastasis development (P = 0.0375). Loss at 18q23 was associated with progesterone receptor negative (PR-) (P = 0.0065) tumors. The comparison of the genomic alterations according to receptor status ER, PR and HER2, lymph node involvement (LN) and development of distant metastases (DM) revealed ...

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-17Bitstream added on 2014-08-13T18:00:21Z : No. of bitstreams: 1 000761591.pdf: 654448 bytes, checksum: 81dc07eca2bdfb73c1933089f1b5ed3c (MD5) / Estudos sobre o desenvolvimento dos adipócitos têm se tornado importante, devido ao fato da diferenciação deste tipo celular estar associado a diversas doenças crônicas e/ou degenerativas, tais como hipertensão, diabetes, doenças cardiovasculares e câncer, as quais possuem vínculo com a obesidade, devido, em parte, à expansão do tecido adiposo. A vitamina D tem demonstrado relação com a obesidade e, portanto, estudar suas bases moleculares, vias metabólicas e interação com tecidos, como o tecido adiposo, é necessário para auxiliar futuramente as ações práticas e clínicas do controle das doenças que acometem grande parte da população. Assim, o presente estudo objetiva estudar essas interações in vitro utilizando pré adipócitos humanos SGBS para a avaliação da expressão dos genes VDR, GR e PPARγ. Para este estudo foram feitas três repetições biológicas independentes e separado por tempo de tratamento (4 horas, 12 horas, 24 horas, 4 dias, 8 dias e 12 dias) e pré-adipócitos as células do tempo 0 hora. Em todos os tempos avaliados as células foram divididas em dois grupos: controle (etanol) e tratado (1,25(OH)2D3). Realizou-se extração de RNA total com posterior análise de expressão gênica via RT-qPCR. Ao se comparar a expressão relativa dos genes alvo com o pré-adipócito não tratado (0h), para ambos os grupos e tempos, o gene GR apresentou diferença estatisticamente significativa (p<0,001) para o grupo tratado com vitamina D nos tempos 12 e 24h, 4, 8 e 12 dias, e para o grupo controle os tempos 12 e 24h, 4 e 8 dias. Encontrou-se diferença significativa para o gene PPARɣ no grupo tratado para os tempos 8 e 12 dias, resultado semelhante ao grupo controle, quando comparados com o préadipócito (0h). A expressão basal do gene VDR não apresentou diferença estatisticamente significativa quando comparado com o pré-adipócito. No entanto, no que tangue o fold change, o gene VDR foi o único a... / Studies on the development of adipocytes have become important due to the fact that differentiation of this cell type is associated with several chronic and or degenerative diseases such as hypertension, diabetes, cardiovascular disease and cancer, which have link with obesity due in part to the expansion of adipose tissue. Vitamin D has shown relationship with obesity and their molecular bases, pathways and interaction with tissues, such as adipose tissue, therewise studies are necessary to support future clinical practices and actions to control of diseases that affecs large populations. This research aims to study these interactions in vitro using SGBS human adipocytes to assess the expression of VDR, GR and PPARɣ genes. For this study, three independent biological replicates were made separate at treatment times (4 hours, 12 hours, 24 hours, 4 days , 8 days and 12 days) and pre- adipocyte cells from time 0 hour. At all times the cells were evaluated divided into two groups: control (ethanol) and treated (1,25(OH)2D3). Total RNA extraction with subsequent analysis of gene expression by RT-qPCR were performed. When comparing the relative expression of target genes with untreated pre-adipocyte (0h) for both groups and times, the GR gene showed a statistically significant difference ( p < 0.001 ) for the group treated with vitamin D in 12 hours, 24 hours, and, 4, 8 and 12 days for the control group and the times 12 and 24 hours, 4 and 8 days. There was significant difference for PPARɣ gene in the group treated at times 8 and 12 days, similar to the control group results, when compared with the pre-adipocyte (0h). The basal expression of the VDR gene showed no statistically significant difference when compared with the preadipocyte. However, for the fold change, the VDR gene was the only to show expression statistically different at time 0h having a negative expression of 2.87 (p <0.05) at time 4 days. The values of fold change found in...

