Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-01-06T14:23:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseExpressaoAdenocarcinoma.pdf: 1904046 bytes, checksum: 657a7af0ca7087667eedd1e253ebcdc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-01-10T13:59:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseExpressaoAdenocarcinoma.pdf: 1904046 bytes, checksum: 657a7af0ca7087667eedd1e253ebcdc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-10T13:59:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseExpressaoAdenocarcinoma.pdf: 1904046 bytes, checksum: 657a7af0ca7087667eedd1e253ebcdc9 (MD5) Previous issue date: 2016-06-02 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A perda de expressão de CDH1 é um evento frequente no câncer gástrico (CG), na manifestação esporádica e hereditária, importante no processo de invasão e metástase. Aproximadamente, 15-50% das famílias afetadas pela síndrome do câncer gástrico difuso hereditário (CGDH) apresentam mutações germinativas no gene CDH1. Evidências demonstraram que hsa-miR-9 participa da regulação negativa desta proteína em câncer de mama e carcinoma hepatocelular. No presente estudo, foi investigada a possibilidade do hsa-miR-9 ser um mecanismo envolvido na perda de função de CDH1 em CGDH e CG esporádico. Para a quantificação relativa da expressão de hsa-miR-9 por PCR em tempo real, foram utilizadas amostras de 9 pacientes portadores de CGDH e amostras pareadas de CG esporádico e tecido não neoplásico adjacente de 138 pacientes. Adicionalmente, foi realizada a análise do número de cópias do gene MYC, um regulador positivo do hsa-miR-9, nas amostras de CGDH. A expressão de RNAm de CDH1 e da sua proteína nas amostras de CG esporádico foram realizadas por PCR em tempo real e Western-Blot, respectivamente. Nas amostras de CGDH, foi observado um aumento da expressão de hsa-miR-9 e do número de cópias do gene MYC (≥3 cópias) independente da presença de mutação germinativa no gene CDH1. No CG esporádico, foi observado uma redução da expressão de RNAm de CDH1, CDH1 e hsa-miR-9 no tumor em relação ao tecido não-neoplásico. Além disso, foi encontrada uma associação significativa da redução da expressão de CDH1 no tipo difuso e nos tumores avançados. A redução da expressão de RNAm CDH1, CDH1 e hsa-miR-9 também foi associada significativamente com a presença de metástase em linfonodo e estadiamento tumoral III-IV. Na análise de correlação, foi identificado uma correlação muito forte entre a expressão do RNAm e proteica de CDH1, e uma correlação forte entre a expressão de RNAm de CDH1 e hsa-miR-9, e a expressão proteica de CDH1 e hsa-miR-9. O hsa-miR-9 assume um caráter controverso em CG de acordo com o tipo de manifestação, ora desempenhando papel de oncomiR (CGDH), ora se comportando como tsmiR (esporádico). No CGDH, o aumento da expressão de hsa-miR-9 pode ser influenciado pela amplificação do gene MYC e sugerimos que funcione como mecanismo de segundo evento em portadores da síndrome CGDH com mutação germinativa no gene CDH1. Em relação ao CG esporádico, baseados na teoria do campo de cancerização, sugerimos que ocorre um aumento da expressão de hsa-miR-9 no tecido gástrico adjacente em relação ao tecido sem neoplasia, sendo essa elevação maior que no tumor, o que levaria a regulação negativa de CDH1, importante para transição epitélio-mesenquimal e iniciação do tumor. / The loss of CDH1 expression is a frequent event in gastric cancer (GC), in sporadic and hereditary manifestation, important in the invasion and metastasis process. Approximately, 15-50% of families affected by hereditary diffuse gastric cancer syndrome (HDGC) have germline mutations in the CDH1 gene. Evidences established that hsa-miR-9 participates of this protein downregulation in breast cancer and hepatocellular carcinoma. In the present study, we investigated the possibility of hsa-miR-9 is involved in CDH1 negative regulation in HDGC and sporadic GC. For the relative quantification of hsa-miR-9 expression by real-time PCR, was used samples from 9 patients with HDGC and paired samples of sporadic GC and adjacent non-neoplasic gastric tissue of 138 patients. Additionally, was performed copy number variation analysis of the MYC gene, a positive regulator of has-miR-9, in HDGC samples. The expression of CDH1 mRNA and its protein in sporadic GC samples were performed by real time PCR and Western Blot, respectively. All HDGC samples, exhibited increased of hsa-miR-9 expression and copies number of MYC (≥3 copies) independent of the presence of germline mutation in CDH1 gene. In sporadic GC it was detected a reduction of CDH1 mRNA expression, CDH1 and hsa-miR-9. Moreover, was found a significant association of CDH1 reduced expression in diffuse-type tumors and advanced. The reduction of CDH1 mRNA expression, CDH1 and hsa-miR-9 was significantly associated with lymph node metastasis and tumor stage III-IV. In correlation analysis, was identified a very strong correlation between the expression of mRNA and protein of CDH1, and a strong correlation between the CDH1 mRNA expression and hsa-miR-9, and the protein expression of CDH1 and hsa-miR-9. The hsa-miR-9 takes a controversial role in CG according to the type of manifestation, playing oncomiR paper in HDGC, occasionally behaving like tsmiR in sporadic. In HDGC, we suggest that hsa-miR-9 overexpression could be influenced by MYC amplification and that it functions as a second event mechanism in patients with germline mutation in the gene CDH1. Regarding sporadic GC, as an alternative hypothesis based on the theory of field cancerization, we suggest that there is an increased expression of hsa-miR-9 in the adjacent stomach tissue compared to the gastric tissue without cancer. This overexpression would be higher in adjacent tissue than in the tumor, leading to downregulation of CDH1, important for epithelial-mesenchymal transition and tumor initiation.

