Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-19T17:34:45Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 672894 bytes, checksum: 1244927f20e5eed71f3171916884e265 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-19T17:34:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 672894 bytes, checksum: 1244927f20e5eed71f3171916884e265 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Botrytis cinerea, o agente etiológico do mofo cinzento, é um patógeno importante em morangueiros. Clonostachys rosea é efetivo no biocontrole dessa doença em diversas culturas, em condições controladas e de campo. O antagonista pode, ainda, promover o crescimento, aumentar a produção e induzir respostas de defesa nas plantas. Objetivando-se investigar os efeitos da aplicação do antagonista na população do patógeno e no metabolismo da planta, estudou-se a interação entre C. rosea, B. cinerea e morangueiros com base na dinâmica populacional dos fungos e no perfil metabólico do hospedeiro. Avaliou-se a colonização foliar de ambos os fungos e a sobrevivência epifítica de C. rosea em folhas, em câmara de crescimento e em cultivos comerciais. O antagonista se estabeleceu e reduziu a colonização por B. cinerea, principalmente quando aplicado semanalmente. A população de C. rosea diminuiu com o tempo após a aplicação, e a intensidade de colonização pelo patógeno foi inversamente proporcional à do antagonista. Em câmara de crescimento, a população epifítica do antagonista reduziu-se substancialmente aos 3 dias da aplicação. Em condições de campo, onde o intervalo mínimo entre a última aplicação e coleta de folhas foi de 7 dias, não foi possível quantificar a população epifítica do antagonista. Comparou-se o perfil metabólico de morangueiros tratados com C. rosea em intervalos de 7, 14 ou 28 dias ao de morangueiros não tratados, e verificou-se que a aplicação semanal alterou o perfil metabólico. Aumentos significativos nos níveis de citrato e succinato, compostos intermediários do ciclo de Krebs, de alguns fitoesteróis, fitoestrogênios, cafeína e piceatanol foram observados. Tais alterações podem estar relacionadas à promoção de crescimento e ativação do sistema de defesa. Concluiu-se que C. rosea afetou a dinâmica populacional de B. cinerea em tecidos assintomáticos e alterou o perfil metabólico de morangueiros. Esses resultados subsidiam estudos subsequentes para elucidar o modo de ação de agentes de biocontrole. / Botrytis cinerea, the causal agent of gray mold, is an important pathogen of strawberry plants. Clonostachys rosea is effective in the biocontrol of gray mold in several crops, in growth chamber or field conditions. The antagonist may also promote growth, increase the production and induce defense responses of plants. Aiming to investigate the effects of antagonist application on pathogen population and plant metabolism, we studied the interaction of C. rosea, B. cinerea and strawberry plants based on the population dynamics of both fungi and metabolic profile of the host. We assessed leaf colonization of both fungi and the epiphytic survival of C. rosea on leaves, under growth chamber and in commercial cultivations. The antagonist established in leaves and reduced the colonization by B. cinerea, mainly when applied weekly. The population of C. rosea decreased over time after the application and tissue colonization by the pathogen was inversely proportional to the colonization by the antagonist. Under growth chamber the antagonist population was substantially reduced 3 days after applied. Under field conditions, which the minimal interval between last application and the collection of leaves was 7 days, it was not possible to quantify the epiphytic population of the antagonist. We compared the metabolic profiles of strawberry plants treated with C. rosea at intervals of 7, 14, or 28 days with the profiles of untreated plants, and found that weekly applications altered the metabolic profiles. There was a significant increase in the levels of citrate and succinate, intermediate compounds in the Krebs cycle, some phytosterols, phytoestrogens, caffeine, and piceatannol. These changes may be related to growth promotion and activation of plant defense system. In conclusion, C. rosea affected the population dynamics of B. cinerea in symptomless tissues and changed the metabolic profile of strawberry plants. These results can support subsequent studies aiming to elucidate the action mode of biocontrol agents.

Orientador: Angélica Zaninelli Schreiber / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SilvaFonseca_AdenilzaCristinada_M.pdf: 2857134 bytes, checksum: 9329779ba094b04efc1a51c3932a5dfd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Introdução: Mucormicose é uma infecção oportunista invasiva causada por fungos filamentosos denominados de Mucorales, antes Zygomycetes, de difícil tratamento e, com mau prognóstico em pacientes imunocomprometidos, caracterizada por manifestações rinocerebrais, pulmonares ou disseminadas. Espécies dos gêneros Rhizopus, Mucor, Absidia (Lichtheimia) e Rhizomucor, são os Mucorales mais isolados de pacientes. São micro-organismos resistentes a voriconazol e equinocandinas in vitro e in vivo. A terapia inclui a reversão dos fatores predisponentes, retirada cirúrgica da área infectada e administração de antifúngicos, em geral, anfotericina B, de atividade terapêutica limitada e muitos efeitos colaterais. Objetivos: Identificação dos isolados de Mucorales selecionados para o estudo por metodologia clássica e técnicas moleculares; padronização da técnica de microdiluição em caldo para avaliação de suscetibilidade aos antifúngicos isolados: anfotericina B; 5-fluorocitosina; fluconazol; micafungina; itraconazol; voriconazol; miconazol e terbinafina de outros gêneros de Mucorales que não Rhizopus spp.; avaliação da Concentração Inibitória Fracional para determinação do tipo de interação que ocorre entre as combinações de antifúngicos anfotericina B x itraconazol; anfotericina B x voriconazol; terbinafina x itraconazol; terbinafina x voriconazol e terbinafina x anfotericina B; padronização da metodologia de avaliação dinâmica de crescimento para o gênero Rhizopus sp. e Rhizopus oryzae (LIF 1832), para possível estabelecimento de correlação clínico-laboratorial já que este foi isolado de um paciente em tratamento de mucormicose. Metodologia: Estudo realizado com 10 isolados clínicos de Mucorales com identificação morfológica prévia de gênero. A identificação molecular foi realizada com os iniciadores ITS1/ITS4; ITS4/ITS5 e NL1/NL4. Os testes de suscetibilidade aos antifúngicos isolados, in vitro, foram realizados pelo método de microdiluição em caldo (CLSI M38-A2). Os antifúngicos combinados foram analisados de acordo com a metodologia do "tabuleiro de xadrez". Já a avaliação dinâmica de crescimento de hifas frente aos antifúngicos anfotericina B, itraconazol e terbinafina para o isolado Rhizopus oryzae (LIF 1832) foi realizada através do sistema Biocell-Tracer?. Resultados: As identificações morfológica e molecular foram discordantes para os isolados LIF 1237 e 1832, classificados morfologicamente como Absidia (Lichtheimia) sp. e Rhizomucor sp. e identificados como Rhizopus oryzae após sequenciamento de DNA. Considerando todos os isolados, as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) foram de: 8 a ? 