Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 Å, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 Å, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 °C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 °C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 °C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 °C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de α-hélice e 42% de folhas- β. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and β-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both β-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 Å, and Rg of 20 and 27 Å, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 °C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 °C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 °C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 °C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de α-helices and 42% de β-sheet.

Sporothrix shenckii, um fungo dimórfico, termo-dependente, é encontrado na natureza associado com matéria orgânica em decomposição, como, espinhos, folhas secas, madeira e também na água. Este fungo é o agente causador da esporotricose, que ocorre com maior freqüência em pessoas que trabalham com o solo e vegetais contaminados com os esporos do fungo, sendo considerada uma doença ocupacional. A contaminação acontece com a inoculação traumática do material contaminado e em alguns casos por inalação dos esporos. Quando infecta o organismo humano, bem como outros mamíferos ou quando cultivado a 37°C, passa para a forma de levedura. É comum em áreas de clima tropical e subtropical, com alta umidade. Apresenta distribuição mundial, sendo que, atualmente no Brasil, são relatados casos em São Paulo, Rio de Janeiro e no Rio Grande do Sul. No Rio de Janeiro, a esporotricose tem sido relatada como doença endêmica, onde o agente etiológico é transmitido de gatos para homens. A esporotricose apresenta caráter crônico, polimórfico e com formação granulamatosa. As formas clínicas e a patogênese dependem do sítio de inoculação do fungo e da resposta imunológica do hospedeiro. O mecanismo de defesa e suscetibilidade do organismo, bem como a disseminação da infecção por este fungo ainda não são totalmente conhecidos. O estado de saúde do paciente contribui diretamente para o estabelecimento da doença, sendo que, alcoolismo, diabete, imunidade comprometida e uso extensivo de drogas imunosupressoras são fatores que podem predispor à infecções severas. Neste trabalho estudamos in vitro a interação do S. schenckii com macrófagos murinos. Por meio de técnicas de fagocitose, ELISA, dosagem de óxido nítrico, viabilidade de leveduras, citometria de fluxo e RT-PCR foram realizados ensaios da atividade de macrófagos. Desta forma foram gerados alguns dados para o melhor entendimento da resposta de defesa nesta doença. Nos estudos realizados, concluímos que os anticorpos gerados nos camundongos pela infecção por S. schenckii foram capazes de induzir a fagocitose do fungo. Também, após a fagocitose das leveduras pelos macrófagos, incubados com laminarina ou manana, houve inibição significativa da produção de TNF-α, indicando que os receptores dectina-l e manose, respectivamente, estão relacionados à produção desta citocina. O soro, contendo os anticorpos do animal infectado, também induziu forte produção desta citocina, mostrando que a entrada do fungo via receptor Fc pode também induzir a produção dessa citocina. Verificamos ainda que a fagocitose de leveduras, pelos macrófagos, na presença de soro de camundongo infectado, induziu alta produção de IL-10. Quando analisamos a expressão de genes presentes nos macrófagos, observamos forte expressão de TLR-2 e MyD-88, na presença das leveduras. Já a expressão de iNOS pelos macrófagos, observamos que foi maior na presença do fungo somente quando as leveduras foram incubadas com o soro, após o período de 72 horas. Em seguida, ao dosar a produção de Óxido Nítrico (NO), verificamos no período de 3 dias de incubação, que houve redução significativa na concentração de NO produzida pelos macrófagos, quando estes foram incubados com o fungo. Porém, quando as leveduras foram opsonizadas pelo soro, houve aumento da produção de NO após 72 horas de incubação. Outra verificação importante foi que os macrófagos foram capazes de destruir as leveduras fagocitadas na presença de soro. / Sporothrix schenckii is a dimorfic fungus, term-dependent, find in nature associated with organic material at decomposition, like thorns, wheat leaves, wood and water. This is the fungi agent that causes sporothricosis, which happens with more frequency with people that work with land and green, contaminated with mold of fungus. That is why it is considered a occupational disease. The contamination happens with traumatic inoculation of material and some cases with inhalation of mold. When a human is infected, as well as other mammals or when cultivate at 37°C, it tums into the yeast form. Is common at tropical and moisture weather areas. Is found all around the world, and nowadays at Brazil, with cases related São Paulo, Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul. At Rio de Janeiro, sporothricosis are related like endemic disease, where the etiologic agent is transmitted by cats to men. Sporothricosis is a chronic, polimorfic disease, and with form granulamatosa. The clinical type and the pathogenesis depend on the way of inoculation and the response of immunological system of the host. The defense and suscebility of the organism, as dissemination of infection with this fungi is not yet totally known. The patient\'s health state contributes directly to the disease, as much as alcoholism, diabetes and immunity deficiency and the extensive use of immunosuppressive drugs are factors that can bring to harder infection. Here, we studied in vitro the interaction of S. schenckii with murine macrophages. Using phagocytosis assay, ELISA, dosage of oxide nitric, CFU assay, flow citometry and RT-PCR were analysed activity of macrophages. We produced some results in order to better understand the response of defense with this disease. In the present study, we conclude that antibodies generated in mice by infection with S. schenckii were capable to promote phagocytosis of fungus. Also, when macrophages and yeast were incubated with laminarin or mannan, we had significant decrease in production of TNF-α, showing that receptors dectin-l and manose, respectively, are related with production this cytokine. The antibodies of mice infected with S. schenckii, also produced hard level this cytokine showing that entrance of fungus by receptor Fc can produce TNF- α. Besides, we verify that phagocitosys of yeast, with sera of infected mice, induct hard production of IL-10. When we analysed the expression of genes of macrophages, we observed hard expression of TLR-2 and MyD-88, when yeast were present. However, the expression of iNOS by macrophages, was more hard with yeast only when sera was present, before 72 hours. Similarly, when yeast were opsonized by sera, we had increase of production of NO after 72 hours of incubation. After, macrophage were capable to destruct yeast phagocyted when sera was present.