O timo é um órgão complexo estruturado por um estroma, o qual é formado principalmente por células epiteliais corticais (cTECs) e por células epiteliais medulares (mTECs) além de outros tipos celulares como células dendríticas (DC), macrófagos, linfócitos B e fibroblastos. Além disso, os precursores das células T originados da medula óssea chegam ao timo (timócitos) se maturando em linfócitos T, os quais migram para a periferia. O timo é, portanto, o local de eventos muito importantes durante a maturação do sistema imune, incluindo o controle de sua própria homeostase. No presente estudo, procuramos retratar as principais características do timo por meio da análise da expressão gênica em grande escala, isto é, descrevendo parte de seu transcriptoma. Fizemos uso da tecnologia dos cDNA microarrays em duas versões. Na primeira delas utilizamos cDNA microarrays construídos em lâminas de vidro e sondas fluorescentes marcadas com fluorocromos Cy3 ou Cy5 e, na segunda versão utilizamos cDNA microarrays em membranas de náilon e sondas radioativas marcadas com o isótopo 33P. Para a análise dos dados, utilizamos programas de bioinformática dedicados, tais como o SAM (Significance analysis of microarrays) e o Cluster e TreeView. Três conjuntos de resultados foram possíveis. No primeiro conjunto observamos a ocorrência da expressão gênica promíscua (PGE) de antígenos de tecidos/órgãos parenquimatosos (TSAs), demarcando sua emergência temporal durante a ontogenia do timo murino, a qual é influenciada pelo background genético das linhagens isogênicas estudadas. A ocorrência da PGE no timo é associada às bases genético-moleculares da indução de tolerância imunológica nas células T, contribuindo com a prevenção da auto-imunidade. O segundo conjunto de resultados consistiu na análise da expressão gênica do timo de camundongos nocautes (KO) envolvendo genes importantes para a maturação das células T, tais como TCR?, LAT, Rel-b, RAG-1 e CD3?, possibilitando a observação de seus efeitos na regulação da transcrição neste órgão. Finalmente, o terceiro conjunto consistiu na definição da dissecação molecular virtual do timo. Por meio de perfis de expressão gênica particulares exibidos por cada tipo principal que povoa o timo, foi possível dissecar este órgão usando a tecnologia dos cDNA microarrays. / The thymus is a complex organ structured by a stroma, which is formed mainly by cortical epithelial cells (cTECs) and medullary epithelial cells (mTECs) besides of other cell types such as dendritic cells (DC), macrophages, B lymphocytes and fibroblasts. Moreover, the T cell precursors arising from the bone marrow reach the thymus (thymocytes) maturing in T lymphocytes, which migrate to the periphery. Thus, the thymus is the place of very important events during the maturation of the immune system, including the control of their own homeostasis. In the present study, we search to picture the main characteristics of the thymus by means of the large scale gene expression analysis that is, describing part of their transcriptome. We made use of the cDNA microarray technology in two versions. In the first one we used cDNA microarrays constructed on glass slides and fluorescent probes labeled with the fluorochromes Cy3 or Cy5 and in the second version we used cDNA microarrays on nylon membranes and radioactive probes labeled with 33P isotope. To data analysis we used dedicated bioinformatics programs, such as SAM (significance analysis of microarrays) and Cluster-Tree View. Three sets of results were possible. In the first set we observed the occurrence of the promiscuous gene expression (PGE) of parenchymal tissue/organ specific antigens (TSAs), demarking their temporal emergence during the murine thymus ontogeny, which is influenced by the genetic background of the inbred strains studied. The occurrence of PGE in the thymus is associated to the molecular-genetics basis of the immune tolerance of T cells, contributing with the prevention of autoimmunity. The second set of results consisted in the analysis of gene expression of thymus from knockout mice (KO) involving genes important for T cell maturation, such as TCR?, LAT, Relb, RAG-1 and CD3?, allowing the observation of its effects on the transcription regulation in this organ. Finally, the third set consisted in the definition of the virtual molecular dissection of the thymus. By means of particular gene expression profiling featured by each main cell type populating the thymus, it was possible to dissect this organ using the cDNA microarray technology.