16 µg/mL para micafungina, de 0,25 a 8 µg/mL para anfotericina B, ? 64 µg/mL para 5-fluorocitosina, de 16 a ? 64 µg/mL para fluconazol, de 1 a > 8 µg/mL para itraconazol, > 8 µg/mL para voriconazol; de 0,25 a 4 µg/mL para miconazol e de 0,031 a > 128 µg/mL para terbinafina. As interações resultantes da combinação de antifúngicos foram de: 100% de sinergismo entre anfotericina B x voriconazol e anfotericina B x itraconazol; 90% de sinergismo entre terbinafina x itraconazol; 80% de sinergismo entre terbinafina x voriconazol e 100% de sinergismo para a combinação de terbinafina x anfotericina B. As taxas de inibição de crescimento das hifas do isolado Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente aos valores de CIMs obtidos pelo método de microdiluição em caldo foram: 88.25% para anfotericina B; 0% para itraconazol e 98,70% para terbinafina. O teste com a combinação de concentrações séricas de itraconazol e terbinafina resultaram em 49,8% de taxa de inibição. Conclusões: Foi observada divergência entre identificação morfológica e molecular para dois isolados. Perfis diferentes de sensibilidade aos antifúngicos foram observados dependendo das espécies. Os antifúngicos mais ativos contra a maioria dos isolados foram anfotericina B e itraconazol. Valores de CIM bem baixos para terbinafina foram observados para Cunninghamella bertholletiae e Syncephalastrum racemosum e todos os isolados foram altamente resistentes a micafungina, 5-fluorocitosina, fluconazol e voriconazol. Os testes de antifúngicos combinados mostraram redução da CIM dos antifúngicos em associação. CIMs elevadas para terbinafina foram observadas para os isolados de R. oryzae e R. stolonifer enquanto que no teste de combinação valores baixos de CIMs foram encontrados, o que ressalta a importância da combinação de antifúngicos no manejo de mucormicose. A taxa de inibição do crescimento das hifas para o isolado LIF 1832 frente aos antifúngicos isolados sugere que hifas podem ser mais suscetíveis que esporos frente aos antifúngicos avaliados. Apesar de não muito alta, a taxa de inibição de crescimento das hifas frente à anfotericina B e à combinação das concentrações séricas de terbinafina e itraconazol pode estar favoravelmente relacionada ao desfecho clínico do paciente em tratamento de mucormicose / Abstract: Introduction: Mucormycosis is an invasive opportunistic infection caused by filamentous fungi called Mucorales (formerly Zygomycetes), difficult to treat, and with poor prognosis in immunocompromised patients, characterized by rhino-cerebral, pulmonary or disseminated manifestations. Species of the genera Rhizopus, Mucor, Absidia (Lichtheimia) and Rhizomucor are the Mucorales most commonly isolated from patients and show resistance to voriconazole and echinocandins in vitro and in vivo. Therapy includes to reverse predisposing factors, surgical removal of the infected area and administration of antifungal agents, in general, Amphotericin B, with limited therapeutic activity and many side effects. Objectives: identification of selected Mucorales isolates by morphological and molecular methods; standardization of broth microdilution for antifungal susceptibility assessment of other Mucorales genera except Rhizopus to the alone antifungals: amphotericin B, fluorocytosine, fluconazole, Itraconazole, voriconazole ; miconazole and terbinafine; establish Fractional Inhibitory Concentration to determine the type of interaction that occurs between combinations of Amphotericin B/Itraconazole; Amphotericin B/Voriconazole; Terbinafine/Itraconazole; Terbinafine/Voriconazole and Terbinafine/Amphotericin B; standardization of the dynamic growth methodology for evaluation Rhizopus sp. and study of isolate Rhizopus oryzae (LIF 1832), for possible establishment of clinical-laboratory correlation this was isolated from a patient undergoing treatment for mucormycosis. Material and Methods: This study evaluated 10 clinical Mucorales isolates with previous morphological gender identification. The molecular identification was performed with primers ITS1/ITS4; ITS4/ITS5 and NL1/NL4. The antifungal susceptibility in vitro was performed by broth microdilution method (CLSI M38-A2). Antifungal combinations were analyzed according to the "chessboard" methodology . The dynamic evaluation of hyphal growth for the isolate Rhizopus oryzae (LIF 1832) for the antifungals amphotericin B, terbinafine and itraconazole, was carried through the BioCell-Tracer system. Results: The morphological and molecular identifications were discordant for LIF 1237 and LIF 1832 isolates, classified morphologically as Absidia (Lichtheimia) sp. and Rhizomucor sp. and after DNA sequencing both as Rhizopus oryzae. Considering all isolates, the minimum inhibitory concentrations (MICs) were 8 to ? 16 µg/mL for Micafungin; from 0.25 to 8 µg/mL for Amphotericin B , ? 64 µg/mL for 5 ¿ Fluorocytosine; of 16 to ? 64 µg/mL for Fluconazole; 1 to > 8 µg/mL for Itraconazole; > 8 µg/mL for Voriconazole ; 0.25 to 4 µg/mL for Miconazole and from 0.031 to > 128 µg/mL for Terbinafine. Interactions resulting from the combination of antifungals were: 100% synergism for Amphotericin B/Voriconazole and Amphotericin B/Itraconazole; 90% synergism between Terbinafine/Itraconazole; 80% synergism between Terbinafine/Voriconazole and 100% synergism for the combination Terbinafine/ Amphotericin B. The hyphae growth inhibition rates obtained for microdilution method MIC values for Rhizopus oryzae (LIF 1832) were 88.25%, for Amphotericin B; 0% for itraconazole and 98.70% to terbinafine. Combined Itraconazole and Terbinafine serum concentrations showed 49.8% of growth inhibition rate. Conclusions: Divergence between morphological and molecular identification for two isolates was observed. Different antifungal susceptibility profiles were observed depending on the species. The most active antifungal agents were Amphotericin B and Itraconazole. MICs for Terbinafine very low were observed to the Syncephalastrum racemosum and C.bertholletiae and all isolates were highly resistant to Micafungin, 5- Fluorocytosine, Fluconazole and Voriconazole. It was possible to observe