A doença de Chagas foi incialmente descrita em 1090 e após mais de 100 anos de investigações sobre essa doença, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos ativados no parasita durante sua adesão e invasão à célula hospedeira. Glicoproteínas de massa molecular de 85kDa localizadas na membrana do parasita foram identificadas como principais elementos responsáveis pela interação com o hospedeiro. Essas proteínas também são capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular (ECM) da célula hospedeira e esse evento parece ser crucial para modulação da adesão e invasão do parasita e consequente avanço da infecção. Embora diferentes elementos tenham sido identificados no hospedeiro como componentes da via de resposta a adesão ao parasita, as modificações induzidas pela sua ligação ao hospedeiro é ainda pouco conhecida. Modificações pós-traducionais de proteínas, incluindo a fosforilação, têm sido utilizadas por diferentes organismos na transdução de sinais extracelulares. Dessa forma, a identificação de proteínas diferencialmente fosforiladas durante a adesão de tripomastigotas de T. cruzi a ECM, fibronectina e laminina foi o objetivo dessa tese. Tripomastigotas foram incubados com ECM, fibronectina-, laminina- ou BSA- previamente aderidos em placas de cultura de células. Em seguida, os parasitas foram coletados e suas proteínas extraídas e separadas por 2D-PAGE. Os géis de eletroforese foram corados com Pro-Q Diamond (para identifiicação de proteínas fosforiladas) e posteriormente com coomassie colloidal (identificação de proteínas totais). Os spots com diferença significativa na coloração com Pro-Q Diamond (p< 0,05) foram identificados por LC-MS/MS. 54 spots foram diferencialmente fosforilados durante a adesão dos parasitas a ECM, dos quais 39 sofreram um aumento da intensidade de fosforilação e 15 uma redução. Já dos 43 spots diferencialmente fosforilados durante incubação com laminina, 16 aumentaram a fosforilação enquanto 27 sofreram redução da intensidade de fosforilação. Por fim, após incubação com fibronectina, dos 50 spots selecionados, 15 spots sofreram aumento da intensidade de fosforilação e 35 sofreram redução. Após identificação dos spots, as modificações por fosforilação/desfosforilação de proteínas de função desconhecida (hypothetical proteins), proteínas do citoesqueleto, proteínas do choque térmico (HSPs) e proteínas componentes do proteassomo do parasita foram as mais evidentes. A validação por immonoblotting de algumas proteínas identificadas indicou que a desfosforilação de proteínas do citoesqueleto junto com a fosforilação de proteínas do choque térmico são os principais eventos durante a resposta do parasita a adesão a ECM e a seus elementos. Além disso, a desfosforilação de ERK 1/2 observada indicou uma inativação dessa proteína em parasitas aderidos a fibronectina e laminina. Os resultados obtidos nessa tese sugerem uma provável relação entre modificações de proteínas do citoesqueleto e HSPs com a capacidade de internalização dos parasitas na célula hospedeira. / The Chagas disease was firstly described in 1909. After more than 100 years of investigation about this sickness much less is known about the mechanism triggered in the parasite during the adhesion and invasion to the host cell. 85kDa glycoproteins were identified as the major element responsible for the attachment to the host. In addition, these proteins are able to binding to extracellular matrix elements and host cytoskeletal proteins and it event appears to be an essential step in host cell invasion by T. cruzi. Although downstream signal modifications have been studied in host cells upon parasite binding, the molecular changes induced on the parasite by ligand binding are largely unknown. Since post-translational modification of proteins by phosphorylation is one of the most important mechanisms employed by organisms to transduce external signals, identification of proteins modified upon adhesion of T. cruzi trypomastigotes to ECM, laminin and fibronectin of the host cell was pursued. Trypomastigotes (Y strain) were incubated with ECM, laminin-, fibronectin- or BSA-coated surfaces, followed by 2D-PAGE stained with Pro-Q Diamond (phosphorylated protein detection) followed by colloidal coomassie stain (total protein identification). Proteins with significant differences in Pro-Q Diamond stain (p<0.05) were identified by LC-MS/MS. 54 spots were differentially phosphorylated during parasite adhesion to ECM, in which 39 spots have increased their phosphorylation level and 15 have decreased their phosphorylation. From the 43 spots presenting modification to the phosphorylation on incubation with laminin, 16 corresponded to cases of increase of phosphorylation and 27 to cases of dephosphorylation. After incubation with fibronectin: from the 50 spots selected, 15 corresponded to increase of phosphorylation and 35 to dephosphorylation. The results show phosphorylation/dephosphorylation modifications of unknown proteins, parasite cytoskeletal proteins (alpha and beta tubulin and paraflagellar-rod proteins), heat shock proteins and proteasome proteins. The validation by immunoblotting of proteins and their phosphorylation intensities indicates that cytoskeletal protein dephosphorylation in addition to heat shock proteins phosphorylation are the most important event during the trypomastigotes adhesion to the ECM. Looking for downstream signaling, dephosphorylation of ERK1/2 was also shown in trypomastigotes adhered to fibronectin or laminin, suggesting its inactivation. Thereby, those results suggest a possible correlation between cytoskeletal proteins and HSPs modification and the ability of parasite to internalize into host cells

A hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus (HbGp) possui estrutura oligomérica composta por 144 cadeias globínicas e 36 cadeias linkers, que não possuem heme, formando uma bicamada hexagonal. Estudos mostraram que a HbGp possui uma alta estabilidade á variação de pH e presença de agentes desnaturantes, tais como, surfactantes e ureia, a 25&deg;C. Com esses conhecimentos prévios, o presente estudo tem por objetivo avaliar a estabilidade térmica da HbGp 0,5-3,0 mg/mL, nas formas oxi-, meta- e cianometa-, em diferentes valores de pH. O efeito do SDS na estabilidade térmica da oxi-HbGp 0,5 e 3,0 mg/mL, em função do pH, será investigado também. Esses estudos foram realizados usando as técnicas de absorção óptica, dicroísmo circular (CD), espalhamento de luz dinâmico (DLS) e espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS). Os resultados de absorção óptica e CD revelam que o processo de desnaturação da oxi- e cianometa-HbGp, no pH 7,0, envolve a formação das espécies oxidadas aquo-meta-HbGp e hemicromo. O processo de desnaturação é próximo ao modelo de dois estados, com uma temperatura crítica (Tc) de 58-59 &deg;C. No pH ácido, a proteína agrega a partir de 58 &deg;C. A cinética de agregação da oxi-HbGp, no pH 7,0, é dependente da concentração de proteína e da temperatura. Os dados de DLS mostram que a meta- e cianometa-HbGp 0,5 mg/mL, pH 7,0, desnaturam a 48 &plusmn; 1 e 56 &plusmn; 1 &deg;C, respectivamente. Em pH alcalino, a proteína dissocia parcialmente antes de desnaturar, e o aumento da concentração de proteína faz aumentar o valor de Tc para a cianometa-HbGp. Dados de SAXS mostram que a oxi- e meta-HbGp, pH 7,0, desnaturam a 60 &deg;C, apresentando valores de Rg=143&plusmn;1 &Aring; e Dmax=450&plusmn;1 &Aring;, enquanto que a cianometa-HbGp se mantém estável, com valores de Rg=107&plusmn;1 &Aring; e Dmax=300&plusmn;1 &Aring;. As análises das curvas p(r) mostram uma porcentagem crescente de dodecâmero e tetrâmero em solução, em relação à fração de protreína íntegra e de subunidades maiores, com o aumento do pH e da temperatura. As análises baseadas no programa OLIGOMER são similares às baseadas na função p(r). A presença do SDS induz a dissociação da oxi-HbGp 0,5 mg/mL pH 7,0. Entretanto, com 3,0 mg/mL de proteína a dissociação é parcial, com a sobreposição dos processos de dissociação, desnaturação e agregação, com o aumento da temperatura. No pH 5,0, o SDS promove a agregação da oxi-HbGp em temperaturas menores. As constantes cinéticas de dissociação da oxi-HbGp 0,5 mg/mL, pH 7,0 aumentam de (0,53&plusmn;0,07)x10-4 s-1 para (2,1&plusmn;0,2)x10-4 s-1 na presença de 0,4 e 0,6 mmol/L de SDS a 40 &deg;C, respectivamente. Na temperatura de 42 &deg;C a constante aumenta 2,6 vezes, com 0,6 mmol/L de SDS, comparada a 40 &deg;C. A oxi-HbGp 3,0 mg/ml na presença de 0,6 mmol/L de SDS, dissocia parcialmente em tempos menores com o aumento da temperatura antes de agregar. Portanto, esses estudos mostram que a estabilidade térmica da HbGp é sensível ao aumento de pH e presença de SDS. A ordem de estabilidade térmica em pH alcalino é dado por: cianometa->oxi->meta-HbGp. Alem disso, o processo de desnaturação é governado pelo valor do pH e dependente da concentração de proteína em solução. / The extracellular hemoglobin Glossoscolex paulistus of (HbGp) has an oligomeric structure composed by 144 globin chains and 36 non globin chains (named linkers), forming a hexagonal bilayer. HbGp presents a high stability reagarding pH variation and the presence of denaturing agents, such as, for example, urea and surfactant, at 25&deg;C. In this way, the present studies aim to evaluate the thermal stability for oxy-, meta- and cyanomet-HbGp 0.5-3.0 mg/ml, at different pH values. The SDS effect on the thermal stability of oxy-HbGp 0.5 and 3.0 mg / mL is also investigated. Optical absorption, circular dichroism (CD), dynamic light scattering (DLS) and small angle X-ray scattering (SAXS) techniques were emplayed for these studies. The results based on the optical absorption and CD spectroscopies show that the denaturation process for oxy- and cyanomet-HbGp, at pH 7.0, involves the formation of oxidized species, such as aquo-met-HbGp and hemichrome. This denaturation process is very close to a two-state model, with a critical temperature (Tc) of 58-59 &deg;C. However, in the acidic pH, the aggregation of protein occurs at 58 &deg;C. The aggregation process kinetics for oxy-HbGp, pH 7.0, is dependent on the protein concentration and temperature. DLS data show that meta- and cyanomet-HbGp, 0.5 mg/mL, pH 7.0, undergo denaturation at 48 &plusmn; 1 and 56 &plusmn; 1 &deg; C, respectively. At alkaline pH, two HbGp forms undergo partial dissociation before denaturation, and at higher protein concentration, an increase of Tc values for cyanomet-HbGp is observed. SAXS results show that the denaturation of oxy-and met-HbGp occur at 60 &deg;C, presenting Rg=143&plusmn;1 &Aring; and Dmax=450&plusmn;15 &Aring;, while cyanomet-HbGp remains stable with Rg =107&plusmn;1 &Aring; and Dmax= 300&plusmn;10&Aring;, at this temperature. The p(r) curves analysis show the increase of dodecamer and tetramer percentages in solution, with increase of pH and temperature. The results using the OLIGOMER program are similar to the p(r) data analysis. For oxy-HbGp 0.5 mg/mL pH 7.0, in the presence of SDS, oligomeric dissociation before denaturation is observed. However, with 3.0 mg/ml of protein the dissociation process is slower, showing an overlap of the dissociation, denaturation and aggregation processes in the system, with increase of temperature. At pH 5.0, SDS promotes the aggregation of oxy-HbGp at lower temperatures, as compared to the absence of surfactant. The kinetic dissociation constant values for oxy-HbGp 0.5 mg/mL increase from (0.53 &plusmn; 0.07) x10-4 s-1 to (2.1 &plusmn; 0.2) x10-4 s-1, in the presence of 0.4 and 0.6 mmol/L SDS at 40 &deg; C, respectively. At 42 &deg;C the dissociation constant value increases 2.6-fold, with 0.6 mmol/L SDS, as compared to 40 &deg;C. For oxy-HbGp 3.0 mg/ml, in the presence of 0.6 mmol/L SDS, the oligomeric dissociation is smallest occurring in shorter times with increasing temperature before aggregation. Therefore, these studies show that the thermal stability of HbGp is sensitive to the pH variation and the presence of SDS. At alkaline pH, the order of thermal stability is the following: cyanomet->oxy->met-HbGp. Furthermore, the denaturation process is governed by the pH value, being dependent on the protein concentration in solution.

A MMP-2 é uma protease que está envolvida em muitos eventos fisiológicos e patológicos e que compartilha similaridades estruturais com a enzima conversora de angiotensina (ECA), de modo que os inibidores da ECA passaram a ser estudados com relação ao efeito inibitório também sobre a MMP-2. No entanto, este potencial inibitório não foi ainda testado na MMP-2 altamente purificada. Este estudo teve como objetivo investigar o potencial inibitório do captopril sobre a atividade da MMP- 2. Primeiramente, supôs-se que a dissolução do captopril poderia induzir a mudanças no pH de soluções tampão. Em segundo lugar, avaliou-se o efeito direto do captopril sobre a MMP-2 presente no plasma humano e a MMP-2 recombinante humana (rhMMP-2) produzida e purificada de E. coli. As análises de atividade in vitro incluíram zimogramas com gelatina e ensaios fluorimétricos com DQ gelatin. A solubilização do captopril reduziu significativamente o pH da solução tampão 50 mM (p<0,01) mas não alterou o pH da solução tampão 200 mM (p>0,05). Resultados de zimografia do plasma e da rhMMP-2 mostraram inibição da atividade gelatinolítica com significância estatística somente em concentrações iguais ou maiores que 4 e 1 mM de captopril, respectivamente (p<0,05). A presença de captopril nos ensaios de fluorimetria resultaram na inibição significante da atividade de rhMMP-2 somente em concentrações iguais ou maiores que 2 mM (p<0,01), enquanto a rhMMP-2 ativada com APMA apresentou inibição significativa diante de 0,5 mM de captopril (p<0,01). As concentrações de captopril efetivas em inibir a MMP-2 in vitro foram muito superiores àquelas referentes à concentração plasmática máxima encontrada no plasma humano após a administração de uma dose de 50 mg de captopril. Em conjunto nossos resultados sugerem que o captopril não parece promover inibição significativa da MMP-2 nas concentrações relatadas in vivo. Além disso, o pH das soluções tamponantes é um aspecto que requer mais atenção durante ensaios de inibição de protease in vitro. / MMP-2 is involved in many physiological and pathological processes. This protease shares structural similarities with the angiotensin-converting enzyme (ACE), and ACE inhibitors have been described to inhibit MMP-2. However, this inhibitory potential has not been tested using a highly purified MM-2 so far. This study aimed at investigating the inhibitory potential of captopril on MMP-2 activity. First it was tested whether the dissolution of captopril would induce changes in the pH of the solutions. Secondly, the direct inhibitory effect of captopril on plasma MMP-2 and on a recombinant human MMP-2 (rhMMP-2) produced and purified from E. coli was tested. The in vitro activity assays included gelatin zymography and a fluorimetric assay with DQ gelatin. Captopril solubilization significantly decreased the pH of the 50 mM Tris buffer solution (p<0.01) but did not decreased the pH of the 200 mM Tris Buffer solution (p>0.05). Zymography results of plasma and rhMMP-2 showed that inhibition of the activity only reached statistical significance >= 4 and 1 mM of captopril, respectively (p<0,05). The presence of captopril in the fluorimetric assay resulted in a significant inhibition of the rhMMP-2 activity only at concentrations >= 2 mM (p<0.01), whereas APMA-activated rhMMP-2 was inhibited by 0.5 mM of captopril (p<0.01). The captopril concentrations found to inhibit MMP-2 are several times of magnitude higher than the maximum plasma concentration after a dose of 50 mg of captopril. In conclusion, captopril does not seem to cause significant inhibition of MMP-2 in the concentrations found in vivo, and more attention has to be given to the pH of the solutions when testing protease inhibition in vitro.