As distrofias musculares formam um grupo amplo e heterogêneo de doenças genéticas, caracterizado basicamente pela degeneração e fraqueza muscular. Ao longo das últimas décadas muitos estudos vêm sendo realizados para a identificação dos genes causadores dessas doenças. Entretanto, apesar da identificação da mutação responsável pela grande maioria das formas descritas, os processos moleculares subjacentes ao defeito genético primário são muito complexos e ainda precisam ser melhor compreendidos. E a compreensão dos mecanismos de cada uma das formas é muito importante para o desenvolvimento adequado de terapias. A avaliação da expressão gênica global por microarranjos de DNA é uma ferramenta bastante poderosa, capaz de produzir uma grande quantidade de dados, delineando o panorama geral do estado do transcriptoma de um determinado tecido ou célula. Assim, os objetivos desse trabalho foram estudar os perfis de expressão do músculo de três linhagens de camundongos modelos de formas distintas de distrofia muscular (Dmdmdx, Largemyd-/- e Dmdmdx/Largemyd-/-) em diferentes fases da progressão da doença (21 dias, três meses e seis meses de idade), com o intuito de caracterizar o processo distrófico e como o perfil de expressão varia com a progressão da idade e a depender da mutação genética. Em cada um dos modelos e idades estudados identificamos um grande número de genes diferencialmente expressos (GDEs), refletindo a complexidade dessas doenças. A análise dos processos e vias biológicas nas quais esses genes estão envolvidos mostrou o forte envolvimento de componentes do sistema imunológico e inflamação, e também de genes relacionados com os processos de degeneração/regeneração e remodelamento da matriz extracelular. De modo geral, as funções biológicas alteradas são bem semelhantes entre as linhagens, sugerindo que apesar de as mutações serem em genes distintos, com funções diferentes, os processos moleculares que são afetados em decorrência dessas mutações são praticamente os mesmos. As maiores diferenças foram vistas na idade de 21 dias, especialmente na linhagem Dmdmdx que apresentou uma grande quantidade de GDEs, dos quais grande parte relacionada com a maior capacidade regenerativa dessa linhagem e, assim, são genes que podem explicar o porquê desses animais apresentarem um fenótipo benigno em relação aos pacientes humanos. A caracterização do modelo duplo-mutante Dmdmdx/Largemyd-/- mostrou que a junção das duas mutações não ocasiona alterações no transcriptoma distintas das obsevadas nas linhagens parentais, sendo que o perfil do duplo-mutante é mais próximo ao de seu parental Largemyd-/-, não apresentando a mesma capacidade regenerativa que o Dmdmdx / The muscular dystrophies form a large and heterogeneous group of genetic diseases, characterized mainly by progressive muscular degeneration and weakness. In the last decades, many studies have been carried on in order to identify the involved genes in these disorders. However, despite the identification of responsible mutations of the majority of the described forms, the underlying molecular processes to the primary mutation are very complex and are not fully understood. And to understand the mechanisms of each form is of major importance to the development of therapies. Global gene expression profiling by DNA microarrays is a powerful tool, able to yield a huge quantity of data, outlining the general landscape of the transcriptome of a given tissue or cell. In this sense, the objectives of this work were to study the expression profile of the muscles from three mice lineages, models for different forms of muscular dystrophy (Dmdmdx, Largemyd-/- and Dmdmdx/Largemyd-/-) in different phases of disease progression (21-day-old, three-month-old and six-month-old), in order to characterize the dystrophic process and how the expression profile changes according to aging and depending on the genetic mutation. In each model and age studied we identified a substantial number of differentially expressed genes (DEGs), reflecting the diseases\' complexity. The analysis of the biological processes and pathways in which these genes are implicated showed a strong involvement of immune system and inflammation components, and also genes related to degeneration/regeneration and extracellular matrix remodeling processes. Altogether, the altered biologic functions are very similar in lineages, suggesting that although mutations are in different genes, with diverse functions, the affected molecular processes due to these mutations are basically the same. The most notable differences were seen on 21-day-old, especially on Dmdmdx lineage that showed a great quantity of DEGs, many of which are related to the better regenerative capacity this lineage exhibits and, thus, they are genes that could explain why these animals manifest a mild phenotype in comparison to human patients. The characterization of the double mutant Dmdmdx/Largemyd-/- showed that the union of both mutations does not bring on alterations on the transcriptome different from those seen in the parental lineages, with the double mutant profile closer to its parental Largemyd-/-, not bearing the same regenerative capacity that Dmdmdx

As sementes do cacaueiro (Theobroma cacao L.) constituem a única fonte de manteiga de cacau, matéria prima fundamental para as indústrias de chocolates e confeitos, farmacêutica e cosmética. Cerca de 50 % do peso seco das sementes é composto por gordura, caracterizada pelo alto nível de estearato (30-37%), em combinação com palmitato (24-31%) e de oleato (33-39%), conferindo-lhe uma composição triglicerídica única, responsável pelas suas propriedades de fusão, com aplicações específicas e especiais. Apesar dos genes que codificam as enzimas da via metabólica de biossíntese de ácidos graxos e triglicerídeos em plantas serem conhecidos, os mecanismos moleculares pelos quais as plantas controlam a produção de estearato e que diferenciam as plantas acumuladoras de estearato de todas as demais não estão claramente definidos. O objetivo deste trabalho foi analisar a composição de ácidos graxos nos frutos de Theobroma cacao e a expressão temporal de genes relacionados à via metabólica de ácidos graxos e triglicerídeos durante o desenvolvimento de sementes de T. cacao, com ênfase na acumulação de estearato. Em paralelo, foram eleitos os genes referências mais estáveis para os estudos em embriões e diversos tecidos de Theobroma cacao. Empregando-se a técnica de reação quantitativa da amplificação em cadeia de transcritos reversos de RNA (RT-qPCR), foram analisadas a expressão dos genes codificadores da proteína carregadora de acil A, B e C, \'beta\'-cetoacil-ACP sintase II, \'delta\'9estearoil-ACP desaturase A e B, Acil-ACP tioesterase A, acil-ACP tioesterase B, acil-CoA sintetase A e B e da proteína