antifungal MIC reduction in combined tests. MICs high for terbinafine alone were observerd to the Rhizopus oryzae and Rhizopus stolonifer while in the combo test low MIC values were observed, which highlights the importance of combining antifungal drugs in the management of mucormycosis. The hypha growth inhibition rates obtained for Rhizopus oryzae (LIF 1832) against antifungal isolates suggest that hyphae may be more susceptible to antifungal agents against spores. Although not too high, the hyphae growth inhibition rate obtained for the combination serum achievable concentrations of Terbinafine and Itraconazole can probably be related to the clinical outcome / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T17:23:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_LudimilaDias_M.pdf: 4371531 bytes, checksum: 15deaceac3a09118222822415b70daaf (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O ciclo sexual de basidiomicetos é controlado pelo sistema mating type. Este é formado por dois loci multigênicos não ligados A e B, o locus A codifica duas proteínas homeodomínio HD1 e HD2, capazes de heterodimerização, enquanto o locus B apresenta genes para receptores de feromônio e feromônios. Em fungos heterotálicos, o desenvolvimento sexual depende da especificidade entre os quatro alelos, sistema este chamado tetrapolar, e é ativado apenas por interações específicas entre alelos parentais necessariamente diferentes, assegurando que hifas geneticamente iguais sejam incompatíveis. Em contrapartida, a condição na qual hifas geneticamente iguais são compatíveis é denominada homotalismo. Fungos basidiomicetos são tipicamente heterotálicos, no entanto, apesar de pertencer a este filo, o fitopatógeno Moniliophthora perniciosa, causador da doença Vassoura de Bruxa no cacaueiro, é classificado como homotálico primário. Curiosamente, apesar desta classificação, M. perniciosa contém um sistema genético tetrapolar, sendo o primeiro fungo descrito com essa característica. Neste trabalho, foi realizada a caracterização dos loci mating type em M. perniciosa e verificamos o perfil transcricional destes genes com o objetivo de entender os mecanismos moleculares que atuam no seu comportamento homotálico. Primeiramente, foram identificados no genoma um locus A e um locus B, além de genes atuantes no processamento e sinalização em resposta aos feromônios. O estudo do perfil transcricional destes genes revelou que um receptor tem um perfil de expressão condizente com a fase do ciclo de vida do fungo na qual ocorre o processo de dicariotização. A análise funcional dos receptores foi realizada em um sistema expressão heteróloga, promissor para o estudo de GPCRs (G coupled proteins receptors), porém não permitiu confirmar a presença de alelos compatíveis de receptores e precursores de feromônios no genoma de M. perniciosa como uma possível explicação ao comportamento homotálico. Tendo em vista o locus A, este é formado por um par MpHD1 e MpHD2, o que difere de outros basidiomicetos devido a inserção de uma sequência (11,958kb) interrompendo seus promotores. A hipótese neste cenário é que o transposon encontrado no locus A poderia ter permitido um crossover desigual que trariam genes compatíveis para o mesmo alelo, sendo responsável pelo homotalismo na espécie. Contrariando essa hipótese, os dados obtidos neste projeto indicam que uma possível transição prévia ao homotalismo resultou em uma pressão seletiva relaxada sobre os loci mating type, cuja consequência foi a degeneração nos genes destes loci. Neste contexto, os genes do mating type poderiam não estar mais envolvidos na dicariotização. Este trabalho, portanto, fornece importantes dados para o entendimento da biologia sexual deste fungo, o que futuramente poderá ser correlacionado a sua fitopatogenicidade / Abstract: The basidiomycetes¿ sexual cycle is controlled by the mating type system. The structure of this system comprises two unlinked multigenic loci, A and B. The A locus codes for homeodomain proteins, HD1 e HD2 which form a heterodimer, and B locus presents pheromone receptors and pheromones. In outcrossing (heterothallic) fungi, sexual development depends on the compatibility of four genes in two different allelic versions in a so-called tetrapolar system, and is strictly activated by specific interactions between different parental alleles, ensuring that genetically identical hyphae are incompatible. The phytopathogen Moniliophthora perniciosa causes Witches¿ broom disease in cacao plants, and it is a typical basidiomycete fungi. However, it completes its sexual development through the crossing of genetically identical hyphae, and is the first described homothallic fungi with a complete tetrapolar genetic system. Here we show the characterization of the mating type loci of M. perniciosa and the transcriptional profile of these genes, to uncover the mechanisms underpinning its homothallic behavior. First, we identified an A locus, a B locus and a set of genes that participates in pheromone processing and signalization. Considering the transcriptional profile of these genes, one receptor shows an expression profile consistent with an involvement in dikaryotization. The functional evaluation of the receptors was performed in a heterologous expression system, a promising tool for GPCR (G coupled proteins receptors) proteins study. This system did not allow the confirmation if M. perniciosa contains compatible alleles for receptors and pheromones, one possible explanation for homothallism. Considering A locus, it codes for a pair MpHD1 and MpHD2, which has a sequence insertion (11,958kb) interrupting their promoters, differing from others basidiomycetes. The hypothesis in this scenario is that the insertion of a transposon could have allowed an unequal crossover that brought together compatible genes in the same allele, causing the homothallism in this species. Interestingly, in an opposite direction, our data indicates that a previous transition for homothallism could have resulted in a relaxed selective pressure on mating type loci, with consequences such as the presence of degenerated genes on these loci. In this context, the mating type genes could not necessarily play a role in dikaryotization process. This work provides valuable data for understanding the sexual biology of M. perniciosa, which hereafter could be correlated with its phytopathogenicity / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM) induz uma resposta imune tipo Th1 relacionada à proteção, com imunodepressão antígeno-específica transitória. As células dendríticas (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antígeno, porém, pouco se sabe sobre seu papel na PCM humana e sobre os efeitos do fungo em suas funções. OBJETIVO: Investigar os efeitos in vitro de antígenos de Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) sobre as DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: Foram incluídos 27 pacientes com PCM ativa (PA; com diagnóstico micológico, histopatológico ou títulos de anticorpos anti-P. brasiliensis >= 32) e 31 pacientes com PCM tratada (PT; anticorpos anti-P. brasiliensis com títulos <= 4, em duas coletas num período de 6 meses, e doença comprovada no passado pelos mesmos critérios de pacientes com PCM ativa), e de 39 indivíduos sadios (CO; não sensibilizados a antígenos de P. brasiliensis e sem anticorpos a tais antígenos fúngicos) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico, tratados com IL-4 e GM-CSF. As DC diferenciadas não-tratadas (nDC) ou tratadas com TNF-alfa (DC+TNF) foram estimuladas com os antígenos de P. brasiliensis: glicoproteína de 43 kDa (gp43) a 2 e 5 ug/mL (Gp2 e Gp5), e antígeno solúvel a 15 ug/mL (CFA). As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DC-SIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL-12p40, IL-1beta e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs foram então co-cultivadas com linfócitos autólogos, medindo-se a linfoproliferação por incorporação de timidina triciada e dosando-se por ELISA os níveis de citocinas IL-10, IL-4, IFN-y e TNF-alfa foram dosadas nos sobrenadantes dessas culturas. RESULTADOS: As DCs de PA e PT apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo PT, Gp5 induziu maior expressão de HLA-DR em comparação ao grupo PA, e o CFA aumentou o percentual de DCs CD86+. As DCs de PT, na presença de TNF-alfa, secretaram grandes quantidades de IL-12p40, especialmente frente ao CFA. Este antígeno induziu forte proliferação de linfócitos autólogos tanto de pacientes do grupo PA quanto do grupo PT, em relação ao grupo CO e às células sem CFA. Os níveis de IL-10 foram maiores no grupo PA, enquanto que os de IL-4 foram maiores no grupo PT, tanto nos co-cultivos com DCs e Gp quanto com DCs e CFA. Por outro lado, apenas o estímulo de DCs com CFA, e não com gp43, induziu altos níveis de IFN-y e TNF-alfa. CONCLUSÕES: DCs de PT tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN, altos níveis de IL-12p40 e baixos de IL-10, induzidos por CFA. DCs de PA apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios, e baixos níveis de IL-12-p40 e IL-10. A gp43 induziu pouca linfoproliferação e baixos níveis de IFN-y e TNF-alfa nos co-cultivos de linfócitos autólogos e DCs de PT e PA. O CFA foi mais eficiente que a gp43 no estímulo de DCs PT e PA mas não de CO, ao induzir proliferação de linfócitos autólogos com aumento da secreção de IFN-y e TNF-alfa. Esses resultados, combinados aos níveis constantes de IL-10 e altas concentrações de IL-12p40, sugerem que o CFA seja melhor indutor de resposta Th1, podendo servir como alvo para pesquisas de epítopos candidatos à vacina de células dendríticas anti-P. brasiliensis. / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) induces a Th1 immune response associated with protection, with a transitory antigen-specific immunodepression. Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, but little is known about their role on human PCM and the effects of fungal antigens on their functions. OBJECTIVE: To investigate the in vitro effects of Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) antigens on monocyte-derived DCs from patients with PCM. METHODS: Twenty-seven patients with active PCM (PA; with mycological or histopathological diagnosis or antibody titles anti-P. brasiliensis >= 32) and 31 treated PCM (PT; antibody titles <= 4 on two samples within six months, and proved disease in the past by the same criteria of active PCM) and from 39 non-PCM subjects (CO; non-sensitized to P. brasiliensis antigens and without anti-fungal antigens antibodies) were included in this study and DCs were generated from peripheral blood monocytes with IL-4 and GM-CSF. Differentiated DCs were treated with TNF-alfa (DC+TNF) or left untreated (nDC) and then stimulated with P. brasiliensis antigens: 43 kDa glycoprotein (gp43) at 2 and 5 ug/mL (Gp2 and Gp5), and the cell-free antigen at 15 ug/mL (CFA). Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD85, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow cytometry and the cytokines IL-10, IL-12p40, IL-1beta and CCL18 were assayed by ELISA. DCs were cocultured with autologous lymphocytes: lymphoproliferation was measured by the incorporation of tritiated thymidine and the cytokines IL-10, IL-4, IFN-y and TNF-alfa were also assayed by ELISA. RESULTS: DCs from PA and PT groups showed similar expression of CD11c and CD1a to those of CO group. On the PT group, Gp5 induced higher expression of HLA-DR when compared to PA and CFA increased the percentage of CD86+ DCs. When stimulated with CFA, TNF-alfa -treated DCs from the PT group secreted large amounts of IL-12p40. This antigen also induced strong proliferation of autologous lymphocytes on both PA and PT groups in comparison to CO group and to unstimulated cells. Both DCs with CFA and DCs with gp43 induced high levels of IL-10 and IL-4 on the PA and PT groups, respectively. On the other hand, only DCs with CFA and not those with gp43 were able to induce high levels of IFN-y and TNF-alfa. CONCLUSIONS: CFA-stimulated DCs from treated PCM showed high expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN, increased levels of IL-12p40 and low levels of IL-10. DCs from patients with active disease have expression of surface molecules similar to those of non-PCM subjects, with low levels of IL-12p40 and IL-10. Gp43 induced low lymphoproliferation and decreased levels of IFN-y and TNF-alfa in the cocultures of DC and autologous lymphocytes from PT and PA groups. CFA was more efficient than gp43 on stimulating DCs to induce proliferation of autologous lymphocytes with increased secretion of IFN-y and TNF-alfa on both PT and PA cells but not on CO. These results combined with constant levels of IL-10 and high amounts of IL-12p40 suggest that CFA may be a better inducer of Th1 immune response and a suitable target for future researches on epitopes candidates for anti-P. brasiliensis dendritic cell-based vaccines