A translação da regeneração pulpar com células tronco para a clinica requerirá o uso de scaffolds injetáveis. O objetivo foi estudar o comportamento de células tronco obtidas de dentes decíduos exfoliados (SHED) injetados em canais radiculares de pré-molares humanos com ápice aberto com scaffold de colágeno recombinante humano tipo I (rhC-I) e a base de nanofibras auto-organizáveis (SA). Para determinar a viabilidade e potencial de diferenciação de SHED in vitro, raízes nao instrumentadas foram posicionadas com o ápice em meio de cultura. SHED ressuspendida em rhC e SA foram injetadas nos canais (n=24, 5X105 células/mL). Os controles foram SHED e scaffolds sozinhos. Marcadores para diferenciação odontoblastica (DSPP, DMP-1 e MEPE) foram avaliados semanalmente por RT-PCR por 28 dias. Para avaliar a diferenciação odontoblástica e formação de tecido in vivo, SHED transuzida com GFP foram injetadas em canais radiculares (n=8, 106 célulass/mL) utilizando os mesmos grupos e implantadas subcutaneamente em camundongos imunodeprimidos. O controle (C+) foi um pré-molar humano extraído. Analise estatística foi feita com ANOVA (=0.05). Os marcadores de diferenciação odontoblástica aumentaram para SA e rhC-I mas nao nos controles. Crescimento de tecido pulpar-símile ( do que 60% do comprimento da raiz) foi observado em 75% dos implantes para SA e rhC-I e 0% nos controles. Analise de imunohistoquimica para GFP confirmou a origem tecidual a partir de SHED. PCNA e ensaio de TUNEL mostraram alta ativiade proliferativa e poucas células apoptóticas. Injeções de tetraciclina evidenciaram neoformação de dentina. A densidade microvascular e nomero de odontoblastos delineando a dentinta foi similar em rhC-I, SA e C+. A associação de SHED com scaffolds injetáveis foi capaz de originar um tecido pulpar capaz de produzir dentina e constitui um passo a mais frente ao objetivo de regeneração pulpar em pacientes humanos. / The translation of dental pulp regeneration with stem cells to the clinic will require the use of injectable scaffolds. The aim was to study the behavior of stem cells from exfoliated deciduous teeth (SHED) injected in the root canal of opened-apex human premolars with either recombinant human collagen I (rhC-I) or selfassembling nanofiber (SA) scaffolds. To assess in vitro SHED viability and differentiative potential, non-instrumented roots were set with the apex in culture media. SHED were mixed in rhC-I or SA and injected into canals (n=24, 5X105 cells/mL). Controls were SHED or scaffolds alone. Odontoblastic differentiation markers (DSPP, DMP-1 and MEPE) were assessed weekly by RT-PCR for 28 days. To evaluate odontoblast differentiation and tissue formation in vivo, SHED transduced with GFP were injected in canals (n=8, 106 cells/mL) using same groups and implanted subcutaneously in immunodeficient mice. Positive control (C+) was extracted premolar. Statistic was done with ANOVA (=0.05). Odontoblastic differentiation markers increased in SA and rhC-I but not in controls. Pulp-like tissue growth ( than 60% of root length) was observed in 75% of implants for SA and rhC-I and 0% in controls. GFP staining confirmed SHEDs tissue origin. PCNA staining and TUNEL assay showed high proliferative activity and few apoptotic cells. Tetracycline injections showed newly formed dentin. Microvessel density and odontoblastic-like cell number lining dentin were similar in rhC-I, SA and C+. Injectable scaffolds and SHED allowed for the engineering of a pulp-like tissue and constitute one step forward towards the goal of dental p ulp regeneration in human patients.