oleosina. Quando se estudou de expressão gênica apenas nos embriões de T. cacao, os três genes mais estáveis foram proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Quando se considerou diversos tecidos de plantas de Theobroma cacao, os melhores genes para a normalização dos valores de expressão foram os codificadores da proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. A acumulação de transcritos da \'delta\'9estearoil-ACP desaturase foi relacionada ao aumento do ácido oleico. O aumento na quantidade deste ácido acontece pela ação conjunta da \'delta\'9estearoil-ACP desaturase, e acil-ACP tioesterase A, a qual mostra maiores níveis de transcritos entre 90 e 140 DAP com pico aos 100 DAP. O aumento de ácidos esteárico estaria relacionado com a ação conjunta e com transcrição temporalmente coordenada dos genes das enzimas \'beta\' -cetoacil-ACP sintase II, Acil-ACP tioesterase A e Acil-ACP tioesterase B. Transcritos da enzima \'beta\' -cetoacil-ACP sintase II apresenta pico aos 100 DAP, possivelmente com acúmulo máximo de substratos 18:0-ACP, que poderiam ser hidrolizado preferencialmente pela enzima acil-ACP tioesterase A, ou acil-ACP tioesterase B, O intervalo entre o pico de acúmulo de trasncritos entre \'beta\'-cetoacil-ACP sintase II (100 DAP) e Acil-ACP tioesterase A e \'delta\'9estearoil-ACP desaturase (110 DAP) sugere que poderia ocorrer um acúmulo de estearato resultante da ação dessas enzimas. Esses resultados corroboram o modelo de acumulação de estearato proposto por Silva (2005) / Cacao seeds (Theobroma cacao L.) are unique sources of cocoa butter, fundamental raw material for the chocolate, confectionary, cosmetic and pharmaceutical industries. Around 50% of the seed dry weight represents fat, characterized by the high levels of stearate (30-37%), in combination of palmitate (24-31%) and oleate (33-39%), giving a unique triacylglycerol compostion, responsible for the melting profile for special and specific applications. Despite the fact that genes encoding enzymes of the fatty acid and triglyceride biosynthetic pathway of plants are known, the mechanisms to control the accumulation of high levels of stearate, that differ from other species, are not clearly defined. The objective of this work was to analyse the composition of fatty acids and the expression of genes associated with fatty acid and triglyceride biosynthetic pathway during the development of cacao pods, with emphasis with stearate accumulation. In parallel, the establishment of stable reference genes to investigate gene expression in developing embryos and other cacao tissues were investigated. Using the quantitative amplification of reversed transcripts (RT-qPCR), the expresion of genes coding for the acyl-carrier protein A, B and C; \'beta\'-ketoacyl-ACP sinthase II; \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase A and B; Acyl-ACP thioesterase A; Acyl-ACP thioesterase B; Acyl-CoA sintethase A and B; and oleosin. When gene expression was conductd only in developing cacao embryos, the three most stable genes were the ribosomal protein L35, acyl-carrier protein A and glyceraldehide 3-phosphate dehydrogenase. When various tissues were considered, the best reference genes for gene expression normalization were those encoding for the ribosomal protein L35, acyl carrier protein B and glyceraldehide 3-phosphate dehydrogenase. The accumulation of \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase transcripts could be associated with the accumulation of oleate, together with the increase of acyl-ACP thioesterase A, with increased relative levels of transcripts between 90 and 140 DAP, peaking at 100 DAP. The increase in stearate might result from the joint activity of the \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase and acyl-ACP thioesterase A, which presented higher accumulation of transcripts between 90 and 140 DAP, with peak at 110 DAP. The increase in stearate would associated with the joint and temporal coordinated expression of genes encoding \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II, and Acyl-ACP thioesterase A and B. Transcripts of the enzyme \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II peaked at 100 DAP, possibly with the maximum accumulation of substrates 18:0-ACP, that would be preferentially hydrolzyed by the enzyme acyl-ACP thioesterase A, or acyl-ACP thioesterase B, The gap between the peak in transcript accumulation between \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II (100 DAP) and acyl-ACP thioesterase A and \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase (110 DAP) could lead to the accumulation of stearate. These results corroborated the model proposed by Silva (2005)

Em 2009, foi demonstrado um potente antiviral na hemolinfa de L. obliqua. Esta proteína purificada reduziu o título viral (TCID50 ml-1) do sarampo, pólio e H1N1 em 157, 61 e 64 vezes. Recentemente, expressamos a proteína antiviral em sistema baculovírus, que reduziu o título de vírus do herpes em 106 vezes, da rubéola e EMC em 105 vezes. No entanto, este sistema de expressão é muito caro e trabalhoso. Com isso, clonamos e expressamos esta proteína com atividade antiviral em sistema bacteriano. A sequência antiviral foi clonada em vetor de expressão pET28a. As construções resultantes foram expressas em E. coli Bl21 DE3 pLysS induzidas com IPTG 1,0 mM. Após expressão, o pellet bacteriano foi sonicado e o material foi purificado por afinidade e gel filtração. Testou-se contra o vírus EMC mostrando uma proteção de 104 vezes em relação ao controle. E utilizando qPCR para determinar os níveis de transcrição de RNA do vírus do herpes e da rubéola em células infectadas mostrou uma inibição respectivamente de 106 e 105 vezes, em relação ao controle. / In 2009, we demonstrated a potent antiviral in the hemolymph of L. obliqua. This purified protein has reduced the viral titer (TCID50 ml-1), measles and polio H1N1 157, 61 and 64 times. Recently, the antiviral protein expressed in baculovirus system, which reduced the title of the herpes virus in 106 times, rubella and EMC in 105 times. However, this expression system is very expensive and laborious. Thus, cloned and expressed this protein with antiviral activity in bacterial system. The antiviral sequence was cloned into pET28a expression vector. The resulting constructs were expressed in E. coli BL21 DE3 pLysS cells induced with 1.0 mM IPTG. Following expression, the bacterial pellet was sonicated and the material was purified by affinity and gel filtration. Was tested against EMC virus showing a protection of 104 times compared to the control. And using qPCR to determine the levels of viral RNA transcription of the herpes virus and rubella-infected cells showed an inhibition of respectively 106 and 105 times compared to the control.