A puberdade é o momento quando um mamífero, macho ou fêmea, se torna capaz de produzir gametas viáveis e exibir comportamento sexual completo. Trata-se do resultado do ajuste gradativo entre o aumento da atividade gonadotrófica e a habilidade das gônadas em assumir simultaneamente a esteroidogênese e a gametogênese. Um dos principais fatores que influenciam o início à puberdade é o genético. A puberdade é uma característica fisiológica originada por muitos fatores (orgânicos e ambientais), que relacionam-se com a expressão de diversos genes, muitos dos quais ainda com funções desconhecidas. Metodologias para a análise da expressão gênica diferencial em tecidos, em particular a Análise Serial de Expressão Gênica (SAGE), incluem ferramentas que permitem a análise global e simultânea de vários transcritos de um determinado tecido, sejam eles conhecidos ou não, fornecendo informações sobre o padrão de expressão gênica de um determinado tipo celular de maneira qualitativa e semi-quantitativa. O objetivo do presente projeto foi analisar, por meio da técnica de SAGE, a expressão gênica diferencial no folículo ovariano de fêmeas bovinas da raça Nelore púberes e pré-púberes, segundo o critério da apresentação ou não de ondas de crescimento folicular que culminavam com a ovulação.. Um total de 14.531 e 14.285 tags tiveram sua seqüência de DNA determinada, revelando a existência de 6.840 e 6.386 genes únicos (biblioteca das novilhas pré-púberes e púberes respectivamente). A comparação entre as duas bibliotecas revelou um total de 127 tags diferencialmente expressos (P<0,05). Os folículos ovarianos de novilhas púberes apresentaram expressão mais elevada de algumas enzimas esteroidogências (CYP11A1 e CYP19) e do transportador de colesterol para a mitocôndria (StAR) indicando intensa atividade esteroidogência (produção de estrógeno) quando comparada ao folículo das bezerras pré-púberes. Além disso, o CTGF (fator de crescimento do tecido conectivo) e o TIMP2 (inibidor tecidual de metaloproteinases) foram mais abundantes nos folículos dos animais púberes, indicando que os mesmos já iniciaram o processo de luteinização, sem entrentanto iniciar o processo de ruptura da matriz extracelular que ocorre na ovulação. A maior expressão de genes relacionados ao metabolismo da matriz extracelular e do citoesqueleto (como por exemplo a osteonectina, a actina e proteínas relacionadas à actina) sugere que os folículos dos animais púberes estão se preparando para a remodelação tecidual. A maior expressão de conexina 43 (gap junction protein) nos folículos dos animais púberes sugere uma intensa comunicação das células da granulosa entre si e com o oócito quando comparadas aos folículos das bezerras pré-púberes. Dentre os genes diferencialmente expressos e mais abundantes no folículo das bezerras pré-púberes, destacou-se o gene da proopiomelanocortina (POMC), que codifica vários fatores hipofisários. Os conhecimentos gerados por este trabalho poderão ser úteis para a identificação de marcadores genéticos para aplicação em programas de seleção assistida por marcadores / Puberty is the stage where any mammal, male or female, becomes able to produce viable gametes and manifest complete sexual behavior. These are results from the gradative adjustment between the increase in gonadotrophic activity and the ability of gonads in undergoing simultaneously both steroidogenesis and gametogenesis. One of the major factors interferring with puberty initiation is the genetics. Puberty is a physiological process controlled by several factors (organic and environmental) related with the expression of several genes, most of them with unknown function. Differential gene expression approaches, in particular the Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), include tools that allow the global and simultaneous analysis of several transcripts from a given tissue, being known or unknown, providing qualitative and semi-quantitative information about the genetic profiles of any cellular type of interest. Using the SAGE approach, the aim of the present study was to analyse the differential gene expression profiles of ovarian follicles from pubertal and pre-pubertal Nelore breed females, observed for the presence or not of follicular growth waves ending in an ovulation, A total of 14,531 and 14,285 tags had their DNA sequences determined, revealing the existence of 6,840 and 6,386 unique tags (pre-pubertal and pubertal follicle libraries respectively). Comparison between the two SAGE libraries revealed 127 differentially expressed genes (P<0,05). Follicles from pubertal heifers showed increased expression of some steroidogenic enzymes (CYP11A1 and CYP19) and StAR, the mitochondrial cholesterol transporter, which together indicates a marked steroidogenic