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM) induz uma resposta imune tipo Th1 relacionada à proteção, com imunodepressão antígeno-específica transitória. As células dendríticas (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antígeno, porém, pouco se sabe sobre seu papel na PCM humana e sobre os efeitos do fungo em suas funções. OBJETIVO: Investigar os efeitos in vitro de antígenos de Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) sobre as DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: Foram incluídos 27 pacientes com PCM ativa (PA; com diagnóstico micológico, histopatológico ou títulos de anticorpos anti-P. brasiliensis >= 32) e 31 pacientes com PCM tratada (PT; anticorpos anti-P. brasiliensis com títulos <= 4, em duas coletas num período de 6 meses, e doença comprovada no passado pelos mesmos critérios de pacientes com PCM ativa), e de 39 indivíduos sadios (CO; não sensibilizados a antígenos de P. brasiliensis e sem anticorpos a tais antígenos fúngicos) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico, tratados com IL-4 e GM-CSF. As DC diferenciadas não-tratadas (nDC) ou tratadas com TNF-alfa (DC+TNF) foram estimuladas com os antígenos de P. brasiliensis: glicoproteína de 43 kDa (gp43) a 2 e 5 ug/mL (Gp2 e Gp5), e antígeno solúvel a 15 ug/mL (CFA). As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DC-SIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL-12p40, IL-1beta e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs foram então co-cultivadas com linfócitos autólogos, medindo-se a linfoproliferação por incorporação de timidina triciada e dosando-se por ELISA os níveis de citocinas IL-10, IL-4, IFN-y e TNF-alfa foram dosadas nos sobrenadantes dessas culturas. RESULTADOS: As DCs de PA e PT apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo PT, Gp5 induziu maior expressão de HLA-DR em comparação ao grupo PA, e o CFA aumentou o percentual de DCs CD86+. As DCs de PT, na presença de TNF-alfa, secretaram grandes quantidades de IL-12p40, especialmente frente ao CFA. Este antígeno induziu forte proliferação de linfócitos autólogos tanto de pacientes do grupo PA quanto do grupo PT, em relação ao grupo CO e às células sem CFA. Os níveis de IL-10 foram maiores no grupo PA, enquanto que os de IL-4 foram maiores no grupo PT, tanto nos co-cultivos com DCs e Gp quanto com DCs e CFA. Por outro lado, apenas o estímulo de DCs com CFA, e não com gp43, induziu altos níveis de IFN-y e TNF-alfa. CONCLUSÕES: DCs de PT tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN, altos níveis de IL-12p40 e baixos de IL-10, induzidos por CFA. DCs de PA apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios, e baixos níveis de IL-12-p40 e IL-10. A gp43 induziu pouca linfoproliferação e baixos níveis de IFN-y e TNF-alfa nos co-cultivos de linfócitos autólogos e DCs de PT e PA. O CFA foi mais eficiente que a gp43 no estímulo de DCs PT e PA mas não de CO, ao induzir proliferação de linfócitos autólogos com aumento da secreção de IFN-y e TNF-alfa. Esses resultados, combinados aos níveis constantes de IL-10 e altas concentrações de IL-12p40, sugerem que o CFA seja melhor indutor de resposta Th1, podendo servir como alvo para pesquisas de epítopos candidatos à vacina de células dendríticas anti-P. brasiliensis. / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) induces a Th1 immune response associated with protection, with a transitory antigen-specific immunodepression. Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, but little is known about their role on human PCM and the effects of fungal antigens on their functions. OBJECTIVE: To investigate the in vitro effects of Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) antigens on monocyte-derived DCs from patients with PCM. METHODS: Twenty-seven patients with active PCM (PA; with mycological or histopathological diagnosis or antibody titles anti-P. brasiliensis >= 32) and 31 treated PCM (PT; antibody titles <= 4 on two samples within six months, and proved disease in the past by the same criteria of active PCM) and from 39 non-PCM subjects (CO; non-sensitized to P. brasiliensis antigens and without anti-fungal antigens antibodies) were included in this study and DCs were generated from peripheral blood monocytes with IL-4 and GM-CSF. Differentiated DCs were treated with TNF-alfa (DC+TNF) or left untreated (nDC) and then stimulated with P. brasiliensis antigens: 43 kDa glycoprotein (gp43) at 2 and 5 ug/mL (Gp2 and Gp5), and the cell-free antigen at 15 ug/mL (CFA). Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD85, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow cytometry and the cytokines IL-10, IL-12p40, IL-1beta and CCL18 were assayed by ELISA. DCs were cocultured with autologous lymphocytes: lymphoproliferation was measured by the incorporation of tritiated thymidine and the cytokines IL-10, IL-4, IFN-y and TNF-alfa were also assayed by ELISA. RESULTS: DCs from PA and PT groups showed similar expression of CD11c and CD1a to those of CO group. On the PT group, Gp5 induced higher expression of HLA-DR when compared to PA and CFA increased the percentage of CD86+ DCs. When stimulated with CFA, TNF-alfa -treated DCs from the PT group secreted large amounts of IL-12p40. This antigen also induced strong proliferation of autologous lymphocytes on both PA and PT groups in comparison to CO group and to unstimulated cells. Both DCs with CFA and DCs with gp43 induced high levels of IL-10 and IL-4 on the PA and PT groups, respectively. On the other hand, only DCs with CFA and not those with gp43 were able to induce high levels of IFN-y and TNF-alfa. CONCLUSIONS: CFA-stimulated DCs from treated PCM showed high expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN, increased levels of IL-12p40 and low levels of IL-10. DCs from patients with active disease have expression of surface molecules similar to those of non-PCM subjects, with low levels of IL-12p40 and IL-10. Gp43 induced low lymphoproliferation and decreased levels of IFN-y and TNF-alfa in the cocultures of DC and autologous lymphocytes from PT and PA groups. CFA was more efficient than gp43 on stimulating DCs to induce proliferation of autologous lymphocytes with increased secretion of IFN-y and TNF-alfa on both PT and PA cells but not on CO. These results combined with constant levels of IL-10 and high amounts of IL-12p40 suggest that CFA may be a better inducer of Th1 immune response and a suitable target for future researches on epitopes candidates for anti-P. brasiliensis dendritic cell-based vaccines