O objetivo do trabalho foi verificar se existe associação dos polimorfismos de lócus microssatélites com o desempenho e expressão gênica. Após genotipagem, os alelos 122 e 130 foram observados, com frequência de 0,94 e 0,06. A frequência gênica foi de 0,88 para animais 130/130 e de 0,12 para indivíduos 122/130. Não houve diferença para os dados fenotípicos entre animais de genótipos diferentes, embora o grupo de animais heterozigoto tenha apresentado uma leve superioridade. A taxa de expressão do Gh não é estatisticamente diferente entre os genótipos observados, porém o grupo homozigoto teve uma taxa de expressão de mRNA maior e mesmo assim menores valores de peso e comprimento, sugerindo uma correlação. O par de iniciadores desenhado amplificou e genotipou com eficiência o locus STR nos animais estudados. A falta de qualidade da água e o manejo inadequado dos animais podem ser os causadores das alterações histopatológicas encontradas no fígado dos animais estudados. Os peixes podem ser via de contaminação humana, devido ao seu consumo como alimento, portanto, medidas de controle devem ser iniciadas para minimizar esse processo. Estudos mais aprofundados com maior controle ambiental, maior variabilidade alélica, maior número amostral e análise de outros genes de interesse associados, seriam interessantes para complementar e enriquecer o presente trabalho. / The objective of this study was to verify if there is association of polymorphisms of microsatellite loci with the performance and gene expression. After genotyping, alleles 122 and 130 were observed, with a frequency of 0,94 and 0,06. The gene frequency was 0,88 for 130/130 animals and 0,12 for 122/130 individuals. There was no difference for phenotypic data among animals of different genotypes, although the group of heterozygous animals presented a slight superiority. The expression rate of GH is not statistically different among the observed genotypes, but the homozygote group had a higher mRNA expression rate and even lower values of weight and length, suggesting a correlation. The pair of primers designed amplified and efficiently genotyped the STR locus in the animals studied. The lack of water quality and inadequate management of the animals may be the cause of the histopathological changes found in the liver of the animals studied. Fish can be a way of human contamination, due to their consumption as food, therefore, control measures must be initiated to minimize this process. Further studies with greater environmental control, greater allelic variability, greater sample size and analysis of other associated genes of interest, would be interesting to complement and enrich the present work.

A sepse é causada por microorganismos tais como: bactérias Gram-negativas, Gram-positivas, fungos e vírus. A sepse grave e o choque séptico estão associados a taxas de mortalidade de 40 a 60%. O evento mais importante para a evolução do quadro séptico é a apoptose das células efetoras do sistema imune. A eliminação de um grande número de células do sistema imune compromete a defesa efetiva do hospedeiro. Para estudarmos o papel das células imunes na sepse utilizamos o modelo de tolerância ao LPS. Em nossos estudos induzimos tolerância ao LPS em camundongos Balb-C e analisamos os padrões da expressão gênica nos linfócitos do baço. Para o mapeamento dos genes, utilizamos o macroarray, identificamos o grupo funcional de genes que tem maior relevância na proteção induzida pela tolerância, e em seguida confirmamos os resultados encontrados através do RT-PCR, Western Blotting, atividade de caspase 1 e citometria de fluxo. Encontramos uma importante redução na expressão de genes, como heat shock proteins, óxido nítrico e apoptose. Após análise da membrana contendo os genes integradores da resposta produzida pela tolerância, optamos por enfatizar inicialmente os genes envolvidos no processo apoptótico devido à relevância deste processo no quadro séptico conforme mostraram os trabalhos encontrados na literatura. Demonstramos que animais tolerantes ao LPS apresentam diminuição dos eventos apoptóticos, com redução na expressão dos genes ligados às caspases 7, 8 e 11, assim como a redução dos genes ligados ao Bid e Apaf-1. Ao analisarmos o RNAm através do RT-PCR, encontramos redução na Caspase 3, Bax e Bcl2, resultado que se confirmou ao analisarmos a expressão protéica através do Western- Blotting. Realizamos citometria de fluxo para avaliarmos a ocerrência de apoptose nos linfócitos dos animais submetidos à ligadura cecal. Confirmamos uma redução da apoptose e necrose em linfócitos dos animais tolerantes em relação aos controles. Com estes resultados podemos propor que a tolerância seria benéfica na redução da apoptose e controle do quadro séptico, além disso, a diminuição na expressão do gene ligado à caspase 11 estaria contribuindo para a diminuição do quadro inflamatório, pois a caspase 11 é um mediador essencial na resposta ao choque séptico. / Sepses are caused by microorganisms such as: Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, fungus and virus. Several sepses and the septic shock have been associated with the mortality rates from 40 to 60%. One of the most important events for the septic evolution is the apoptosis cells of the immune system. The cells immune system elimination compromises the host. We induced LPS tolerance in Balb-C mice and analyzed genes expressions in spleens; we found an important reduction in the genes expressions like: heat shock proteins, nitric oxide and apoptosis. After analysis of the membrane containing the sepses genes produced by tolerance, we emphasized initially the genes involved in the apoptosis. Demonstrated that animals LPS tolerants presented decrease in apoptotic events, with reduction in the genes expression related caspases 7, 8, 11, Bid and Apaf-1. In the mRNA by RT-PCR, we found a reduction in Caspase 3, Bax and Bcl2, and these results were confirmed by Western-blot. We realized flow cytometry and we showed that the results are maintained, presenting reduction in both the apoptotic and necrotic events in tolerants animals. These results showed that the tolerance would be favorable in the apoptosis reduction and control of the sepsis, moreover, the expression reduction to caspase 11 genes would be contributing to the inflammatory reduction because Caspase 11 is an essential mediator in the septic shock.