O câncer de mama é importante problema de saúde pública. O microambiente onde as células cancerígenas se encontram possui moléculas como a laminina e seus peptídeos bioativos, que influenciam a biologia tumoral. Estudo anterior realizado no laboratório demonstrou que o peptídeo C16, derivado da laminina, aumenta a expressão gênica de GPNMB e SPOCK1. Nesse trabalho, demonstramos que o peptídeo C16 aumentou níveis moleculares de GPNMB e SPOCK em células malignas MDA-MB-231e MCF-7, comparado com células normais MCF-10A. C16 estimulou significantemente a invasão de células MDA-MB-231. Silenciamento de GPNMB diminuiu a invasão celular desencadeada por C16. Contextualizando in vivo nossos resultados in vitro, imunohistoquímica em tissue microarrays mostrou que a presença de GPNMB e SPOCK é significantemente maior em câncer de mama. Assim, C16 regula os níveis de GPNMB e SPOCK em células mamárias malignas. C16 e GPNMB cooperam regulando a invasão de células MDA-MB-231. GPNMB e SPOCK foram mais detectados em câncer de mama comparado com mama normal. / Breast cancer is an important public health. The microenvironment in which cancer cells are found contains molecules such as laminin and its bioactive peptides that influence tumor biology. Previous study conducted in the laboratory showed that the C16 peptide derived from laminin, increases the gene expression of GPNMB and SPOCK1. In this work, we demonstrate that the C16 peptide increased molecular levels of GPNMB and SPOCK in malignant cells MDA-MB-231e MCF-7 cells compared with normal cells MCF-10A. C16 significantly stimulated invasion of MDA-MB-231 cells. GPNMB silencing decreased cell invasion triggered by C16. Contextualizing in vivo our in vitro results, tissue microarrays immunohistochemistry showed that the presence of GPNMB and SPOCK are significantly higher in breast cancer. Thus, C16 regulates the levels of GPNMB and SPOCK in malignant breast cells. C16 and cooperate GPNMB regulating the invasion of MDA-MB-231 cells. SPOCK and GPNMB were more detected in breast cancer compared to normal breast.

O câncer de próstata é o segundo câncer mais freqüentemente diagnosticado em homens. Durante o crescimento tumoral, as células neoplásicas interagem com a matriz extracelular (MEC). Analisamos o efeito de C16, peptídeo derivado da clivagem da MEC, sobre a migração, invasão e regulação dos invadopódios em células de câncer de próstata (DU145). Ensaios de migração e invasão demonstraram que C16 promoveu um aumento da atividade migratória e invasiva de células DU145 de maneira dose dependente. Demonstramos que o peptídeo estimula a fosforilação de Src. Ensaios de degradação em substrato fluorescente mostraram que C16 promoveu a formação de invadopódios de células DU145. O immunoblot nos revelou que este peptídeo também estimula a expressão de Tks4, Tks5, cortactina e MT1-MMP. C16 estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, importantes para o fenótipo invasivo das células tumorais. Nossos resultados sugerem que o peptídeo C16 regula migração, invasão, invadopódios e suas moléculas-chave e a geração de espécies reativas de oxigênio em células DU145. / Prostate cancer is the second most frequently diagnosed cancer in males. During tumor growth, neoplastic cells interact with the extracellular matrix (ECM) Our Laboratory has demonstrated that peptides derived from ECM cleavage are involved in migration, invasion and invadopodia formation in different tumor cell lines. Invadopodia activity depends on expression of the proteins Tks4, Tks5, cortactin, MT1-MMP, as well as reactive oxygen species (ROS) generation. Migration and invasion assays in chemotaxis chambers demonstrated that C16 increased migration and invasion activities of DU145 cells in a dose-dependent manner. We observed that the peptide stimulated phosphorylation of Src. Fluorescent substrate degradation assay showed that C16 increased invadopodia activity of DU145 cells. Immunoblot revealed that this peptide stimulated Tks4, Tks5, cortactin and MT1-MMP expression. Furthermore, C16 increased ROS production. Our results strongly suggested that C16 regulates migration, invasion, invadopodia key-molecules, and ROS generation in DU145 cells.

Sabendo que o aumento da pressão arterial (PA) é importante no desencadeamento de uma resposta inflamatória e alterações estruturais como forma adaptativa, a hipótese desse estudo é a de que o treinamento aeróbio (TA) pode causar um remodelamento glomerular benéfico e agir sobre a expressão de citocinas inflamatórias. Para responder a esta hipótese, foram considerados como objetivos: 1) Avaliar se o curso temporal do TA leva a melhora morfológica; 2) Avaliar a expressão de marcadores inflamatórios no curso temporal do TA. Foram usados ratos machos normotensos (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR). Os animais foram divididos em quatorze grupos, entre hipertensos e normotensos, treinados e sedentários. As avaliações de teste de esforço máximo (TEM) foram feitas nas semanas 0, 6 e 12, de forma a avaliar o desempenho físico e a permitir ajustar o protocolo de TA. Nos períodos das semanas 0, 1, 2, 4, 8 e 12, grupos de animais foram submetidos à cateterização da artéria femoral para a medida de PA e frequência cardíaca (FC). Em seguida, os animais foram eutanasiados e os rins foram coletados para análise histológica, usando as técnicas: Ácido Periódico de Schiff (APS) e Picrossirius, e detecção por imunohistoquímica (IHQ) de marcadores inflamatórios (IL-1?, IL-6). Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente comparando-se os grupos por análise de variância (ANOVA) Fatorial, complementada por teste post hoc de Bonferroni. Para todas as análises foi adotado o nível de significância de p<=0,05. Tanto SHR quanto WKY apresentaram melhora no desempenho físico. Ao final do TA, somente os SHR apresentaram queda de pressão arterial média (PAM) e tanto SHR quanto WKY apresentaram queda de FC. A análise morfométrica glomerular mostrou que o TA induziu um aumento da área do glomérulo no WKY, e um aumento da área da cápsula de Bowman e da área do glomérulo no SHR. Também observamos diminuição na deposição de fibras de colágeno, proteoglicanos, IL-1? e IL-6 glomerulares, induzida pelo TA. Concluindo, os dados indicam que o TA induziu um remodelamento glomerular benéfico e uma redução na expressão de IL-1? e IL-6 nos animais hipertensos, o que possivelmente está associado à queda de PAM observada / Considering that the increase in blood pressure (BP) is an important trigger for inflammatory response and structural changes as adaptive way, the hypothesis of this study is that aerobic training (TA) may induce a beneficial glomerular remodeling and act on the expression of inflammatory cytokines. To address this hypothesis, we considered the following objectives: 1) to assess the time course of TA that leads to morphological improvement, 2) evaluate the expression of inflammatory markers in the temporal course of TA. We used male normotensive (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR). The animals were divided into fourteen groups, among hypertensive and normotensive trained and sedentary. Evaluations of maximum effort test (TEM) were taken at weeks 0, 6 and 12, in order to evaluate the physical performance and permit adjustments in the protocol of TA. At weeks 0, 1, 2, 4, 8 and 12, the rats underwent femoral artery catheterization for measurement of BP and heart rate (HR). After then, the animals were euthanized and kidneys were collected for histological analysis, using the techniques of periodic acid-Schiff (APS) and picrosirius, and detection by immunohistochemistry (IHC) of inflammatory markers (IL-1? and IL-6). The results were statistically evaluated by comparing the groups by analysis of variance (ANOVA) Factorial, complemented by Bonferroni\'s post hoc test. For all analyzes was adopted significance level of p <= 0.05. Both SHR as WKY showed improvement in physical performance. At the end of the TA, only SHR decreased mean arterial pressure (MAP), when both SHR and WKY decreased HR. The glomerular morphometric analysis revealed that TA induced an increase in the glomerular area in WKY and an increase in the area of Bowman\'s capsule and of glomerulus in SHR. We also observed a decrease in the deposition of collagen fibers and proteoglycans in glomerulus, and IL-1? and IL-6 IHQ staining in glomerulus induced by TA. In conclusion, our data suggests that TA induces a beneficial glomerular remodeling and a reduction in the glomerular expression of IL-1? and IL-6 in hypertensive animals, which is possibly associated with the reduction observed in MAP

Introdução: A disfunção neurogênica do trato urinário inferior (DNTUI) é comum, tendo como causa diversas doenças neurológicas e se apresentando de maneira diversa e heterogênea. O tratamento da DNTUI pode incluir medicamentos, utilização de toxina botulínica intravesical e tratamento cirúrgico. A cirurgia de ampliação vesical é uma alternativa consagrada, usada principalmente no caso de bexigas fibrosadas ou em pacientes refratários ao tratamento conservador ou minimamente invasivo. Os mecanismos que levam à progressão da fibrose vesical e à refratariedade aos tratamentos conservadores nessa população de pacientes não são bem conhecidos. Objetivos: Avaliar a expressão gênica dos fatores relacionados à hipóxia e fibrose nos pacientes com DNTUI e correlacionar o padrão de expressão gênica com as características urodinâmicas dos pacientes estudados. Métodos: Foram avaliados prospectivamente 17 pacientes com DNTUI que foram submetidos à cirurgia de ampliação vesical pelo Departamento de Urologia do HCFMUSP. Os pacientes foram avaliados de acordo com os sintomas clínicos, exames laboratoriais e avaliação urodinâmica completa. Durante a cirurgia foi obtido um fragmento vesical interessando todas as camadas da bexiga para análise de expressão gênica com utilização de qRT-PCR de MMP-1, TIMP-1, HIF1alfa, HIF2alfa, HIF3alfa, iNOS, eNOS, VEGF e CTGF. Amostras vesicais de 9 doadores cadavéricos foram utilizados como controles. Resultados: A média dos pacientes estudados foi de 37,5 anos, com complacência vesical variando entre 3,8 e 50 ml/cmH20, com média de 11,16ml/cmH20. Os pacientes apresentaram superexpressão estatisticamente significativa de TIMP-1 e HIF3alfa e subexpressão estatisticamente significativa de MMP-1. A expressão gênica de HIF1alfa e HIF2alfa também apresentou uma tendência à superexpressão, apesar de não ser estatisticamente significativa (p = 0,14 e p = 0,11). Os outros genes avaliados foram expressos de forma heterogênea. Conclusão: Em pacientes com DNTUI associados a fibrose vesical e/ou refratariedade ao tratamento conservador, que foram submetidos à cirurgia de ampliação vesical, os fatores relacionados ao aumento da deposição da matriz extracelular e à hipóxia parecem ser relevantes na progressão da disfunção vesical. Esse achados são compatíveis com estudos em modelos animais de obstrução infravesical e hipóxia e reforçam a necessidade de estudos complementares para o melhor entendimento da fisiopatologia da progressão da disfunção vesical na DNTUI / Introduction: The