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-18Bitstream added on 2014-12-02T11:21:06Z : No. of bitstreams: 1 000773336_20190218.pdf: 311514 bytes, checksum: 3013fb73613f9ad6df44d3e85824afe7 (MD5) / O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo amplamente utilizado para estudos de diversos aspectos da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para estudar os mecanismos moleculares e bioquímicos envolvidos na regulação do metabolismo de glicogênio. A avaliação de uma coleção de linhagens mutantes individualmente nocauteadas em genes que codificam fatores de transcrição permitiu identificar várias proteínas potencialmente envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio do fungo N. crassa. Dentre as proteínas, o fator de transcrição FLBC foi identificado como uma possível proteína regulatória do metabolismo de glicogênio. A linhagem mutante apresentou alterações no perfil de acúmulo de glicogênio e na expressão do gene gsn em relação à linhagem selvagem, quando submetidas a estresse térmico. Estudos preliminares realizados anteriormente em nosso laboratório mostraram severas alterações morfológicas na linhagem flbCKO, como reduzida capacidade de conidiação, com a presença de poucos microconídios, formação de hifas aéreas reduzidas, morfologia das extremidades das hifas alterada, aspecto e morfologia alterados das colônias e produção acentuada do pigmento melanina, indicando que a proteína FLBC desempenha importante papel no desenvolvimento do fungo. O fator de transcrição FLBC, objeto de estudo deste trabalho, é uma proteína homóloga às proteínas FlbC e FLE1 dos fungos Aspergillus nidulans e Podospora anserina, respectivamente, ambas envolvidas nos processos de conidiação e desenvolvimento dos fungos. O objetivo deste trabalho foi realizar uma caracterização funcional detalhada deste fator de transcrição em N. crassa. Análises de expressão gênica mostraram níveis elevados do transcrito flbC durante o crescimento vegetativo do fungo e após a indução do desenvolvimento assexual. A linhagem nocaute mostrou uma desregulação... / The filamentous fungus Neurospora crassa is a model organism widely used for studies of several aspects of the biology in eukaryotes. We have been studying the molecular and biochemical mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The screening of a knocked-out strains set in genes encoding transcription factors has identified many proteins likely involved in the regulation of glycogen metabolism in the fungus N. crassa. Among the proteins, the transcription factor FLBC was identified as a regulatory protein of the glycogen metabolism. The mutant strain showed changes in the glycogen accumulated and in the gsn gene expression when compared to the wild-type strain under heat stress. Preliminary studies carried out in our laboratory showed severe morphological changes in the strain flbCKO, such as reduced ability to conidiate, presence of a few microconidia, reduced production of aerial hyphae, altered morphology of hyphae tips, changes in the colonies morphology and high production of the pigment melanin, suggesting that FLBC plays an important role in the fungus development. The transcription factor FLBC, object of study in this work, is the Aspergillus nidulans and Podospora anserina FlbC/FLE1 homologous protein, respectively, both involved in conidiation and fungal growth. The purpose of this study was to perform functional characterization of this transcription factor in N. crassa. Analysis of gene expression showed high levels of the transcript flbC during vegetative growth and after induction of asexual development. The knockout strain presented a misregulation in the accumulation of reserve carbohydrate (glycogen and trehalose) during vegetative growth accumulating higher levels of both carbohydrates as compared to the wildtype strain. Analysis of gene expression in the strains wild-type and flbCKO showed that gdn (encoding for debranching enzyme) and gpn (encoding glycogen phosphorylase) genes are...