The cultivation of flowers is, in Brazil, very recent and little known species have a high ornamental potential, Cartamus is such a species and there are cultivars for the production of oil and as well as for ornamental pourposes. Being a recent crop in Brazil, little is known about its associated diseases, specially those that affect the seeds and the soil borne, such as white mold that causes great losses to several crops. Six experiments were conducted with the objectives of testing the reaction of the crop to isolates of Sclerotinia sclerotiorum, the biocontrol of S. sclerotiorum and of pathogens associated to the seeds, and the effect of the biocontrollers on cartamus plant growth. Isolates of the pathogen from chrisantemum, lettuce, soybean, and carrots, as well as isolates of Trichoderma sp. (ETSR 20 e TC 1.15) and comercial products of Trichoderma spp. (Agrotrich and Trichodel®) were used. In the reaction test, the cartamus crop was more severely attacked by the isolate obtained from lettuce, which when incorporated to commercial substrate did not promote the development of the disease in plant, but reduced plant growth. Trichodel® was the product that promoted the highest growth of plants when incorporated to the substrate, even in the absence of the pathogen. The product more efficient in controlling seed pathogens was Agrotrich. In the growth of seedlings, the isolates ETSR20 and TC1.15 were the best, when applied to the seeds and the latter promoted the best emergency of seeds in commercial substrate. Therefore, the Trichoderma based products can be used in the control of seed pathogens and growth promotion of cartamus plants as seed or substrate treatment. There are differences in disease severity on cartamus among isolates of S. sclerotiorum from different crops and its presence reduces the crop s growth, even in the absence of visible symptoms / A floricultura, no Brasil, é relativamente recente, existindo espécies pouco conhecidas com alto potencial ornamental. O cártamo é uma delas e possui cultivares tanto para a produção de óleo quanto para ornamentação. Por ser uma cultura recente no Brasil, pouco se conhece sobre as doenças associadas a ela, especialmente as que afetam as sementes e as veiculadas pelo solo, como o mofo branco, que causa grandes prejuízos a diversas culturas. Seis experimentos foram conduzidos com o objetivo de testar a reação da cultura a isolados de Sclerotinia sclerotiorum, o biocontrole de patógenos associados às sementes e de Sclerotinia sclerotiorum e o efeito dos biocontroladores no crescimento de plantas de cártamo. Foram utilizados isolados de Sclerotinia sclerotiorum das culturas do crisântemo, alface, soja e cenoura, e isolados de Trichoderma spp. (ETSR 20 e TC 1.15) e formulados comerciais à base de Trichoderma spp. (Agrotrich e Trichodel®). No teste de reação, a cultura do cártamo foi mais severamente atacada pelo isolado proveniente da alface, o qual, quando incorporado ao substrato comercial, não promoveu o desenvolvimento da doença nas plantas, porém prejudicou seu crescimento. Trichodel® foi o produto que maior crescimento proporcionou às plantas quando incorporado ao substrato, mesmo sem a presença do patógeno. O produto mais eficiente no controle dos patógenos das sementes foi o formulado comercial Agrotrich. No crescimento de plântulas, os isolados ETSR 20 e TC 1.15 se sobressaíram quando aplicados às sementes e este obteve melhor resultado na emergência de plântulas em substrato. Assim, os produtos a base de Trichoderma são viáveis para controle de patógenos de sementes e crescimento de plantas tanto no tratamento de sementes como do substrato. Existem diferenças na severidade da doença em cártamo entre isolados de Sclerotinia sclerotiorum oriundos de diferentes culturas e sua presença reduz o crescimento da cultura, mesmo na ausência de sintomas visíveis

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-18T16:16:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 350102 bytes, checksum: f63374577f4c51e4a93a1ed9f2503a88 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T16:16:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 350102 bytes, checksum: f63374577f4c51e4a93a1ed9f2503a88 (MD5) Previous issue date: 2015-07-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trichoderma spp., antagonistas a vários fitopatógenos, são comumente isoladas do solo, da rizosfera, e como endofíticos. Nosso objetivo foi selecionar isolados de Trichoderma spp. nas culturas do feijão e da soja em Minas Gerais e avaliar o antagonismo a S. sclerotiorum, agente causal do mofo-branco de ambas as culturas. Obtiveram-se 48 isolados, sendo 30 da rizosfera, 11 epifíticos, quatro endofíticos e três de restos culturais. Com base no sequenciamento das regiões ITS, TEF1-α e RPB2, incluíram-se os isolados em oito espécies de Trichoderma: 29 como T. harzianum; 5 como T. koningiopsis; 4 como T. hamatum; 4 como T. atroviride; 2 como T. asperelloides; 2 como T. longibrachiatum; 1 como T. asperellum e 1 como T. neokoningii. Oito isolados inibiram completamente o crescimento do patógeno em teste de pareamento. Oito isolados foram os mais eficientes no crescimento em meio de cultura. Vinte e quatro isolados foram os mais eficientes em parasitar escleródios no solo, com 79-99% de eficiência. Em ágar-água, 31 isolados inibiram a germinação miceliogênica entre 78-100%, e sete isolados inibiram a germinação carpogênica em mais de 85%. Sete isolados inibiram 100% a infecção em folíolos destacados e um isolado inibiu em 79% a infecção em hastes destacadas. Dois isolados de T. harzianum, UN34 e IM2, foram os mais promissores: UN34 por reduzir a sobrevivência e as germinações miceliogênica e carpogênica de escleródios; e IM2 por reduzir a infecção em folíolos e hastes destacados. De acordo com os resultados, existe um potencial dos isolados de Trichoderma spp. no controle biológico de S. sclerotiorum. / Trichoderma spp., antagonists to plant pathogens, are commonly isolated from soil, rhizosphere, and as endophytic. We aimed to select Trichoderma spp. isolates from bean and soybean crops in Minas Gerais and to evaluate their antagonism to S. sclerotiorum, the causal agent of white mold on both crops. We got 48 isolates: 30 rhizospheric, 11 epiphytic, four endophytic, and three isolates from crop debris. Based on the sequencing of ITS, TEF1-α, and RPB2 regions, the isolates were classified in eight Trichoderma species: 29 as T. harzianum, 5 as T. koningiopsis, 4 as T. hamatum, 4 as T. atroviride, 2 as T. asperelloides; 2 as T. longibrachiatum, 1 as T. asperellum, and 1 as T. neokoningii. Eight isolates completely inhibited pathogen growth in dual culture test. Eight isolates were the most efficient in growing in culture medium. Twenty-four isolates were the best in parasitizing sclerotia in soil, with 79-99% of efficiency. In water-agar, 31 isolates inhibited miceliogenic germination from 78-100%, and seven isolates inhibited the carpogenic germination by more than 85%. Seven isolates inhibited 100% infection on detached leaflets and one isolate inhibited 79% infection on detached stems. Two isolates of T. harzianum, UN34 and IM2, were the most promising: UN34 for reducing the survival and both miceliogenic and carpogenic germination of sclerotia; and IM2 for reducing infection in both leaflets and stems. According to the results, there is a potential of the isolates of Trichoderma spp. in the biocontrol of S. sclerotiorum.