O decanoato de nandrolona é um esteróide anabólico-androgênico (EAA), derivado da testosterona, utilizado de maneira abusiva por indivíduos procurando ganho de força física ou apenas efeitos estéticos. Doses suprafisiológicas desses compostos têm sido associadas a efeitos psiquiátricos adversos, especialmente episódios de impulsividade e aumento no comportamento agressivo. Considerando o desconhecimento dos mecanismos neurais envolvidos nessa desinibição comportamental, nós investigamos a integridade da transcrição de componentes do sistema serotoninérgico (intimamente relacionados à expressão de comportamentos emocionais) em diversas áreas cerebrais de camundongos sob a administração prolongada de nandrolona. Camundongos machos adultos da linhagem C57Bl/6J receberam uma injeção subcutânea diária de 15 mg/kg de decanoato de nandrolona durante 28 dias. Diferentes grupos de animais foram utilizados para a análise de comportamentos emocionais e para a quantificação da expressão de genes relacionados à serotonina (5-HT), utilizando a transcrição reversa do RNA associada à técnica de PCR em tempo-real. Os camundongos tratados apresentaram um aumento na massa corporal, hiperatividade motora e aumento de comportamentos relacionados à ansiedade em ambientes novos. A imobilidade avaliada no teste de nado forçado apresentou-se reduzida. Os animais que receberam a nandrolona se mostraram mais agressivos e impulsivos para iniciar o ataque aos camundongos oponentes, no modelo de residenteintruso. O EAA induziu uma redução significante na quantidade de transcritos da maioria dos receptores pós-sinápticos de 5-HT investigados na amígdala e no córtex pré-frontal. A expressão do gene do receptor 5-HT1B (reconhecidamente envolvido com as alterações comportamentais observadas) estava também reduzida no hipocampo e hipotálamo. No mesencéfalo, região onde se encontram os corpos neuronais dos neurônios serotoninérgicos que inervam o sistema límbico e demais áreas cerebrais, não se observou nenhuma alteração na expressão dos genes relacionados aos receptores serotoninérgicos pré-sinápticos. Os transcritos do transportador e da enzima de síntese de 5-HT, indicadores da integridade serotoninérgica pré-sináptica, também não se apresentaram alterados. Dessa maneira, concluímos que o efeito de altas doses do EAA decanoato de nandrolona em camundongos confirma os dados encontrados em literatura quanto à desinibição comportamental observada em usuários abusivos humanos. Nosso modelo também foi eficiente em mostrar pela primeira vez alterações moleculares induzidas por este EAA. A redução generalizada na expressão dos genes de receptores de 5-HT na amígdala e córtex pré-frontal sugere essas áreas, pós-sinápticas ao sistema serotoninérgico, como críticas nos efeitos induzidos pelo EAA. Nosso trabalho também sugere um papel importante para o receptor 5-HT1B na desinibição comportamental observada / Nandrolone decanoate is a highly abused anabolic-androgenic steroid (AAS) by individuals looking for gains in physical strength or body appearance. Supraphysiological doses of this testosterone synthetic derivative have been associated with many physical and psychiatric adverse effects, especially reported episodes of impulsiveness and overt aggressive behavior. Since the neural mechanisms underlying AAS-induced behavioral disinhibition are unknown, we investigated the integrity of serotonergic system transcription in several brain areas of mice under prolonged nandrolone administration. Male C57Bl/6J mice received 15 mg/kg of nandrolone decanoate subcutaneously once daily for 28 days, and different sets of animals were used to investigate motor and emotion-related behaviors or 5-HT-related gene expression by qRT-PCR. AAS-injected mice had increased body weight, were hyperactive and displayed more anxious-like behaviors in novel environments. They exhibited reduced immobility in the forced swim test, higher probability of being aggressive and elevated impulsivity to attack the opponent. AAS induced substantial reduction in the transcription of most postsynaptic 5-HT receptors investigated in the amygdala and prefrontal cortex. Interestingly, 5-HT1B mRNA was further reduced in the hippocampus and hypothalamus. At the midbrain level, there was no alteration in 5- HT receptors, transporter or synthetic enzyme gene transcription. In conclusion, high doses of AAS nandrolone in male mice recapitulate the behavioral disinhibition observed in abusers. Furthermore, they are associated with overall decrease in 5-HT receptor gene expression in the amygdala and prefrontal cortex, implicating these areas as critical sites for AASinduced effects and indicating a role for the 5-HT1B receptor in this behavioral disinhibition