activity (oestrogen production), when compared with follicles from pre-pubertal heifers. Furthermore, connective tissue growth factor (CTGF) and TIMP2 (tissue inhibitor of metalloproteinases 2) were shown to be increased in pubertal follicles, indicating the starting of luteinization proccess, without however initiating the rupture of extracellular matrix, which takes place in ovulation. Higher levels of expression presented by extracellular matrix and cytoskeletal related genes (as examples osteonectin, actin and actin-related proteins) also indicate that the follicle from pubertal heifers is at the verge of tissue remodelation. The higher expression of connexin 43 (gap junction protein) indicated that this follicle shows a more intense communication among granulosa cells and between these and the oocyte, as compared to the pre-pubertal calves follicle. Among the differentially expressed genes more abundant in the pre-pubertal follicle is the proopiomelanocortin gene (POMC), which codifies to some hypophiseal factors. The knowledge generated by this study may contribute to the identification of genetic markers to be used in marker assisted selection programmes

Introdução: As células tronco podem contribuir na patogênese da endometriose. Os objetivos deste estudo foram avaliar e comparar a expressão de genes relacionados à atividade das células tronco no endométrio tópico (Et), peritônio normal (PN) e nos implantes de endometriose peritoneal superficial e profunda (EPS/EPP) de mulheres inférteis com endometriose. Métodos: Vinte e quatro amostras de Et, PN, EPS e EPP foram obtidas durante laparoscopia de seis pacientes. A expressão de 84 genes relacionados à atividade de células tronco foi avaliada pela técnica de transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase (RT-PCR). Resultados: Todos os genes foram expressos no Et, PN, EPS e EPP. Não houve diferença entre o PN, EPS e EPP. Não houve diferença quando as lesões de EPS e EPP foram comparadas entre si. Comparados ao Et, 24, 49 e 45 genes foram diferencialmente expressos no PN, EPS e EPP, respectivamente. Destes genes diferencialmente expressos 23 eram comuns. A análise funcional dos 23 genes evidenciou 5 genes comumente superexpressos (genes reguladores do ciclo celular; comunicação celular e marcador de células embrionárias) e 18 subexpressos (fatores de crescimento; marcadores de células neurais; marcador de auto-renovação; marcador de células embrionárias; divisão celular simétrica e assimétrica; marcadores de células hematopoiéticas; comunicação celular, via de sinalização Notch; via de sinalização Wnt; marcador de células mesenquimais; marcador metabólico e moduladores do cromossomo e da cromatina). Conclusões: Os genes relacionados à atividade de células tronco estavam expressos no endométrio tópico, nas lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda e no peritônio normal. A expressão gênica foi mais semelhante no peritônio normal e nas lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda, comparadas ao endométrio tópico. Não se observaram diferenças significantes na expressão gênica entre as lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda / Introduction: Stem/progenitor cells may contribute to the pathogenesis of endometriosis. The objective of this study was to identify and compare expression of genes regulating SPCs function in eutopic endometrium (EuE), normal peritoneum (NP) and peritonea superficial and deep infiltrative endometriosis (SE/DIE) of women with pelvic endometriosis. Methods: Twenty-four biopsies from EuE, NP, SE and DIE were obtained during laparoscopy from 6 patients. The expression of 84 stem cell-related genes was performed using a RT-PCR-based analysis. Results: All genes analyzed were expressed in the EuE, NP, SE and DIE. No difference was shown between SE, DIE and NP. There was no difference when the SE and DIE were compared to each other. Compared to EuE, 24, 49 and 49 genes were differentially expressed in the NP, SE, and DIE, respectively. Of these differentially expressed genes 23 were the same. Funcional analisis demonstrated that 5 genes were commonly overexpressed (cell cycle regulators; cell communication and embryonic cell marker) and 18 underexpressed (growth regulators; neural cell markers; self-renewal marker; embryonic cell marker; symmetric and asymmetric stem cell division; hematopoietic cell markers; cell communication; Wnt pathway; Notch pathway; mesenchymal cell marker; metabolic marker; chromosome and chromatin modulators). Conclusions: Stem cell related genes were expressed in the human endometrium, peritoneal superficial and deep endometriosis lesions and in the normal peritoneum. There was no difference when superficial and deep endometriosis were compared to each other.