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-16Bitstream added on 2015-01-26T13:30:32Z : No. of bitstreams: 1 000795987.pdf: 998188 bytes, checksum: e6159c6f35ebfadfb6dd641749093a52 (MD5) / A Mancha Preta dos Citros (MPC), causada pelo fungo Phyllosticta citricarpa, é uma das mais importantes doenças da citricultura brasileira. No entanto, muito pouco se sabe sobre os mecanismos de patogenicidade deste patógeno na interação com seus hospedeiros. Além disso, P. citricarpa é morfologicamente muito semelhante a P. capitalensis, espécie endofítica também em citros, o que dificulta a diferenciação entre elas, gerando evidentes barreiras fitossanitárias à exportação de frutos in natura. Do mesmo modo, pouco ainda é conhecido sobre seus genomas, ainda não completamente sequenciados, assim como seus transcriptomas em diferentes condições. Assim, o objetivo geral desse trabalho foi avaliar e comparar os genomas e transcriptomas de P. citricarpa e P. capitalensis. O sequenciamento genômico com tecnologia Illumina gerou 179.880.616 reads para P. citricarpa que foram montados em 19.143 contigs, e 148.831.020 reads de P. capitalensis contidos em 11.080 contigs. Foram preditas 16.267 ORFs para a espécie patogênica e 14.813 para a espécie endofítica. Ambos os genomas são similares, com quantidades semelhantes de genes na maioria das categorias analisadas. Os transcriptomas por sua vez geraram em média 74 bilhões de reads por repetição biológica para ambas as espécies, com 3.074 transcritos diferencialmente expressos, sendo 2.637 mais expressos em P. citricarpa e 1.097 em P. capitalensis, com expressiva diferença qualitativa em ambas. P. citricarpa apresentou maior quantidade de genes expressos que P. capitalensis em quase todas as vias analisadas. A espécie endofítica apresentou maior número de genes expressos nas vias de sinalização e adesão. Além disso, os genes envolvidos na interação planta-patógeno foram também mais expressos na espécie endofítica. Os resultados obtidos dos genomas e transcriptomas de P. citricarpa e de P. capitalensis contribuem para maior compreensão da biologia dessas espécies / Citrus black spot (CBP), caused by Phyllosticta citricarpa, is one of the most important citrus disease in the Brazilian citrus industry. However, the mechanisms of pathogenicity of this pathogen during the interactions with their hosts are poorly understood. P. citricarpa is frequently associated with P. capitalensis, which is morphologically similar to the endophytic specie. This feature difficults the differentiation of both species resulting in phytossanitary barriers for in natura fruit exportation. Moreover, their genomes were not fully sequenced yet and there is a lack of knowledge of their transcriptomes in different conditions. Thus, the overall objectives of this work were to evaluate and compare the genome and transcriptome of both species. The total genome sequence was 179,880,616 reads for P. citricarpa and 148,831,020 reads for P. capitalensis assembled in 19,143 and 11,080 contigs, respectively. There were predicted 16,267 ORFs for the pathogenic specie and 14,813 for the endophytic specie. P. citricarpa and P. capitalensis presented very similar amounts of genes. The transcriptomic sequence generated on average 74 billion of reads per biological repeat for each species. There were obtained 3,074 differential expressed transcripts, 2,637 were more expressed in P. citricarpa and 1,097 in P. capitalensis. Transcriptional differences between these species were observed. P. citricarpa showed more expressed genes than P. capitalensis in most analyzed categories. The endophytic specie presented more expressed genes on signaling pathway and adhesion than the pathogenic specie. Additionally, plant-pathogen interaction genes were expressed on P. capitalensis. Thus, the results of genomic and transcriptomic analyses of the P. citricarpa and P. capitalensis contribute to the biology comprehension of these species