OBJETIVOS: Estudar o ambiente interno em escolas públicas situadas em duas cidades (Atibaia e São Paulo), com diferentes níveis de poluição atmosférica, mediante a identificação e quantificação dos principais alérgenos presentes na poeira e no ar das salas de aula dessas escolas, assim como a avaliação da existência de padrão sazonal para cada um dos alérgenos estudados. MATERIAIS E MÉTODOS: As amostras de poeira foram coletadas de uma única sala de aula em cada escola, uma vez por mês durante um ano. A cada visita foram medidas a temperatura e umidade relativa do ar. A aspiração da poeira foi realizada em 8 pontos da sala, sendo 2 próximos à janela, 2 junto à porta, 2 junto à lousa e 2 no centro. Uma das amostras aspirada de cada local foi analisada quanto à sua composição, através de leitura por ELISA, utilizando-se anticorpos monoclonais (Indoor Biotechnologies-USA), para dosagem dos seguintes alérgenos: Der p 1, Der f 1, Blo t 5, Fel d 1, Can f 1, Asp f 1, Alt a 1, Bla g 1 e Bla g 2. A outra amostra foi semeada em agar Sabouraud para cultura para fungos. As amostras de ar foram coletadas por 20 minutos com o aparelho de Andersen N-6, um impactador de 6 estágios, colocado no centro da sala de aula. Os gêneros dos fungos foram identificados pela observação macroscópica das xi colônias e pelas características microscópicas das hifas, determinadas pela técnica de Ridell. RESULTADOS: Os resultados mostraram baixos níveis (< 2ug/g) de alérgenos de ácaros (Der p 1, Der f 1 e Blo t 5) na maioria das amostras de poeira dos pisos das escolas. Também foram encontrados baixos níveis (< 1ug/g) dos alérgenos animais (Fel d 1 e Can f 1), sendo que maiores níveis de Can f 1 foram detectados nas amostras da escola de São Paulo. Os alérgenos de barata não foram detectados nas duas escolas. As maiores quantidades de alérgenos de ácaros ocorreram durante a primavera e as menores no outono. Em Atibaia, verificaram-se maiores níveis de alérgenos de ácaros e esporos de fungos junto à lousa. Foram identificados 19 gêneros de fungos nas amostras de poeira e 25 gêneros nas amostras de ar das duas escolas. Destacaram-se Cladosporium nas amostras coletadas com aparelho de Andersen e Trichoderma nas amostras aspiradas. Considerando-se o total de esporos de fungos obtidos com aparelho de Andersen, não houve diferença estatisticamente significante entre as escolas de Atibaia e São Paulo, assim como não houve diferença entre as estações do ano. Em relação às amostras de poeira coletadas com aspirador, São Paulo apresentou os maiores níveis de UFC/g de poeira. CONCLUSÃO: Os pisos e o ar das escolas estaduais estudadas parecem não representar fonte importante de exposição à alérgenos de ácaros, fungos, cães, gatos e baratas, independente da presença de poluição atmosférica / Objective: To study indoor environment in public schools located in two cities (Atibaia and São Paulo) with different degrees of air pollution, identifying and measuring the most important allergens in classroom dust and air samples and evaluating the existence of seasonal variation for each allergen. Methods: Dust samples were obtained from a single classroom in each school, once a month during a year. During each visit temperature and relative humidity were measured. Floor dust was collected from eight different sites: 2 near the door, 2 near the window, 2 near the blackboard and 2 in the middle of the room. One sample collected from each site was analyzed by using mAb-based ELISAs (Indoor Biotechnologies-USA) for Der p 1, Der f 1, Blo t 5, Asp f1, Alt a 1, Fel d 1, Can f 1, Bla g 1 and Bla g 2. The other samples were plated on Sabouraud dextrose agar. Air samples were collected for 20 minutes with a N-6 Andersen sampler, a six-stage impactor, located in the middle of the classroom. Fungal genera were identified by macroscopic observation of the colonies and by the microscopic characteristics of the sporulating hyphae determined by the Ridell technique. Results: The results showed low levels (<2ug/g) of mite allergens (Der p 1, Der f 1 and Blo t 5) in most dust samples collected from the classroom\'s floor. Low levels (<1ug/g) of animal allergens (Fel d 1 and Can f 1) were found too, and higher levels of Can f 1 were detected in dust samples from São Paulo. Cockroach allergens (Bla g 1 and Bla g 2) were undetectable in all samples. Higher levels of mite allergens occurred during spring and lower during autumn. Higher levels of mite allergens and fungal spores were found near the blackboard in Atibaia. A total of 19 different fungal genera were distinguished in dust samples, while 25 genera were identified in air samples. The most frequently isolated fungal genera in Andersen samples was Cladosporium and in dust samples was Trichoderma. Considering total mold spores obtained with Andersen sampler, there was no statistically significant difference between São Paulo and Atibaia schools, neither between the seasons of the year. In relation to dust samples collected with vaccum cleaner, the school from São Paulo presented higher levels of UFC/g of dust. Conclusion: The floor and air from these two elementary schools in São Paulo seems not to represent an important source of exposure to allergens from mites, molds, cats, dogs and cockroach, independent on the presence of air pollution.