Estudos têm relatado o potencial de aplicação cosmética de classes de proteínas que conferem resistência aos diferentes tipos de estresse sobre a pele. Nesse contexto, as proteínas de estresse - proteínas de choque térmico, metalotioneínas e sirtuínas - enquadram-se entre as proteínas de grande potencial no combate ao fotoenvelhecimento. Diversos extratos vegetais tem mostrado potencial de induzir uma ou mais proteínas de estresse. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos in vitro da aplicação isolada dos extratos de Anadenanthera colubrina (Angico branco), Rhodiola rosea (Rodiola), Pfaffia paniculata (Pfaffia), sobre a expressão gênica das proteínas do choque térmico (Heat shock proteins, HSP32 e HSP72), metalotioneína (MT-I) e da sirtuína isoforma SIRT1, em condição basal e mediante exposição aguda das culturas celulares à radiação UV. Como resultados de maior relevância o extrato de Anadenanthera colubrina foi capaz de modular positivamente as expressões gênicas de HSP72, SIRT-1 e MT-I, em fibroblastos sob condição basal. Já o extrato de Pfaffia paniculata foi capaz de elevar a expressão gênica de SIRT-1, em fibroblastos irradiados por UVA após incubação com o extrato vegetal e sob condição basal, além de induzir MT-I em culturas não irradiadas. Por fim, o extrato de Rhodiola rosea elevou as expressões de HSP32 e MT-I, em fibroblastos sob condição basal. Devido à capacidade indutora das proteínas de estresse pelos extratos vegetais avaliados, sugere-se que os mesmos apresentam potencial para utilização em produtos cosméticos, especialmente, com finalidade antienvelhecimento. / Studies have reported the potential for cosmetic application of proteins classes that confer resistance to different types of stress on the skin. In this context, stress proteins - heat shock proteins, metallothioneins and sirtuins - fall between the proteins of great potential in the fight against photoaging. Several plant extracts have been shown potential to induce one or more stress proteins. Thus, the objective of this study was to evaluate the in vitro effects from the isolated application of the extracts Anadenanthera colubrina (Angico-branco), Rhodiola rosea (Rodiola), Pfaffia paniculata (Fáfia) on the gene expression of heat shock proteins, HSP32 and HSP72, metallothionein (MT-I) and the sirtuin, isoform SIRT1, in basal conditions and upon acute exposure of cell cultures to UV radiation. As most relevant results, Anadenanthera colubrina extract was able to positively modulate the gene expression of HSP72, SIRT-1 and MT-I in fibroblasts under basal conditions. The Pfaffia paniculata extract was able to increase the gene expression of SIRT-1 in fibroblasts irradiated by UV after incubation with plant extract and in basal conditions, in addition to induce MT-I in non-irradiated cultures. Finally, the extract of Rhodiola rosea increased HSP32 and MT-I gene expressions in fibroblasts under basal conditions. Considering the plant extracts ability to induce stress proteins, it is suggested that they have potential for use in cosmetic products, especially, for anti-aging purposes.

As infecções humanas com Leishmania spp dão origem a um amplo espectro de manifestações clínicas que vão desde lesões tegumentares até compromisso visceral. O fenótipo da doença está intimamente relacionado com o tipo de resposta do hospedeiro mamífero à infecção do parasito e à variabilidade genética entre as espécies. Neste contexto, a identificação e caracterização de genes que regulam a virulência no fenótipo de Leishmania são essenciais para a compreensão dos mecanismos patogênicos do hospedeiro-parasita. Estudos anteriores realizados no laboratório mostraram a atenuação da virulência através da superexpressão do SL RNA em transfectantes de Leishmania (L.) major e Leishmania (V.) braziliensis em modelo murino. Para entender as mudanças fenotípicas encontradas em Leishmania (L.) major, a análise do perfil de expressão de genes permitiu identificar seis genes down-regulados e up-regulados, que poderiam contribuir individualmente com um padrão de virulência. Seis genes foram selecionados, os quais estão diferencialmente expressos entre as linhagens controle e transfectante. Para identificar genes específicos que poderiam compensar parcialmente a perda de virulência, foram analisados o fenótipo da infecção in vivo em camundongos suscetíveis. O conjunto de nossos dados sugerem que os genes estudados (LmjF 12.066 proteína fosfatase serina/treonina (PP2A); LmjF 36,5640 semelhante a ciclina; LmjF 36,4740 PIG-P (fosfatidilinositol N-acetilglucosaminil transferase - subunidade P) podem afetar negativamente a virulência de Leishmania (L.) major in vivo. Foram observadas diferenças significativas (p<0,005) entre os transfectantes contendo o vetor vazio e os transfectantes superexpressores, embora a caracterização do crescimento em condições axênicas não mostrou alterações. A localização destas proteínas superexpressas sugerem uma localização citoplasmática. Os resultados apresentados indicam que os altos níveis de expressão destes genes comparado com as linhagens controle afetam negativamente a capacidade de linhagens virulentas, induzam lesões quando são injetadas em camundongos susceptíveis. / Human infections with Leishmania spp give rise to a spectrum of clinical manifestations ranging from tegumentary lesions to a visceral disease. The phenotype of the disease isclosely related to the type of parasite mammalian host response to infection and genetic variability among species. In this context, the identification and characterization of genes that regulate virulence in Leishmania phenotype is essential to the understanding of the pathogenic mechanisms of host-parasite. Previous studies conducted in the laboratory showed attenuation the virulence due to overexpression of the SL RNA in transfectants of Leishmania (L.) major and Leishmania (V.) braziliensis in a murine model. To understand the phenotypic changes found in Leishmania (L.) major, analyzes gene expression profile allowed to identify genes over- or under-expressed that may individually contribute to the virulence pattern. Six genes were selected which are differentially expressed between the control lines and transfectant. To identify specific genes can partly compensate for the loss of virulence, were analyze the phenotype of infection in vivo susceptible mice. Our results suggest that the studied genes (LmjF. 12.0660- Serine/threonine protein phosphatase (PP2A); LmjF. 36.5640 cycline-like; LmjF. 36.4740 PIG-P (phosphatidyl inositol N-acetylglucosaminyl transferase subuni P) had a negative effect over virulence of Leishmania (L.) major in vivo. Significant differences were observed p=<0.005 between parental; transfectants with vector alone and overexpressor, although growth profile in axenic conditions has not shown any change. All the proteins were detected in the cytoplasm. The results presented here indicate that high levels of these proteins affect negatively the ability of a virulent line to induce lesions when injected in susceptible mice.