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-14Bitstream added on 2015-03-03T12:07:19Z : No. of bitstreams: 1 000806274_20170326.pdf: 204005 bytes, checksum: 232261f91e8dde821c0961e4e71b0b00 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-03-31T12:19:26Z: 000806274_20170326.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-31T12:20:23Z : No. of bitstreams: 1 000806274.pdf: 1010729 bytes, checksum: c77fc90b5c8dac855aba5940fa105b4c (MD5) / O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica de indivíduos portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DM2, compensados e não compensados metabolicamente), dislipidemia e/ou periodontite crônica, e avaliar se tais alterações metabólicas apresentam efeito mutagênico. Cento e cinquenta pacientes, divididos em 5 grupos (grupo 1 - diabetes descompensado, com dislipidemia e com doença periodontal; grupo 2 - diabetes compensado, com dislipidemia e com doença periodontal; grupo 3 - sem diabetes, com dislipidemia e com doença periodontal; grupo 4 - sem diabetes, sem dislipidemia e com doença periodontal; e o grupo 5 - sem diabetes, sem dislipidemia e sem doença periodontal), foram avaliados quanto ao exame periodontal completo, exame físico e avaliação laboratorial da glicemia de jejum e perfil lipídico. De cada paciente foi coletado sangue para investigar a expressão gênica e as lesões no DNA. A avaliação da expressão gênica foi realizada por microarray e validada por RT-qPCR (Transcrição Reversa seguida de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real, ou quantitativo). As lesões no DNA foram avaliadas por meio do teste do micronúcleo. Os dados foram submetidos à análise bioinformática e estatística. Para verificar os resultados obtidos pelo microarray, os Grupos 1, 2 e 3 foram submetidos a comparações por pares. As análises de RT-qPCR confirmaram a expressão diferencial dos genes HLA-QA1, PDCD6, TRDV3, PPAP2B, HLA-DQB1, RIN3, VCAN, PPIC e SLC6A13. As frequências de micronúcleos foram significativamente mais elevadas em pacientes afetados por pelo menos uma das doenças sistêmicas, em comparação com aqueles sistemicamente saudáveis. Concluímos que foram identificados genes diferencialmente expressos em indivíduos portadores de DM2 também afetados por dislipidemia e periodontite crônica. Os resultados do micronúcleo confirmaram ser este teste útil como biomarcador para lesões no DNA, e demonstraram... / The aim of this study was to evaluate the gene expression in individuals with type 2 diabetes (T2D, poor and well-controlled diabetics), dyslipidemia, and/or chronic periodontitis, and to assess whether these metabolic changes have mutagenic effect. One hundred and fifty patients were divided into 5 groups (group 1 – poor controlled diabetes with dyslipidemia and periodontal disease; group 2 – well-controlled diabetes with dyslipidemia and periodontal disease; group 3 – without diabetes with dyslipidemia and periodontal disease; group 4 – without diabetes, without dyslipidemia and with periodontal disease; and group 5 – without diabetes, dyslipidemia and periodontal disease), and were assessed a complete periodontal and physical examination, and laboratory evaluation of fasting glucose and lipid profile. From each patient, blood was collected to investigate gene expression and DNA damage. The gene expression was evaluated by microarray analysis and validated by RTqPCR (Polymerase Chain Reaction Real-Time, or quantitative). The DNA damage was evaluated using the micronucleus test. Data were subjected to statistical and bioinformatics analyses. To verify the results obtained by microarray, the Groups 1, 2 and 3 were submitted to pair comparisons. The RT-qPCR analysis confirmed the differential expression of HLA-QA1, PDCD6, TRDV3, PPAP2B, HLA-DQB1, RIN3, VCAN, PPIC and SLC6A13 genes. Significantly higher micronuclei frequencies were found in patients affected by any of the systemic diseases in comparison with the ones systemically healthy. We concluded that differentially expressed genes were identified in individuals with type 2 diabetes, dyslipidemia and chronic periodontitis. The results of the micronucleus confirmed that this test is useful as biomarker for DNA damage, and demonstrated that the three pathologies occurring simultaneously promoted an additional role in the production of DNA damage.