neurogenic lower urinary tract dysfunction (NLUTD) is a common complication of a variety of neurological diseases and can present itself in a diverse and heterogeneous way. NLUTD can be treated with anticholinergic or alfa3 agonists drugs, intravesical botulinum toxin and/or surgical treatment. The bladder augmentation surgery is a classic alternative, used mainly in cases of fibrotic bladders or in patients with refractory symptoms with conservative treatment. The mechanisms that lead to the progression of bladder fibrosis and to conservative treatments failure are not well known. Objectives: To evaluate the expression of fibrosis and hypoxia related genes in patients with NLTUD and correlate the pattern of gene expression with urodynamic data of the population studied. Methods: We analyzed bladder specimens of 17 patients with NLUTD undergoing bladder augmentation surgery due to bladder fibrosis or conservative treatment failure. Urodynamic tests were performed in all patients. A bladder fragment was obtained during surgery for relative gene epression with quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) of MMP-1, TIMP-1, HIF1alfa, HIF2alfa, HIF3alfa, iNOS, eNOS, VEGF e CTGF. 9 cadaveric organ donors composed the control group. Results: The mean age of the patients was 37.5 years. Bladder compliance ranged form 3,8 to 50 ml/cmH20, with a mean of 11,16 ml/cmH20. Patients undergoing bladder augmentation surgery presented a statistically significant overexpression of TIMP-1 and HIF3alfa. MMP-1 was statistically significant underexpressed. The gene expression of HIF1alfa and HIF2alfa also showed a tendency to overexpression, although it was not statistically significant (p = 0,14 and p = 0,11). The other genes were expressed heterogenously. Discussion: In patients with NLUTD associated with bladder fibrosis and/or failure to conservative treatment, the gene expression of factors related to increased extracellular matrix deposition and hypoxia appears to be relevant in the progression of bladder dysfunction. These findings are comparable with studies in animal models of bladder oulet obstrucion and hypoxia and reinforces the need for complentary studies to better understand the pathophysiology of the progression of bladder dysfunction in the NLTUD

A endometriose é uma doença de origem multifatorial, caracterizada por presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina, responsável por sintomas álgicos com grande impacto na qualidade de vida da paciente, além de ser um dos principais fatores de infertilidade. Muitos estudos já foram realizados no intuito de explicar a etiopatogenia da endometriose, assim como muito tem sido estudado para encontrar novas estratégias de tratamento. Várias linhas de medicamentos têm sido estudadas com este intuito, agindo em diferentes pontos da etiopatogênese da doença, uma delas na inibição de metaloproteinases da matriz extracelular, que tem papel no remodelamento do mesotélio do peritônio e angiogênese. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência de uma droga (doxiciclina) de baixo custo, com ação conhecida na inibição das metaloproteinases, em endometriose peritoneal induzida em ratas. Para isso, foram usadas 30 ratas adultas Wistar com lesão induzida de endometriose, divididas em três grupos, um grupo controle (C, n=10) sem tratamento, um grupo onde foi administrado doxiciclina em baixa dose (BD, n=10) e um grupo onde foi realizado doxiciclina em alta dose (AD, n=10). Foi realizada avaliação da área das lesões de cada rata e estudo imunohistoquímico para positividade de anticorpo primário de metaloproteinase de matriz 9 (MMP9) e de inibidor de metaloproteinase de matriz 2 (TIMP2). A doxiciclina atuou reduzindo a área das lesões nos grupos BD e AD (p=0,0052) em relação ao grupo C e reduzindo a expressão do TIMP2 no grupo AD (p=0,0009) em relação aos grupos BD e C. Não houve resultado significativo na expressão da MMP9. / Endometriosis is a multifactorial origin disease, characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity, responsible for painful symptoms with important impact on the life quality of the patient, besides being one of the main factors of infertility. Many studies have already been carried out to explain the etiopathogenesis of endometriosis, and much has been studied to find new treatment strategies. Several lines of drugs have been studied for this purpose, acting at different points in the etiopathogenesis of the disease, one of them in the inhibition of extracellular matrix metalloproteinases, which plays a role in the remodeling of the peritoneum mesothelium and angiogenesis. The purpose of this study was to evaluate the influence of a low-cost drug (doxycycline), with known action on the inhibition of metalloproteinases, in induced peritoneal endometriosis in rats. Thirty adult Wistar rats with endometriosis-induced lesions were divided into three groups: one untreated control group (C, n = 10), one group receiving low dose doxycycline (BD, n = 10) and a group where high dose doxycycline (AD, n = 10) was performed. An evaluation of the lesion area of each rat and immunohistochemical study for primary antibody to matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and matrix metalloproteinase inhibitor 2 (TIMP2) was performed. Doxycycline worked by reducing the area of lesions in the BD and AD groups (p = 0.0052) in relation to the C group and reducing the expression of TIMP2 in the AD group (p = 0.0009) in relation to the BD and C groups. There was no significant effect on MMP9 expression in the present study.