La dissertazione si propone ad analizzare la regolamentazione della televisione aperta in Brasile, cercando di capire come sono costruite e orientate le politiche pubbliche conformate da questo insieme della legislazione. Così, la dissertazione parte dal diritto in quanto oggetto di studio, ma anche in quanto un metodo per analizzare la propria regolamentazione, condividendo la comprensione che le regole subiscono determinazioni della realtà sociale allo stesso tempo in cui la influenziano. Così, intesa in quanto processo che coinvolge conflitti, la definizione delle politiche per la televisione brasiliana sarà studiata a partire da una contraddizione centrale relativa a due logiche coinvolte nella sua regolamentazione: una che dirige la fornitura del servizio al suo sfruttamento commerciale e alla centralizzazione del potere, e unaltra che concepisce i mezzi di comunicazione in quanto strumenti cruciali per la costituzione di uno spazio pubblico democratico. Per sviluppare questa analisi, sarà interessante esaminare come si organizza l\'attività economica dei mass media e le caratteristiche del suo bene più specifico e primario linformazione. Superata questa prima fase, si compierà applicare i suoi elementi al contesto brasiliano, sia nella comprensione del processo di consolidamento della televisione in quanto principale mass media sia nella valutazione dellinsieme della sua regolamentazione. La contraddizione già riferita sarà puntata nella Costituzione Federale, leggi, decreti e altri atti normativi al fine di verificare la solidità e la coerenza delle politiche pubbliche rivolte alla televisione aperta nel paese. Da questa analisi risulteranno alcune lezioni e alcuni fondamenti che potranno servire, non solo alla valutazione dello stato attuale della regolamentazione della televisione e della comunicazione nel paese, ma anche alla costruzione di modelli e alternative democratizzanti. / A dissertação visa analisar a regulação da televisão aberta no Brasil, buscando apreender como são construídas e orientadas as políticas públicas conformadas por esse conjunto da legislação. Para tanto, o trabalho parte do direito como objeto de estudo, mas também como método de análise da própria regulação, partilhando do entendimento de que as normas sofrem determinações da realidade social ao mesmo tempo em que a influenciam. Assim, compreendida como um processo que envolve conflitos, a definição das políticas para a televisão brasileira será estudada a partir de uma contradição central relativa a duas lógicas envolvidas em sua regulação: uma que direciona a prestação do serviço à sua exploração comercial e à centralização de poder, outra que concebe os meios de comunicação como instrumentos cruciais à constituição de um espaço público democrático. Para o desenvolvimento dessa análise, interessará examinar como se organiza a atividade econômica dos meios de comunicação de massa e as características de seu bem mais específico e primário a informação. Realizada essa etapa inicial, cumprirá tratar de tais elementos junto ao contexto brasileiro, tanto para compreensão do processo de consolidação da televisão como principal meio de comunicação de massa quanto para avaliação do conjunto de sua regulação. A contradição já referida será mapeada na Constituição Federal, leis, decretos e demais atos normativos com o intuito de verificar a consistência e coerência das políticas públicas voltadas à televisão aberta no país. Dessa análise resultarão algumas lições e alguns fundamentos que poderão servir, não só à avaliação do estado atual da regulação da televisão e da comunicação no país, como também à construção de modelos e alternativas democratizantes.