O ferro é elemento essencial para quase todos os organismos, participando de reações importantes no metabolismo das plantas, incluindo a fotossíntese. A homeostase desse metal não é completamente entendida em organismos vegetais, sendo que tanto o excesso quanto a deficiência são deletérios. O arroz (Oryza sativa L. ssp. indica) é normalmente cultivado em terrenos irrigados, o que pode levar ao excesso de ferro. Neste trabalho, nós utilizamos a técnica de Análise Diferencial de Representações (RDA) para isolar seqüências cuja expressão é aumentada ou diminuída pelo excesso de ferro. Foram isoladas 24 seqüências aumentadas e 15 inibidas. Onze seqüências tiveram seu padrão de expressão confirmado como sendo ativadas pelo excesso de ferro, de 14 testadas. Nenhuma seqüência teve seu padrão confirmado como sendo inibido pelo excesso de ferro. Dentre as seqüências confirmadas como diferencialmente expressas, foram encontrados genes relacionados à fotossíntese, resposta a estresse, degradação de proteínas, metabolismo de açúcares e aminoácidos e fatores de transcrição. Vários desses genes estão associados a senescência em outros trabalhos, indicando que a planta sob excesso de ferro pode estar entrando na rota que leva à senescência. Também foi encontrado um fator de transcrição da família WRKY cuja expressão é mais acentuada no 3º dia de tratamento, com diminuição gradual até o 9º dia. Esse dado pode indicar que essa proteína pode estar envolvida na resposta inicial ao estresse, sendo um candidato a regulador da resposta.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-06-19T16:20:52Z No. of bitstreams: 1 2017_FabríciodaSilvaMorgado.pdf: 7664868 bytes, checksum: 4767942a70994bbd3c3882749c32c0a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-18T16:45:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_FabríciodaSilvaMorgado.pdf: 7664868 bytes, checksum: 4767942a70994bbd3c3882749c32c0a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-18T16:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_FabríciodaSilvaMorgado.pdf: 7664868 bytes, checksum: 4767942a70994bbd3c3882749c32c0a1 (MD5) Previous issue date: 2017-08-18 / Os baculovírus são vírus que infectam larvas de mariposas e borboletas. São vírus capazes de formar dois fenótipos virais ao longo da infecção celular separados temporalmente. O primeiro fenótipo, os budded vírus, são vírus que brotam da célula e retêm um envelope a partir da membrana celular. Estes servem como agentes da proliferação sistêmica dentro do corpo do hospedeiro. O segundo fenótipo, os occlusion derived virus, são partículas virais envelopadas no núcleo e oclusas dentro da matriz cristalina formada pela proteína poliedrina, abundantemente expressa em momentos muito tardios da infecção. O progresso da infecção e os padrões de expressão gênica são controlados principalmente a nível transcricional, com base na sequência de DNA contida nos promotores dos genes. Para avaliar o programa transcricional e os elementos controladores das infecções baculovirais, desenvolvemos uma nova metodologia de detecção de luminescência em tempo real, derivada da infecção de células de inseto por baculovírus recombinantes contendo promotores de genes expressos em diferentes fases da infecção que controlam a expressão da proteína quimioluminescente Luciferase de vaga-lume. Isto permitiu, de forma inédita, a caracterização detalhada da expressão gênica a partir de promotores dos baculovírus Anticarsia gemmatalis MNPV e Autographa californica MNPV. O que revelou perfis de expressão diferenciais em linhagens permissivas, semipermissivas e não-permissivas à infecção por estes baculovírus. Também foram avaliados promotores do Bracovírus endosimbiótico encontrado em Microplitis demolitor, uma vespa parasita de larvas de Lepidoptera, através da metodologia de medição de luminescência em tempo real. Estes promotores derivados do Bracovírus apresentaram perfis de expressão similares aos de promotores tardios dos baculovírus. A capacidade de transdução e entrega gênica na linhagem celular derivada da vespa M. demolitor por baculovírus recombinantes também foi avaliada / The baculoviruses are infectious to the larvae of moths and butterflies. These are viruses capable of forming two distinct phenotypes throughout the cellular infection that are temporally separated. The first phenotype, the budded virus, are virions the budded thru the cell membrane, carrying an envelope. These are the agents of the systemic infection within the host’s body. The second phenotype, the