A embriogênese somática é uma técnica alternativa com potencial aplicação na propagação clonal de plantas, além de ser uma excelente ferramenta para estudos básicos e análise dos eventos moleculares e bioquímicos que ocorrem durante a embriogênese vegetal. Contudo, apesar de várias pesquisas relativas a embriogênese somática, a falta de conhecimento sobre os fatores que controlam o fenômeno, comprova que existem ainda muitos pontos a serem entendidos sobre o processo. Deste modo, o presente estudo foi concebido com o intuito de estudar a embriogênese somática de duas espécies de citros, as quais apresentam diferentes graus de eficiência na produção de embriões somáticos. Inicialmente, buscou-se avaliar comparativamente o processo de embriogênese somática de duas espécies de citros, observando-se as diferenças estruturais através de análises histológicas e histoquímicas, e as diferenças na expressão do gene AtSERK1 nos calos, através de hibridização in situ. Para instalação dos experimentos, foram utilizados calos provenientes de nucelos de duas espécies, Citrus sinensis L. Osbeck, variedade Valência, e Citrus limonia Osbeck, variedade limão ‘Cravo’. Amostras de calos em meio de multiplicação, em meio de obtenção de embriões, e embriões somáticos nas diferentes fases de desenvolvimento foram coletados para observações anatômicas e histoquímicas através de microscopia óptica e realização de estudo da expressão gênica através de hibridização in situ. Com relação à morfologia, os principais resultados obtidos demonstraram que existem diferenças anatômicas e histoquímicas entre calos de limão ‘Cravo’ e ‘Valência’. Em relação à expressão gênica, os resultados evidenciaram a expressão do gene AtSERK1 em calos das duas espécies de citros, tanto em meio de multiplicação, com sacarose, como em meio de indução, com maltose, indicando que o potencial embriogênico já está instalado no calo em meio de multiplicação. Pode-se concluir também que este gene é conservado entre Arabidopsis e Citrus. Desenvolveram-se, também, experimentos para estudar os efeitos de alguns tratamentos (frio, dessecação, agrupamentos celulares) na otimização da indução e sincronização da embriogênese somática de C. sinensis, var. Valência. Neste sentido, calos nucelares de laranja ‘Valência’, procedentes do meio de multiplicação foram mantidos no mesmo meio líquido em agitador orbital a 200 rpm durante 24h e posteriormente peneirados de acordo com os tratamentos. As peneiras utilizadas apresentaram malhas de 150 µm (P1), 300 µm (P2) e 600 µm (P3). Além do efeito das peneiras também foram observados os efeitos de exposição ao frio (4 o C por quatro semanas, ausência de luz) e dessecação (27 o C, em placas de Petri na ausência de meio de cultura, seis dias, ausência de luz), sendo posteriormente mantidos em B.O.D., a 26 ± 1 o C e intensidade luminosa de 300 lux. Os resultados obtidos permitiram concluir que em relação ao desenvolvimento e produção de embriões somáticos o fator peneira foi superior ao fator estresse na freqüência embriogênica. O desenvolvimento de embriões somáticos em Citrus sinensis ocorre mais eficientemente a partir de agrupamentos celulares de tamanhos específicos. / Somatic embryogenesis is an alternative technique with potential application for clonal propagation of plants, and an excellent tool for basic studies and analysis of the molecular and biochemical events that occur during embryogenesis. However, although many studies have been done, the factors that control somatic embryogenesis are not completely understood. Thus, the present study proposes to evaluate aspects of somatic embryogenesis of two citrus species, which differ in efficiency for the production of somatic embryos. Initially, a comparison of the embryogenic process was done in terms of structural and histochemical analysis and evaluation of the expression of the gene AtSERK1 in callus cultures through in situ hybridization. For the experiments, callus cultures obtained from nucelli of two species, Citrus sinensis L. Osbeck, cv. Valencia, and Citrus limonia Osbeck, cv. Rangpur lime were used for anatomical and histochemical observations, callus samples from cultures in multiplication medium, in embryo induction medium, and somatic embryos in different stages of development were collected. Callus and embryo samples were also collected for analysis of gene expression through in situ hybridization. The anatomical and histochemical analysis showed differences between Rangpur lime and Valencia callus cultures. The in situ hybridization results evidenced the expression of the gene AtSERK1 in cultures of both citrus species, and also in both culture conditions: multiplication medium, with sucrose, and embryo induction medium, with maltose, indicating that the embriogenic potential is already installed in the callus cultures in multiplication medium. The results also lead to the conclusion that the gene is conserved between Arabidopsis thaliana and Citrus. Experiments aiming to synchronize the somatic embryogenesis formation in C. sinensis, cv. Valencia, were installed testing the effect of cold, desiccation and cell cluster size on somatic embryo formation. For that, callus cultures of ‘Valência’ sweet orange were cultivated in liquid medium in an orbital shaker, at 200 rpm, for 24h, and sieved through the following screens: 150 µm (P1), 300 µm (P2) and 600 µm (P3). The cell aggregates were then exposed to cold (4 o C, for four weeks, in the dark) and desiccation (27 o C, in Petri plates without culture medium, six days, in the dark) treatments, and cultured in incubators at 26 ± 1 o C and 300 lux of light intensity. The results lead to the conclusion that the separation of cultures in clusters of different sizes and the stress treatments were effective for synchronization and embryogenesis frequency. The size of cell clusters was the most important factor.