Submitted by Kamila Costa (kamilavasconceloscosta@gmail.com) on 2015-06-16T20:15:01Z No. of bitstreams: 1 Dissertação-Basílio J T de Souza.pdf: 853886 bytes, checksum: c1a3b3221775ec08efe9f6db34baf819 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-17T15:14:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação-Basílio J T de Souza.pdf: 853886 bytes, checksum: c1a3b3221775ec08efe9f6db34baf819 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-17T15:15:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação-Basílio J T de Souza.pdf: 853886 bytes, checksum: c1a3b3221775ec08efe9f6db34baf819 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-17T15:15:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação-Basílio J T de Souza.pdf: 853886 bytes, checksum: c1a3b3221775ec08efe9f6db34baf819 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The phenomenon pastorinha is one among the constituent expression forms of the Brazilian culture returned for the time of native and so that we obtained knowledge on him centered the focus of our research in Parintins, in Medium Amazon. In the systemization of the results of the research the proposal is to present, a priori, conceptual elements for the understanding of what come to be it referred phenomenon, of as it was built and which his/her function in the process of civilization of the human element that would be the Brazilian people, under the aegis of Jesus' Company. Done like this, through oral reports originating from of the social groups linked to the referred phenomenon in Parintins lifted his report in Medium Amazon and in consonance with the classic and other pertinent readings could build the present speech contemplating the form of as one plays the pastorinha for Brazil out and, particularly, in Parintins. Our analysis goes back to the different forms of as the Iberian woman it was seen by the glance of the Iberian cut societies, centered in the rules consuetudinárias and for the glance of the dramatic arts according to the pastoral Solemnities, between the Medium Age and Renaissance. Already in the New World, for the sexual abuses imputed the indigenous woman, for the defense of the environment, for the child's protection. / O fenômeno pastorinha é uma dentre as formas de expressão constituintes da cultura brasileira voltada para o tempo de natal e para queobtivéssemos conhecimento sobre ele centramos o foco da nossa pesquisa em Parintins, no Médio Amazonas. Na sistematização dos resultados da pesquisa a proposta é apresentar, a priori, elementos conceituais para o entendimento do que vem a ser o referido fenômeno, de como foi construído e qual a sua função no processo de civilização do elemento humano que seria o povo brasileiro, sob a égide da Companhia de Jesus. Feito assim, através de relatos orais oriundos dos grupos sociais vinculados ao referido fenômeno em Parintins levantamos o seu histórico no Médio Amazonas e em consonância com os clássicos e outras leituras pertinentes pudemos construir o presente discursocontemplando a forma de como se brinca a pastorinha pelo Brasil afora e, particularmente, em Parintins.Nossa análise se volta para as diferentes formas de como a mulher ibérica era vista pelo olhar das sociedades de corte ibéricas, centradas nas regras consuetudinárias e pelo olhar das artes dramáticas conforme os Autos pastoris, entre a Idade Média e o Renascimento. Já no Novo Mundo, para os abusos sexuais imputados à mulher indígena, para a defesa do meio ambiente, para a proteção da criança.

INTRODUÇÃO: O grau histológico é um dos principais fatores prognósticos em câncer de mama. Entretanto, os carcinomas pouco diferenciados ainda constituem um grupo bastante heterogêneo de tumores, pois podem corresponder a qualquer um dos subgrupos segundo a classificação genética: basal-símile, HER2, luminal ou mama-normal. OBJETIVOS: Neste estudo nós analisamos a freqüência dos perfis imunoistoquímicos básicos quanto à expressão de receptores de estrógeno e progesterona e HER2 em carcinomas de mama com menos de 10% de formação tubular e suas relações com fatores prognósticos clássicos e com a expressão de p63, c- Kit, EGFR, VEGF-A e citoqueratinas basais e luminais. MATERIAL E MÉTODOS: Este estudo retrospectivo incluiu 134 carcinomas de mama selecionados dos arquivos da Divisão de Patologia Cirúrgica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, de 2000 a 2003. Os tumores foram revistos e classificados quanto à expressão imunoistoquímica de receptor de estrogênio, receptor de progesterona e HER2 nos perfis luminal (receptores hormonais positivos), HER2 (HER2 positivo e receptores hormonais negativos) e triplo-negativo. O subgrupo luminal foi subdividido quanto à expressão ou não de HER2. O exame imunoistoquímico para p63, citoqueratinas basais 5, 14 e 17,VEGF-A, EGFR, c-Kit e citoqueratinas luminais 8/18 foram feitos em bloco construídos pela técnica de arranjo em matriz de amostras teciduais. As variáveis prognósticas clássicas: idade da paciente, tamanho do tumor, estado linfonodal, grau nuclear, necrose tumoral, contagem mitótica e embolização vascular linfática, foram comparadas nos diferentes subgrupos. RESULTADOS: Os carcinomas mamários invasivos pouco diferenciados confirmaram sua heterogeneidade. O subtipo luminal foi o mais freqüente (73 casos), seguido pelo subtipo triplonegativo (39 casos) e do subtipo HER2 (22 casos). O subgrupo triplonegativo apresentou a maior proporção de tumores maiores que 2,0 cm , maior freqüência de necrose e a maior taxa de expressão de citoqueratinas basais. Este subgrupo juntamente com o subgrupo HER2 expressaram maiores índices de proliferação celular. O subgrupo HER2 mostrou maior número de casos associados à presença de componente in situ e maior freqüência de detecções de embolização vascular linfática. O subgrupo luminal apresentou o maior número de casos com expressão de citoqueratinas luminais 8/18 e o menor número de tumores maiores que 2,0 cm. Quanto à expressão de citoqueratinas basais, 81 casos não as expressaram e 53 expressaram pelo menos uma delas, a maioria destes casos pertencentes ao subgrupo triplo-negativo. O fenótipo triplo-negativo