occlusion derived virus, are enveloped viral particles that are occluded within the crystalline matrix that forms the occlusion bodies, that protect the virus in the environment in the absence of the host. The progress of the cell infection and the patterns of gene expression are controlled at the transcriptional level, mainly based on the DNA sequence of the gene promoters. To evaluate the transcriptional program and the controlling elements of the baculovírus, we developed a new methodology of real time detection of luminescence derived from the infection of insect cells by recombinante baculovírus containing gene promoters of different phases of the infection controlling the chemilluminescent firefly Luciferase protein. This allowed for the detailed characterization of the gene expression from selected Anticarsia gemmatalis and Autographa californica MNPV genes promoters. This revelaed differential patterns of expression in permissive, semipermissive and non-permissive cell lines. We also evaluated gene promoters of the endosymbiont Bracovirus found in Microplitis demolitor, a parasitic wasp of Lepidopteran larvae, using the real-time luminescence detection technique. These promoters revealed patterns similar to late gene promoters from the baculoviruses. The ability of recombinant baculovirus to transduce and deliver genes to a M. demolitor wasp derived cell line was also assessed.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-10T20:45:08Z No. of bitstreams: 1 2017_MariaGeaneFontes.pdf: 4573833 bytes, checksum: ab50d2e6f2ab5d5e3f1d2ee9a669ced0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-07-27T20:33:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MariaGeaneFontes.pdf: 4573833 bytes, checksum: ab50d2e6f2ab5d5e3f1d2ee9a669ced0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-27T20:33:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MariaGeaneFontes.pdf: 4573833 bytes, checksum: ab50d2e6f2ab5d5e3f1d2ee9a669ced0 (MD5) Previous issue date: 2017-07-27 / O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das hortaliças mais importantes no Brasil e no mundo. A doença comumente conhecida como ‘vira cabeça’ (causada por espécies de Tospovirus) é uma das mais importantes afetando o tomateiro a nível mundial. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo estudar a interação tomateiro-tospovírus através da análise transcritômica na interação compatível Solanum lycopersicum–Groundnut ringspot virus (GRSV), da avaliação da resistência a tospovírus na cv. ‘Rey de Los tempranos’ (=‘PI 203230’) e da caracaterização de novas espécies hospedeiras de GRSV. No CAPÍTULO II foi realizado um estudo do transcritoma na interação compatível entre a cultivar de tomate ‘Santa Clara’ e GRSV com a finalidade de identificar genes inibidos ou induzidos após inoculação do vírus. Amostras foliares de plantas da cv. ‘Santa Clara’ (mecanicamente inoculadas com um isolado de GRSV e mock-inoculadas) foram coletadas a 0, 3, 5, 7 e 10 dias após a inoculação. Um ‘pool’ equimolar entre os períodos 3-5 (3-5DAI) e 7-10 (7-10DAI) foi estabelecido após a extração do RNA, análise da concentração e da qualidade. Um total de 12 bibliotecas de cDNA foram sequenciadas gerando um total de 396 milhões reads que foram mapeados no genoma de referência do tomateiro. Cerca de 9.206 genes foram diferencialmente expressos na interação S. lycopersicum ‘Santa Clara’ – GRSV. Dentre esses genes 5.562, 5.283 e 3.924 foram identificados como diferencialmente expressos nos períodos 0DAI, 3-5DAI e 7-10DAI, respectivamente. O espectro de eficiência da resistência identificada na cultivar de tomate ‘Rey de Los Tempranos’ foi investigada em bioensaios envolvendo a inoculação mecânica com uma coleção de isolados de Tospovirus (CAPÍTULO III). Plantas da linhagem resistente ‘LAM 147’ (portadora do gene Sw-5) também foram avaliadas e a cv. ‘Santa Clara’ (isolinha suscetível de ‘LAM 147’) foi utilizada como controle suscetível. Os resultados indicaram que a resistência do acesso ‘Rey de Los Tempranos’ se caracteriza como sendo do tipo espécie-específica (funciona somente contra isolados de TSWV) e isolado-específica (alguns isolados de TSWV são capazes de ‘quebrar’ a resistência). Plantas híbridas (F1) resultante de cruzamentos realizados entre ‘Rey de Los Tempranos’ e cv. ‘Santa Clara’ (inoculadas com o isolado TSWV #523) não exibiram sintomas, indicando que esta seria uma resistência conferida por fator(es) dominante(s). No CAPÍTULO IV, amostras foliares com sintomas similares aos induzidos por espécies