Submitted by JACIARA CRISTINA ALMEIDA DO AMARAL (jaciaramaral@ufpa.br) on 2018-09-24T18:34:39Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1_Dissertação_Final_AlineBarral.pdf: 935702 bytes, checksum: 0e13603e9f7137c77025d2055231cd3e (MD5) / Approved for entry into archive by JACIARA CRISTINA ALMEIDA DO AMARAL (jaciaramaral@ufpa.br) on 2018-09-24T18:35:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1_Dissertação_Final_AlineBarral.pdf: 935702 bytes, checksum: 0e13603e9f7137c77025d2055231cd3e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-24T18:35:00Z (GMT). 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New azolics such as posaconazole and voriconazole began to be used, but with limitations due to the high cost, the use of physical methods such as cryosurgery, thermotherapy, laser therapy and both. The low cure rates and high rates of relapse of the disease may be related to the different treatment methods employed and the lack of a standardized regimen itself. The objective of this work was to evaluate the in vitro sensitivity of conidia and in vitro induced muriform cells of Fonsecaea spp. in the presence of different antifungal agents, to date there are no studies evaluating the action of drugs using the pathogenic form of the fungus, reinforcing the importance of this study, following the method established in the standard M38-A2, Clinical and Laboratory Standards Institute. The minimum inhibitory concentration for each drug was obtained after 5 days of interaction, posaconazole showed better in vitro inhibitory activity for conidia (CIMMG = 0.632μg / ml) and muriform cells (CIMMG = 1μg / ml). In the analysis of the fungicidal concentration, in both conidia and muriform cells, posaconazole presented lower value (CFMMG = 6.72μg / ml, in both). The fungus samples presented distinct times to differentiate their conidia in muriform cells, therefore we believe that although they belong to the same genus the fungi present physiological peculiarities still unknown. In the in vitro susceptibility tests PCZ had the lowest inhibitory and fungicidal concentrations in both conidia and muriform cells, thus investing in susceptibility testing was important to identify sensitive or resistant strains. / A cromoblastomicose (CBM) é uma doença fúngica caracterizada por lesões crônicas cutâneas e subcutâneas, decorrentes da implantação transcutânea prévia de diferentes fungos negros, pertencentes a família Herpotrichiellaceae, o principal agente pertencente ao gênero Fonsecaea. A região amazônica é a principal área endêmica do Brasil, o estado do Pará a principal área endêmica no país e segunda no mundo. Não há uma padronização de tratamento, é usado a terapia medicamentosa, com diferentes esquemas, principalmente itraconazol. Novos azólicos como posaconazol e voriconazol começaram a ser utilizados, mas com limitações devido ao alto custo, o uso de métodos físicos como a criocirurgia, termoterapia, terapia a laser e a combinação de ambos. As baixas taxas de cura e altas taxas de recidivas da doença pode estar relacionado aos diferentes métodos de tratamento empregados e a própria falta de um esquema padronizado. O objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade in vitro de conídios e células muriformes, induzidas in vitro, de Fonsecaea spp. frente a diferentes antifúngicos, até o momento não há estudos que avaliem a ação de fármacos usando a forma patogênica do fungo, reforçando a importância deste estudo, seguindo o método estabelecido na norma M38-A2, do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A concentração inibitória mínima para cada fármaco utilizado foi obtida após 5 dias de interação, o posaconazol apresentou melhor atividade inibitória in vitro para conídios (CIMMG=0.632μg/ml) e células muriformes (CIMMG=1μg/ml). Na análise da concentração fungicida, tanto em conídios quanto em células muriformes, o posaconazol apresentou menor valor (CFMMG=6.72μg/ml, em ambos). As amostras fúngicas apresentaram tempos distintos para diferenciar seus conídios em células muriformes, portanto acreditamos que apesar de pertencerem ao mesmo gênero os fungos apresentam particularidades fisiológicas ainda desconhecidas. Nos testes de suscetibilidade in vitro, o PCZ teve as menores concentrações inibitórias e fungicidas tanto em conídios quanto em células muriformes,com isso investir em testes de suscetibilidade foi impor importante para identificar cepas sensíveis ou resistente.

The endophytic fungus Aspergillus niger isolated from specie plant Hancornia speciosa, commonly known as mangabeira, was cultivated in different culture media and used for identification of six substances in their extracts, such as oxalic, citric, tartaric, p-acetylbenzoic, hexylitaconic acids and phyrofen. For quantification of pyrophen in different extracts, it was developed a method by High Performance Liquid Chromatography that was efficient for both extract analysis and fermented broth. The method allowed to evaluate the effect of different media ways and culture time on the pyrophen. The analyzed media for pyrophen production were mangaba juice, Czapeck and potato dextrose broth (PDB) and the highest yield was obtained using mangaba juice. The effect of culture time was evaluated by cultivating the fungus in the PDB medium, being the ideal period of fermentation for pyrophen production was 12 days. / O fungo endofítico Aspergilus niger isolado da espécie vegetal Hancornia speciosa, conhecida popularmente como mangabeira, foi cultivado nos meios suco de mangaba, Czapeck e Caldo de Batata Dextrose (CDB) e levou ao isolamento e identificação de seis substâncias em seus extratos, sendo elas os ácidos oxálico, cítrico, tartárico, p-acetil-benzóico e hexilitacônico e a substância pirofeno. Visando encontrar a melhor condição de cultivo para produção de pirofeno foi desenvolvido um método analítico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para análise desta substância. O método desenvolvido foi eficiente tanto para análise dos extratos quanto para análise do caldo fermentado e permitiu avaliar o efeito dos diferentes meios e do tempo de cultivo na produção desta substância. A maior produção de pirofeno foi obtida utilizando suco de mangaba como meio de cultivo e o período ideal de fermentação para a produção de pirofeno foi de 12 dias, quando cultivado no meio líquido CDB.