esteve intimamente relacionado à expressão de citoqueratinas basais. Dentre todas as variáveis estudadas, o único fator preditivo independente associado ao perfil triplo-negativo foi a expressão de citoqueratinas basais (p<0.0001) e o único fator preditivo independente associado à expressão de citoqueratinas basais foi a presença do fenótipo triplo-negativo (p<0,0001). O subgrupo basal-símile (tumores triplo-negativo com expressão de pelo menos uma citoqueratina basal) mostrou a maior freqüência de tumores > 2,0 cm e conjuntamente com o subgrupo triplo-negativo não basal-símile, a maior freqüência de tumores com presença de necrose e com alta contagem mitótica. A comparação entre os carcinomas HER2(+) quanto à expressão de receptores hormonais mostrou maiores indicadores de atividade proliferativa no grupo de receptores hormonais (-). Por outro lado, tumores positivos para os receptores de estrógeno e/ou progesterona com o sem expressão HER2 não mostraram qualquer diferença. CONCLUSÕES: O subgrupo de tumores com receptores hormonais positivos foi o mais freqüente e com características morfológicas e imunoistoquímicas mais favoráveis que os outros subgrupos, independente da expressão de HER2, sugerindo que carcinomas de mama pouco diferenciados com expressão de pelo menos um dos receptores hormonais correspondem ao subtipo luminal B genético. Os carcinomas pouco diferenciados com imunofenótipo triplonegativo e HER2(+) são similares quanto às características morfológicas associadas à doença com potencial agressivo. No entanto, a expressão das citoqueratinas basais diferenciam os dois subgrupos, e pode sugerir o fenótipo basal-símile e o padrão de doença associado a este fenótipo. Nosso estudo mostrou que entre os carcinomas de mama pouco diferenciados de mama, o painel imunoistoquímico clássico (receptores hormonais e HER2) associado à expressão de pelo menos uma das citoqueratinas basais permitem a identificação dos distintos subtipos, equivalentes aos vistos na classificação genética / INTRODUCTION: Histological grade is one of the main prognostic factors for breast cancer. However, poorly differentiated carcinomas still make up a quite heterogeneous group of tumors since they can belong to any of the subgroups according to genetic classification: basal-like, HER2, luminal or normal breast. OBJECTIVES: In this study we have analyzed the frequency of the basic immunohistochemical profiles as for the expression of estrogen and progesterone receptors and HER2 in breast cancer with less than 10% of tubular formation, and their relation with classic prognostic factors, expression of p63, c-Kit, EGFR, VEGF-A, basal and luminal cytokeratins. MATERIAL AND METHODS: This retrospective study included 134 breast carcinomas dated between 2000 and 2003, selected from the files from the Division of Surgical Pathology, University of São Paulo Medical School. All slides were revised and classified according to immunohistochemical expression of estrogen receptor, progesterone receptors and HER2 in luminal (positive hormonal receptors), HER2 (positive HER2 and negative hormonal receptors) and triple-negative. The luminal subgroup was further divided according to expression or absence of HER2. Immunohistochemical marking for p63, cytokeratins 5, 14 and 17 and 8/18, VEGF-A, EGFR, c-Kit was done through tissue microarray. The classical prognostic variables: age, tumor size, lymph node state, nuclear grade, tumor necrosis, mitotic count and lymphatic vascular embolization were compared among the different subgroups. RESULTS: The poorly differentiated invasive breast carcinomas confirmed their heterogeneity. The luminal subtype was the most frequent (73 cases), followed by the triple-negative (39 cases) and HER2 (22 cases). The triple-negative subgroup presented the highest proportion of tumors bigger than 2.0 cm, necrosis and higher basal cytokeratin rate expression. This subgroup as well as HER2 subgroup expressed higher cellular proliferation scores. The HER2 subgroup presented the highest number of cases associated with in situ component and higher frequency of lymphatic vascular embolization detection. The luminal subgroup presented the highest expression of luminal cytokeratins 8/18 and the least number of tumors larger than 2.0 cm. As for basal cytokeratin expression, 81 cases did not present any cytokeratin at all and 53 at least one, most of them belonging to the triple-negative subgroup. The triple-negative phenotype was intimately related to the expression of basal cytokeratins. Among all the variables studied, the only independent predictive factor associated with triple-negative profile was the presence of basal cytokeratin (p<0.0001), and the only independent predictive factor associated with basal cytokeratin expression was the presence of triple-negative phenotype (p<0.0001). The basal like subgroup (triple-negative tumors with the expression of at least one basal cytokeratin) showed the highest frequency of tumors larger than 2.0 cm, and together with the non-basal like, the highest frequency of tumors with necrosis and high mitotic count. The comparison between HER2 (+) carcinomas as far as hormonal receptors, showed higher proliferative activity in the group of negative hormonal receptors. On the other hand, tumors positive for estrogen and/or progesterone receptors with or without HER2 expression did not present any difference. CONCLUSIONS: The tumor subgroup with positive hormonal receptors was the most frequent and with more favorable morphological and imunohistochemical characteristics than the other subgroups, independent of HER2 expression, suggesting poorly differentiated breast carcinomas with the expression of at least one of the hormonal receptors correspond to luminal B genetic subgroup. The poorly differentiated carcinomas with triple-negative and HER2(+) immunophenotype are similar in relation to morphological characteristics associated to the disease with aggressive potential. However, the expression of basal cytokeratins differs the two subgroups and can suggest the basal-like phenotype and the disease evolution associated with it. Our study showed that among poorly differentiated breast carcinomas, the classic immunohistochemical panel (hormonal receptors and HER2) associated with the expression of at least one of the basal cytokeratins, allow the identification of the specific subtypes, similar to the ones seen in genetic classification