RALFs são peptídeos hormonais de aproximadamente 5kD que regulam negativamente o alongamento celular. Dentre suas atividades biológicas, a alcalinização do meio extracelular e a inibição do alongamento celular são tidas como associadas, pois a acidificação do meio extracelular é necessária para a expansão celular. A atividade de alcalinização e a de inibição do crescimento são medidas em dois ensaios distintos: o ensaio de alcalinização do meio extracelular de células em suspensão e o ensaio do crescimento de raiz primária de plantas jovens. Buscando-se fazer ambas as avaliações da inibição da expansão celular e da alcalinização em um único modelo de estudo, tomou-se como medida da expansão celular o volume das células decantadas (VCD). Quando o tampão MES ou o pré-tratamento com \"Fusicoccin\" foi utilizado para se atenuar o efeito de alcalinização do AtRALF1, verificou-se que o efeito de inibição do alongamento celular não sofreu alteração. Em arabidopsis são encontrados nove peptídeos RALF, que apresentam alta similaridade com o RALF original de tabaco. Com exceção do AtRALF4, todos são capazes de alcalinizar o meio extracelular e inibir raízes. A comparação da estrutura primária do AtRALF4 com os demais RALFs mostra que poucos resíduos são distintos entre eles, sugerindo que estes possam ser os determinantes das atividades de inibição e alcalinização. A alteração de um destes resíduos, AtRALF4(N92A), é capaz de restaurar a capacidade do AtRALF4 de inibir as raízes sem, no entanto, recuperar a atividade de alcalinização. Quando três outros resíduos exclusivos do AtRALF4 foram substituídos pelos seus correspondentes do AtRALF1, observa-se uma restauração parcial da alcalinização, desta vez, sem alterar a capacidade de inibir as raízes. Recentemente, foi mostrado pelo nosso grupo que o peptídeo AtRALF1 induz a expressão de genes relacionados ao rearranjo da parede celular. Quando verificado por PCR quantitativa, contatou-se que somente os peptídeos mutantes que apresentam atividade de inibição do crescimento são capazes de promover uma indução semelhante. Ainda, utilizando gel indicador de pH, verificou-se que plantas transgênicas super-expressando AtRALF1 (35S:AtRALF1) acidificam o meio durante seu crescimento de maneira semelhante a plantas selvagens. O peptídeo de defesa AtPEP1, a exemplo dos peptídeos RALF, também promove a alcalinização do meio extracelular. A utilização de drogas para reproduzir ou atenuar o efeito de alcalinização promovido por este peptídeo sugere que a expressão dos genes responsivos a AtPEP1 também não está relacionada à alteração na atividade das próton-ATPases. Finalmente, quando mutantes para ambos os receptores de AtPEPs foram utilizados (atpepr1/r2) em gel indicador de pH, verificou-se que estes alcalinizam o pH da rizosfera na presença do peptídeo. Nossos dados somados sugerem uma dissociação das atividades biológicas de alcalinização do meio extracelular e de inibição da expansão celular. A alteração na atividade das próton-ATPases pode não ser apenas uma mensagem secundária do efeito biológico, mas sim outra fonte de informação independente e ainda pouco explorada como tal. / RALFs are 5kD peptide hormones that negatively regulates cell expansion. Among the biological activities of the RALF peptide, the extracellular alkalinization and cellular expansion inhibition were previously suggested to be associated, once the extracellular acidification is required to cell expansion. Usually, the alkalinization and cell expansion inhibition activities are evaluated in two different assays, the cell suspension medium alkalinization and the plantlet root growth inhibition. We manage to set an assay in which both cell expansion inhibition and extracellular alkalinization activities could be evaluated. Using the package suspension cell volume through decantation as a value of cell expansion, we evaluated the relation between alkalinization and cell expansion inhibition in different conditions. When the MES buffer or the pre-treatment with Fusicoccin was used to arrest the AtRALF1 extracellular alkalinization, the package cell volume inhibition activity was not affected. There are 9 RALF peptides encoded in arabidopsis plants that are closely related with the first isoform isolated from tobacco. With exception of the AtRALF4, all those isoforms are able to alkalinize the extracellular medium and arrest root growth. Comparing the AtRALF4 with other eight isoforms, we verified that are few different amino acids between them, suggesting that those amino acids could be essential for the biological activities. The rescue of one of those amino acids, AtRALF4(N92A), was able to regain the root growth inhibition activity of the AtRALF4 peptide, although the extracellular alkalinization activity was not restored. When three other AtRALF4 amino acids were substituted by their AtRALF1 correspondent, there is a partial rescue of the extracellular alkalinization activity, but no alterations in the root growth inhibition. We had recently shown that the AtRALF1 peptide induces the expression of genes related to cell wall rearrangement. The quantitative PCR analyses demonstrates that only the mutant peptides that are able to arrest root growth are also able to induce the gene expression. When submitted to a pH indicator, it was verified that AtRALF1 overexpressing plants acidifies it during its growth, as much as wild type plants.The defense peptide AtPEP1, similarly of AtRALF1, also triggers extracellular alkalinization. The use of proton-pump chemical modulators to simulate or arrests AtPEP1 extracellular alkalinization activity suggests that the gene expression of the AtPEP1-responsive genes is not related to changes in plasma membrane proton pump activity. Finally, when double mutants for both the AtPEP1 receptors (atpepr1/r2) were submitted to a pH gel indicator, it was seen that they alkalinize the rhizosphere pH in the presence of the AtPEP1 peptide. Our data suggests that the extracellular alkalinization and arrest of cell expansion activities are dissociated. The proton pump modulation activity may not be only a secondary messenger, but another source of information independent and yet to be explored.