de Tospovirus (clorose, necrose foliar intensa, mosqueado, anéis concêntricos e deformação foliar) foram coletadas em campos de soja [Glycine max (L.) Merrill], ervilha (Pisum sativum L.), jiló (Solanum aethiopicum L. var. gilo Raddi), almeirão (Cichorium intybus L.) e jurubeba vermelha (S. stramonifolium Jacq.) em Brasília–DF, Brasil. Para a identificação do agente causal dessas doenças foram realizados testes sorológicos, moleculares e bioensaios examinando o círculo de plantas hospedeiras. Resultados dos testes moleculares e sorológicos (ELISA) mostraram que as plantas sintomáticas foram positivas apenas para a espécie GRSV. Todos os isolados foram capazes de induzir sintomas característicos de tospoviroses nos ensaios de círculos de hospedeiras. Desta forma, o presente trabalho também relata pela primeira vez cinco novas espécies como hospedeiras naturais de GRSV em condições brasileiras. / The tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the most important vegetables in Brazil and around the world. The disease universally known as ‘spotted wilt’ is caused by species of Tospovirus and it is one of the most important problems affecting tomato crops worldwide. The main objectives of the present work were to study the tomato–tospovirus interaction via transcriptional analysis of a compatible interaction Solanum lycopersicum–Groundnut ringspot virus (GRSV), to evaluate the spectrum of resistance to tospovirus in the cultivar ‘Rey de Los Tempranos’ (=‘PI 203230’ ) and to characterize new GRSV hosts. A transcriptome study on the compatible interaction between the tomato cultivar ‘Santa Clara’ and GRSV (CHAPTER II) was conducted in order to identify genes inhibited and/or induced after virus infection in ‘Santa Clara’ (a highly susceptible tomato accession). Leaf samples of ‘Santa Clara’ plants mechanically inoculated with one GRSV isolate as well as mockinoculated plants were collected at 0, 3, 5, 7 and 10 days after inoculation (DAI). Equimolar pools of the periods 3-5 (3-5DAI) and 7-10 (7-10DAI) were established after RNA extraction and concentration and quality assessement. Twelve cDNA libraries were sequenced and a total of 396.2 millions reads were mapped into the tomato reference genome. About 9,206 genes were differentially expressed in the interaction S. lycopersicum ‘Santa Clara’–GRSV. Among these genes, 5,283; 5,562 and 3,924 genes were identified as differential expressed in the periods 0DAI, 3-7-5DAI, and 10DAI, respectively. The resistance spectrum of the cultivar ‘Rey de Los Tempranos’ was investigated in bioassays involving mechanical inoculation with 22 tospovirus isolates (CHAPTER III). Plants of the resistant inbred line ‘LAM 147’ (carrying the Sw-5 gene in homozygous condition) were also evaluated and the susceptible cultivar ‘Santa Clara’ (the near isogenic line of ‘LAM 147’) was used as susceptible control. The results indicated that the resistance of ‘Rey de Los Tempranos’ might be characterized as being species-specific (i.e. effective only against TSWV isolates) and isolated-specific (i.e. a subgroup of TSWV isolates was able to overcome the resistance). Hybrid plants (F1) derived from the crosses between ‘Rey de Los Tempranos’ and ‘Santa Clara’ (inoculated with the TSWV #523 isolate) did not exhibit symptoms, indicating that the resistance could be conferred by dominant factor(s). In CHAPTER IV, foliar samples displaying symptoms similar to those induced by Tospovirus species (chlorosis, necrosis, leaf mottling, concentric rings and leaf deformation) were collected in production fields of soybean [Glycine max (L.) Merrill], field pea (Pisum sativum L.), chicory (Cichorium intybus L.), scarlet eggplant (Solanum aethiopicum L. var. gilo Raddi), and red jurubeba (S. stramonifolium Jacq.) in Brasília-DF, Brazil. Serological tests, molecular assays, and host range studies were carried out in order to identify the causal agents of these diseases. Serological tests (ELISA) showed that symptomatic plants were positive only for GRSV. PCR analyses of the soybean, field pea, scarlet eggplant, chicory, and red jurubeba were conducted using primers specific for the nucleocapsid protein (N). The sequence analyses of the tospovirus-derived amplicons displayed high identity with GRSV isolates. All isolates were able to induce characteristic symptoms of tospoviroses in all plant species employed in the host range studies. Thus, the present work also reports for the first time five new plant species as natural hosts of GRSV under Brazilian conditions.