A embriogênese somática é uma técnica alternativa com potencial aplicação na propagação clonal de plantas, além de ser uma excelente ferramenta para estudos básicos e análise dos eventos moleculares e bioquímicos que ocorrem durante a embriogênese vegetal. Contudo, apesar de várias pesquisas relativas a embriogênese somática, a falta de conhecimento sobre os fatores que controlam o fenômeno, comprova que existem ainda muitos pontos a serem entendidos sobre o processo. Deste modo, o presente estudo foi concebido com o intuito de estudar a embriogênese somática de duas espécies de citros, as quais apresentam diferentes graus de eficiência na produção de embriões somáticos. Inicialmente, buscou-se avaliar comparativamente o processo de embriogênese somática de duas espécies de citros, observando-se as diferenças estruturais através de análises histológicas e histoquímicas, e as diferenças na expressão do gene AtSERK1 nos calos, através de hibridização in situ. Para instalação dos experimentos, foram utilizados calos provenientes de nucelos de duas espécies, Citrus sinensis L. Osbeck, variedade Valência, e Citrus limonia Osbeck, variedade limão ‘Cravo’. Amostras de calos em meio de multiplicação, em meio de obtenção de embriões, e embriões somáticos nas diferentes fases de desenvolvimento foram coletados para observações anatômicas e histoquímicas através de microscopia óptica e realização de estudo da expressão gênica através de hibridização in situ. Com relação à morfologia, os principais resultados obtidos demonstraram que existem diferenças anatômicas e histoquímicas entre calos de limão ‘Cravo’ e ‘Valência’. Em relação à expressão gênica, os resultados evidenciaram a expressão do gene AtSERK1 em calos das duas espécies de citros, tanto em meio de multiplicação, com sacarose, como em meio de indução, com maltose, indicando que o potencial embriogênico já está instalado no calo em meio de multiplicação. Pode-se concluir também que este gene é conservado entre Arabidopsis e Citrus. Desenvolveram-se, também, experimentos para estudar os efeitos de alguns tratamentos (frio, dessecação, agrupamentos celulares) na otimização da indução e sincronização da embriogênese somática de C. sinensis, var. Valência. Neste sentido, calos nucelares de laranja ‘Valência’, procedentes do meio de multiplicação foram mantidos no mesmo meio líquido em agitador orbital a 200 rpm durante 24h e posteriormente peneirados de acordo com os tratamentos. As peneiras utilizadas apresentaram malhas de 150 µm (P1), 300 µm (P2) e 600 µm (P3). Além do efeito das peneiras também foram observados os efeitos de exposição ao frio (4 o C por quatro semanas, ausência de luz) e dessecação (27 o C, em placas de Petri na ausência de meio de cultura, seis dias, ausência de luz), sendo posteriormente mantidos em B.O.D., a 26 ± 1 o C e intensidade luminosa de 300 lux. Os resultados obtidos permitiram concluir que em relação ao desenvolvimento e produção de embriões somáticos o fator peneira foi superior ao fator estresse na freqüência embriogênica. O desenvolvimento de embriões somáticos em Citrus sinensis ocorre mais eficientemente a partir de agrupamentos celulares de tamanhos específicos. / Somatic embryogenesis is an alternative technique with potential application for clonal propagation of plants, and an excellent tool for basic studies and analysis of the molecular and biochemical events that occur during embryogenesis. However, although many studies have been done, the factors that control somatic embryogenesis are not completely understood. Thus, the present study proposes to evaluate aspects of somatic embryogenesis of two citrus species, which differ in efficiency for the production of somatic embryos. Initially, a comparison of the embryogenic process was done in terms of structural and histochemical analysis and evaluation of the expression of the gene AtSERK1 in callus cultures through in situ hybridization. For the experiments, callus cultures obtained from nucelli of two species, Citrus sinensis L. Osbeck, cv. Valencia, and Citrus limonia Osbeck, cv. Rangpur lime were used for anatomical and histochemical observations, callus samples from cultures in multiplication medium, in embryo induction medium, and somatic embryos in different stages of development were collected. Callus and embryo samples were also collected for analysis of gene expression through in situ hybridization. The anatomical and histochemical analysis showed differences between Rangpur lime and Valencia callus cultures. The in situ hybridization results evidenced the expression of the gene AtSERK1 in cultures of both citrus species, and also in both culture conditions: multiplication medium, with sucrose, and embryo induction medium, with maltose, indicating that the embriogenic potential is already installed in the callus cultures in multiplication medium. The results also lead to the conclusion that the gene is conserved between Arabidopsis thaliana and Citrus. Experiments aiming to synchronize the somatic embryogenesis formation in C. sinensis, cv. Valencia, were installed testing the effect of cold, desiccation and cell cluster size on somatic embryo formation. For that, callus cultures of ‘Valência’ sweet orange were cultivated in liquid medium in an orbital shaker, at 200 rpm, for 24h, and sieved through the following screens: 150 µm (P1), 300 µm (P2) and 600 µm (P3). The cell aggregates were then exposed to cold (4 o C, for four weeks, in the dark) and desiccation (27 o C, in Petri plates without culture medium, six days, in the dark) treatments, and cultured in incubators at 26 ± 1 o C and 300 lux of light intensity. The results lead to the conclusion that the separation of cultures in clusters of different sizes and the stress treatments were effective for synchronization and embryogenesis frequency. The size of cell clusters was the most important factor.