O rápido declínio da qualidade nutricional de P. maximum com o avanço da maturidade é um dos maiores limitantes do desempenho animal em pastagens. Devido ao modo de reprodução apomítica da espécie, a engenharia genética surge como importante ferramenta para o desenvolvimento de novas cultivares. Sendo assim, a identificação de genes responsáveis pela queda da digestibilidade da fibra é um passo importante para a geração de cultivares transgênicas. Objetivou-se neste estudo determinar a produtividade, composição bromatológica, digestibilidade in vitro das frações folha e colmo de 11 genótipos de P. maximum colhidos em três idades de corte: 30, 60 e 90 dias de crescimento, bem como quantificar a expressão de seis enzimas da via de lignificação da parede celular. Objetivou-se ainda a classificação dos genótipos em grupos de acordo com suas características produtivas e de qualidade nutricional. Utilizou-se delineamento de blocos ao acaso, em esquema de parcela subdividida, com três repetições, no qual a parcela experimental foi composta de seis linhas com 4 m de comprimento, espaçadas de 0,5 m, sendo a data de corte a parcela e os genótipos as sub-parcelas. A produção de MS diferiu entre os genótipos somente com 90 dias de crescimento. Houve ainda variação entre os genótipos quando à porcentagem de folhas, colmos e material morto. Os genótipos não diferiram quanto à composição química e digestibilidade da fração folha, porém apresentaram grande variação quanto à composição química e digestibilidade da fração colmo. A fração colmo apresentou maiores valores de FDN, FDA e lignina, e menores valores de PB do que a fração folha. Entretanto, a fração colmo apresentou maior digestibilidade da MS com 60 dias de crescimento e maior digestibilidade da FDN com 30 e 60 dias de crescimento. O agrupamento detectou 4 grupos de genótipos de acordo com produtividade e DIVFDN do colmo. Os acessos PM39 e PM47 se destacaram por boa produtividade, elevada digestibilidade da FDN do colmo, enquanto as cultivares Milênio e Mombaça apresentaram alta produção de massa, porém baixa digestibilidade da fibra do colmo. A cultivar Massai e os acessos PM39 e PM47 foram selecionados como genótipos com boa manutenção da digestibilidade da fibra (LENTA), enquanto os genótipos Tanzânia, Milênio e Mombaça foram selecionados como genótipos com rápida queda da digestibilidade da fibra do colmo (RÁPIDA) para quantificação da expressão gênica. Foi realizada uma quantificação da expressão relativa de seis genes de interesse (CCR, COMT, C4H, 4CL, CAD e PAL) e um gene controle (GAPDH) nas três idade de corte. Houve interação tratamento idade para os genes C4H e COMT, com aumento da expressão dos genes de 30 para 60 dias de crescimento somente no grupo de RÁPIDA queda da digestibilidade. No grupo com LENTA queda da digestibilidade não houve alteração da expressão com 60 dias. O gene PAL mostrou comportamento semelhante, porém a interação tratamento idade não foi significativa. Estas características posicionam estes três genes como possíveis moduladores da digestibilidade do colmo de P. maximum. Conclui-se que a maturidade tem maior efeito sobre a qualidade nutricional da fração colmo do que sobre a fração folha e que há grande variação entre os genótipos em relação ao efeito da maturidade sobre a digestibilidade da fração colmo, indicando a possibilidade de seleção de cultivares com maior digestibilidade de colmos, e a dificuldade de se selecionar genótipos com maior digestibilidade de folhas. Identificou-se os genes C4H, COMT e PAL como possíveis candidatos à engenharia genética para produção de cultivares transgênicas. / The rapid decline of nutritional quality of P. maximum with advanced maturity is an important limiting factor for animal performance in pastures. Because of the apomitic reproduction of the species, genetic engineering arises as an important tool for development of new cultivars. Therefore, the identification of genes responsible for the decline in fiber digestibility is an important step towards generating transgenic cultivars. The objective of this study was to determine the yield, chemical composition, in vitro digestibility of leaf and stem fractions of 11 P. maximum genotypes harvested at three stages: 30, 60 and 90 days of regrowth, as well as to quantify the expression of six enzymes from the cell-wall lignification pathway. Another objective was to classify the genotypes in groups according to their productive and nutritional characteristics. A randomized block design in a split plot arrangement with three replications was used, in which the experimental plot was composed of six lines with 4 m length, spaced 0.5 m, being the harvest age the plot and the genotypes the sub-plots. The DM production differed between genotypes only after 90 days of regrowth. There was variation among genotypes in the percentage of leaves, stems and dead material. The genotypes did not differ in chemical composition and digestibility of the leaf fraction, but there was great variation in chemical composition and digestibility of the stem fraction. The stem fraction had higher NDF, ADF and lignin content, and lower CP content than the leaf fraction. However, the stem fraction had higher DM digestibility with 60 days of regrowth, and higher NDF digestibility after 30 and 60 days. The clustering procedure separated the genotypes in four groups cording to DM yield, stem NDF digestibility and percentage of leaves. The accessions PM39 and PM47 stood out for their good productivity and high stem NDF digestibility, while the cultivars Milênio and Mombaça had high DM yield but lower stem NDF digestibility. For quantification of gene expression, the Massai cultivar and the accessions PM39 and PM47 were selected as genotypes with good maintenance of fiber digestibility (SLOW), while the genotypes Tanzânia, Milênio and Mombaça were selected as ones with fast decline in stem fiber digestibility (FAST). The relative expression of six genes of interest (CCR, COMT, C4H, 4CL, CAD and PAL), and one control gene (GAPDH) was determined in the three harvested ages. There was a treatment age interaction for the C4H and COMT genes, with an increase in gene expression from 30 to 60 days of regrowth only in the group with FAST decline in digestibility. In the group with SLOW decline in digestibility, there was no difference in expression from 30 to 60 days of regrowth. The gene PAL had similar profile of expression; however the treatment age interaction was not significant. These characteristics place these three genes as possible modulators of stem digestibility in P. maximum. We conclude that maturity has a great effect over the stem nutritional quality than over leaves, and there was great variation among genotypes in the effect of maturity on stem fiber digestibility, indicating the possibility to select cultivars with higher stem digestibility, and also the difficulty to select genotypes with higher leaf digestibility. We identified the genes C4H, COMT and PAL as possible candidates for genetic engineering aiming the production of transgenic cultivars.